CN114853855B - 一种具有促降血糖激素glp-1分泌作用的富铬酵母活性肽 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有促降血糖激素GLP‑1分泌作用的活性肽，该活性肽来源于富铬酵母，氨基酸序列为PSIVGRPR(脯氨酸‑丝氨酸‑异亮氨酸‑缬氨酸‑甘氨酸‑精氨酸‑脯氨酸‑精氨酸)。本发明公开的富铬酵母来源活性肽不仅结构新颖，而且经细胞和动物实验验证，可以显著促进肠内分泌L‑细胞分泌降血糖激素GLP‑1，因而具有调节血糖的作用。

Description

一种具有促降血糖激素GLP-1分泌作用的富铬酵母活性肽

技术领域

本发明属于酵母活性肽技术领域，具体涉及一种具有促降血糖激素GLP-1分泌作用的富铬酵母活性肽。

技术背景

胰高血糖素样肽-1(GLP-1，glucagon-like peptide-1)是一种天然具有降血糖作用的内分泌激素，主要由肠内分泌细胞L-细胞所分泌。GLP-1的生理功能主要包括促进胰岛β-细胞分泌胰岛素、抑制胰岛α-细胞表达胰高血糖素、降低餐后血糖水平，并且可通过延迟胃排空、增加饱腹感等方式强化降血糖效应。由于GLP-1的降血糖作用具有血糖依赖性，不会使血糖水平低于正常值，无低血糖风险，因此，GLP-1在糖尿病防治中具有重要作用，围绕提升和稳定体内GLP-1水平是当前降血糖新药的研发热点。

活性肽是两个或两个以上氨基酸以肽键相连、具有生物活性的化合物，具有丰富的生理调节作用，包括天然存在的活性肽、蛋白质降解的活性肽和人工合成的活性肽。酵母作为一种高营养价值食品，含有丰富的蛋白质，富铬酵母是酵母在含铬培养基中经培养所获得的培养物，降血糖功效显著，以富铬酵母蛋白为原料筛选具有促进降血糖激素GLP-1分泌作用的活性肽，不仅对富铬酵母的深度加工开发而且对新颖结构的降血糖活性肽发现、满足人们对于天然来源的降血糖功能因子的需求都具有重大意义。

发明内容

本发明公开了一种具有促降血糖激素GLP-1分泌作用且结构新颖的活性肽，该活性肽来源于富铬酵母，氨基酸序列为PSIVGRPR(脯氨酸-丝氨酸-异亮氨酸-缬氨酸-甘氨酸-精氨酸-脯氨酸-精氨酸)，经细胞和动物实验验证，该富铬酵母来源活性肽可以显著促进肠内分泌L-细胞分泌降血糖激素GLP-1，因而具有调节血糖的作用。

一种具有促降血糖激素GLP-1分泌作用的活性肽的筛选方法如下：

1、按料液比50：1(g:L)将富铬酵母粉中加入浓度为1mol/L的氢氧化钠溶液中，在温度25℃条件下搅拌提取2h，离心取上清液，上清液用浓度为5mol/L的盐酸溶液调节pH到3.0，静置，离心取沉淀，冷冻干燥，得富铬酵母蛋白；

2、将富铬酵母蛋白加入pH2.0、胃蛋白酶活力2000U/mL的胃液模拟液中，在37℃条件下搅拌酶解2h后，用浓度为1mol/L的NaOH溶液调节pH至6.8使胃蛋白酶失活，接着加入胰蛋白酶至活力为100U/mL，在37℃条件下继续搅拌酶解2h后，加热至95℃保持5min，使胰蛋白酶失活，离心取上清，上清液经截留分子量为3000Da的超滤膜过滤，取滤过液，冷冻干燥，得富铬酵母蛋白酶解物；

3、通过LC-MS结构分析、目标肽人工合成及目标肽促进肠内分泌L-细胞分泌GLP-1活性评价，从富铬酵母蛋白酶解物中筛选出促GLP-1分泌活性明确、结构新颖稳定的活性肽PSIVGRPR。

本发明的有益技术效果体现在：

本发明公开的具有促降血糖激素GLP-1分泌作用的富铬酵母活性肽，氨基酸序列明确，结构新颖，促进肠内分泌L-细胞分泌GLP-1活性显著，不仅在调节血糖多肽类药物的研发和应用方面有巨大的前景，而且为富铬酵母活性肽调节血糖作用的构效关系研究以及富铬酵母降血糖产品开发奠定了可靠的基础。

附图说明

图1富铬酵母蛋白促GLP-1分泌试验结果图；

图2不同分子量富铬酵母蛋白酶解物促GLP-1分泌试验结果图：

图3低分子量富铬酵母蛋白酶解物质谱总离子流图；

图4目标活性肽P-Ⅱ的质谱图及结构式图；

图5人工合成的活性肽P-Ⅱ的RP-HPLC图和质谱图；

图6人工合成的活性肽P-Ⅱ促GLP-1分泌的细胞试验结果图；

图7PMB处理对人工合成的活性肽P-Ⅱ促GLP-1分泌的影响试验结果图；

图8人工合成的活性肽P-Ⅱ促GLP-1分泌的动物试验结果图。

具体实施方式

下面结合具体的实施例，对本发明做进一步说明。本发明的特点和优点将随着描述而更清楚，但示例性的实施例仅仅用来说明本发明，并不对本发明的范围构成任何限制。

实施例1

按料液比50：1(g:L)将富铬酵母粉中加入浓度为1mol/L的氢氧化钠溶液中，在温度25℃条件下搅拌提取2h，离心取上清液，上清液用浓度为5mol/L的盐酸溶液调节pH到3.0，静置，离心取沉淀，冷冻干燥，得富铬酵母蛋白。将富铬酵母蛋白溶解在0.1mol/L的氢氧化钠溶液中，用D-Hanks溶液稀释至浓度分别为400、600、800μg/mL，过0.45μm滤膜备用。

将Matrigel胶铺在96孔板上，每孔50μL，在细胞培养箱中孵育1h后，吸出孔内多余的胶，高糖培养基洗板两次，静置30min至板孔晾干。将处于对数生长期的肠内分泌L-细胞系NCI-H716细胞用完全培养基(加入10％血清的高糖培养基)调整细胞密度为1×10⁶个/mL，每孔加入100μL细胞悬液，置于细胞培养箱中培养48h后，分别加入浓度为0、400、600、800μg/mL的富铬酵母蛋白溶液，继续培养2h后，收集上清液，加入可以抑制GLP-1分解的苯甲基磺酰氟至终浓度为50μg/mL，测定GLP-1含量。

测定结果表明(图1)，不同浓度的酵母蛋白作用于NCH-716细胞时，细胞上清并未检测到明显的GLP-1含量上升(P<0.05)，MTT法检测细胞活性也未见细胞有明显的损伤(P<0.05)，表明富铬酵母蛋白不能促进NCH-716细胞分泌GLP-1。

实施例2

按料液比50：1(g:L)将富铬酵母粉中加入浓度为1mol/L的氢氧化钠溶液中，在温度25℃条件下搅拌提取2h，离心取上清液，上清液用浓度为5mol/L的盐酸溶液调节pH到3.0，静置，离心取沉淀，冷冻干燥，得富铬酵母蛋白；将富铬酵母蛋白加入pH2.0、胃蛋白酶活力2000U/mL的胃液模拟液中，在37℃条件下搅拌酶解2h后，用浓度为1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至6.8使胃蛋白酶失活，接着加入胰蛋白酶至活力为100U/mL，在37℃条件下继续搅拌酶解2h后，加热至95℃保持5min，使胰蛋白酶失活，离心取上清，上清液经截留分子量为3000Da的超滤膜过滤，分别取分子量小于3000Da的滤过液和分子量大于3000Da的截留液，冷冻干燥，得不同分子量富铬酵母蛋白酶解物。将不同分子量富铬酵母蛋白酶解物分别配置浓度为100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000μg/mL的溶液，过0.45μm滤膜备用。采用实施例1中的方法评价不同分子量富铬酵母蛋白酶解物促进NCI-H716细胞分泌GLP-1的活性。

测定结果表明(图2)，与分子量>3000Da的酶解物相比，分子量<3000Da的酶解物具有更显著的促NCI-H716细胞分泌GLP-1的活性，其活性大小与浓度呈剂量依赖式变化，最佳作用浓度为400μg/mL，GLP-1最大分泌量为15.727±0.485pM。因此，活性肽宜从分子量<3000Da的酶解物中筛选。

实施例3

LC-MS在负离子模式下对分子量<3000Da的酶解物进行检测，得到总离子流图(图3)，总离子流图基线稳定，说明仪器数据采集稳定性很好。采用de novo从头测序法，使用搜索软件PEAKS(PEAKS Studio 10.6build 20201221)联合“Uniprot-酵母”数据库分析，共搜索到6295个肽段，检测到酵母源蛋白11种，检测到符合酵母蛋白序列的肽共有33条，其中肽段“FELSGIPPAPR”重复出现4次、“YFNDSQR”重复出现4次、“GFPGGAPPAPEAEGPTVE”重复出现2次、“ELSGIPPAPR”重复出现4次、“FVYSLDYA”重复出现2次，除去重复出现的肽段，检测出不同的酵母肽段共22条。多肽序列的质谱分析结果如表1所示。

表1多肽序列的质谱分析结果

肽段的疏水性越高，后续合成难度越大，由于要对筛选出的肽进行人工合成，需要将疏水性大于0.5的肽段淘汰掉。对经软件分析不重复的22条肽使用“Innovagen”在线软件进行疏水性分析，肽段的疏水性分析结果如表2所示，其中15个肽疏水性小于0.5，进一步在“BIOPEP”数据库中未检索到这15个肽的序列，表明这15个肽段的结构是新颖的。使用“PeptideRanker”在线网站根据肽中氨基酸的序列来预测这些肽的生物学活性，其值越接近1则表明具有生物活性的可能越大，生物活性预测结果如表3所示，其中生物活性大于0.5的肽有3条，分别命名为：P-Ⅰ、P-Ⅱ、P-Ⅲ。对筛选出的3条肽使用“ToxinPred”进行毒性检测，结果如表4所示，均无毒，使用“Expasy”在线软件对筛选出的3条肽稳定性进行分析，一般认为稳定性指数小于40的肽是稳定的，由于只有P-Ⅱ(PSIVGRPR)的稳定性在40以下，因此，选取P-Ⅱ进行人工合成。图4为目标肽段P-Ⅱ的质谱图和结构式。

表2肽段的疏水性分析

表3 PeptideRanker在线网站活性预测

表4 ToxinPred和Expasy在线网站毒性和稳定性预测

实施例4

委托南京肽谷生物科技有限公司人工合成序列为“PSIVGRPR”的P-Ⅱ肽段，使用反相高效液相色谱和质谱对人工合成的肽段进行结构鉴定，结果表明(图5)，人工合成肽段与筛选出的目标肽段P-Ⅱ结构相同。

采用实施例1中的活性评价方法验证人工合成P-Ⅱ肽段促进NCI-H716细胞分泌GLP-1的活性。结果表明(图6)，与空白组相比，浓度为400、500μg/mL的人工合成P-Ⅱ肽段均不会损伤细胞的生长(P<0.05)，且与空白组相比，人工合成P-Ⅱ肽段具有显著促进GLP-1分泌的作用(P<0.05)。

为了排除LPS对试验结果的影响，采用多粘菌素B(PMB)屏蔽法对人工合成P-Ⅱ肽段中是否存在LPS的污染进行检测。结果表明(图7)，人工合成P-Ⅱ肽段浓度为400、500μg/mL时测定的LPS含量与对照组无显著差异(P<0.05)，PMB预处理后的人工合成P-Ⅱ肽段促GLP-1分泌作用与没有预处理组相比没有显著差异(P<0.05)，表明人工合成P-Ⅱ肽段促GLP-1的分泌作用与LPS污染无关。

实施例5

人工合成P-Ⅱ肽段促进L细胞分泌GLP-1的动物实验验证。将禁食过夜的小鼠用4％的水合氯醛腹腔注射麻醉后，打开腹腔，找到肝门静脉插管，并用细线结扎空肠部分，用浓度为116mg/kg体重的P-Ⅱ直接给药在结扎的空肠上，由于P-Ⅱ用D-Hanks溶液溶解，故空白对照组注射同等体积的D-Hanks溶液，收集在肠道内给药0、15、30min时各组的肝门静脉血浆，血浆保存在抗凝管中，-80℃保存，测定各组小鼠血浆中GLP-1的含量。

测定结果表明(图8)，与对照组相比，给药后血浆GLP-1浓度在30min内显著增加(P<0.05)，相比于基础水平(0min)也显著增加(P<0.05)，动物实验测定结果更直观地证明了P-Ⅱ可促进肠内分泌L-细胞分泌GLP-1。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，本发明的内容，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

Claims (1)

1.一种具有促降血糖激素GLP-1分泌作用的富铬酵母活性肽在制备降血糖产品中的用途，其特征在于所述活性肽的氨基酸序列为：PSIVGRPR（脯氨酸-丝氨酸-异亮氨酸-缬氨酸-甘氨酸-精氨酸-脯氨酸-精氨酸）。

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