CN112086167A - LF-EMFs磁刺激与诱发感应电流刺激对突出可塑性LTP调控效应的对比分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明以海马区Schaffer‑CA1侧枝的突触可塑性LTP为原型，提出了LF‑EMFs磁刺激与诱发感应电流刺激对突出可塑性LTP调控效应的对比分析方法，LF‑EMFs磁刺激作为临床上治疗阿尔兹海默病的一种有效手段，其作用机制未知，而海马区Schaffer‑CA1通路的突触可塑性LTP一直被当作是研究学习与记忆机制的经典模型。本发明通过计算LF‑EMFs在海马脑片上引发的感应电流，并对比了LF‑EMFs与电流调控的结果，发现LF‑EMFs调控效果与其产生的感应电流大小呈非线性关系。本发明对于揭示LF‑EMFs对LTP的调控效果以及找寻LF‑EMFs影响LTP的作用机制具有重要的指导意义。
Description
技术领域
本发明以海马区Schaffer-CA1侧枝的突触可塑性LTP为原型，提出了LF-EMFs磁刺激与诱发感应电流刺激对突出可塑性LTP调控效应的对比分析方法，对揭示LF-EMFs对LTP的调控效果以及找寻LF-EMFs影响LTP的作用机制具有重要的指导意义，本发明归属于生物医学工程等领域。
背景技术
在过去的几十年中，陆续的证据证明磁场会影响神经系统的高级功能，如学习和记忆。伴随着科技的进步，电力系统和用电器的普及，人们的生活也就几乎完全暴露在了磁场中，因为绝大部分电力线和用电设备均有产生低频电磁场的能力；另一方面，磁场具有良好穿透性，因此可以穿过头骨无创地治疗神经疾病，成为治疗神经疾病的优选方式。正是这些原因，使公众越来越在意磁场对于生物体产生的效应，尤其是对于大脑记忆活动和认知功能方面带来的影响。离体海马脑片成为一种探究磁场对脑部影响的有力工具。自从20世纪50年代Li和McII对于豚鼠脑片和猫脑片皮层的膜静息电位的测量拉开了离体脑片电生理研究的序幕。随着离体海马脑片的普及，其研究价值不断地受到了肯定，Rahman等人认为离体大脑切片研究是一种自底向上的研究方法，具有精确控制外界对神经元形态和突触活动的刺激和阐明锥体神经元胞体和轴突末端急性影响的优势。离体海马脑片的这些特点，使得研究者可以对实验进行非常精准地把控。按照不同的实验目的直接调整脑片的外部条件，即可直接观察到调控之后产生的现象，排除其他因素带来的干扰。因此离体海马脑片非常适合用于研究磁场对神经记忆功能的影响。
在之前的一些研究中认为磁场本身是依靠磁场而无电极，磁场无痛地穿透皮肤和头骨，通过在穿透处附近感应出电流，使脑部特定的区域兴奋或抑制的一种影响脑部活动的外部刺激方式。因此在测量磁场对离体海马脑片神经功能的影响时，其在脑片关键通路上诱发的电流大小是决定磁场调控效果的关键因素。因此本文利用电流分流原理以及电压电阻关系，通过对海马脑片的重要通路Schaffer侧枝施加电流后测量诱发电压的方式测量出海马神经通路的电导率，结合法拉第感应定律，提出了一种计算磁场诱发脑片产生的感生电流值的方法；并使用单纯电流刺激与磁场刺激的效果进行对比，梳理磁场的调控效果与电流之间的关系。本发明对于揭示LF-EMFs对LTP的调控效果以及找寻LF-EMFs影响LTP的作用机制具有重要的指导意义。
发明内容
本发明提供了LF-EMFs磁刺激与诱发感应电流刺激对突出可塑性LTP调控效应的对比分析方法，目的是掌握通过计算LF-EMFs在海马脑片上引发的感应电流，并对比了LF-EMFs与电流调控的结果，发现LF-EMFs调控效果与其产生的感应电流大小呈非线性关系，由于离体脑片具有靶向性好、调控剂量容易控制、且受到的干扰因素少等优势，因此本文采用的研究方法提高了磁刺激对学习与记忆影响的基础研究，进而揭示其作用机理并为其在临床上的应用提供必要的客观依据。
本发明的技术方案：
本发明提出了一种计算LF-EMFs诱发脑片感应电流的方法，并对比LF-EMFs与直接电流调控的效果，通过两者之间的差异分析，判断LF-EMFs除电流效应外，是否存在其他可能影响LTP的效能。通过本分析方法有助于了解低频低强度短时磁刺激对学习与记忆相关的作用机制，对临床上LF-EMFs磁刺激的应用提供了一种有效的借鉴方法。
本发明提出LF-EMFs磁刺激与诱发感应电流刺激对突出可塑性LTP调控效应的对比分析方法。
具体步骤是：
第1步、为了计算LF-EMFs对Schaffer侧枝的感应电流大小，该通路的电导率γ是一个重要的参数，本文通过使用MEA多电极阵列对Schaffer侧枝施加电流并测量两侧电压，通过欧姆定律即可计算出该侧枝的电导率。首先对Schaffer侧枝上的靠中间位置的任意一点施加电流i，由于Schaffer侧枝是神经通路，整条神经通路的电导率近似均匀且会高于周围的神经组织，根据欧姆定理，在刺激点施加的电流i会从该点沿Schaffer侧枝向左右两侧传导。根据基尔霍夫电流定理，由于神经通路电导率近似均匀，因此每侧会分得0.5i。接下来再通过MEA测出左右两侧电流引起的电压值V，根据欧姆定律即可得出该点左右两侧的电阻值R和电导值γ，如公式1所示：
其中V0为未施加电流时，该侧枝刺激点的初始电压值。通过MEA多电极阵列施加的大小不同的两次电流值i1、i2，同时记录下来在脑片上引发的电位V1、V2，即可消掉V0，最终计算得到电导值γ。
第2步、由于Schaffer侧枝的位置贯穿海马CA1区和CA3区。为了得到一个较为准确的Schaffer侧枝电导值，Schaffer侧枝被分为平均的四段，在每一段选择一个刺激点对该点施加电流。因此在理想状态下，所施加的电流会均匀地沿着通路分流向该点的两侧，每侧将会接受1/2的电流。通过多次重复地对该点施加大小不同的电流刺激，即可计算出该点左右两侧的电导值；
第3步、在得到了海马Schaffer侧枝的电导率后，则要计算LF-EMFs在海马Schaffer侧枝产生的感应电流大小，根据磁场装置的结构特点，海马脑片位于感应磁场的上方，根据法拉第感应定律，时变磁场会感应出电场，使邻近的闭合电路回路总产生感应电流，如公式(2)所示：
本文以时变的正弦波磁场为例，由于变化的磁场会产生感生电场，因此会在脑片上会诱发出非保守的余弦电流场，从而在脑片上产生余弦电流。通过对于几个磁场剂量感生电流的计算，可以发现mT量级的LF-EMFs受其频率和强度的限制，在海马脑片Schaffer侧枝上的诱发的电流非常小，基本不会超过0.1μA。
第4步、为了验证LF-EMFs调控与电流调控的差异性，采用与LF-EMFs同频率的电流频率刺激方式，频率分别为100Hz和200Hz，两个电流的表达式为0.1×10-6sin2π100t(A)和0.2×10-6sin2π200t(A)，电流刺激的总时长与LF-EMFs刺激时间也保持一致，为1min。
第5步、实验结果表明，无论是TBS/HFS-LTP，在经过了两种电流调控后其LTP与相应控制组相比都呈现了明显的下降效果，各组之间具有显著性差异。这证明了μA量级的电流的确可以对LTP产生调控效果，产生的调控效果与LF-EMFs类似，同样是降低型调控，而0.1μA和0.2μA电流组(无论TBS/HFS)虽然在单向方差分析统计下表明两者之间存在P＜0.001量级的显著性差异，两者调控后产生的LTP水平相近。
本发明的优点和有益效果：
自1966年发现以来，海马LTP就是学习和记忆方向最具吸引力的细胞机制，目前大多数影响人类生活的记忆疾病都与大脑内LTP水平存在着一定的联系。越来越多的研究都致力于使用外界手段对LTP进行调控，其中就包括电刺激和磁刺激手段，其中磁刺激作为一个无创且易控制的神经调制工具吸引了越来越多的注意，而LF-EMFs则是磁刺激中常用的频率范围。从LF-EMFs和电流调控结果还可以看出TBS-LTP和HFS-LTP在面对不同频率磁场时存在敏感度差异。TBS和HFS诱导频率以及两者触发的特异性通路已经导致了它们在面对相关记忆疾病时表现出差别。而根据本文中得到的结果，两者的差异性同样在面对LF-EMFs刺激时得到了体现，这种差别是值得临床治疗重视的。本发明对于揭示LF-EMFs对LTP的调控效果以及找寻LF-EMFs影响LTP的作用机制具有重要的指导意义。
附图说明
图1海马区脑片电导率测量的实验过程图。A表示选取的海马区脑片及电流刺激和电压记录的示意图。①-⑩表示随机放置的10种海马脑片(其中橙色点代表多电极阵列上的电流刺激位点)
图2100Hz/2mT及200Hz/2mT对HFS-/TBS-LTP的调控效果。(A)对TBS-LTP的调控效果.(B)对TBS组的箱型图和显著性差异分析.(C)对HFS-LTP的调控效果.(D)对HFS组的箱型图和显著性差异分析.(***，代表被线段覆盖的组之间都具有0.001水平的显著性差异，p＜0.001)
图3两种电流对TBS-/HFS-LTP的调控效果分析图.(A)0.1和0.2μA对TBS-LTP的调控效果(B)各组的箱型图和单向方差分析(TBS-LTP)(C)0.1和0.2μA对HFS-LTP的调控效果(D)各组的箱型图和单向方差分析(HFS-LTP)(***，代表被线段覆盖的组之间都具有0.001水平的显著性差异，p＜0.001。)
图4调控效果对比分析图(A)0.1μA电流和100Hz/2mT磁场对TBS-LTP的调控(B)0.2μA电流和200Hz/2mT磁场对TBS-LTP的调控(C)0.1μA电流和100Hz/2mT磁场对HFS-LTP的调控(D)0.2μA电流和200Hz/2mT磁场对TBS-LTP的调控。
具体实施方式
实施例一
第1步、急性分离大鼠海马脑片
SD大鼠用10％浓度的水合氯醛腹腔注射进行麻醉(0.1ml/20g)，等老鼠完全麻醉后，快速断头取脑，此过程时间应控制在1-3分钟，把大脑经过修葺后移至4℃的切片液中，接着使用振动切片机将其切成400μm厚的切片，振动频率为8，速度为2，最后将这些切片放置于人工脑脊液中孵育1小时，等待下一步的使用。
第2步、LTP的记录方法
我们所使用的MEA由60个细胞外电极组成，每个电极之间的间距为200μm，且每个电极都可以作为刺激或者记录点。在孵育60min以后，选取一片脑片，将其移至MEA阵列上，把该阵列放置于倒置的显微镜上，并连续不断的向脑片中通入充氧的人工脑脊液，流速设置为每分钟2ml，温度为恒定的31℃，让脑片一直处于其中。然后使用将一种尼龙制的网格盖片放置在脑片上方，确保切片表面与电极之间具有一个良好的接触。初始刺激电流为50μA，接着可以通过阵列上其他所有剩余电极同时来记录CA1区辐射层的场兴奋性突触后电位(fEPSP)，这些记录的fEPSP通过刺激电极附近的电极进行进一步的分析，随后调节刺激电流的大小，使得fEPSP幅值达到最大响应的百分之三十到百分之四十。使用0.066Hz的频率来诱发基线突触信号，用fEPSP的幅值来计算对突触传递影响的大小，在诱导LTP产生之前，先记录基线20分钟，然后施加1秒100Hz的高频刺激来诱导LTP的产生。
第3步、Schaffer-collateral电导率的测量方法
由于Schaffer侧枝的位置贯穿海马CA1区和CA3区。为了得到整个通路一个较为准确的Schaffer侧枝电导值，本文将Schaffer侧枝被平均分为四段，在每一段选择一个刺激点对该点施加电流，通过多次重复地施加大小不同的电流刺激，即可计算出该点左右两侧的电导值，具体的过程则如图1中①-⑩所示。在电导测量的实验过程中，由于Schaffer侧枝的形状和排放位置的差异性，因此选用脑片的个数为n＝10，将每个脑片的Schaffer侧枝近似均匀分成四段，每段选择一个电流刺激位置点和两个相邻的电压记录位置点，因此每个脑片会有四个刺激位置点，对应着有八个电压记录位置点。针对每个电流刺激位点会施加从小到大的三次电流刺激，电流值选取以诱发最大fEPSP的20％、40％和60％为基准。
每个脑片选择的四个刺激位点在图1中以橙色点显示，，经过对十个脑片完成测量，共对80个点的电导率计算结果进行均一化，得到电导率均值近似为0.31S/m，该值非常接近于现有研究中测量得出的大脑灰质的电导率0.33S/m。灰质是一种神经组织，是中枢神经系统的重要组成部分，其本身是由大量的神经元胞体及其树突的聚集而形成，而Schaffer侧枝本身则是大量神经椎体细胞的排列，组成两者的细胞结构性质类似，因此本文中所测量的与灰质电导率近似的0.31S/m Schaffer侧枝电导值，可以被认为具有一定的参考价值。
第4步、感应电流的计算方法
LF-EMFs磁场垂直穿过脑片上的Schaffer侧枝，首先将脑片简化成一个半径为5mm的圆，在计算过程中取其周长为10πmm，面积为25πmm2，εi为LF-EMFs在脑片上产生的感生电动势，根据欧姆定律dI＝εi/dR，再对其进行积分，则可计算出感应电流I值，如果磁场频率和强度选取100Hz/2mT和200Hz/2mT正弦磁场，其中电导率γ≈0.31S/m，脑片厚度为400μm，诱导产生的感生电流如计算公式3所示，
第5步、在TBS和HFS两种诱导方式下LF-EMFs对LTP的调控规律
如图2所示的实验结果表明，使用了100Hz/2mT和200Hz/2mT两种LF-EMFs对HFS/TBS-LTP进行了调控，形成了100Hz/2mT TBS，100Hz/2mT HFS，200Hz/2mT TBS和200Hz/2mTHFS组，调控结果如图2.A，C所示，实验结果表明100Hz/2mT磁场对LTP的调控效果要高于200Hz/2mT磁场，统计分析结果表明，两种LF-EMFs的调控后的LTP无论是TBS型或是HFS型都与其相应的对照组存在着显著性差异(图2.B，D)，LF-EMFs对LTP的调控力度与其频率呈反比。
第6步、在TBS和HFS两种诱导方式下电流刺激对LTP的调控规律
本文使用了电流对突触可塑性进行干预，使用软件MC_Stimulus II(MCS GmbH，Reutlingen，Germany)来实现对海马电流干预。电流频率与LF-EMF的两种频率相同，为100Hz和200Hz。由于MEA电极施加的电流最低值为0.1μA，本文所选择的调控电流大小无法低于0.1μA。因此文中最后选择的电流是峰值0.1μA频率100Hz和峰值0.2μA频率200Hz的正弦电流。频率与磁场大小保持一致，但电流的大小是磁场计算得到的感应电流的100倍。两个电流的表达式为0.1×10-6sin2π100t(A)和0.2×10-6sin2π200t(A)，电流刺激的总时长与LF-EMFs刺激时间也保持一致，为1min。形成了0.1μA TBS/HFS组和0.2μA TBS/HFS组，调控结果如图3所示。其中，无论是TBS/HFS-LTP，在经过了两种电流调控后其LTP与相应控制组相比都呈现了明显的下降效果(图3A，C)，各组之间具有显著性差异(图3B，D)。这证明了μA量级的电流的确可以对LTP产生调控效果，产生的调控效果与LF-EMFs类似，同样是降低型调控。而0.1μA和0.2μA电流组(无论TBS/HFS)虽然在单向方差分析统计下表明两者之间存在P＜0.001量级的显著性差异，但根据图3A，C结果显示，两者调控后产生的LTP水平相近。
第7步、LF-EMFs与电流刺激对LTP调控规律的对比分析
最后，通过计算得到100Hz/2mT和200Hz/2mT磁场产生的感生电流峰值为0.001×10-6(A)和0.002×10-6(A)，其与对应的0.1μA和0.2μA电流调控组的调控效果对比如图4所示。图4.A，B表明，对于TBS-LTP而言，0.1μA的100Hz的正弦电流调控效果类似于100Hz/2mT的正弦磁场的调控效果，0.2μA电流与200Hz/2mT的调控效果相近。虽然两个磁场的仿真电流峰值为0.001μA和0.002μA，虽然与施加的0.1μA和0.2μA电流剂量相差百倍，但从两者对LTP的调控效果来讲，0.1μA与100Hz/2mT的调控效果相近，0.2μA与200Hz/2mT的调控效果相近，均没有明显的差异性。图4.C，D的表明，对于HFS-LTP而言，0.1μA电流虽仍与100Hz/2mT的LF-EMF调控效果类似，但0.2μA电流和200Hz/2mT LF-EMF的调控效果却有明显的差别，0.2μA电流相较于200Hz/2mT磁场调控效果更强。结果中并没有显示出明显的线性变化规律，能在脑片产生约0.001μA电流的100Hz/2mT磁场调控与0.1μA电流调控效果没有明显的调控效果差异，无论是对TBS-LTP或是对HFS-LTP。而产生感应电流约为0.002μA的200Hz/2mT磁场与0.2μA电流则在调控TBS和HFS时产生了不同结果，对TBS而言200Hz磁场与0.02μA电流对其产生的调控效果是相当的；HFS-LTP则显然对0.2μA的电流刺激更加敏感，0.2μA电流对其的调控效果要强于200Hz/2mT磁场。
Claims (4)
1.LF-EMFs磁刺激与诱发感应电流刺激对突出可塑性LTP调控效应的对比分析方法，其具体步骤是：
第1步、Schaffer侧枝电导率的测量方法
为了计算LF-EMFs在Schaffer侧枝上诱导的感应电流大小，需要计算出该通路的电导率值；首先采用MEA多电极阵列在Schaffer侧枝上选择一个电流刺激点，通过施加两次大小不同的电流值，在该刺激点两端的相邻电极上分别测量出两次的电压值，根据欧姆定律计算出该段Schaffer侧枝的电导率值，对80个值进行平均化，确定Schaffer侧枝的电导率值为0.31S/m；
第2步、LF-EMFs磁刺激诱导的感应电流计算方法
LF-EMFs磁场垂直穿过脑片上的Schaffer侧枝，首先将脑片简化成一个半径为5mm的圆，在计算过程中取其周长为10πmm，面积为25πmm2，εi为LF-EMFs在脑片上产生的感生电动势，根据欧姆定律dI＝εi/dR，再对其进行积分，则可计算出感应电流I值，如果磁场频率和强度选取100Hz/2mT和200Hz/2mT正弦磁场，其中电导率γ≈0.31S/m，脑片厚度为400μm，诱导产生的感生电流计算公式如下，
第3步、LF-EMFs磁刺激与电流刺激对LTP调控效应的对比实验
刺激协议包括1min的LF-EMFs的磁刺激和1min的电流刺激，紧接着20min的Baseline记录，100Hz的LTP诱导，和60min的LTP记录，电流刺激选择100Hz/0.1μA和200Hz/0.2μA，LF-EMFs选择100Hz/2mT和200Hz/2mT，100Hz的电流刺激与LF-EMFs刺激对突触可塑性LTP的调控结果相似，200Hz的0.2μA电流刺激要强于200Hz/2mT对LTP的调控。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，为了准确控制LF-EMFs刺激和电流刺激对Schaffer侧枝的作用剂量，本次实验选择离体海马脑片作为实验样本。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将Schaffer侧枝被平均分为四段，分别对四段进行电导率计算，从而获取整个Schaffer侧枝较为准确地电导率值。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，突触可塑性LTP的诱导方式采用两种形式，分别为HFS和TBS。
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