CN114870192A - 红粉(舒缓)曲目产生的音乐节律磁场对突触可塑性ltp调控的分析方法 - Google Patents
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Abstract
本文阐述了红粉(舒缓)曲目产生的音乐节律磁场对突触可塑性LTP调控的分析方法，选择了3首不同频率的红粉(舒缓)曲目和对应频率的3首纯净正弦曲目，曲目经外置声卡和功率放大器输出到线圈中，产生磁场强度为2mT的音乐节律磁场；实验中对离体海马脑片进行了2min的磁刺激，采用多电极阵列系统记录6种音乐节律磁场对Schaffer‑CA1突触后的场电位信号。实验发现，曲目1产生的音乐节律磁场对LTP增强调控效果最为明显；曲目1，2，3中的频率混叠效果导致其对LTP的调控弱于对应频率的曲目4，5，6产生的纯净正弦磁场；1500Hz的磁刺激是调控突触可塑性LTP增强和抑制转换的一个拐点频率。
Description
技术领域
本发明以急性分离的SD(Sprague-Dawley)大鼠海马脑片Schaffer-CA1神经通路的突触可塑性LTP(long-term potentiation)为研究对象，揭示了红粉(舒缓)曲目产生的音乐节律磁场对突触可塑性LTP的调控规律，对音乐磁场刺激模式的选择具有一定的借鉴意义，本发明归属于生物医学工程等领域。
背景技术
音乐与人类生活密不可分，人们倾向于在学习或工作时将自己暴露在音乐环境下，以提高效率。在过去的几十年里，科学家们不断探索音乐与人类记忆与认知的关系。实验发现聆听莫扎特奏鸣曲等类似的舒缓音乐，可以提高个体的空间认知水平，不同时期不同类型的音乐训练，对认知能力和可塑性都具有促进作用。临床上，癫痫患者每天听莫扎特K.448音乐，有助于模拟清醒状态下颅内噪声频率，可能会减少癫痫病发作的概率，音乐练习可以显著增强成年人患者的主观记忆功能和客观认知功能，不同患病程度的阿尔兹海默症患者采用音乐治疗，结果证实了对轻度患者的记忆能力有一定促进作用。现有研究实验证明了音乐疗法对于学习记忆及认知功能具有积极作用。
磁刺激是神经调控的一种常用物理手段，rTMS(repetitive TranscranialMagnetic Stimulation)是一种治疗抑郁症、阿尔兹海默症等疾病的最有效方法，实验发现，脑组织暴露于rTMS可以引起神经元活动的持续变化，并影响海马区的突触可塑性。其它参数的磁刺激也被广泛研究，实验发现大鼠每天暴露在50Hz/2mT磁场中4周后，对空间记忆的获取和维持具有积极作用，将大鼠脑源性神经元网络暴露于高强度50Hz磁场中，实验发现增强了神经元的同步爆发活性，通过水迷宫测试发现，短时间暴露在50Hz强磁场中会损伤空间记忆能力的巩固，实验也发现了15Hz/2 mT的低频低强度磁场刺激可以抑制大鼠海马区突触可塑性LTP。实验发现HF-EMFs(High-frequency electromagnetic fields)作用于癌细胞膜通道后，破坏了癌细胞功能，达到治疗癌症的目的。实验发现亚毫米尺寸微型线圈采用70kHz的高频磁刺激，可以在细胞附近感应出足够的电场，改变了离子通道动力学特性。
音乐与磁场联合影响研究相对较少，实验发现对9名患有严重难治性抑郁症的成年患者提供音乐和rTMS的联合治疗，能够改善治疗效果，且未出现副作用。海马体Schaffer-CA1突触可塑性LTP作为研究学习与记忆的经典模型，目前未见到音乐与磁场结合对LTP调控影响的报道，因此，本发明将音乐与磁场结合，研究它们的共同作用，即音乐节律磁场刺激对Schaffer-CA1突触可塑性LTP的调节规律，发现采用较高频率的音乐磁场对海马脑片施加刺激可以增强LTP，本发明为今后研究一定参数的音乐磁场对学习记忆等认知功能的促进作用提供了参考。
发明内容
本发明提供了研究红粉(舒缓)曲目产生的音乐节律磁场对突触可塑性LTP调控的分析方法，目的是掌握不同类型音乐曲目产生的音乐磁场刺激对突触可塑性调控规律的差异性。由于离体脑片具有靶向性好、调控剂量容易控制、且受到的干扰因素少等优势，因此本发明采用离体脑片作为研究对象，该研究方法提高了音乐刺激和磁刺激对学习与记忆影响的基础研究，进而揭示其作用机理并为其在临床上的应用提供必要的客观依据。
本发明的技术方案
本发明基于实验室设备，设计了一套能够产生带有音乐节律的磁场的暴露装置，电脑上采用Adobe Audition CC2019音乐播放软件输出音乐曲目，通过UR12外置声卡转换为模拟信号，通过音频线将模拟信号接入到200kHz带宽的LYD-2025功率放大器后输出给线圈，最终输出的磁场强度使用特斯拉计校准，产生满足实验要求的音乐节律磁场。之后按照固定的刺激协议对急性分离的大鼠海马脑片施加磁场刺激，记录海马脑片Schaffer-CA1通路上的fEPSP(field excitatory postsynaptic potential)，并通过对记录数据的分析，研究音乐节律磁场对LTP的调控规律。通过本分析方法有助于了解音乐磁场刺激对学习与记忆相关功能的作用机制，对临床上音乐磁场的应用提供了一种有效的借鉴方法。
本发明提出红粉(舒缓)曲目产生的音乐节律磁场刺激对突触可塑性LTP调控的分析方法。
具体步骤是
第1步、在产生具有音乐节律磁场和电生理记录装置设计上，主要由电脑、UR12外置声卡，LYB-2025功率放大器、XDS-1B正置显微镜、MEA2100-60多电极阵列和线圈组成；首先在电脑上通过Adobe Audition CC2019音乐播放器输出音乐曲目，经UR12外置声卡将音乐曲目转换为模拟信号，模拟信号通过音频线接入到LYD-2025功率放大器后输出给线圈，产生满足实验要求的音乐节律磁场；线圈的外径为26.5mm，内径为16.5mm，高度为9.0mm，匝数为200，线圈材料选择直径为0.6mm的铜线；大脑切片位于线圈中心下方5mm处，通过调节LYB-2025功率放大器的输出电流为0.9A，在海马脑片上可以接收到强度为2mT的磁场；
第2步、首先选择了3首不同频率的红粉(舒缓)曲目：曲目1是莫扎特的经典曲目《土耳其进行曲》，曲目主要频率范围在3000～4000Hz；曲目2是贝多芬的经典曲目《月光奏鸣曲》，曲目主要频率范围在2000～3000Hz：曲目3是肖邦的经典曲目《葬礼进行曲》，曲目主要频率范围在1000～2000Hz；其次，取三首曲目的中间频率值，产生了三首纯净正弦曲目，分别为曲目4，频率为3500Hz，曲目5，频率为2500Hz，曲目6，频率为1500Hz；将六首曲目通过第1步设计的装置产生对应的音乐节律磁场，对离体海马脑片进行磁刺激，通过多电极阵列系统记录Schaffer-CA1突触后的场电位信号，每首曲目包含3组有效海马脑片数据；
第3步、在施加了曲目1，2，3产生的音乐节律磁场刺激2min后，记录到的LTP幅值相对于没有磁刺激的LTP的幅值分别增大了16.69％，14.50％，0.63％，从实验结果可知，曲目1和2产生的音乐节律磁场对LTP的幅值具有显著性增强作用(p＜0.05)，且随频率的升高而升高，但曲目3产生的节律磁场对LTP的增强效果不具有显著性差异(p＞0.05)；曲目4，5产生的音乐节律磁场刺激后，记录到的LTP幅值相对于没有磁刺激的LTP的幅值分别增大了27.54％和20.43％，但曲目6产生的音乐节律磁场刺激后，记录到的LTP幅值相对于没有磁刺激的LTP的幅值却降低了18.60％；
第4步，实验发现，曲目1产生的音乐节律磁场对LTP增强调控效果最为明显；曲目1，2，3中的频率混叠效果导致其对LTP的调控效果弱于对应频率的曲目4，5，6产生的纯净正弦磁场；1500Hz的磁刺激是调控突触可塑性LTP增强和抑制转换的一个拐点频率。
本发明的优点和有益效果
音乐疗法，如红粉(舒缓)音乐是治疗与学习和记忆相关的神经性疾病的重要手段，磁场同样也被证实对其具有调节作用，然而，二者结合后产生的具有音乐节律的磁场对学习与记忆的作用效果还未被证实。本发明提出红粉(舒缓)曲目产生的音乐节律磁场刺激对突触可塑性LTP调控的分析方法，选择了三个舒缓音乐曲目和三个纯净正弦曲目作为实验曲目。而本文中得到的结果，对揭示红粉(舒缓)曲目产生的音乐节律磁场刺激对突触可塑性LTP调控规律具有重要的参考价值，为音乐磁场这种刺激模式提供了理论基础，对临床上音乐磁场刺激模式的应用以及参数的选择有重要的指导意义。
附图说明
图1音乐节律磁场发生装置和电生理信号记录系统；
图2音乐节律磁场刺激后对Schaffer-CA1突触可塑性LTP的调控效果对比分析图.Exp1：舒缓音乐(曲目1，2，3)节律磁场的作用结果；
图3音乐节律磁场刺激后对Schaffer-CA1突触可塑性LTP的调控效果对比分析图.Exp2：纯净正弦(曲目4，5，6)节律磁场的作用结果。
具体实施方式
实施例一
第1步、急性分离SD大鼠海马脑片
SD大鼠用10％浓度的水合氯醛腹腔注射进行麻醉(0.1ml/20g)，等老鼠完全麻醉后，快速断头取脑，此过程时间应控制在1-3分钟，把大脑经过修葺后移至4℃的切片液中，接着使用振动切片机将其切成400μm厚的切片，振动频率为8，速度为2，最后将这些切片放置于人工脑脊液中孵育1小时，等待下一步的使用。
第2步、LTP的记录方法
我们所使用的MEA(multi-electrode array)由60个细胞外电极组成，每个电极之间的间距为200μm，且每个电极都可以作为刺激或者记录点。在孵育60min以后，选取一片脑片，将其移至MEA阵列上，把该阵列放置于倒置的显微镜上，并连续不断的向脑片中通入充氧的人工脑脊液，流速设置为每分钟2ml，温度为恒定的31℃，让脑片一直处于其中。然后使用一种尼龙制的网格盖片放置在脑片上方，确保切片表面与电极之间具有一个良好的接触。初始刺激电流为50μA，接着可以通过阵列上其他所有剩余电极同时来记录海马脑片的Schaffer-CA1神经通路的CA1区辐射层的场兴奋性突触后电位(fEPSP)，这些记录的fEPSP通过刺激电极附近的电极进行进一步的分析，随后调节刺激电流的大小，使得fEPSP幅值达到最大响应的百分之三十到四十。使用0.066Hz的频率来诱发基线突触信号，用fEPSP的幅值来计算对突触传递影响的大小，在诱导LTP产生之前，先记录基线10分钟，然后施加1秒100Hz的高频刺激来诱导LTP的产生。
第3步、音乐磁场产生的设置过程
本研究中设计的音乐节律磁场发生装置主要由电脑、外置声卡，功率放大器，和自制的线圈组成，如图1所示。使用电脑中安装的Adobe Audition CC2019音乐播放软件分别输出6个音乐曲目，通过外置声卡UR12转换为模拟信号，通过音频线将模拟信号接入到200kHz带宽的LYD-2025功率放大器，功率放大后输出给线圈，产生满足实验要求的舒缓音乐节律磁场。调节功率放大器，设置输入线圈的激励电流为0.9A，音乐磁场的强度为2mT。由于音乐曲目频率范围有波动，所以剂量大小有波动，但是在脑片上的分布均匀，线圈输出的磁场具有音乐节律特性。使用特斯拉计测量线圈输出的磁场强度，满足2±0.2mT的输出要求。
第4步、舒缓音乐节律磁场和纯净正弦磁场的刺激协议
在实验开始前，利用LTP-director软件中I/O curve模式进行测试刺激，采用20-70μA(0.1Hz)的电流，依次对脑片进行刺激，记录刺激产生的fEPSP，并选择引起振幅最大值的50％的电流值作为最佳刺激参数。在测试刺激完成后，选择最佳的刺激电流，刺激电极位置选择在CA1区锥体细胞辐射层。实验中首先记录fEPSP的基线10min，基线记录后，采用HFS(频率100Hz，刺激脉冲为100次，持续时间为1s)诱导LTP，可塑性诱导的时间在整个实验过程中相对较短，故施加HFS高频电刺激的时间忽略不计。选择LTP诱导成功的脑片记录20min的fEPSP，保证fEPSP的幅值达到稳定状态，然后打开音乐磁场发生装置，对海马切片施加带有音乐节律磁场的刺激，本文磁场刺激时间选择为2min，磁场强度大小为2mT左右，磁刺激完成后继续记录20min的fEPSP，记录软件采用LTP-Director，在fEPSP的整个记录过程中，每分钟记录2个取样点。音乐节律磁场的刺激实验分成两组，一组定义为Exp1，主要完成曲目1，2，3节律磁场的磁刺激；另一组定义为Exp2，主要完成纯净正弦节律磁场(曲目4，5，6)的磁刺激，每一个音乐节律磁场至少完成3个以上的有效脑片样本实验。
第5步、音乐节律磁刺激对突触可塑性的实验结果分析
①Exp1：舒缓音乐节律磁场对Schaffer-CA1突触可塑性LTP的影响结果分析如图2所示。Exp1完成了三种舒缓音乐节律磁场(曲目1，2，3)对海马离体脑片的磁暴露实验，每个实验组包含3组有效脑片上记录的数据(n＝3)，其中HFS直接诱导的被定义为LTP1，磁刺激后的被记录为LTP2。首先对每组前10min记录的基线部分进行了归一化处理，基线的fEPSPs振幅为100.023±1.02mV，而后采用100Hz的HFS诱导产生LTP，记录了20min的fEPSPs，将所有记录到的fEPSPs幅值平均后，曲目1，2，3记录到的LTP1幅值分别为171.67±6.11，154.00±9.85，158.67±3.79mV，加入曲目1，2，3节律磁场刺激后，记录了20min的fEPSPs，将记录到的所有fEPSPs幅值平均后，曲目1，2，3记录到的LTP2幅值分别为200.33±5.86，176.33±9.29，159.67±3.51mV，其相对于LTP1的幅值分别增大了16.69％，14.50％，0.63％。从实验结果可知，曲目1和曲目2音乐节律磁场对LTP幅值的具有增强作用，且随频率的升高而升高，但曲目3节律磁场对LTP的增强效果不明显。
②Exp2：纯净正弦节律磁场对突触可塑性LTP的影响结果分析如图3所示。Exp2完成了与三种舒缓音乐节律磁场对应的纯净正弦磁场(曲目4，5，6)对海马离体脑片的磁暴露实验，同样记录的有效脑片数量为3，其中HFS直接诱导的被定义为LTP1，磁刺激后被记录为LTP2。对每组前10min记录的基线部分fEPSPs进行了归一化处理，幅值为100.023±1.02mV，采用100Hz的HFS(high-frequency stimulation)诱导产生LTP，记录了20min的fEPSPs，将记录到的所有fEPSPs幅值平均后，曲目4，5，6组对应的LTP1幅值分别为170.67±9.29，138.67±7.23，143.33±6.81mV，加入曲目4，5，6节律磁场刺激后，记录了20min的fEPSPs，将记录到的所有fEPSPs幅值平均后，曲目4，5，6记录的LTP2幅值分别为217.67±9.45，167.00±8.54，116.67±13.32mV，曲目4，5相对于LTP1的幅值分别增大了27.54％和20.43％，但曲目6相对于LTP1的幅值降低了18.60％。从实验结果可知，曲目4和曲目5音乐节律磁场对LTP幅值的具有增强作用，且随频率的升高而升高，但曲目6节律磁场对LTP却产生了抑制效果。
第6步、音乐节律磁场对LTP干预影响具有频率选择性
采用曲目1，2，3的音乐节律磁刺激可以提高LTP的幅值，高频曲目1(《土耳其进行曲》)和中频曲目2(《月光奏鸣曲》)的刺激前后的fEPSP幅度具有显著性差异，低频曲目3(《葬礼进行曲》)对LTP的提高幅度很小，刺激前后fEPSP的幅值没有显著差异。同样，3500Hz和2500Hz的纯净正弦磁场可以显著提高LTP，1500Hz的纯净正弦磁场对LTP有显著抑制作用。说明频率为1500Hz～3500Hz范围的音乐节律磁场对LTP干预影响具有频率选择性，频率较高的音乐磁场可以提高LTP，频率较低的音乐磁场可以抑制LTP，1500Hz的磁刺激是调控突触可塑性LTP增强和抑制转换的一个拐点频率。
Claims (3)
1.红粉(舒缓)曲目产生的音乐节律磁场对突触可塑性LTP调控的分析方法，其特征是：
第1步、在产生具有音乐节律磁场和电生理记录装置设计上，主要由电脑、UR12外置声卡，LYB-2025功率放大器、XDS-1B正置显微镜、MEA2100-60多电极阵列和线圈组成；首先在电脑上通过Adobe Audition CC2019音乐播放器输出音乐曲目，经UR12外置声卡将音乐曲目转换为模拟信号，模拟信号通过音频线接入到LYD-2025功率放大器后输出给线圈，产生满足实验要求的音乐节律磁场；线圈的外径为26.5mm，内径为16.5mm，高度为9.0mm，匝数为200，线圈材料选择直径为0.6mm的铜线；大脑切片位于线圈中心下方5mm处，通过调节LYB-2025功率放大器的输出电流为0.9A，在海马脑片上可以接收到强度为2mT的磁场；
第2步、首先选择了3首不同频率的红粉(舒缓)曲目：曲目1是莫扎特的经典曲目《土耳其进行曲》，曲目主要频率范围在3000～4000Hz；曲目2是贝多芬的经典曲目《月光奏鸣曲》，曲目主要频率范围在2000～3000Hz；曲目3是肖邦的经典曲目《葬礼进行曲》，曲目主要频率范围在1000～2000Hz；其次，取三首曲目的中间频率值，产生了三首纯净正弦曲目，分别为曲目4，频率为3500Hz，曲目5，频率为2500Hz，曲目6，频率为1500Hz；将六首曲目通过第1步设计的装置产生对应的音乐节律磁场，对海马脑片进行磁刺激，通过多电极阵列系统记录Schaffer-CA1突触后的场电位信号，每首曲目包含3组有效数据；
第3步、曲目1，2，3产生的音乐节律磁场刺激2min后，记录到的LTP幅值相对于没有磁刺激的LTP的幅值分别增大了16.69％，14.50％，0.63％，从实验结果可知，曲目1和2产生的音乐节律磁场对LTP的幅值具有显著性增强作用，且随频率的升高而升高，但曲目3产生的节律磁场对LTP的增强效果不具有显著性差异；曲目4，5产生的音乐节律磁场刺激后，记录到的LTP幅值相对于没有磁刺激的LTP的幅值分别增大了27.54％和20.43％，但曲目6产生的音乐节律磁场刺激后，记录到的LTP幅值相对于没有磁刺激的LTP的幅值却降低了18.60％；
第4步，实验发现，曲目1产生的音乐节律磁场对LTP增强调控效果最为明显；曲目1，2，3中的频率混叠效果导致其对LTP的调控弱于对应频率的曲目4，5，6产生的纯净正弦磁场；1500Hz的磁刺激是调控突触可塑性LTP增强和抑制转换的一个拐点频率。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，本次实验针对的样本为急性分离的SD大鼠海马脑片的Schaffer-CA1神经通路。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在音乐节律磁场刺激前诱导突触可塑性LTP，诱导方式为HFS(频率100Hz，刺激脉冲个数为100，持续时间为1s)。
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