CN112457384B - 一种酶解多肽及用于制备抗白血病的药物的用途 - Google Patents

一种酶解多肽及用于制备抗白血病的药物的用途 Download PDF

Info

Publication number
CN112457384B
CN112457384B CN202011498157.3A CN202011498157A CN112457384B CN 112457384 B CN112457384 B CN 112457384B CN 202011498157 A CN202011498157 A CN 202011498157A CN 112457384 B CN112457384 B CN 112457384B
Authority
CN
China
Prior art keywords
enzymolysis
protein
collecting
polypeptide
solution
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202011498157.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112457384A (zh
Inventor
郭守山
请求不公布姓名
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wei Junfeng
Original Assignee
Zhejiang Tianmei Supply Chain Management Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhejiang Tianmei Supply Chain Management Co ltd filed Critical Zhejiang Tianmei Supply Chain Management Co ltd
Priority to CN202011498157.3A priority Critical patent/CN112457384B/zh
Publication of CN112457384A publication Critical patent/CN112457384A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112457384B publication Critical patent/CN112457384B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明公开了一种酶解多肽及用于制备抗白血病的药物的用途，该酶解多肽由如下方法制备：先使用碱提酸沉法从北五味子的干燥成熟果实中提取五味子总蛋白，再使用碱性蛋白酶对五味子总蛋白进行酶解，最后使用超滤分离收集分子量介于5000u和7000u间的五味子酶解多肽。本发明提供的五味子酶解多肽对急性淋巴细胞白血病Jurkat细胞均具有明显的抑制活性，可以用于制备抗急性淋巴细胞白血病的药物。

Description

一种酶解多肽及用于制备抗白血病的药物的用途
技术领域
本发明属于多肽领域，涉及酶解多肽及应用，具体涉及一种酶解多肽及用于制备抗白血病的药物的用途。
背景技术
急性淋巴细胞白血病属于侵袭性血液系统恶性肿瘤，约占儿童期白血病的75％，在成人中也较为常见。其特征是T系祖细胞异常克隆性增殖，导致白血病淋巴母细胞在骨髓和各种髓外部位积聚，从而引起贫血、发热、肝脾肿大、关节疼痛以及全身淋巴结肿大等临床症状。急性淋巴细胞白血病发病率逐年上升，严重威胁人们生命健康。寻找开发有效的化疗药物是攻克急性淋巴细胞白血病的重要途径。
五味子为木兰科五味子属多年生木质藤本植物，其成熟果实干燥后作药用，因其果实甘、酸、辛、苦、咸五味俱全，故名五味子，主产于东北地区，故习称“北五味子”。
目前，五味子的研究主要集中于五味子中的小分子化合物，对其所含多肽的研究极少。
发明内容
本发明的目的在于提供一种酶解多肽及用于制备抗白血病的药物的用途。
实现本发明上述目的技术方案如下：
一种酶解多肽，由如下方法制备：先使用碱提酸沉法从北五味子的干燥成熟果实中提取五味子总蛋白，再使用碱性蛋白酶对五味子总蛋白进行酶解，最后使用超滤分离收集分子量介于5000u和7000u间的五味子酶解多肽。
进一步地，碱提酸沉方法为：取北五味子的干燥成熟果实先用无水乙醇热回流提取，过滤挥干残留溶剂；加纯净水，调节pH至10.5，常温搅拌提取；提取液先过滤收集滤液，离心，取上清液，调节pH至4.5，静置，离心，收集沉淀，冷冻干燥，得到五味子总蛋白。
进一步地，酶解参数为：pH值，8.0；酶解温度，50℃；酶解时间，8h；酶添加量，2500U/g。
进一步地，超滤步骤中依次使用截留分子量为7000u和5000u的超滤膜进行超滤，收集分子量介于5000u和7000u之间的组分，冷冻干燥。
上述酶解多肽在制备治疗急性淋巴细胞白血病的药物方面的应用。
本发明的突出优点：
本发明提供了一种五味子酶解多肽，活性研究表明该多肽对急性淋巴细胞白血病Jurkat细胞均具有明显的抑制活性，可以用于制备抗急性淋巴细胞白血病的药物。
附图说明
图1为扫描电子显微镜下观察五味子酶解多肽的形貌；
图2为Westernblotting图。
具体实施方式
下面就结合实施例具体介绍本发明的实质性内容，由于篇幅原因，实验过程的描述无法做到非常详细，凡是实验中未详细描述的部分均为本领域技术人员熟知的常规操作。
实施例1
一、实验材料
将北五味子的干燥成熟果实粉碎过60目筛，备用。
纯净水为娃哈哈桶装纯净水；碱性蛋白酶购自诺维信。
二、实验方法
步骤S1：碱提酸沉提取总蛋白
取北五味子的干燥成熟果实1kg先用10L无水乙醇热回流提取3h，过滤挥干残留溶剂。加10L纯净水，用10％氢氧化钠溶液调节pH至10.5，常温搅拌提取6h。提取液先过滤收集滤液，再以4000r/min离心20min，取上清液，用10％盐酸溶液调节pH至4.5，静置2h，以4000r/min离心20min，收集沉淀，冷冻干燥，得到五味子总蛋白。
步骤S2：蛋白酶酶解
取适量五味子总蛋白用纯净水溶解配制成浓度为0.1mg/mL的溶液，加入碱性蛋白酶进行酶解，酶解参数如下：pH值，8.0；酶解温度，50℃；酶解时间，8h；酶添加量，2500U/g。酶解结束后，85℃水浴10min灭酶，冷却至常温，以9000r/min离心20min，取上清液，冷冻干燥，得到五味子酶解蛋白。
步骤S3：超滤分离
取适量五味子酶解蛋白用纯净水溶解配制成浓度为10mg/mL的溶液，依次使用截留分子量为7000u和5000u的超滤膜进行超滤，收集分子量介于5000u和7000u之间的组分，冷冻干燥即得五味子酶解多肽。
扫描电子显微镜下观察五味子酶解多肽的形貌，结果如图1所示。
实施例2
一、实验材料
急性淋巴细胞白血病Jurkat细胞购自ATCC。
胎牛血清、RP-MI1640培养液购自Hyclone公司。
五味子酶解多肽按照实施例方法制备。
二、实验方法
1、细胞培养
急性淋巴细胞白血病Jurkat细胞用含10％胎牛血清和1％双抗的RP-MI1640培养液置于37℃、体积分数为5％CO2、饱和湿度的培养箱中常规培养，每2d更换1次培养液。
2、MTT试验测定细胞增殖活性
取对数生长期的Jurkat细胞消化重悬制成细胞悬液，接种于96孔板中，每孔1×104个细胞、200μL，37℃、5％CO2条件培养24h，去上清，加入含有10、20μg/mL五味子酶解多肽的完全培养基，同时设无药对照孔和无细胞调零孔，每组设5个复孔，继续培养48h。到时间后，每孔加入浓度为5mg/mL的MTT试剂20μL，继续培养4h，弃上清液，再向每孔加入150μLDMSO，振荡溶解，采用酶标仪测定570nm波长下的吸光度值(OD570)，根据如下公式计算不同浓度五味子酶解多肽对Jurkat细胞的抑制率。
Figure BDA0002842813620000031
3、Westernblotting试验测定细胞凋亡调控基因的表达水平
取对数生长期的Jurkat细胞消化重悬制成细胞悬液，接种于24孔板中，每孔2×105个细胞，37℃、5％CO2条件培养24h，去上清，加入含有10、20μg/mL五味子酶解多肽的完全培养基，同时设无药对照孔，每组设5个复孔，继续培养48h。收集各组细胞，PBS洗涤两次，以裂解液提取总蛋白。用BCA蛋白检测试剂盒测量蛋白浓度。各组取等量总蛋白上样于SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。电泳结束后，取出分离胶，利用电转仪将分离胶上的蛋白转至PVDF膜上。用含有5％BSA的封闭液室温封闭2h，加入抗Bcl-2、Bax、β-Actin一抗，4℃摇床过夜，加入HRP标记的二抗室温孵育1h，化学发光法显色，凝胶成像。
4、统计学方法
所有数据采用SPSS17.0统计分析，计量资料以均值±标准差表示，两组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
三、实验结果
1、MTT结果
MTT试验结果如表1所示，不同浓度的五味子酶解多肽对急性淋巴细胞白血病Jurkat细胞均具有明显的抑制活性，高浓度抑制活性更强。
表1不同浓度五味子酶解多肽对Jurkat细胞的抑制率
10μg/mL 20μg/mL
抑制率(％) 32.85±2.27 69.43±2.51
2、Westernblotting结果
Westernblotting试验结果如图2所示，五味子酶解多肽组促凋亡蛋白Bax的含量显著高于无药对照孔，抑凋亡蛋白Bcl-2的含量显著低于无药对照孔。该结果表明，五味子酶解多肽对急性淋巴细胞白血病Jurkat细胞的抑制活性与促进其凋亡有关。
上述结果表明，实施例1制备的五味子酶解多肽对急性淋巴细胞白血病Jurkat细胞均具有明显的抑制活性，可以用于制备抗急性淋巴细胞白血病的药物。
上述实施例是对本发明实质性内容的体现，用于更好地解释本发明，但本领域技术人员应当知晓，不应将本发明的保护范围局限于上述具体的实施例。

Claims (2)

1.一种酶解多肽，其特征在于，由如下步骤制备：
步骤S1：碱提酸沉提取总蛋白
将北五味子的干燥成熟果实粉碎，取1kg先用10L无水乙醇热回流提取3h，过滤收集粉末，挥干残留溶剂；加10L纯净水，用10%氢氧化钠溶液调节pH至10.5，常温搅拌提取6h；提取液先过滤收集滤液，再以4000r/min离心20min，取上清液，用10%盐酸溶液调节pH至4.5，静置2h，以4000r/min离心20min，收集沉淀，冷冻干燥，得到五味子总蛋白；
步骤S2：蛋白酶酶解
取适量五味子总蛋白用纯净水溶解配制成浓度为0.1mg/mL的溶液，加入碱性蛋白酶进行酶解，酶解参数如下：pH值，8.0；酶解温度，50℃；酶解时间，8h；酶添加量，2500U/g；酶解结束后，85℃水浴10min灭酶，冷却至常温，以9000r/min离心20min，取上清液，冷冻干燥，得到五味子酶解蛋白；
步骤S3：超滤分离
取适量五味子酶解蛋白用纯净水溶解配制成浓度为10mg/mL的溶液，依次使用截留分子量为7000u和5000u的超滤膜进行超滤，收集分子量介于5000u和7000u之间的组分，冷冻干燥即得。
2.权利要求1所述的酶解多肽在制备治疗急性淋巴细胞白血病的药物中的应用。
CN202011498157.3A 2020-12-17 2020-12-17 一种酶解多肽及用于制备抗白血病的药物的用途 Active CN112457384B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011498157.3A CN112457384B (zh) 2020-12-17 2020-12-17 一种酶解多肽及用于制备抗白血病的药物的用途

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011498157.3A CN112457384B (zh) 2020-12-17 2020-12-17 一种酶解多肽及用于制备抗白血病的药物的用途

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112457384A CN112457384A (zh) 2021-03-09
CN112457384B true CN112457384B (zh) 2023-03-28

Family

ID=74803177

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011498157.3A Active CN112457384B (zh) 2020-12-17 2020-12-17 一种酶解多肽及用于制备抗白血病的药物的用途

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112457384B (zh)

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1281210C (zh) * 2003-11-29 2006-10-25 胡汛 五味子乙素在制备治疗肿瘤药物中的应用
FR2948565B1 (fr) * 2009-07-30 2011-10-28 Expanscience Lab Composition cosmetique pour le traitement de l'acne comprenant un extrait petidique de schizandra
CN102757510A (zh) * 2012-04-28 2012-10-31 江苏大学 低分子量五味子多糖及其制备方法和用途

Also Published As

Publication number Publication date
CN112457384A (zh) 2021-03-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101961371B (zh) 从甜味绞股蓝中提取分离人参皂苷、黄酮、多糖的方法
CN105816702B (zh) 一种甘蔗多酚提取物及其制备方法和应用
CN107410861A (zh) 一种糖尿病人群适宜的多肽食疗米糊及其制备工艺
WO2021078296A1 (zh) 降低血糖血脂及糖化血红蛋白的多糖复合多肽及制备方法
CN108434248B (zh) 一种枸杞活性成分的提取方法及用途
CN111870659A (zh) 酶解谷物麸皮提取物在制备dpp-4抑制剂中的应用
CN107412721A (zh) 一种降血糖苦瓜多肽复方胶囊及其制备方法
CN110772630A (zh) 活化胰岛素受体及调控血糖的复合苦瓜肽口服液及制备方法
US10434148B2 (en) Preparation method of albumin peptide combination having the action of inhibiting the proliferation of cancer cells
WO2021078288A1 (zh) 活化胰岛素及治疗糖尿病的复合苦瓜肽口服药及制备方法
CN112457384B (zh) 一种酶解多肽及用于制备抗白血病的药物的用途
CN109806285B (zh) 一种具有降尿酸活性的辣木叶提取物及其制备方法与应用
CN105943569A (zh) 一种青梅有效成分的提取方法
CN112245342B (zh) 一种人参系列护肤提取物及其制备方法和应用
CN111529555A (zh) 一种提取倒心盾翅藤中总皂苷的方法及其应用
KR20200120884A (ko) 가래나무 추출물, 분획물 또는 그 유래 생리활성 물질을 유효성분으로 함유하는 최종당화산물 생성 억제 및 분해 효과를 가지는 약학적 조성물
CN111423449A (zh) 从荸荠中分离的新苯骈二氧六环型木脂素及其制备保肝药物用途
CN116211903A (zh) 一种北沙参发酵物及其水提物、产品和应用
CN109528744A (zh) 龙胆苦苷及其应用
CN115607651A (zh) 一种降糖中药组合物
CN104605358A (zh) 一种α-葡萄糖苷酶抑制剂的制备方法及其产物和应用
JP2015098438A (ja) 糖取り込み促進剤
CN108685964B (zh) 毛大丁草提取物的应用及其有效组分制备方法
AU2021100814A4 (en) Oral botanical drug for treating lung squamous cell carcinoma (LSCC) and various bone metastases, and preparation method thereof
KR102568412B1 (ko) 실리마린 생체이용률이 증대된 밀크씨슬 추출물 제조방법

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20221219

Address after: 314000 Room 304, 2/F and 3/F, Building 1, No. 117, Furun Middle Road, Dongsha Street, Nanhu District, Jiaxing City, Zhejiang Province

Applicant after: Zhejiang Tianmei Supply Chain Management Co.,Ltd.

Address before: 211198 18 Jiangning Science Park, Nanjing, Jiangsu.

Applicant before: NANJING GAISIFU MEDICAL TECHNOLOGY CO.,LTD.

TA01 Transfer of patent application right
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20230818

Address after: Room 402, Building 4, Wangheyuan, Nanhu District, Jiaxing City, Zhejiang Province, 314001

Patentee after: Wei Junfeng

Address before: 314000 Room 304, 2/F and 3/F, Building 1, No. 117, Furun Middle Road, Dongsha Street, Nanhu District, Jiaxing City, Zhejiang Province

Patentee before: Zhejiang Tianmei Supply Chain Management Co.,Ltd.

TR01 Transfer of patent right