CN114853859A

CN114853859A - 茶树水通道蛋白基因CsAQP95及其应用

Info

Publication number: CN114853859A
Application number: CN202210475300.XA
Authority: CN
Inventors: 杨天元; 赵鑫鹏; 范晓娟; 张照亮; 王俊杰; 廉晓红; 罗小草
Original assignee: Anhui Agricultural University AHAU
Current assignee: Anhui Agricultural University AHAU
Priority date: 2022-04-29
Filing date: 2022-04-29
Publication date: 2022-08-05
Anticipated expiration: 2042-04-29
Also published as: CN114853859B; NL2033935B1

Abstract

本发明公开了茶树水通道蛋白基因CsAQP95及其应用，茶树水通道蛋白基因CsAQP95的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示；茶树水通道蛋白基因CsAQP95编码的蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。茶树水通道蛋白基因CsAQP95的表达促进植物的生长及其生物量的积累，CsAQP95在茶树的顶芽，嫩叶和根部高表达，将该基因构建的pTCK303‑CsAQP95质粒转入野生型WT和尿素吸收缺陷型拟南芥突变体atdur3中，显著增加了拟南芥的生物量和产量。该基因的克隆和应用有助于推动以增加茶叶产量为目标的遗传改良进程，促进茶产业的绿色、健康和可持续发展，本发明具有很重要的应用价值。

Description

茶树水通道蛋白基因CsAQP95及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及茶树水通道蛋白基因CsAQP95及其应用。

背景技术

茶树(Camellia sinensis(L.)O.Kuntze)是重要的叶用经济作物，长期采摘新梢会带走大量的氮素。在茶园生产中，通常以尿素作为茶树的主要的氮素来源，然而，过量使用尿素会造成土壤酸化、土壤板结和水体富营养化等生态环境问题。研究表明水通道蛋白(AQP)在植物高效吸收利用尿素中发挥重要作用。因此，研究茶树根中的水通道蛋白基因的生理功能有助于揭示茶树吸收尿素的分子机制，有助于提高茶树的氮素吸收利用效率，为培育氮高效利用的茶树新品种提供理论依据和功能基因资源。

发明内容

本发明的目的在于提供茶树水通道蛋白基因CsAQP95及其应用，其丰富了茶树中水通道蛋白的研究，为茶树提高生物量上提供了新思路，为实现茶树增加生物量的积累提供了理论和实际参考基础。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

在本发明的第一方面，提出了一种茶树水通道蛋白基因CsAQP95，所述茶树水通道蛋白基因CsAQP95的核苷酸序列，如序列表SEQ ID NO.1所示。

进一步的，本发明还提出了茶树水通道蛋白基因CsAQP95编码的蛋白序列，所述蛋白序列如序列表SEQ ID NO.2所示。

在本发明另一方面，提出了一种茶树表达载体pTCK303-CsAQP95，其特征在于：所述表达载体通过将SEQ ID NO：1所示的片段酶切至载体pTCK303获得。

在本发明另一方面，提出了茶树水通道蛋白基因CsAQP95用于提高植物生物量。

在本发明另一方面，提出了茶树水通道蛋白基因CsAQP95用于提高植物生物量的方法，包括以下步骤：

(1)配置转化液：把pTCK303-CsAQP95载体冻融法转化到EHA105农杆菌当中，并通过常规PCR方法鉴定阳性克隆，制备转化液；

(2)将植物花序浸泡在转化液当中，黑暗放置24h后正常培养，收获种子，将收获的种子至于离心管中，灭菌后用枪头吸取种子播于MS固体培养基上，在4℃黑暗条件下春化72h，转移至培养室，温度23℃；光周期16h光/8h暗条件下培养两周后，选取叶片绿色、根系发育正常的抗性植株移植到栽培基质中继续培养，移植前栽培基质充分吸水，移植后覆盖保鲜膜，3d去除保鲜膜进行培养，获得的T2代种子生物量提高。

进一步的，所述步骤(1)中，转化液具体制备方法如下，挑取含有目的基因的阳性菌落，在含有相应抗生素的LB液体培养基中，28℃培养约24h；吸取培养过的菌液加入到新鲜的含有相应抗生素的LB液体培养基，继续振荡培养至OD₆₀₀为1.0，离心收集菌体，用质量百分数为5％的蔗糖溶液重悬菌体，终浓度OD₆₀₀为0.8，加入质量百分数为0.1％有机硅表面活性剂摇匀，即得所述转化液。

进一步的，所述步骤(2)中，灭菌方法如下，先用体积百分数为75％的乙醇灭菌1min，再用质量百分数为10％NaClO灭菌5min，然后用无菌水冲洗5-6遍。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明中，首次克隆并验证了茶树水通道蛋白基因CsAQP95基因，该基因在能够显著提高植物的株高和生物量。本发明还提供了含有CsAQP95基因的重组质粒、转基因工程菌(即将载体pTCK303-CsAQP95转化到EHA105农杆菌之后获得的工程菌)。本发明丰富了茶树中水通道蛋白基因生理功能的研究，为培育氮养分高效利用茶树新品种提供基因资源和理论基础。

附图说明

图1为本发明实施例中茶树水通道蛋白基因CsAQP95不同组织表达模式图；

图2为本发明实施例中茶树水通道蛋白基因CsAQP95对不同形态氮素处理的响应情况图；

图3为本发明实施例中茶树水通道蛋白CsAQP95的亚细胞定位图；

图4中，A为野生型、CsAQP95超表达、CsAQP95回补突变体材料表型图；B为野生型、CsAQP95超表达、CsAQP95回补突变体材料的单株种子图；C为为野生型、CsAQP95超表达、CsAQP95回补突变体材料的株高图；D为野生型、CsAQP95超表达、CsAQP95回补突变体材料的生物量图；E为野生型、CsAQP95超表达、CsAQP95回补突变体材料单株种子重量图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

1、CsAQP95基因的克隆与序列结构分析

茶树CsAQP95基因的克隆与序列结构分析，具体如下：

茶树国家级良种‘舒茶早’种植于安徽农业大学农萃园，取幼嫩根用于RNA的提取。总RNA的抽提采用RNA prep Pure Plant Kit(Tiangen,Beijing,China)试剂盒按照说明操作，用分光度计检测其RNA含量和质量。

反转录生成第一链：取1μg RNA作模板，根据PrimeScript II 1st Strand cDNASynthesis Kit(Takara Biotech,China)试剂盒说明配置，加入Oligo dT Primer(50μM)0.6μl，Random 6mers(50μM)0.4μl，dNTP Mixture(10mM each)1μl，RNase Free ddH2O补足至10μl，65℃变性5min，立即在冰上放置。然后在上述反应液中加入5×PrimerScriptbuffer 4μl，RNase Inhibitor(40U)0.5μl，PrimerScript RTase(200U)1μldH₂O补足20μl，42℃温育45min，95℃5min灭活反转录酶。经过优化后，取适量的反转录产物用于随后的PCR。以cDNA第一链作为RT-PCR模板，常规方法做PCR，扩增CsAQP95基因。其中上游引物：(5’-GGGGTACC ATGCCGATGATCTACGTGG-3’)，下游引物：(5’-GGACTAGTTTAGTAATCAGCGGTGGGC-3’)。20μl PCR反应体系为：10×Ex taq buffer 2.5μl，dNTP2.0μl，上、下游引物各1μl，Ex taq 0.2μl，模板1μl，ddH₂015.8μl。

反应程序如下为：98℃10sec，98℃10sec，57℃30sec，72℃2min，72℃10min，35个循环。PCR产物CsAQP95基因经纯化回收后，连接到pGEM-T Easy Vector载体(Promega，Shanghai，China)上得到pGEM-T Easy::CsAQP95质粒，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，送通用公司测序，得到的CsAQP95基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示，具体如下：

ATGCCGATGATCTACGTGGATCGGATTACTCGCCGGATCGCGGTCGGAAACCGGGAAGAGGCGACCCACCCCGCCGCTCTCAAGGCGGCGCTGGCGGAGTTCATCTCAACCCTAATTTTCGTCTTCGCGGGCCAGGGATCCGGGATGGCCTTCAATAAGATCACTCATAGCAGCTTCACTACCCCCTCCGGCCTCATCGCCGCCGCTATTGCCCACGCATTCGGACTTTTTGTCGCCGTCGCCATCAGCGCTAACATCTCCGGCGGCCACGTCAATCCCGCTGTCACGTTCGGCGCGTGCCTCGGCGGCCACATCACCATCCTACGTGGCCTACTCTACTGGATTGCCCAGTTGCTTGGCTCCGTCGTCGCGTGCTTACTCCTCAAGTTTGTCACCAATGGCATGACTACAACCGCTTTCGGTTTATCATCAGGAGTAAATGTATGGAACGGTTTCGTAATGGAGATCGTATTGACCTTTGGGCTGGTCTATACCGTATACGCTACCGCACTGGATGGTAGGAAGGGCGAGTTGGGAATTATAGCACCACTCGCGATCGGTCTCATAGTGGGGGCCAATATTTTGGTGGGTGGGGCCTTTGACGGAGCATCCATGAACCCGGCTGTTTCGTTCGGCCCGGCCGTCGTGAGTTGGACTTGGGATAACCACTGGATCTATTGGGCCGGGCCTCTTATTGGTAGTGCATTGGCTGCGATTATCTATGAGTTGTTCTTCATGAACCATACCCACGAGCAATTGCCCACCGCTGATTACTAA

CsAQP95基因编码的蛋白序列，如序列表SEQ ID NO.2所示具体如下：

MPMIYVDRITRRIAVGNREEATHPAALKAALAEFISTLIFVFAGQGSGMAFNKITHSSFTTPSGLIAAAIAHAFGLFVAVAISANISGGHVNPAVTFGACLGGHITILRGLLYWIAQLLGSVVACLLLKFVTNGMTTTAFGLSSGVNVWNGFVMEIVLTFGLVYTVYATALDGRKGELGIIAPLAIGLIVGANILVGGAFDGASMNPAVSFGPAVVSWTWDNHWIYWAGPLIGSALAAIIYELFFMNHTHEQLPTADY

2、CsAQP95基因的表达分析

(1)茶树不同组织CsAQP95基因表达模式

茶树国家级良种舒茶早品种种植于安徽省庐阳区合肥安徽农业大学农萃园，这17个组织器官包括芽(Bud)、1叶(1^st Leaf)、1叶脉(1^st Main Vein)、2叶(2^nd Leaf)、2叶脉(2^ndMain Vein)、3叶(3^rdLeaf)、3叶脉(3^rd Main Vein)、4叶(4^th Leaf)、4叶脉(4^thMain Vein)、5叶(5^th Leaf)、5叶脉(5^thMain Vein)、维管束(Vascular Bundle)、1叶和2叶之间的嫩茎(1-2Stem)、2叶和3叶之间的嫩茎(2-3Stem2)、3叶和4叶之间的嫩茎(3-4Stem)、4叶和5叶之间的嫩茎(4-5Stem)和根(Root)。同时这些样品用于总RNA的提取以及cDNA第一链合成。反转录产物(cDNA第一条链)稀释30倍作为模板，使用HieffTM qPCR

Green Master Mix(No Rox)(Yeasen，Shanghai，China)，配制20μl反应体系：2.0μl稀释30倍的逆转录产物，上下游引物各0.4μl(10pmol/μl)，10μl HieffTM qPCR

Green Master Mix，7.2μlddH20，每个反应配3个重复。然后在Bio-rad CFX-96仪器上以程序：①95℃5min②95℃10sec，60℃30sec，72℃30sec运行39个循环③从65℃到95℃，以0.1℃/sec绘制熔解曲线。上游引物：(5’-TGGCGGAGTTCATCTCAACC-3’)，下游引物：(5’-AGTAGGCCACGTAGGATGGT-3’)，以茶树CsGADPH基因为内参，上游引物：(5’-TTGGCATCGTTGAGGGTCT-3’)，下游引物：(5’-CAGTGGGAACACGGAAAGC-3’)通过仪器自带分析软件，计算出CsAQP95在茶树不同组织中的相对表达水平。

(2)茶树的CsAQP95基因在不同形态氮素处理下的表达情况

两年生茶树扦插苗(舒茶早)取自中国安徽省舒城县德昌育木基地。采用大小一致的扦插苗在安徽农业大学茶树生物学与资源利用国家重点实验室的温室进行水培。温室设置为温度25℃，光照时间16h，黑暗时间8h，相对湿度设置为70-75％。首先，将茶树扦插苗在小西茂毅营养液中生长1个半月，获得足够的发育良好的茶树新生根系。不同形态氮素处理：基础营养液缺N处理一周后，将茶树扦插苗分别在缺N、含1.43mM Urea-N、1.43mM Ca(NO₃)₂-N、1.43mM(NH₄)₂SO₄-N的溶液中生长10d、20d，收集根组织样本，并立即在液氮中速冻，存储于-80℃的超低温冰箱用于分析CsAQP95基因的表达量。RNA的提取和定量PCR方法同上。

图1和图2分别是CsAQP95在茶树不同组织中和不同形态氮素处理下的表达模式。‘舒茶早’茶树14个不同组织器官定量PCR结果显示：CsAQP95表达模式幼嫩组织和根部表达丰度较高。不同形态氮素水培结果表明，CsAQP受尿素处理20d后显著诱导上调表达。推测CsAQP95可能参与茶树根吸收和转运尿素的功能。

3、茶树CsAQP95的亚细胞定位

把pCAMBIA1305.1-CsAQP95载体电击法转化到EHA105农杆菌当中，并通过常规PCR方法鉴定阳性克隆。挑取菌落PCR验证正确的单克隆，接种于5ml液体LB培养基(含50μg/mlrif和100μg/ml Spec)，培养至OD₆₀₀＝0.8-1.2。取1ml过夜培养的农杆菌，接入100ml液体LB培养基含(50μg/ml rif和100μg/ml Spec)，28℃200r/min过夜培养。离心收集菌体，用10mMMgCl₂和10mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸调节pH为5.6的重悬液重悬菌体至OD₆₀₀＝0.4。在菌液中加入100μM的乙酰丁香酮(As)，28℃孵育2h，注射前按1：1的比例与EHA105混合菌液。用一次性1ml注射器去掉针头吸取菌液，从烟草叶片下表皮注射，使菌液渗透到整个叶片组织中。注射后的烟草暗处理8-12h，正常温室培养2-3天后，使用激光共聚焦显微镜观察GFP荧光记录并拍照。

图3是CsAQP95在烟草叶片中的亚细胞定位图。如图3所示，其中，GFP：绿色荧光蛋白；AtPIP2A::mCherry：质膜maker基因；Bright Field：pCAMBIA1305.1-CsAQP95的明场图片；Merged：pCAMBIA1305.1-CsAQP95融合图片。由图3可知：通过与pCAMBIA1305.1-CsAQP95(GFP绿色荧光信号)与AtPIP2A::mCherry(红色荧光信号的质膜maker)的两种荧光信号完全重合，而空载体在核和质膜均有信号且核定位信号没有和质膜maker重叠，表明茶树CsAQP95亚细胞定位于细胞质膜。

4、CsAQP95基因在拟南芥体内功能验证

(1)pTCK303-CsAQP95质粒转化农杆菌

前面测序正确的pTCK303-CsAQP95质粒，取1μl质粒通过电击法转化EHA105，送通用公司测序验证。

(2)拟南芥遗传转化

取适量的野生型拟南芥种子加去离子水，置于4度冰箱春化，春化处理72h之后播种。播种完覆盖保鲜膜，置于合适条件(湿度60％；温度23℃；光周期16h光/8h暗)下等待发芽。种子出芽之后，选取大小一致的苗进行移栽，正常培养。把pTCK303-CsAQP95载体冻融法转化到EHA105农杆菌当中，并通过常规PCR方法鉴定阳性克隆。挑取含有目的基因的阳性菌落，在5mL含有相应抗生素的LB液体培养基中，28℃200r/min培养约24h；吸取培养过的菌液2ml，加入到100mL新鲜的含有相应抗生素的LB液体培养基，继续振荡培养至OD₆₀₀约为1.0，离心收集菌体，用质量百分数为5％的蔗糖溶液重悬菌体，终浓度OD₆₀₀约为0.8，加入质量百分数为0.1％silwet L-77摇匀。拟南芥种植约一个月，植株开始陆续开花，挑选生长健壮的植株为待转化植株，转化前不断去除顶端花序，以使植株产生更多的花蕾,转化前一天需将待转化植株充分浇水。

将准备好的转化液装在容器内，轻轻把拟南芥花序浸泡在转化液当中约30sec，然后黑暗放置24h，然后正常培养，收获种子。将收获的拟南芥种子至于离心管中，先用1ml75％的乙醇灭菌1min,再用10％的NaClO灭菌5min，然后用无菌水冲洗5-6遍，用枪头吸取种子，播于MS固体培养基上。4℃黑暗条件下春化72h，转移至培养室，温度23℃；光周期16h光/8h暗条件下培养。约两周后，选取叶片绿色、根系发育正常的抗性植株移植到栽培基质中继续培养。移植前栽培基质充分吸水，移植后覆盖保鲜膜，约3d去除，以后管理同上，收获T2代种子用于实验。

提取拟南芥苗期DNA和RNA，利用基因特异引物进行PCR检测目的基因表达。将转基因植株在-6℃培养2h后取出培养皿，4℃黑暗培养12h后转入正常培养室培养，4d后观察幼苗存活情况。

图4是野生型和CsAQP95转基因拟南芥的生长表型。如图4所示，与野生型相比，CsAQP超表达株系(CsAQP95-OE)植物中和回补拟南芥突变体株系(Ubi:CsAQP95/atdur3)的株高、生物量和种子重量均显著提高，表明CsAQP95表达能显著提高拟南芥植株的生物量和产量，为利用分子辅助育种提高茶树氮素吸收利用效率和提高新梢重量提供理论基础和功能基因资源。

本发明仅提供了南芥的实施例，其他植物亦适用于本发明的方法。

以上内容仅仅是对本发明结构所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离本发明的结构或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 安徽农业大学

<120> 茶树水通道蛋白基因CsAQP95及其应用

<130> NO

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 777

<212> DNA

<213> 茶树(Camellia sinensis L. O. Kuntze)

<400> 1

atgccgatga tctacgtgga tcggattact cgccggatcg cggtcggaaa ccgggaagag 60

gcgacccacc ccgccgctct caaggcggcg ctggcggagt tcatctcaac cctaattttc 120

gtcttcgcgg gccagggatc cgggatggcc ttcaataaga tcactcatag cagcttcact 180

accccctccg gcctcatcgc cgccgctatt gcccacgcat tcggactttt tgtcgccgtc 240

gccatcagcg ctaacatctc cggcggccac gtcaatcccg ctgtcacgtt cggcgcgtgc 300

ctcggcggcc acatcaccat cctacgtggc ctactctact ggattgccca gttgcttggc 360

tccgtcgtcg cgtgcttact cctcaagttt gtcaccaatg gcatgactac aaccgctttc 420

ggtttatcat caggagtaaa tgtatggaac ggtttcgtaa tggagatcgt attgaccttt 480

gggctggtct ataccgtata cgctaccgca ctggatggta ggaagggcga gttgggaatt 540

atagcaccac tcgcgatcgg tctcatagtg ggggccaata ttttggtggg tggggccttt 600

gacggagcat ccatgaaccc ggctgtttcg ttcggcccgg ccgtcgtgag ttggacttgg 660

gataaccact ggatctattg ggccgggcct cttattggta gtgcattggc tgcgattatc 720

tatgagttgt tcttcatgaa ccatacccac gagcaattgc ccaccgctga ttactaa 777

<210> 2

<211> 258

<212> PRT

<213> 茶树(Camellia sinensis L. O. Kuntze)

<400> 2

Met Pro Met Ile Tyr Val Asp Arg Ile Thr Arg Arg Ile Ala Val Gly

1 5 10 15

Asn Arg Glu Glu Ala Thr His Pro Ala Ala Leu Lys Ala Ala Leu Ala

20 25 30

Glu Phe Ile Ser Thr Leu Ile Phe Val Phe Ala Gly Gln Gly Ser Gly

35 40 45

Met Ala Phe Asn Lys Ile Thr His Ser Ser Phe Thr Thr Pro Ser Gly

50 55 60

Leu Ile Ala Ala Ala Ile Ala His Ala Phe Gly Leu Phe Val Ala Val

65 70 75 80

Ala Ile Ser Ala Asn Ile Ser Gly Gly His Val Asn Pro Ala Val Thr

85 90 95

Phe Gly Ala Cys Leu Gly Gly His Ile Thr Ile Leu Arg Gly Leu Leu

100 105 110

Tyr Trp Ile Ala Gln Leu Leu Gly Ser Val Val Ala Cys Leu Leu Leu

115 120 125

Lys Phe Val Thr Asn Gly Met Thr Thr Thr Ala Phe Gly Leu Ser Ser

130 135 140

Gly Val Asn Val Trp Asn Gly Phe Val Met Glu Ile Val Leu Thr Phe

145 150 155 160

Gly Leu Val Tyr Thr Val Tyr Ala Thr Ala Leu Asp Gly Arg Lys Gly

165 170 175

Glu Leu Gly Ile Ile Ala Pro Leu Ala Ile Gly Leu Ile Val Gly Ala

180 185 190

Asn Ile Leu Val Gly Gly Ala Phe Asp Gly Ala Ser Met Asn Pro Ala

195 200 205

Val Ser Phe Gly Pro Ala Val Val Ser Trp Thr Trp Asp Asn His Trp

210 215 220

Ile Tyr Trp Ala Gly Pro Leu Ile Gly Ser Ala Leu Ala Ala Ile Ile

225 230 235 240

Tyr Glu Leu Phe Phe Met Asn His Thr His Glu Gln Leu Pro Thr Ala

245 250 255

Asp Tyr

Claims

1.一种茶树水通道蛋白基因CsAQP95，其特征在于：所述茶树水通道蛋白基因CsAQP95的核苷酸序列，如序列表SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的一种茶树水通道蛋白基因CsAQP95，其特征在于：所述茶树水通道蛋白基因CsAQP95编码的蛋白序列，如序列表SEQ ID NO.2所示。

3.一种茶树表达载体pTCK303-CsAQP95，其特征在于：所述表达载体通过将SEQ ID NO：1所示的片段酶切至载体pTCK303获得。

4.茶树水通道蛋白基因CsAQP95用于提高植物生物量。

5.茶树水通道蛋白基因CsAQP95用于提高植物生物量的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(2)将植物花序浸泡在转化液当中，黑暗放置24h后正常培养，收获种子，将收获的种子至于离心管中，灭菌后用枪头吸取种子播于MS固体培养基上，在4℃黑暗条件下春化72h，转移至培养室，温度23℃；光周期16h光照/8h暗条件下培养两周后，选取叶片绿色、根系发育正常的抗性植株移植到栽培基质中继续培养，移植前栽培基质充分吸水，移植后覆盖保鲜膜，3d去除保鲜膜进行培养，获得的T2代种子生物量提高。

6.根据权利要求5所述的茶树水通道蛋白基因CsAQP95用于提高植物生物量的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，转化液具体制备方法如下，挑取含有目的基因的阳性菌落，在含有相应抗生素的LB液体培养基中，28℃培养约24h；吸取培养过的菌液加入到新鲜的含有相应抗生素的LB液体培养基，继续振荡培养至OD₆₀₀为1.0，离心收集菌体，用质量百分数为5％的蔗糖溶液重悬菌体，终浓度OD₆₀₀为0.8，加入质量百分数为0.1％有机硅表面活性剂摇匀，即得所述转化液。

7.根据权利要求5所述的茶树水通道蛋白基因CsAQP95用于提高植物生物量的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，灭菌方法如下，先用体积百分数为75％的乙醇灭菌1min，再用10wt％NaClO灭菌5min，然后用无菌水冲洗5-6遍。