CN112175938B - 三种低频低强度短时磁刺激模式对突触可塑性ltp调控效应的分析方法 - Google Patents

三种低频低强度短时磁刺激模式对突触可塑性ltp调控效应的分析方法 Download PDF

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Abstract

本发明提出了三种低频低强度短时磁刺激模式对突触可塑性LTP调控效应的分析方法，实验结果表明，三种模式磁刺激均会对突触可塑性LTP产生一定程度的抑制，其中，连续正弦磁场的抑制效果最为显著，而另外两种的抑制效果相对较弱，且随着时间的增大，三种模式的抑制效果更为明显。本发明通过Agilent 83712信号源产生正弦信号，通过Master‑8可编程刺激器产生脉冲和节律信号，经功率放大器PB717X放大后，产生频率为15Hz，强度为2mT的低频低强度磁场信号，对离体海马脑片实现了10s，20s，40s，60s的短时刺激，并采用多电极阵列记录到LTP信号，对于探究磁刺激对学习和认知的影响机制提供了依据。

Description

三种低频低强度短时磁刺激模式对突触可塑性LTP调控效应 的分析方法
技术领域
本发明以急性分离的SD大鼠海马区Schaffer-CA1通路为研究对象，揭示了三种低频低强度短时磁刺激模式对突触可塑性LTP的调控规律，对临床上磁刺激模式的选择具有一定的借鉴意义，本发明归属于生物医学工程等领域。
背景技术
突触可塑性广泛存在于生物体中，包括神经中枢系统的发育，大脑的认知以及学习记忆等多种神经活动。越来越多的实验表明突触可塑性与学习记忆有着密切的联系，海马中的兴奋性突触环路成为研究LTP的重要模型。研究低频低强度磁刺激对大脑或者活体动物突触可塑性的影响很重要，因为大量的证据表明极低频磁场暴露会影响空间学习和记忆，并且与神经退行性疾病相关，包括帕金森(PD)和阿尔兹海默症(AD)等。另一方面，也有很多神经性疾病产生的特征就表现在突触可塑性的改变上，涉及到树突棘的形态变化，和可塑性异常以及信号的传导等。因此，了解低频低强度对突触可塑性的调节作用这种神经生物学机制是非常重要的。在之前的研究中，虽然采用的磁场刺激模式有很多种，如，正弦磁场刺激、脉冲磁场刺激和节律脉冲磁场刺激，其在临床上或者活体动物上也有一定的疗效，但随着现代科技的进步以及经颅磁技术的不断广泛使用，对于一些更深层次的问题需要有更明确的认识，其中不同模式下的低频低强度短时磁刺激对突触可塑性影响的调控规律却未知，同时不同模式下涉及到许多的参数设计，其产生的作用效果也会不同，因此本发明从这个角度提出了三种低频低强度短期磁刺激模式对突触可塑性LTP调控影响的分析方法。
对于极低频脉冲电磁场，始终是电磁生物效应的研究热点，不同频率和功率的ELF脉冲磁场，对小鼠进行不同时长的照射，结果发现该磁场可以抑制小鼠骨骼生成白细胞的功能，影响小鼠的学习记忆能力。低频弱脉冲磁场(LFPMF)对大鼠进行照射，结果发现15Hz的LFPMF可以影响大鼠的行为和脑电图，使相关神经组织受到损伤。强度分别为0.25T，0.34T和0.64T的脉冲磁场对大鼠进行全身照射，结果发现低频脉冲磁场对大鼠学习记忆的影响会随着磁场强度的不同而有所不同，其促进及抑制作用均可能存在“窗口”效应。目前磁刺激对突触可塑性研究的主要手段包括在活体动物上进行长期的磁刺激暴露实验和在急性分离的离体海马脑片进行磁刺激实验，再通过记录细胞或者组织的场电位来反映磁刺激对突触可塑性活动的影响情况，将所有数据进行对比分析，来进一步揭示三种低频低强度磁场对突触可塑性的调控影响的差异性。本发明为今后研究更深层次的低频低强度磁场对学习记忆能力的影响和临床磁刺激模式的选择提供一个参考和借鉴。
发明内容
本发明提供了三种低频低强度短时磁刺激模式对突触可塑性LTP调控效应的分析方法，目的是掌握不同模式磁刺激对突触可塑性调控规律的差异性，由于离体脑片具有靶向性好、调控剂量容易控制、且受到的干扰因素少等优势，因此本文采用的研究方法提高了磁刺激对学习与记忆影响的基础研究，进而揭示其作用机理并为其在临床上的应用提供必要的客观依据。
本发明的技术方案：
本发明使用实验室自制的在线磁暴露装置，脉冲和节律磁场通过Master-8刺激器产生，产生的信号连接功率放大器，最终输出的放大信号通过线圈产生满足实验要求的磁场信号。连续正弦磁场的频率和幅值可以通过信号发生器的前面板进行设置，相应的磁场强度在之前的研究中我们已得到所对应的电压值，最终输出的磁场强度使用特斯拉计校准，从而保证其准确性。之后应用编写好的磁刺激协议在急性分离的大鼠海马脑片Schaffer-CA1通路上测量fEPSP信号并分析对LTP的影响。在此基础上阐明了正弦磁场、脉冲磁场和节律磁场对突触可塑性的影响规律，通过本分析方法有助于了解低频低强度短时磁刺激对学习与记忆相关的作用机制，对临床上三种磁刺激方式的使用提供了一种有效的借鉴方法。
本发明提出的三种低频低强度短时磁刺激模式对突触可塑性LTP调控影响的分析方法，
具体步骤是：
第1步、在磁场产生上，磁场线圈固定在离体海马脑片下方2cm处，首先，通过Agilent83712信号源产生正弦信号，通过Master-8可编程刺激器产生脉冲和节律信号，经功率放大器PB717X放大后，产生正弦，脉冲和节律脉冲三种低频磁刺激模式；最后调节信号源和可编程刺激器的频率为15Hz，通过功率放大器调节磁场输出强度为2mT；正弦，脉冲和节律脉冲三种低频磁刺激都采用1分钟内短期磁刺激方式，磁刺激时间选择4种，分别为10s，20s，40s，60s，磁刺激后采用电生理系统记录突触可塑性LTP；
第2步、从连续正弦、连续脉冲和节律脉冲等三种不同的ELF-EMFs模式以及四个不同的磁场刺激时间(10s，20s，40s，60s)入手，记录低频低强度短时磁刺激对突触可塑性的影响；
第3步、当数据记录完成以后，使用LTP-Analysis软件对数据进行分析，并将数据导出为.dat格式文件。我们使用Origin 8.0将这些原始数据处理作图，并且进行数据的统计分析。所有数据用平均值±方差来表示，统计结果中的差异性表现为***P＜0.001，**P＜0.01，*P＜0.05，ns：没有显著性差异。
第4步、实验结果表明，经过磁场暴露后的组别相比于对照组，fEPSP的幅值均有所下降，表明连续正弦刺激组能够显著的抑制LTP的生成；经过脉冲磁场暴露后的实验组fEPSP幅值低于对照组，表现出对LTP的抑制作用，同时随着脉冲个数的增加，抑制作用更加明显；经过节律脉冲磁场暴露的实验组fEPSP均有所下降，LTP表现出抑制作用，且随脉冲个数的增加，该效果更为明显。对上述的三种模式的磁场进行数据的对比分析，与控制组相比，三种模式的磁刺激都会对LTP有抑制作用；随着磁刺激时间的增加，三种模式的磁场对fEPSP的抑制率均会随之增加，且连续的正弦磁场抑制率最为明显。其中在10s时，三者差异性较小，而在20s，40s和60s时，这种差异性会更加显著。
第5步、最后选取节律脉冲磁场的参数④，将其对大鼠脑片暴露结束后，等待不同的恢复时长，再进行高频刺激以及LTP的诱导，从而来探究磁场对LTP作用是永久还是可逆的。
本发明的优点和有益效果：
ELF-EMFs刺激是目前对记忆与认知等神经退行性一种有效治疗手段，但其作用机制尚不清楚，本发明提出了三种低频低强度短时磁刺激模式对突触可塑性LTP调控影响的分析方法，本发明的结果我们的实验为不同模式的低频低强度短时磁刺激对神经通路的研究提供了理论的基础，同时在今后的研究中我们也会将电生理方法与分子生物学、药学等方法结合起来，进一步的去揭示学习与记忆形成的相关机制，并且对临床上磁刺激治疗的磁刺激模式和参数选择等均有重要借鉴意义。
附图说明
图1三种不同模式的磁刺激模式的实验协议示意图。A.连续的正弦磁场刺激协议，磁场剂量为15Hz/2mT，刺激时间为10，20，40，60s；B.高频电刺激(HFS)诱导波形，来诱导产生LTP；C.连续的脉冲磁场刺激协议，信号的脉冲宽度都为200μs，剂量为15Hz/2mT，四种刺激协议如图中①②③④所示，脉冲个数分别为150，300，600和900个；D.节律(间断)脉冲磁场刺激协议，每个脉冲宽度为200μs，磁场剂量为15Hz/2mT，四种刺激协议如图中①②③④所示。
图2连续正弦，连续脉冲和节律脉冲模式磁刺激对突触可塑性影响的直方图，可以看到磁场对突触可塑性具有减弱的调制作用
图3三种不同模式磁场对突触可塑性的时间响应曲线
图4磁场对LTP作用的恢复时间间隔。A节律脉冲磁场的刺激方案，恢复时间为0-20分钟，基线记录，HFS高频电刺激以及LTP记录。B 1min的LTP的时间进程(黑色：对照组；红色：实验组)；C.5min节律脉冲磁场暴露后LTP的时间进程(黑色：对照组；红色：实验组)。C.10min节律脉冲磁场暴露后LTP的时间进程(黑色：对照组；红色：实验组)。E.20min节律脉冲磁场暴露后LTP的时间进程(黑色：对照组；红色：实验组)。结果表明fEPSP的响应取决于时间间隔，并且在20min时这种磁场作用可能会消失。
具体实施方式
实施例一
第1步、急性分离大鼠海马脑片
SD大鼠用10％浓度的水合氯醛腹腔注射进行麻醉(0.1ml/20g)，等老鼠完全麻醉后，快速断头取脑，此过程时间应控制在1-3分钟，把大脑经过修葺后移至4℃的切片液中，接着使用振动切片机将其切成400μm厚的切片，振动频率为8，速度为2，最后将这些切片放置于人工脑脊液中孵育1小时，等待下一步的使用。
第2步、LTP的记录方法
我们所使用的MEA由60个细胞外电极组成，每个电极之间的间距为200μm，且每个电极都可以作为刺激或者记录点。在孵育60min以后，选取一片脑片，将其移至MEA阵列上，把该阵列放置于倒置的显微镜上，并连续不断的向脑片中通入充氧的人工脑脊液，流速设置为每分钟2ml，温度为恒定的31℃，让脑片一直处于其中。然后使用将一种尼龙制的网格盖片放置在脑片上方，确保切片表面与电极之间具有一个良好的接触。初始刺激电流为50μA，接着可以通过阵列上其他所有剩余电极同时来记录CA1区辐射层的场兴奋性突触后电位(fEPSP)，这些记录的fEPSP通过刺激电极附近的电极进行进一步的分析，随后调节刺激电流的大小，使得fEPSP幅值达到最大响应的百分之三十到百分之四十。使用0.066Hz的频率来诱发基线突触信号，用fEPSP的幅值来计算对突触传递影响的大小，在诱导LTP产生之前，先记录基线20分钟，然后施加1秒100Hz的高频刺激来诱导LTP的产生。
第3步、三种不同模式磁场产生的设置过程
①正弦磁场：使用信号发生器，设置频率为15Hz，因为根据我们之前的计算，2mT的磁场需要线圈输出电压达到17.8V，而我们的功率放大器为2倍，因此这里信号发生器的幅值设置为8.9V。将信号发生器与功率放大器以及线圈进行连接，输出即可。
②脉冲磁场：首先我们设置150个脉冲，脉冲宽度为200μs，因为频率为15Hz，所以这
里的周期为66.7ms，编写程序如下：
TRAIN，1，ENTER
M，1，150，ENTER，0，ENTER
DURA，1，200，ENTER，6，ENTER
INTER，1，66.7，ENTER，3，ENTER
DELAY，1，20，ENTER，3，ENTER
这里的0，3和6分别代表s，ms和μs。将该程序输入进Master-8刺激器中，通过设置Master-8单通道1为TRAIN触发方式，直接通过按键1来进行触发，输出信号与功率放大器相连，调整电压幅值。按下前面板上的1，即可输出150个脉冲的磁场。同理，300，600和900脉冲只需将该程序中的150修改成相应的数据即可。
③节律脉冲磁场：节律脉冲有两种输出信号，单独使用一个通道无法输出，需要用到两个通道，并将其连接起来，一个用于触发，一个用于输出。首先我们设置第一组参数，每串10个脉冲，15串，脉冲宽度为200μs，串间隔为5s。
TRAIN，3，ENTER
M，3，15，ENTER，0，ENTER
DURA，3，200，ENTER，6，ENTER
INTER，3，5，ENTER，0，ENTER
DELAY，3，20，ENTER，3，ENTER
CONNECT，3，2，ENTER
TRAIN，2，ENTER
M，2，10，ENTER，0，ENTER
DURA，2，200，ENTER，6，ENTER
INTER，2，66.7，ENTER，0，ENTER
DELAY，2，20，ENTER，3，ENTER
通过设置Master-8通道2和3为节律输出方式，设置其在内部相连，将通道2的输出与通道3的输入进行相连接，最终通过按键3来进行触发。同理其它三种参数将对应的数据进行修改即可。
第4步、三种不同模式磁场产生不同的刺激协议
如图1所示，正弦磁场：连续正弦磁场对大鼠海马脑片的作用，实验开始记录20分钟基线，1秒HFS，最后记录60分钟的LTP的实验数据；脉冲磁场：接着使用Master-8可编程设备，进行连续脉冲磁场的编程，设置其脉冲个数分别为150，300，600和900个，脉冲宽度为200μs，目的是使其磁场作用时间保持一致。4种脉冲磁场的参数为：脉宽为200μs，周期为66.7ms，分别为150串(磁场时间10s)，300串(磁场时间20s)，600串(磁场时间40s)，900串(磁场时间60s)；实验开始记录20分钟基线，1秒HFS，最后记录60分钟的LTP的实验数据；节律脉冲磁场：接着采用Master-8编写四种不同参数的节律脉冲磁场，分别为①每串10个脉冲，连续15串，串间隔5s；②每串50个脉冲，6串，串间隔30s；③每串75个脉冲，8串，串间隔15s；④每串100个脉冲，9串，串间隔10s，脉冲宽度均为200μs。实验开始记录20分钟基线，1秒HFS，最后记录60分钟的LTP的实验数据；
第5步、三种不同模式磁场短时磁刺激对突触可塑性的实验结果分析
如图2所示的实验结果表明，三种模式的ELF-EMFs都会对LTP有抑制作用。而相比于连续脉冲磁场和节律脉冲磁场，连续的正弦磁场对突触可塑性的影响最为明显。我们利用单因素方差进行统计分析(Fsine-pulse＝371.255，P＜0.001；Fsine-rhythm＝202.433，P＜0.001；20s：Fsine-pulse＝910.655，P＜0.001，Fsine-rhythm＝511.226，P＜0.001；40s：Fsine-pulse＝1008.364，P＜0.001；Fsine-rhythm＝839.372，P＜0.001；60s：Fsine-pulse＝5003.694，P＜0.001；Fsine-rhythm＝2116.959，P＜0.001)，可以发现连续正弦磁场分别与连续脉冲磁场和节律脉冲磁场相比，均具有显著性差异。同时，我们对连续脉冲磁场和节律脉冲磁场进行对比分析，发现除在10s，两者无明显差异性。
第6步、三种不同模式磁场短时磁刺激的时间响应函数
图3为三种不同模式磁场短时磁刺激的时间响应函数，横轴表示施加磁场暴露的时间，纵轴表示突触可塑性诱导后的突触活动强度。我们可以看到相比于对照组，在突触可塑性诱导之前施加三种模式的磁场，都会伴随着时间的增加，这种抑制效果更为明显，在相同磁刺激时间下，连续正弦磁场对于突触活动的抑制性更强，其中在10s时，三者差异性较小，而在20s，40s和60s时，这种差异性会更加显著。通过结果可知，在实验中所采用的三种磁场，无论哪种模式的磁场，其对突触可塑性的影响效果都会随着磁场暴露时间的增加而增加，因此我们可以得到结论，大鼠海马CA1区的突触可塑性对于磁刺激具有时间依赖性。
第7步、节律脉冲磁场对LTP刺激的作用是可恢复的
我们设置了新的刺激协议，采用节律脉冲刺激参数4的磁场，即每串100个脉冲，共9串，串间隔为10s(磁场时间60s)，脉宽为200μs，磁场强度为2mT，频率为15Hz。在磁场暴露后，加入不同的恢复时间(1min，5min，10min和20min)，然后进行基线以及LTP记录，所有fEPSP的幅值均以平均值±标准差记录在图中。结果显示，与对照组相比，经过磁场暴露及不同时间恢复后的LTP有着明显的差异性(0min：F＝821.387，P＜0.001；5min：F＝814.221，P＜0.001；10min：F＝623.690，P＜0.001；20min：F＝22.533，P＞0.001)，表明LTP的响应与磁刺激和基线开始记录之间的间隔时间有着一定的联系。0min组与5min组有着明显的差异性(F＝119.159，P＜0.05)，表明随着时间间隔的增加，磁刺激对LTP抑制的效果逐渐降低。经过磁刺激60s后，20min组和对照组进行比较，发现没有显著性差异(F＝22.533，P＞0.05)，表明当恢复时间达到20min时，磁刺激对于突触可塑性的影响基本消失。综上所述，我们实验中所采用的15Hz/2mT的节律脉冲磁场对突触可塑性的作用效果不是永久的，而是可恢复性的。

Claims (3)

1.三种低频低强度短时磁刺激模式对突触可塑性LTP调控效应的非治疗目的分析方法，其特征是：
第1步、在磁场产生上，磁场线圈固定在离体海马脑片下方2cm处，首先，通过Agilent83712信号源产生正弦信号，通过Master-8可编程刺激器产生脉冲和节律信号，经功率放大器PB717X放大后，产生正弦，脉冲和节律脉冲三种低频磁刺激模式；最后调节信号源和可编程刺激器的频率为15Hz，通过功率放大器调节磁场输出强度为2mT；
第2步、正弦，脉冲和节律脉冲三种低频磁刺激都采用1分钟内短时磁刺激方式，磁刺激时间选择4种，分别为10s，20s，40s，60s，磁刺激后采用电生理系统记录突触可塑性LTP；其中，正弦磁场分别采用这4种磁刺激时间；4种脉冲磁刺激时间的刺激协议为：信号脉宽都为200μs，信号周期都为66.7ms，(1)脉冲个数为150串，磁刺激时间为10s，(2)脉冲个数为300串，磁刺激时间为20s，(3)脉冲个数为600串，磁刺激时间为40s，(4)脉冲个数为900串，磁刺激时间60s；4种节律脉冲磁刺激时间的刺激协议为：信号脉宽都为200μs，(1)每串10个脉冲，共15串，串间隔为5s，磁刺激时间为10s，(2)每串50个脉冲，共6串，串间隔为30s，磁刺激时间为20s，(3)每串75个脉冲，共8串，串间隔15s，磁刺激时间为40s，(4)每串100个脉冲，共9串，串间隔为10s，磁刺激时间60s；
第3步、三种模式的低频低强度短期磁刺激均会对突触可塑性LTP产生一定程度的抑制，其中，与控制组相比，连续正弦磁场的抑制效果最为显著，而连续脉冲磁场和节律磁场抑制效果相对较弱，除了在10s外，连续脉冲磁场和节律磁场无明显差异性；
第4步、在突触可塑性诱导之前施加三种模式的磁场，都会伴随着时间的增加，这种抑制效果更为明显，在相同磁刺激时间下，连续正弦磁场对于突触活动的抑制性更强，其中在10s时，三者差异性较小，而在20s，40s和60s时，这种差异性会更加显著；
第5步、节律脉冲刺激对突触可塑性的抑制效果是可逆的，经过磁刺激60s后，当恢复时间达到20min时，磁刺激对于突触可塑性的影响基本消失；
本次实验针对的样本为急性分离的SD大鼠海马区Schaffer-CA1通路。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，脉冲低频磁刺激模式信号的产生方式为，通过设置Master-8单通道1为TRAIN触发方式，直接通过按键1来进行触发。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，节律低频磁刺激模式信号的产生方式为，通过设置Master-8通道2和3为节律输出方式，设置其在内部相连，将通道2的输出与通道3的输入进行相连接，最终通过按键3来进行触发。
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