CN114854814A - 一种阿魏酸淀粉酯的生物合成方法 - Google Patents

一种阿魏酸淀粉酯的生物合成方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于改性淀粉技术领域，具体涉及一种阿魏酸淀粉酯的生物合成的方法，能够使微生物在不同发酵阶段执行不同的发酵任务。该方法为：首先制备挤压酶解淀粉液，再制备富含阿魏酸固体基质，将挤压酶解淀粉液和富含阿魏酸固体基质按重量比混合得到混合浆料，再分别接入黑曲霉混合浆料，同时加入占混合浆料重量1～3‰磁性纳米颗粒材料，30～35℃下180r/min发酵40～48h；发酵结束后浆渣分离，用磁铁吸出磁性纳米颗粒材料，干燥后即得到阿魏酸淀粉酯。本发明的技术方案能够解决阿魏酸淀粉酯制备工艺中存在废液难回收利用、污染环境、产品得率较低、原料浪费等问题，并具有微生物绿色合成、易分离、可重复利用、反应效率高等特点，符合绿色化学的理念。

Description

一种阿魏酸淀粉酯的生物合成方法
技术领域
本发明属于改性淀粉技术领域，具体涉及一种阿魏酸淀粉酯的生物合成方法。
背景技术
淀粉是一种可再生的天然多糖聚合物，在食品、医药、化工等行业应用广泛。但由于其分子内及分子间多羟基的相互作用，导致其受热时，分解温度低于熔融温度，成膜性较差，会引起老化回生、糊凝胶化和脱水缩合现象。而经改性后的淀粉不仅可避免上述现象的发生，还会改变淀粉透明度、黏度、凝胶质构、成膜性及稳定性，促进其在各行业的应用。
阿魏酸是植物中普遍存在的一种酚酸，具有清除自由基和抗血小板凝聚的功效。阿魏酸淀粉酯是一种新型的阿魏酸糖基衍生物，不仅提高了阿魏酸的抗氧化功效，还具有抗炎症、抗血栓、降低胆固醇等功效。此外，阿魏酸淀粉酯具有较强的抗α-淀粉酶水解能力，可以减少其在肠胃中被淀粉酶水解的机会，增加进入小肠和结肠的可能性。目前，阿魏酸淀粉酯制备方法大多以有机试剂作为溶剂并对阿魏酸进行酰化处理，存在反应过程复杂、反应时间长、副产物多以及原料利用率低等问题，而生物法合成阿魏酸淀粉酯相对于化学法来说更安全，可扩大其应用范围。
发明专利CN 112174824 A公开报道了一种新型阿魏酸酯衍生物及其制备方法和应用。该方法制得的阿魏酸酯衍生物具有比阿魏酸更强的生理活性和较低的毒性，纯度高，能够提高免疫细胞免疫效果。但由于4-二甲氨基吡啶、二环己基碳二亚胺和酸性溶液液的加入使该方法存在废液难回收利用、污染环境等问题。
发明专利CN 112280813 A公开报道了一种酶促合成阿魏酸淀粉酯的方法。该方法对淀粉进行挤压处理破坏其分子结构，以离子液体作为反应介质，在脂肪酶催化作用下，阿魏酸与淀粉酯化生成阿魏酸淀粉酯。但脂肪酶在离子液体下催化是可逆的，导致阿魏酸淀粉酯的得率较低，造成原料的浪费。
尽管目前存在很多关于阿魏酸和淀粉物理结合、化学结合或酶促结合的工艺方法，但利用微生物高效、绿色、环保的从头合成阿魏酸淀粉酯的生物工艺方法还鲜有报道。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种阿魏酸淀粉酯的生物合成的方法，以解决上述背景技术中存在的阿魏酸淀粉酯制备工艺中存在废液难回收利用、污染环境、产品得率较低及原料浪费等问题。
本发明通过如下技术方案实现：
一种阿魏酸淀粉酯的生物合成方法，具体包括如下步骤：
(1)挤压酶解淀粉液的制备：将待挤压的淀粉置于双螺杆挤压机中，调节双螺杆挤压机参数并挤压淀粉，得到的挤压产物在40～60℃下鼓风干燥18～24h后粉碎，过100目筛，加入挤压淀粉粉末重量3～5倍的乙酸钠缓冲液，沸水浴加热10～15min，冷却至室温后分别加入挤压淀粉粉末重量1～3‰和0.5～2‰的普鲁兰酶和α-淀粉酶并混匀，50～60℃下酶解6～8h，得挤压酶解淀粉液；所述的乙酸钠缓冲液摩尔溶度为0.1mol/L，pH为5.5，普鲁兰酶酶活为10万U/g，α-淀粉酶酶活为20万U/g；
(2)富含阿魏酸固体基质的制备：取麸皮淀粉，115℃蒸煮15～20min，待原料冷却至35℃时，按原料重量接入芽孢杆菌104～105个/g原料和乳酸菌103～105个/g原料，固态发酵，20～24h松料一次，发酵44～48h，湿度保持为80～90％，发酵温度为32～35℃，得到富含阿魏酸固体基质；
(3)将步骤(1)的挤压酶解淀粉液和步骤(2)的富含阿魏酸固体基质按重量比5:1～10:1混合得到混合浆料，接入黑曲霉103～105个/g混合浆料，同时加入占混合浆料重量1～3‰磁性纳米颗粒材料，置于30～35℃下180r/min发酵40～48h；
(4)发酵结束后浆渣分离，用磁铁吸出磁性纳米颗粒材料，干燥后即得到阿魏酸淀粉酯。
优选地，步骤(1)所述的淀粉为玉米淀粉、藜麦淀粉或马铃薯淀粉中的一种。
优选地，步骤(1)所述的双螺杆挤压机参数具体为：双螺杆挤压机的螺杆直径为20～25mm，长径比30:1，模孔直径4～5mm，双螺杆挤压机各段套筒温度分别为Ⅰ区40～60℃、Ⅱ区50～70℃、Ⅲ区70～90℃、Ⅳ区90～120℃，Ⅴ区50～70℃，调节物料含水量为20～30％，螺杆转速为150～200r/min。
优选地，步骤(2)所述的芽孢杆菌为解淀粉芽胞杆菌CICC 24519，具有多糖水解酶系丰富和高产阿魏酸酯酶的特性；所述的乳酸菌为植物乳杆菌植物亚种CICC 21792，具有高产阿魏酸酯酶和纤维素酶的特性。
优选地，步骤(2)所述的富含阿魏酸固体基质中阿魏酸含量可达1.5～3.0mg/g。
优选地，步骤(3)所述的黑曲霉为黑曲霉CICC 40064，具有高产脂肪酶的特性。
优选地，步骤(3)所述的磁性纳米颗粒为FeNi@SiO2磁性纳米复合粒子，粒径为80～100nm，不仅可以避免黑曲霉生长繁殖过程出现的团聚现象，还可以加速阿魏酸和挤压淀粉酶解液的酯化合成进程。
与现有技术相比，本发明的优点如下：
本发明的技术核心是通过工艺控制方法来实现微生物生物合成阿魏酸淀粉酯，即如何让微生物在不同发酵阶段执行不同的发酵任务。挤压-酶解联用技术不仅可以增加淀粉中抗性淀粉的比例，还会改变淀粉的质构等相关特性，增加与阿魏酸酯化反应的活性位点数量，并降低酯化所需能量。芽孢杆菌分泌的多糖酶系丰富，尤其是果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶和阿魏酸酯酶，可用于分解麸皮淀粉中果胶、木质素、纤维素和半纤维素，促进阿魏酸以游离态的释放。而乳酸菌的加入可以促进芽孢杆菌的生长繁殖，表现为互利共生。乳酸菌也具有多糖水解酶系丰富和高产阿魏酸酯酶的特性，可增加麸皮淀粉中游离态阿魏酸的含量，为后续合成阿魏酸淀粉酯提供更多的底物。脂肪酶是催化阿魏酸与挤压淀粉酶解液中淀粉酯化反应的关键酶，而黑曲霉具有高产脂肪酶的能力，可利用麸皮淀粉和挤压淀粉酶解液中的营养物质快速生长繁殖，其生长繁殖过程中产生的脂肪酶用于生物合成阿魏酸淀粉酯。
此外，磁性纳米颗粒材料可均匀吸附于黑曲霉表面，导致其带正电荷，从而避免黑曲霉在发酵过程中出现的团聚现象。而挤压淀粉酶解液中淀粉通过带负电荷，从而带有磁性纳米颗粒材料的黑曲霉可以通过电荷吸附结合更多的淀粉，在黑曲霉自身产脂肪酶作用下酯化生成更多的阿魏酸淀粉酯。阿魏酸淀粉酯由于不带电荷，溶于发酵液中。发酵结束后，用磁铁吸出带有黑曲霉的磁性纳米颗粒，可减少灭菌过程，而高温灭菌会导致阿魏酸淀粉酯分解。
本发明具有微生物绿色合成、易分离可重复利用、反应效率高等特点，符合绿色化学的理念。
具体实施方式
下面对本发明技术方案的实施例进行详细的描述，以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。
需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。
本发明所述的所有菌种均可通过商业渠道购买得到。
实施例1
一种阿魏酸淀粉酯的生物合成方法，具体包括如下步骤：
(1)将待挤压的玉米淀粉置于双螺杆挤压机中，调节双螺杆挤压机参数为：双螺杆挤压机的螺杆直径为20mm，长径比30:1，模孔直径4mm，双螺杆挤压机各段套筒温度分别为Ⅰ区40℃、Ⅱ区50℃、Ⅲ区70℃、Ⅳ区90℃，Ⅴ区50℃，调节物料含水量为20％，螺杆转速为150r/min，挤压玉米淀粉，得到的挤压产物在40℃下鼓风干燥24h后粉碎，过100目筛，加入挤压淀粉粉末重量4倍的0.1mol/L、pH 5.5乙酸钠缓冲液，沸水浴加热10min，冷却至室温后分别加入挤压淀粉粉末重量1‰的酶活为10万U/g的普鲁兰酶和0.5‰的酶活为20万U/g的α-淀粉酶并混匀，50℃下酶解8h，得挤压酶解淀粉液。
(2)取麸皮淀粉，115℃蒸煮15min，待原料冷却至35℃时，按原料重量接入解淀粉芽胞杆菌CICC 24519 1×104个/g原料和植物乳杆菌植物亚种CICC 21792 1×103个/g原料，固态发酵20h松料一次，发酵44h，湿度保持为80％，发酵温度为32℃，得富含阿魏酸固体基质。
(3)将步骤(1)的挤压酶解淀粉液和步骤(2)的富含阿魏酸固体基质按重量比5：1混合得到混合浆料，接入黑曲霉CICC 40064 1×103个/g混合浆料，同时加入占混合浆料重量1‰FeNi@SiO2磁性纳米复合粒子，粒径为80nm，置于30℃下180r/min发酵40h。
(4)发酵结束后浆渣分离，用磁铁吸出FeNi@SiO2磁性纳米复合粒子，干燥后即得到阿魏酸淀粉酯。
实施例2
一种阿魏酸淀粉酯的生物合成方法，具体包括如下步骤：
(1)将待挤压的藜麦淀粉置于双螺杆挤压机中，调节双螺杆挤压机参数为：双螺杆挤压机的螺杆直径为25mm，长径比30:1，模孔直径5mm，双螺杆挤压机各段套筒温度分别为Ⅰ区50℃、Ⅱ区60℃、Ⅲ区80℃、Ⅳ区100℃，Ⅴ区60℃，调节物料含水量为25％，螺杆转速为180r/min，挤压藜麦淀粉，得到的挤压产物在50℃下鼓风干燥20h后粉碎，过100目筛，加入挤压淀粉粉末重量3倍的0.1mol/L、pH 5.5乙酸钠缓冲液，沸水浴加热10min，冷却后分别加入挤压淀粉粉末重量2‰的酶活为10万U/g的普鲁兰酶和1‰的酶活为20万U/g的α-淀粉酶并混匀，55℃下酶解7h，得挤压酶解淀粉液。
(2)取麸皮淀粉，115℃蒸煮20min，待原料冷却至35℃时，按原料重量接入解淀粉芽胞杆菌CICC 24519 5×104个/g原料和植物乳杆菌植物亚种CICC 21792 5×103个/g原料，固态发酵20h松料一次，发酵46h，湿度保持为85％，发酵温度为34℃，得富含阿魏酸固体基质。
(3)将步骤(1)的挤压酶解淀粉液和步骤(2)的富含阿魏酸固体基质按重量比8：1混合得到混合浆料，接入黑曲霉CICC 40064 2×104个/g混合浆料，同时加入占混合浆料重量2‰FeNi@SiO2磁性纳米复合粒子，粒径为90nm，置于32℃下180r/min发酵44h。
(4)发酵结束后浆渣分离，用磁铁吸出FeNi@SiO2磁性纳米复合粒子，干燥后即得到阿魏酸淀粉酯。
实施例3
一种阿魏酸淀粉酯的生物合成方法，具体包括如下步骤：
(1)将待挤压的马铃薯淀粉置于双螺杆挤压机中，调节双螺杆挤压机参数为：双螺杆挤压机的螺杆直径为25mm，长径比30:1，模孔直径5mm，双螺杆挤压机各段套筒温度分别为Ⅰ区60℃、Ⅱ区70℃、Ⅲ区90℃、Ⅳ区120℃，Ⅴ区70℃，调节物料含水量为30％，螺杆转速为200r/min，挤压马铃薯淀粉，得到的挤压产物在60℃下鼓风干燥18h后粉碎，过100目筛，加入挤压淀粉粉末重量5倍的0.1mol/L、pH 5.5乙酸钠缓冲液，沸水浴加热10min，冷却至室温后分别加入挤压淀粉粉末重量3‰的酶活为10万U/g的普鲁兰酶和2‰的酶活为20万U/g的α-淀粉酶并混匀，60℃下酶解6h，得挤压酶解淀粉液。
(2)取麸皮淀粉，115℃蒸煮20min，待原料冷却至35℃时，按原料重量接入解淀粉芽胞杆菌CICC 24519 1×105个/g原料和植物乳杆菌植物亚种CICC 21792 1×105个/g原料，固态发酵20h松料一次，发酵48h，湿度保持为90％，发酵温度为35℃，得富含阿魏酸固体基质。
(3)将步骤(1)的挤压酶解淀粉液和步骤(2)的富含阿魏酸固体基质按重量比10：1混合得到混合浆料，接入黑曲霉CICC 40064 1×105个/g混合浆料，同时加入占混合浆料重量3‰FeNi@SiO2磁性纳米复合粒子，粒径为100nm，置于35℃下200r/min发酵48h。
(4)发酵结束后浆渣分离，用磁铁吸出FeNi@SiO2磁性纳米复合粒子，干燥后即得到阿魏酸淀粉酯。
对比实施例1
(1)取麸皮淀粉，115℃蒸煮15min，待原料冷却至35℃时，按原料重量接入解淀粉芽胞杆菌CICC 24519 1×104个/g原料和植物乳杆菌植物亚种CICC21792 1×103个/g原料，固态发酵20h松料一次，发酵44h，湿度保持为80％，发酵温度为32℃，得富含阿魏酸固体基质。
(2)将玉米淀粉和步骤(1)的富含阿魏酸固体基质按重量比5:1混合得到混合浆料，接入黑曲霉CICC 40064 1×103个/g混合浆料，同时加入占混合浆料重量1‰FeNi@SiO2磁性纳米复合粒子，粒径为80nm，置于30℃下180r/min发酵40h。
(3)发酵结束后浆渣分离，用磁铁吸出FeNi@SiO2磁性纳米复合粒子，干燥后即得到阿魏酸淀粉酯。
对比实施例2
(1)将待挤压的藜麦淀粉置于双螺杆挤压机中，调节双螺杆挤压机参数为：双螺杆挤压机的螺杆直径为25mm，长径比30:1，模孔直径5mm，双螺杆挤压机各段套筒温度分别为Ⅰ区50℃、Ⅱ区60℃、Ⅲ区80℃、Ⅳ区100℃，Ⅴ区60℃，调节物料含水量为25％，螺杆转速为180r/min，挤压藜麦淀粉，得到的挤压产物在50℃下鼓风干燥20h后粉碎，过100目筛，加入挤压淀粉粉末重量3倍的0.1mol/L、pH 5.5乙酸钠缓冲液，沸水浴加热10min，冷却至室温后分别加入挤压淀粉粉末重量2‰的酶活为10万U/g的普鲁兰酶和1‰的酶活为20万U/g的α-淀粉酶并混匀，55℃下酶解7h，得挤压酶解淀粉液。
(2)取麸皮淀粉，115℃蒸煮20min，冷却至室温后得到麸皮淀粉基质。
(3)将步骤(1)的挤压酶解淀粉液和步骤(2)的麸皮淀粉基质按重量比8:1混合得到混合浆料，接入黑曲霉CICC 40064 2×104个/g混合浆料，同时加入占混合浆料重量2‰FeNi@SiO2磁性纳米复合粒子，粒径为90nm，置于32℃下180r/min发酵44h。
(4)发酵结束后浆渣分离，用磁铁吸出FeNi@SiO2磁性纳米复合粒子，干燥后即得到阿魏酸淀粉酯。
对比实施例3
(1)将待挤压的马铃薯淀粉置于双螺杆挤压机中，调节双螺杆挤压机参数为：双螺杆挤压机的螺杆直径为25mm，长径比30:1，模孔直径5mm，双螺杆挤压机各段套筒温度分别为Ⅰ区60℃、Ⅱ区70℃、Ⅲ区90℃、Ⅳ区120℃，Ⅴ区70℃，调节物料含水量为30％，螺杆转速为200r/min，挤压马铃薯淀粉，得到的挤压产物在60℃下鼓风干燥18h后粉碎，过100目筛，加入挤压淀粉粉末重量5倍的0.1mol/L、pH 5.5乙酸钠缓冲液，沸水浴加热10min，冷却至室温后分别加入挤压淀粉粉末重量3‰的酶活为10万U/g的普鲁兰酶和2‰的酶活为20万U/g的α-淀粉酶并混匀，60℃下酶解6h，得挤压酶解淀粉液。
(2)取麸皮淀粉，115℃蒸煮20min，待原料冷却至35℃时，按原料重量接入解淀粉芽胞杆菌CICC 24519 1×105个/g原料和植物乳杆菌植物亚种CICC217921×105个/g原料，固态发酵20h松料一次，发酵48h，湿度保持为90％，发酵温度为35℃，得富含阿魏酸固体基质。
(3)将步骤(1)的挤压酶解淀粉液和步骤(2)的富含阿魏酸固体基质按重量比10：1混合得到混合浆料，接入黑曲霉CICC 40064 1×105个/g混合浆料，置于35℃下200r/min发酵48h。
(4)发酵结束后浆渣分离，灭菌，干燥后即得到阿魏酸淀粉酯。
对以上各实施例和对比实施例制备的阿魏酸淀粉酯进行取代度、糊化特性和DPPH自由基清除能力的评价，其品质分析结果见表1。
表1各实施例和对比实施例制备的阿魏酸淀粉酯取代度、焓值、黏度和DPPH自由基清除能力的比较表
Figure BDA0003690372910000081
由表1可见，本发明所有实施例制备的阿魏酸淀粉酯的取代度和DPPH自由基清除能力均高于对比实施例，而焓值和黏度均低于对比实施例。因此，利用本发明微生物绿色合成的阿魏酸淀粉酯产品得率高，污染环境小，易分离可重复利用，且产品具有比原料更强的抗氧化活性。该制备工艺符合绿色化学的发展理念。
以上结合详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (7)

1.一种阿魏酸淀粉酯的生物合成方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
(1)挤压酶解淀粉液的制备：将待挤压的淀粉置于双螺杆挤压机中，调节双螺杆挤压机参数并挤压淀粉，得到的挤压产物在40～60℃下鼓风干燥18～24h后粉碎，过100目筛，加入挤压淀粉粉末重量3～5倍的乙酸钠缓冲液，沸水浴加热10～15min，冷却至室温后分别加入挤压淀粉粉末重量1～3‰和0.5～2‰的普鲁兰酶和α-淀粉酶并混匀，50～60℃下酶解6～8h，得挤压酶解淀粉液；所述的乙酸钠缓冲液摩尔溶度为0.1mol/L，pH为5.5，普鲁兰酶酶活为10万U/g，α-淀粉酶酶活为20万U/g；
(2)富含阿魏酸固体基质的制备：取麸皮淀粉，115℃蒸煮15～20min，待原料冷却至35℃时，按原料重量接入芽孢杆菌104～105个/g原料和乳酸菌103～105个/g原料，固态发酵，20～24h松料一次，发酵44～48h，湿度保持为80～90％，发酵温度为32～35℃，得到富含阿魏酸固体基质；
(3)将步骤(1)的挤压酶解淀粉液和步骤(2)的富含阿魏酸固体基质按重量比5：1～10：1混合得到混合浆料，接入黑曲霉103～105个/g混合浆料，同时加入占混合浆料重量1～3‰磁性纳米颗粒材料，置于30～35℃下180r/min发酵40～48h；
(4)发酵结束后浆渣分离，用磁铁吸出磁性纳米颗粒材料，干燥后即得到阿魏酸淀粉酯。
2.如权利要求1所述的一种阿魏酸淀粉酯的生物合成方法，其特征在于，步骤(1)所述的淀粉为玉米淀粉、藜麦淀粉或马铃薯淀粉中的一种。
3.如权利要求1所述的一种阿魏酸淀粉酯的生物合成方法，其特征在于，步骤(1)所述的双螺杆挤压机参数具体为：双螺杆挤压机的螺杆直径为20～25mm，长径比30:1，模孔直径4～5mm，双螺杆挤压机各段套筒温度分别为Ⅰ区40～60℃、Ⅱ区50～70℃、Ⅲ区70～90℃、Ⅳ区90～120℃，Ⅴ区50～70℃，调节物料含水量为20～30％，螺杆转速为150～200r/min。
4.如权利要求1所述的一种阿魏酸淀粉酯的生物合成方法，其特征在于，步骤(2)所述的芽孢杆菌为解淀粉芽胞杆菌CICC 24519；所述的乳酸菌为植物乳杆菌植物亚种CICC21792。
5.如权利要求1所述的一种阿魏酸淀粉酯的生物合成方法，其特征在于，步骤(2)所述的富含阿魏酸固体基质中阿魏酸含量可达1.5～3.0mg/g。
6.如权利要求1所述的一种阿魏酸淀粉酯的生物合成方法，其特征在于，步骤(3)所述的黑曲霉为黑曲霉CICC 40064。
7.如权利要求1所述的一种阿魏酸淀粉酯的生物合成方法，其特征在于，步骤(3)所述的磁性纳米颗粒为FeNi@SiO2磁性纳米复合粒子，粒径为80～100nm。
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