CN114854597A - 一种雨生红球藻培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微藻培养技术领域，具体提供了一种用于培养雨生红球藻的培养基，所述培养基包括0‑8mg/L硅酸钠和1‑2mg/L的吲哚乙酸，且硅酸钠的添加量不为0。本发明提供的培养基相对于传统培养基，对雨生红球藻的生长和虾青素积累均有较好的促进作用，且原料易得，具有较好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于微藻培养技术领域，具体涉及一种高效培养雨生红球藻的培养基。
背景技术
雨生红球藻（Haematococcus pluviali）是一种主要分布于淡水的单细胞绿藻，是当前天然虾青素的重要来源，其虾青素含量相较于其他来源，如甲壳纲动物提取物、红发夫酵母、土壤农杆菌及小球藻，具有巨大优势。
现有技术中对于雨生红球藻的培养条件优化主要集中在：培养温度、光照条件，pH和培养基等等。
在对于培养基的优化上，可以分为两个方向，一是增加雨生红球藻的细胞数量，二是增加虾青素的积累量，这两个方向与雨生红球藻的生长周期具有较大的关系。雨生红球藻生长周期可分为游动细胞阶段（生长阶段）和不动细胞阶段（诱导阶段），两个阶段根据不同的环境进行适应性变化，在适宜生长环境下为绿色游动细胞，在不利环境中则积累虾青素，转变为红色厚壁孢子，即不动细胞阶段。因此在实际生产中，多针对这两个不同阶段进行条件调整以获取最高虾青素产量。在游动细胞阶段，通过提高藻细胞量，使得能够用于产生虾青素的细胞基数变大，再在逆境诱导条件下，使雨生红球藻细胞转化为不动细胞积累虾青素。
中国授权专利CN201310609340.X公开了一种雨生红球藻培养基，包括多种成分，可用于光合自养培养雨生红球藻，能够显著促进雨生红球藻的生长，可使雨生红球藻迅速进入指数生长期，在短时间内达到较高的生长密度并保持其种群的优势地位，从而有助于在野外扩大培养过程中最大程度降低外来杂菌、杂藻和原生动物的污染几率，缩短生长周期，提高培养成功率。但其仅仅针对的是游动细胞阶段，对于虾青素积累的不同细胞阶段的影响并不明确，因此能否真正提高虾青素产量并不确定。
中国专利申请CN202110744683.1公开了一种雨生红球藻培养基及其制备方法和雨生红球藻培养方法，该雨生红球藻培养基包括基础培养基、江蓠属海藻提取物和赖氨酸芽孢杆菌。通过在雨生红球藻培养过程中添加江蓠属海藻提取物和赖氨酸芽孢杆菌，可显著提升雨生红球藻生物量和虾青素产量。其中江蓠属海藻提取物用于提高游动细胞阶段的藻细胞数量，赖氨酸芽孢杆菌减少逆境条件引起的藻细胞损耗。但其实质还是将提高虾青素含量的方法停留在游动细胞阶段，本质上为保证细胞数量而提高虾青素产量，而非提高藻细胞本身的性能。
此外，现有技术中还有向培养基中添加激素或者抗生素以提高雨生红球藻虾青素产量的方法，但仍有进一步优化的空间。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种培养基，通过优化培养基成分配比，使雨生红球藻的虾青素产能提高。
本发明中，“绿色细胞阶段”“细胞生长阶段”、“生长阶段”、“游动细胞阶段”在一定程度上具有相同的含义，指雨生红球藻处于绿色且基本不积累虾青素的阶段。
本发明中，“红色细胞阶段”“逆境诱导阶段”“诱导阶段”“不动细胞阶段”在一定程度上具有相同的含义，指雨生红球藻经过逆境诱导后开始积累虾青素的阶段。
本发明中，“接种量”是指藻种接种于培养基的体积比。如，接种量1：10表示接种时，每100mL培养基接种10mL藻液。
本发明中，“培养基替换”是指更换整体培养基，一般方法包括将藻液低速离心，弃去培养基后直接更换；也可以是其他达到同样目的的相似手段。
一方面，本发明提供了一种培养基。
所述的培养基用于培养雨生红球藻，包括以下成分：
1-2mg/L的吲哚乙酸；
硅酸钠0-8mg/L，且硅酸钠的添加量不为0；
所述的培养基至少在雨生红球藻诱导阶段使用。
或者，所述的培养基可以在生长阶段和诱导阶段使用。
当所述的培养基仅在诱导阶段使用时，藻种为稳定期雨生红球藻，接种方式为培养基替换。
当所述的培养基在生长阶段和诱导阶段使用时，藻种为指数期雨生红球藻，接种量为1：10。
优选地，所述的培养基为BG11培养基。
优选地，所述的培养基成分如下：
| 成分 | 浓度（mg/L） |
| 硅酸钠 | 0-8，且不为0 |
| 吲哚乙酸 | 1-2 |
| 硝酸钠 | 1100-1300 |
| 七水硫酸镁 | 80-100 |
| 三水磷酸氢二钾 | 30-50 |
| 一水柠檬酸 | 1-10 |
| 氯化钙 | 30-40 |
| 柠檬酸铁胺 | 1-10 |
| 乙二胺四乙酸二钠 | 1-10 |
| 硼酸 | 1-10 |
| 硫酸锰 | 1-10 |
| 七水硫酸锌 | 0.5-1 |
| 二水钼酸钠 | 0.5-1 |
| 五水硫酸铜 | 0.01-0.05 |
| 氯化钴 | 0.01-0.05 |
| 碳酸钠 | 25-30 |
进一步优选地，所述的培养基成分如下：
| 成分 | 浓度（mg/L） |
| 硅酸钠 | 4-5 |
| 吲哚乙酸 | 1.5 |
| 硝酸钠 | 1300 |
| 七水硫酸镁 | 100 |
| 三水磷酸氢二钾 | 40 |
| 一水柠檬酸 | 10 |
| 氯化钙 | 30 |
| 柠檬酸铁胺 | 5 |
| 乙二胺四乙酸二钠 | 5 |
| 硼酸 | 5 |
| 硫酸锰 | 5 |
| 七水硫酸锌 | 0.5 |
| 二水钼酸钠 | 0.5 |
| 五水硫酸铜 | 0.05 |
| 氯化钴 | 0.05 |
| 碳酸钠 | 25 |
当所述的培养基仅在诱导阶段使用时，初始pH为7-8，优选为7.8。
当所述的培养基在生长阶段和诱导阶段使用时，初始pH为7-8，优选为7.1。
另一方面，本发明提供了一种雨生红球藻的培养方法。
所述的培养方法包括将雨生红球藻接种于前述的培养基中。
当所述的培养基仅用于诱导阶段时，所述的培养方法包括以下步骤：常规方法培养至稳定期的雨生红球藻，前述培养基替换，逆境诱导，诱导阶段培养；
优选地，所述的诱导阶段培养条件为：28℃ 5000lux。
当所述的培养基用于生长阶段和诱导阶段时，所述的培养方法包括以下步骤：指数期雨生红球藻，接种量为1：10于前述培养基，生长阶段培养，逆境诱导，诱导阶段培养。
所述的生长阶段培养条件为：25℃ 2000lux。
所述的诱导阶段培养条件为：条件28℃ 5000lux。
本发明的有益效果：
本发明提供的培养基原料易得，用于雨生红球藻培养时，不仅能够促进藻细胞的生长，同时可以促进虾青素的积累，对于实际投产具有重要意义。
附图说明
图1为实施例1藻密度变化结果。
图2为实施例1干重变化结果。
图3为实施例1虾青素含量变化结果。
图4为实施例2藻密度变化结果。
图5为实施例2干重变化结果。
图6为实施例2虾青素含量变化结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1一种雨生红球藻培养基及培养方法
本实施例生长培养基为BG11培养基，成分如下：
| 成分 | 浓度（mg/L） |
| 硝酸钠 | 1300 |
| 七水硫酸镁 | 100 |
| 三水磷酸氢二钾 | 40 |
| 一水柠檬酸 | 10 |
| 氯化钙 | 30 |
| 柠檬酸铁胺 | 5 |
| 乙二胺四乙酸二钠 | 5 |
| 硼酸 | 5 |
| 硫酸锰 | 5 |
| 七水硫酸锌 | 0.5 |
| 二水钼酸钠 | 0.5 |
| 五水硫酸铜 | 0.05 |
| 氯化钴 | 0.05 |
| 碳酸钠 | 25 |
生长培养基的pH为7.1。
本实施例诱导培养基包括以下组分：
| 成分 | 浓度（mg/L） |
| 硅酸钠 | 5 |
| 吲哚乙酸 | 1.5 |
| 硝酸钠 | 1300 |
| 七水硫酸镁 | 100 |
| 三水磷酸氢二钾 | 40 |
| 一水柠檬酸 | 10 |
| 氯化钙 | 30 |
| 柠檬酸铁胺 | 5 |
| 乙二胺四乙酸二钠 | 5 |
| 硼酸 | 5 |
| 硫酸锰 | 5 |
| 七水硫酸锌 | 0.5 |
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| 五水硫酸铜 | 0.05 |
| 氯化钴 | 0.05 |
| 碳酸钠 | 25 |
诱导培养基的pH为7.8。
本实施例的雨生红球藻藻种为Haematococcus pluvialis FACHB-877，购自中国科学院淡水藻种库，培养基为BG11。
生长期培养条件：25℃ 2000lux；诱导期培养条件28℃ 5000lux。
（1）生长期
将对数期藻种按1：10比例接种于BG11培养基，记为D1。培养10天。
（2）诱导期
对生长期培养后的藻液进行培养基更换，具体操作为将藻液低速离心获得藻体，并补充原培养基等量的诱导培养基，调整至诱导期培养条件后继续培养。
分别于D12、D14、D16取藻液进行检测，具体检测藻密度、干重和虾青素含量。
并参照以上实验设置对照组，对照组生长期和诱导期均采用BG11培养基。
实验结果见图1-3，其中图1为藻密度变化结果，图2为干重变化结果，图3为虾青素含量变化结果。
实施例2一种雨生红球藻培养基及培养方法
本实施例生长培养基和诱导培养基相同，包括以下组分：
| 成分 | 浓度（mg/L） |
| 硅酸钠 | 4 |
| 吲哚乙酸 | 1.8 |
| 硝酸钠 | 1300 |
| 七水硫酸镁 | 100 |
| 三水磷酸氢二钾 | 40 |
| 一水柠檬酸 | 10 |
| 氯化钙 | 30 |
| 柠檬酸铁胺 | 5 |
| 乙二胺四乙酸二钠 | 5 |
| 硼酸 | 5 |
| 硫酸锰 | 5 |
| 七水硫酸锌 | 0.5 |
| 二水钼酸钠 | 0.5 |
| 五水硫酸铜 | 0.05 |
| 氯化钴 | 0.05 |
| 碳酸钠 | 25 |
培养基pH为7.1。
本实施例的雨生红球藻藻种为Haematococcus pluvialis FACHB-877，购自中国科学院淡水藻种库，培养基为BG11。
生长期培养条件：25℃ 2000lux；诱导期培养条件28℃ 5000lux。
（1）生长期
将对数期藻种按1：10比例接种于培养基，记为D1。培养10天（D10）检测藻密度并记录。
（2）诱导期
调整培养条件。
分别于D12、D14、D16取藻液进行检测，具体检测指标为藻密度、干重、虾青素含量。
并参照以上实验设置对照组，对照组采用BG11培养基。
实验结果见图4-6，其中图4为藻密度变化结果，图5为干重变化结果，图6为虾青素含量变化结果。
结果表明，本发明的培养基在应用于雨生红球藻生长期培养和诱导期培养时，具有促进虾青素积累的作用。
与实施例1相比，实施例2的虾青素积累含量增多，且生长期培养结束后藻密度更高，诱导期结束后藻干重增加，表明本申请的培养基对雨生红球藻还有一定的促进生长作用。
对比例1-3
参照实施例1的实验组设置对比例1-3，差别在于诱导培养基组分不同，具体如下。
培养第16天检测藻密度、干重和虾青素含量，与对照组的相对值结果如下。
对比例4-6
将对比例1-3的培养基参照实施例2的实验组进行实验作为对比例4-6，培养第16天检测藻密度、干重和虾青素含量，与对照组的相对值结果如下。
对比例7-8
分别参照实施例1-2的实验组设置实施例7-8，差别在于不添加吲哚乙酸，培养第16天检测藻密度、干重和虾青素含量，与对照组的相对值结果如下。
Claims (15)
1.一种培养基，其特征在于，所述的培养基用于培养雨生红球藻，包括0-8mg/L 硅酸钠和和1-2mg/L的吲哚乙酸，且硅酸钠的添加量不为0。
2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，至少在诱导阶段使用。
3.根据权利要求2所述的培养基，其特征在于，在生长阶段和诱导阶段使用。
4.根据权利要求2所述的培养基，其特征在于，藻种为稳定期雨生红球藻，接种方式为培养基替换。
5.根据权利要求3所述的培养基，其特征在于，藻种为指数期雨生红球藻，接种量为1：10。
6.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述的培养基为BG11培养基。
7.根据权利要求6所述的培养基，其特征在于，包括以下成分：硅酸钠0-8mg/L且不为0，吲哚乙酸1-2mg/L，硝酸钠1100-1300mg/L，七水硫酸镁80-100mg/L，三水磷酸氢二钾30-50mg/L，一水柠檬酸1-10mg/L，氯化钙30-40mg/L，柠檬酸铁胺1-10mg/L，乙二胺四乙酸二钠1-10mg/L，硼酸1-10mg/L，硫酸锰1-10mg/L，七水硫酸锌0.5-1mg/L，二水钼酸钠0.5-1mg/L，五水硫酸铜0.01-0.05mg/L，氯化钴0.01-0.05mg/L，碳酸钠25-30mg/L。
8.一种雨生红球藻的培养方法，其特征在于，包括将雨生红球藻接种于权利要求1-7任一项所述的培养基中。
9.根据权利要求8所述的培养方法，其特征在于，藻种为稳定期雨生红球藻，接种方式为培养基替换。
10.根据权利要求8所述的培养方法，其特征在于，藻种为指数期雨生红球藻，接种量为1：10。
11.根据权利要求9所述的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：常规方法培养至稳定期的雨生红球藻，用所述的培养基替换，诱导阶段培养。
12.根据权利要求10所述的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：指数期雨生红球藻，接种量为1：10接种于所述的培养基，生长阶段培养，诱导阶段培养。
13.根据权利要求11所述的培养方法，其特征在于，诱导阶段培养条件为28℃5000lux。
14.根据权利要求12所述的培养方法，其特征在于，生长阶段培养条件25℃ 2000lux；诱导阶段培养条件28℃ 5000lux。
15.一种虾青素的制备方法，其特征在于，包括使用权利要求1-7任一项所述的培养基培养雨生红球藻获得制备原料。
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| DAVID CHRISTIAN ET AL.: "Enhanced astaxanthin accumulation in Haematococcus pluvialis using high carbon dioxide concentration and light illumination", 《BIORESOURCE TECHNOLOGY》 * |
| 李艳国: "雨生红球藻ZL-1 生长和虾青素积累条件优化", 《生态科学》 * |
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