CN114846131A - 用于悬浮细胞的自动培养基更换策略 - Google Patents

用于悬浮细胞的自动培养基更换策略 Download PDF

Info

Publication number
CN114846131A
CN114846131A CN202080085212.8A CN202080085212A CN114846131A CN 114846131 A CN114846131 A CN 114846131A CN 202080085212 A CN202080085212 A CN 202080085212A CN 114846131 A CN114846131 A CN 114846131A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cells
container
cell
culture
suspension
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202080085212.8A
Other languages
English (en)
Inventor
L·豪普特
J·霍普菲尔德
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Thalys Biotech Co ltd
Universitaetsmedizin Goettingen Georg August Universitaet
Original Assignee
Thalys Biotech Co ltd
Universitaetsmedizin Goettingen Georg August Universitaet
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Thalys Biotech Co ltd, Universitaetsmedizin Goettingen Georg August Universitaet filed Critical Thalys Biotech Co ltd
Publication of CN114846131A publication Critical patent/CN114846131A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M33/00—Means for introduction, transport, positioning, extraction, harvesting, peeling or sampling of biological material in or from the apparatus
    • C12M33/22—Settling tanks; Sedimentation by gravity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M27/00—Means for mixing, agitating or circulating fluids in the vessel
    • C12M27/02—Stirrer or mobile mixing elements
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
    • C12M29/18—External loop; Means for reintroduction of fermented biomass or liquid percolate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M47/00—Means for after-treatment of the produced biomass or of the fermentation or metabolic products, e.g. storage of biomass
    • C12M47/02—Separating microorganisms from the culture medium; Concentration of biomass
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0696—Artificially induced pluripotent stem cells, e.g. iPS

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及一种改变悬浮培养物的培养基的方法，所述悬浮培养物包含悬浮在所述培养基中的细胞，所述方法包括：(i)将悬浮培养物的一部分转移到容器中，其中所述容器在底部包括至少一个开口；(ii)使包含在所述悬浮液的部分中的细胞通过重力沉降在所述容器的底部的至少一个开口处，从而形成上清液；(iii)将沉降在所述容器的底部的细胞分配(回)到悬浮培养物中；(iv)弃去上清液。

Description

用于悬浮细胞的自动培养基更换策略
相关申请的交叉引用
本申请要求在2019年12月11日提交的欧洲专利申请第19 215091.0号的优先权的权益，其内容通过引用以其整体并入本文以用于所有目的。
技术领域
本发明涉及一种改变悬浮培养物的培养基的方法，所述悬浮培养物包含悬浮在培养基中的细胞。
背景技术
传统上，诱导多能干细胞(iPSC)和其它贴壁细胞在静态细胞培养容器(“2D培养”)中培养和扩增。由于它们的贴壁特性，这种培养形式允许容易地改变培养基：除去用过的培养基，而贴壁细胞保留在细胞培养容器的表面上。然而，2D培养仅在有限程度上可放大和自动化，这导致高的人工和成本密集型工作量，例如在GMP条件下产生大量用于临床治疗的细胞和商业治疗性细胞产品。
关于商业生物工艺开发，在搅拌式生物反应器中的悬浮培养物中的培养是传统2D培养的有吸引力的替代方案。例如，在文献中已经多次描述了以iPSC聚集物的形式悬浮培养iPSC(“3D培养”)(Olmer等人,2012；Kwok等人,2018；Amit等人,2010)。3D悬浮培养提供了开发有效、可再现和可规模化的生物工艺的可能性，其中培养参数如pH、溶解氧(DO)和温度可控。
与传统的2D培养相反，改变悬浮培养物中的培养基仍然是一种挑战，因为必须从培养基中分离并且保留细胞/细胞聚集物，同时去除用过的培养基。在生物工艺中，这可以以传统的方式通过灌注解决。已经描述的另一种可能性是中断细胞/细胞聚集物的搅拌和沉降，随后除去培养基并加入新鲜培养基(参见，例如Kwok等人,2018)。然而，搅拌的长时间中断可能导致形成更大的聚集物(聚集物融合)。这导致形成较大的、不均匀的聚集物，进而导致质量传递和信号梯度的差异以及自发分化和细胞聚集物中多能性的降低(Lipsitz等2018，也参见实施例1)。
US2016/0215257公开了用于包含干细胞和/或分化细胞的细胞聚集物的扩增和传代的方法，并且包括在搅拌釜式生物反应器中使用封闭系统。WO 2013/109520公开了包括细胞聚集物捕获器的灌注式生物反应器系统。US 2017/0191022公开了使用声学滤波器来保留细胞。
因此，仍然需要改变悬浮培养的培养基的方法，特别是其中整个过程可以在不从系统中除去细胞或聚集物并且不将细胞暴露于与长时间沉降和/或离心相关的压力的情况下进行。本发明旨在解决这种需要。
发明内容
这种需要通过权利要求中限定的主题来解决。本文展示了一种改变悬浮培养物的培养基的方法，所述悬浮培养物包含悬浮在所述培养基中的细胞。
因此，本发明涉及一种改变悬浮培养物的培养基的方法，所述悬浮培养物包含悬浮在所述培养基中的细胞，所述方法包括：
(i)将悬浮培养物的一部分转移到容器中，其中所述容器在底部包含至少一个开口；
(ii)使包含在悬浮液的部分中的细胞通过重力沉降在容器的底部的至少一个开口处，从而形成上清液；
(iii)将沉降在容器的底部的细胞分配(回)到悬浮培养物中；
(iv)弃去上清液。
所述方法可以在生物反应器中进行。所述生物反应器可以是搅拌式生物反应器(STR)、摇摆式生物反应器(RM)和/或多并行生物反应器。
所述悬浮培养物可以连续搅拌。
所述细胞可以基本上均匀地分布在所述培养基中。
所述容器可以是管状的。容器可具有圆锥形底部。容器可以是移液管尖端、(一次性使用的)袋或(一次性使用的)袋的圆锥形/锥形部分。
可以在步骤(i)中将所述悬浮培养物的部分吸取到所述容器中。
所述细胞可以是真核细胞、真菌细胞如酵母细胞如P.pastoris、昆虫细胞如Drosophila melanogaster S2和Spodoptera frugiperda Sf9细胞、细菌细胞如E.coli、Streptomyces和Salmonella typhimurium、或植物细胞。优选地，所述细胞是真核细胞。
所述细胞可以是悬浮培养的贴壁细胞。
所述细胞可以选自由原代细胞、从组织或器官获得的细胞、永生化细胞、多能干细胞组成的组，优选所述细胞是多能干细胞，优选诱导多能干细胞(iPSC)、或iPSC衍生的细胞。所述细胞可以选自由TC-1133、Gibco ATCC ACS-1004的Human Episomal iPSC系、ATCCACS-1021、ATCC ACS-1025、ATCC ACS-1027、ATCC ACS-1030、HEK293、HEK293T、BHK 21、CHO、NS0和Sp2/0-Ag14组成的列表。所述细胞可以是人或非人的。
所述细胞可以是细胞聚集物。所述细胞聚集物的平均直径可以为约50至800μm、约150至800μm、至少约800μm、至少约600μm、至少约500μm、至少约400μm、至少约300μm、至少约200μm、至少约150μm、约300至500μm、约150至300μm、约50至150μm、约80至100μm、约180至250μm或约200至250μm。
所述方法还可以包括：(v)向悬浮培养物中添加与上清液等体积的培养基。
在本发明方法的步骤(ii)中，使所述细胞沉降的时间可以是至少1min、至少2min、至少3min、至少4min、至少5min、至少6min、至少7min、至少8min、至少9min、至少10min、至少11min、至少12min、至少13min、至少14min、至少15min、至少16min、至少17min、至少18min、至少19min或至少20min。
在步骤(iii)中，步骤(i)中转移的细胞的至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97.5％、至少99％或基本上所有细胞可以分配(回)到悬浮培养物中。
所述细胞可以在微载体颗粒上生长。所述悬浮培养物可以是微载体培养物。
在本发明方法的步骤(ii)中，所述悬浮液的部分可以保持静止，从而使包含在悬浮液的部分中的细胞通过重力沉降在容器的底部的至少一个开口处。
在本发明方法的步骤(i)中，所述悬浮液的部分可以通过所述容器的底部的至少一个开口转移到所述容器中。
在本发明方法的步骤(iii)中，将沉降在所述容器的底部的细胞通过所述容器的底部的至少一个开口分配(回)到悬浮培养物中。
附图说明
当结合非限制性实施例和附图考虑时，参考详细描述将更好地理解本发明，其中：
图1示出了本发明的方法的示例性实施方式，其也可以被称为“尖端沉降”或“移液管尖端沉降”。将悬浮培养物(2)的一部分从悬浮培养物转移到容器(1)中。这可以是自动化过程，其中将包含至少一个开口(3)的容器(1)的尖端浸入悬浮培养物中，并吸取悬浮培养物(2)的一部分。示例性容器(1)，这里为以横截面示出的圆锥形移液管尖端，在底部(3)处具有一个开口。
然后，通过保持容器(这里是移液管尖端)静止一段限定的时间，例如约3分钟或约5分钟，使细胞(22)通过重力沉降在所述容器的底部的至少一个开口处。沉降可以在容器仍被浸没时发生，或者容器可以再次从悬浮培养物中移出。由此，产生基本上不含细胞的培养基的上清液(21)。
在足够数量的细胞或细胞聚集物沉积后，将细胞(22)分配回悬浮培养物中，同时保留培养基(21)的上清液。剩余的上清液(21)可以被丢弃，例如通过将其分配到废物容器中。
图1所示的过程可以连续重复。这允许培养基的连续更换，这可以被看作模拟灌注培养基更换过程。
图2显示iPSC聚集物的形态。描绘了从ambr15悬浮培养物取样的含有聚集物的24孔板的孔的图像。使用Cellavista细胞成像仪获得图像。标尺：3mm。
图3显示4天后的iPSC扩增率。
图4显示多能性相关基因的表达。在iPSC悬浮培养的第4天，用流式细胞术分析多能性相关基因的表达。
具体实施方式
本发明将在下面详细描述，并且还将通过所附的实施例和附图进一步说明。
生物反应器中悬浮培养物的自动化培养基更换仍然是一个挑战。手动培养基更换通常涉及将悬浮培养物的至少一部分转移出生物反应器，并且包括例如细胞的离心。这种机械刺激可对细胞活力或功能，例如干细胞的不期望分化，具有负面影响(Lipsitz等人,2018，也参见实施例1)。本发明的培养基更换方法避免了细胞转移出生物反应器以及机械压力刺激。因此，手动交互的次数有限，并且污染的风险有限。
生物反应器中悬浮培养物的自动化培养基更换(“容器沉降”)的一种可能性是停止搅拌并使细胞沉降在生物反应器的底部。然后可以吸出上清液并用新鲜培养基替换。然而，这也导致细胞的机械刺激，会导致不规则的生长和多能性的丧失(参见例如实施例1，图2和4)。本发明的方法克服了这个问题。
上述问题通过本发明的方法(“尖端沉降”)得以解决。在生物反应器中，优选搅拌悬浮培养物中的细胞。这对于在悬浮培养物中可形成细胞聚集物的正常贴壁细胞尤其重要。在现有技术中，停止搅拌，并使细胞或细胞聚集物沉降。沉降后，更换上清液，并再次开始搅拌(参见例如Kwok等人2018)。然而，沉降对细胞具有负面影响(Lipsitz等2018，实施例1，图2和4)。因此，在本发明的方法中，生物反应器的搅拌优选不停止而是连续运行，并且优选避免搅拌的停止。然而，本发明的方法也可以在生物反应器中进行，其中不搅拌培养基。
尽管与容器沉降方法相比，令人惊讶地产生规则形成/成形的细胞聚集物(图2)和显著更高的多能性标记物阳性的iPSC的比率(图4)，本发明的方法(“尖端沉降”)还导致iPSC的生长速率增加，如实施例1和图4中所示。综上所述，本发明的方法是改变悬浮培养物培养基的改进方法。
在本发明方法的示例性实施方式中(也参见图1或实施例1)，将细胞培养基的部分转移到容器，例如移液管尖端中。在转移之后，使细胞通过重力在容器的底部的至少一个开口处沉降在容器的底部。因此，细胞浓缩在培养基部分的底部，即形成优选基本上不含细胞的上清液。在沉降之后，例如通过排出细胞而上清液保留在容器中，将细胞分配回到生物反应器的培养基中。可以丢弃上清液。为了在生物反应器中维持恒定体积的培养基，丢弃的上清液可以用等量的新鲜培养基替换。重要的是，仅从悬浮培养物中取出细胞的(相对较少的)部分，同时连续搅拌剩余的细胞。因此，容器中仅有少量细胞，这可以减少培养基更换所需的时间，因此也减少了培养基更换期间细胞沉降的时间。最重要的是，不必从生物反应器中除去细胞。
因此，本发明涉及一种改变悬浮培养物的培养基的方法，所述悬浮培养物包含悬浮在所述培养基中的细胞，所述方法包括：
(i)将悬浮培养物的一部分转移到容器中，其中所述容器在底部包含至少一个开口；
(ii)使包含在所述悬浮液的部分中的细胞通过重力沉降在所述容器的底部的至少一个开口处，从而形成上清液；
(iii)将沉降在所述容器的底部的细胞分配(回)到悬浮培养物中；
(iv)弃去上清液。
当实施本发明的方法时，可以看出包含在悬浮液的部分中的细胞在步骤(ii)中保持静止。这意味着，在步骤(ii)中没有液体流动，而只有细胞通过重力沉降。因此，本发明方法的步骤(ii)还可以包括：(ii)使所述悬浮液的部分保持静止，从而使包含在所述悬浮液的部分中的细胞通过重力沉降在所述容器的底部的至少一个开口处，从而形成上清液。因此，本发明还涉及改变悬浮培养物的培养基的方法，所述悬浮培养物包含悬浮在培养基中的细胞，所述方法包括：
(i)将悬浮培养物的一部分转移到容器中，其中所述容器在底部包含至少一个开口；
(ii)使所述悬浮液的部分保持静止，从而使包含在所述悬浮液的部分中的细胞通过重力沉降在所述容器的底部的至少一个开口处，从而形成上清液；
(iii)将沉降在所述容器的底部的细胞分配(回)到悬浮培养物中；
(iv)弃去上清液。
本发明的进一步特征可见，所述悬浮培养物的部分转移到所述容器中和/或通过所述容器的底部的至少一个开口将沉降在所述容器的底部的细胞分配到所述容器外。因此，相同的开口可用于转移所述容器中的细胞悬浮液的部分和用于将沉降在所述容器的底部的细胞转移出所述容器(回)到悬浮培养物中。因此，本发明方法的步骤(i)还可以包括：(i)将悬浮培养物的一部分转移到容器中，其中所述容器在底部包含至少一个开口，其中所述悬浮液的部分通过所述容器的底部的至少一个开口转移到所述容器中。步骤(iii)还可以包括：(iii)将沉降在容器的底部的细胞通过容器的底部的至少一个开口分配(回)到悬浮培养物中。
因此，本发明还涉及改变悬浮培养物的培养基的方法，所述悬浮培养物包含悬浮在培养基中的细胞，所述方法包括：
(i)将悬浮培养物的一部分转移到容器中，其中所述容器在底部包含至少一个开口，其中所述悬浮液的部分通过所述容器的底部的至少一个开口转移到所述容器中；
(ii)使包含在悬浮液的部分中的细胞通过重力沉降在所述容器的底部的至少一个开口处，从而形成上清液；
(iii)将沉降在所述容器的底部的细胞分配(回)到悬浮培养物中；
(iv)弃去上清液。
因此，本发明还涉及改变悬浮培养物的培养基的方法，所述悬浮培养物包含悬浮在培养基中的细胞，所述方法包括：
(i)将悬浮培养物的一部分转移到容器中，其中所述容器在底部包含至少一个开口；
(ii)使包含在所述悬浮液的部分中的细胞通过重力沉降在所述容器的底部的至少一个开口处，从而形成上清液；
(iii)将沉降在所述容器的底部的细胞通过所述容器的底部的至少一个开口分配(回)到悬浮培养物中；
(iv)弃去上清液。
因此，本发明还涉及改变悬浮培养物的培养基的方法，所述悬浮培养物包含悬浮在培养基中的细胞，所述方法包括：
(i)将一部分悬浮培养物转移到容器中，其中所述容器在底部包含至少一个开口，其中所述悬浮液的一部分通过所述容器的底部的至少一个开口转移到所述容器中；
(ii)使所述悬浮液的所述部分保持静止，从而使包含在所述悬浮液的所述部分中的所述细胞通过重力沉降在所述容器的底部的所述至少一个开口处，从而形成上清液；
(iii)将沉降在容器的底部的细胞通过容器的底部的至少一个开口分配(回)到悬浮培养物中；
(iv)弃去上清液。
如本文所用的术语“分配”不限于从容器内部施加力。或者，本发明也设想了例如通过从容器中吸出细胞而从容器外部除去细胞。在进行该操作时，上清液可以保留在容器中并且可以在之后弃去。
弃去的培养基的量或体积可以通过向悬浮培养物中添加与上清液相等体积的培养基来替换。因此，悬浮培养物的体积可以保持恒定。因此，本发明的方法可进一步包括步骤(v)：向悬浮培养物中添加与上清液等体积的培养基。本发明的方法也可用于增加或减少悬浮培养物的体积。例如，通过向悬浮培养物中添加大于上清液体积的体积，悬浮培养物的(总)体积增加。因此，本发明的方法可进一步包括步骤(v)：向悬浮培养物中添加大于上清液体积的培养基。反之亦然，通过向悬浮培养物中添加比上清液体积小的体积，悬浮培养物的(总)体积减少。因此，本发明的方法可进一步包括步骤(v)：向悬浮培养物中添加小于上清液的体积的培养基。
本文所用的术语“悬浮培养物”是一种细胞培养物，其中单细胞或细胞的小聚集物在优选搅拌的生长培养基中发挥功能和增殖，从而形成悬浮液(参见化学中的定义：“悬浮在液体中的小固体颗粒”)。这与贴壁培养相反，贴壁培养中细胞附着于细胞培养容器，细胞培养容器可以包被有细胞外基质(ECM)的蛋白质。在悬浮培养中，优选地，细胞和/或培养基中不加入ECM的蛋白。悬浮培养物优选基本上不含固体颗粒，例如珠、微球、微载体颗粒等；在本文中，细胞或细胞聚集物不是固体颗粒。在一个实施方式中，细胞不在微载体(悬浮)培养中。
本发明的方法还可用于微载体培养物中的培养基更换，即用于在微载体颗粒上生长的细胞。因此，细胞可以在微载体颗粒上生长。本文所用的“微载体颗粒”涉及使贴壁细胞在生物反应器中生长的支持基质。微载体通常是125-250μm球体，并且它们的密度允许它们在温和搅拌下保持在悬浮液中。微载体可以由许多不同的材料制成，包括DEAE-葡聚糖、玻璃、聚苯乙烯塑料、丙烯酰胺、胶原和藻酸盐。表面化学可以包括细胞外基质蛋白、重组蛋白、肽和带正电荷或负电荷的分子。几种类型的微载体可商购获得，包括基于藻酸盐(GEM，Global Cell Solutions)、基于葡聚糖(Cytodex，GE Healthcare)、基于胶原(Cultispher，Percell)和基于聚苯乙烯(SoloHill Engineering)的微载体。它们的孔隙率、比重、光学性质、动物组分的存在和表面化学性质可能不同。
如本文所用的“生长培养基”或“培养基”是设计用于支持微生物、细胞或小植物生长的液体。不同类型的培养基用于培养不同类型的细胞。本领域技术人员能够识别哪种培养基对于特定的细胞类型是最佳的。
本发明的方法优选在生物反应器中进行。如本文所用，术语“反应器”和“生物反应器”，可以互换使用，指为细胞培养提供动态流体环境的封闭培养容器，生物反应器可以是搅动的和/或搅拌的。搅拌式生物反应器的实例包括但不限于搅拌釜式生物反应器、波浪混合/摇摆式生物反应器、上下搅拌式生物反应器(即，包括活塞作用的搅拌式反应器)、转瓶、摇瓶、振荡式生物反应器、桨式混合器，立式轮式生物反应器。搅拌式反应器可以被配置成容纳约2mL-20000L的细胞培养物体积。优选的生物反应器可以具有高至50L的体积。适用于本发明方法的示例性生物反应器是可购自Sartorius Stedim Biotech的ambr 15生物反应器。生物反应器可以是不锈钢或一次性使用的生物反应器。生物反应器可以由单个容器组成或者可以包括几个平行的生物反应器。该一次性使用的生物反应器可以由玻璃或塑料制造，该一次性使用的生物反应器可以是搅拌釜式生物反应器或摇摆式生物反应器，实施例：Sartorius STR，RM，ambr15，ambr250。培养基的pH可以通过生物反应器控制，优选通过CO2供应控制，并且可以保持在6.6至7.6的范围内，优选地为约7.4。
生物反应器可以是搅拌式生物反应器(STR)。STR例如可获自Sartorius StedimBiotech，包括但不限于
Figure BDA0003683729450000091
A/B/B-DCU/Cplus/D-DCU、
Figure BDA0003683729450000092
15和
Figure BDA0003683729450000093
250。生物反应器可以是摇摆式生物反应器(RM)。RM例如可获自Sartorius Stedim Biotech，并且包括但不限于
Figure BDA0003683729450000094
RM和
Figure BDA0003683729450000097
RM TX。生物反应器可以是多并行生物反应器，例如可获自Sartorius Stedim Biotech，并且包括但不限于
Figure BDA0003683729450000096
15和
Figure BDA0003683729450000095
250。
在一些实施方式中，所述生物反应器中的培养容器的体积为约50mL至约20000L。在一些实施方式中，所述生物反应器中的培养容器的体积为约50mL至约2000L。在一些实施方式中，所述生物反应器中的培养容器的体积为约50mL至约200L。在一些实施方式中，所述生物反应器中的培养容器的体积为约50mL至约100L。在一些实施方式中，所述生物反应器中的培养容器的体积为约50mL至约50L。在一些实施方式中，所述生物反应器中的培养容器的体积为约50mL至约20L。在一些实施方式中，所述生物反应器中的培养容器的体积为约50mL至约10L。在一些实施方式中，所述生物反应器中的培养容器的体积为约50mL至约1L。在一些实施方式中，所述生物反应器中的培养容器的体积为约100mL至约10L。在一些实施方式中，所述生物反应器中的培养容器的体积为约100mL至约5L。在一些实施方式中，在生物反应器中的培养容器的体积为约150mL至约1L。在一些实施方式中，生物反应器中培养容器的体积为约1L至约1000L。
如本文所述，悬浮培养物中的细胞优选不沉降，而是分布于培养基中。因此，优选搅拌悬浮培养物。连续搅拌可导致细胞在培养基/悬浮培养物中基本上均匀分布，并可帮助干细胞如iPSC维持其多能性(也参见实施例1和图4)。因此，细胞优选基本上均匀地分布在培养基中。
本文所用的术语“容器”涉及适于保持悬浮培养物的任何容器，所述悬浮培养物包含悬浮在培养基中的细胞。所述容器可以是管状的，即可以具有圆柱体的形式。圆柱体的一个底部优选地基本上对着重力方向。所述容器或圆柱体可具有圆锥形底部代替平面基座。至少一个开口可以在圆锥形表面的最底部。这种具有圆锥形底部的容器也可被描述为移液管尖端。因此，任何类型的移液管尖端都可以被设想为本发明的容器。
然而，所述容器不限于移液管尖端等。所述容器也可以是袋。本文所用的“袋”涉及柔性容器，优选由塑料制成，其包括至少一个柔性管。柔性管可以浸入悬浮培养物中，即，在所述容器是袋的情况下，所述容器的“底部”可以与浸入悬浮培养物中的管的端部相关。所述管可以具有圆锥形或锥形末端，该末端可以浸入悬浮培养物中并对应于本文所述容器的底部。袋的实例包括但不限于可获自Sartorius Stedim Biotech并作为
Figure BDA0003683729450000101
2D或
Figure BDA0003683729450000102
3D袋出售的一次性使用的袋。所述袋可以用于一次性使用。
为了将沉降的细胞从容器分配回悬浮培养物中，所述容器在底部包括至少一个开口，细胞可通过该开口分配。所述细胞的一部分可以经由底部的至少一个开口转移到所述容器中。然而，本发明还设想使用不同的开口将悬浮培养物的部分转移到所述容器中。如果使用(封闭的)生物反应器，则所述容器优选在生物反应器内部。
悬浮培养物的部分的转移可以通过任何合适的方式进行。例如，通过抽吸控制转移，例如通过施加将部分吸取到所述容器中的轻微负压。因此，在步骤(i)中，所述悬浮培养物的部分可以被吸取到所述容器中。
本发明的方法通常可用于可在细胞培养物中培养的任何细胞，即，也可用于贴壁细胞培养。有利地，所述方法用于改变悬浮培养物的培养基，其中细胞从培养基分离是重要的。在此上下文中，“悬浮在培养基中”是指在悬浮液中培养的细胞，无论它们实际上是否是悬浮细胞。因此，本发明的方法也可用于贴壁细胞，如果它们悬浮在培养基中的话。因此，细胞可以是悬浮培养的贴壁细胞。
悬浮培养的贴壁细胞，即不能附着于培养容器的贴壁细胞，可以形成细胞聚集物。如本文所用，术语“聚集物”和“细胞聚集物”可互换使用，是指多个细胞，例如(诱导)多能干细胞，其中细胞之间的缔合是由细胞-细胞相互作用(例如，通过彼此的生物附着)引起的。生物附着可以是例如通过表面蛋白，如整联蛋白、免疫球蛋白、钙粘着蛋白、选择蛋白或其它细胞粘附分子。例如，细胞可以在悬浮液中自发地缔合并且形成细胞-细胞附着(例如，自组装)，从而形成聚集物。在一些实施方式中，细胞聚集物可以是基本上均质的(即，主要含有相同类型的细胞)。在其它实施方式中，细胞聚集物可以是异质的(即，含有一种以上类型的细胞)。
本发明的方法适用于细胞聚集物。细胞聚集物的大小可以变化。细胞聚集物的平均直径可以为约50至800μm、约150至800μm、至少约800μm、至少约600μm、至少约500μm、至少约400μm、至少约300μm、至少约200μm、至少约150μm、约300至500μm、约150至300μm、约50至150μm、约80至100μm、约180至250μm或约200至250μm。
所述细胞可以是任何可以悬浮培养的细胞，例如原核细胞或真核细胞，在一个实施方式中优选真核细胞。所述细胞可以选自由原代细胞、从组织或器官获得的细胞、永生化细胞、多能干细胞组成的组，优选所述细胞是多能干细胞，更优选诱导多能干细胞(iPSC)或衍生自iPSC的细胞。“衍生自iPSC的细胞”涉及分化的细胞或分化成特定细胞类型的细胞，其不再能够在身体的任何细胞类型中分化。从iPSC开始分化成不同细胞类型的方法是本领域技术人员已知的。“衍生自iPSC的细胞”可以涉及心脏细胞和/或组织、肝细胞和/或组织、肾细胞和/或组织、脑细胞和/或组织、胰腺细胞和/或组织、肺细胞和/或组织、骨骼肌细胞和/或组织、胃肠细胞和/或组织、神经元细胞和/或组织、皮肤细胞和/或组织、骨细胞和/或组织、骨髓、脂肪细胞和/或组织、结缔细胞和/或组织、视网膜细胞和/或组织、血管细胞和/或组织、基质细胞或心肌细胞。从WO 2015/025030和WO 2015/040142中已知产生心脏组织的方法。细胞也可以在生物反应器中或生物反应器外分化，例如分化成心肌细胞或基质细胞。这些分化的细胞也可利用本发明的方法在生物反应器中培养。从组织或器官获得的细胞可以从心脏细胞和/或组织、肝细胞和/或组织、肾细胞和/或组织、脑细胞和/或组织、胰腺细胞和/或组织、肺细胞和/或组织、骨骼肌细胞和/或组织、胃肠细胞和/或组织、神经元细胞和/或组织、皮肤细胞和/或组织、骨细胞和/或组织、骨髓、脂肪细胞和/或组织、结缔细胞和/或组织、视网膜细胞和/或组织、血管细胞和/或组织、基质细胞或心肌细胞获得。
所述细胞可以是哺乳动物的细胞，仅举几个说明性实例，所述哺乳动物例如人、狗、小鼠、大鼠、猪、猿例如食蟹猴。优选地，所述细胞是人的。其它优选的细胞包括真菌细胞如酵母细胞如P.pastoris，昆虫细胞如Drosophila melanogaster S2和Spodopterafrugiperda Sf9细胞，细菌细胞如E.coli、Streptomyces和Salmonella typhimurium细胞，或植物细胞。
本文所用的术语“多能干细胞”(iPSC)是指能够分化成身体的每种细胞类型的细胞。因此，多能干细胞提供了分化成基本上任何组织或器官的独特机会。目前，最常用的多能细胞是胚胎干细胞(ESC)或诱导多能干细胞(iPSC)。人ESC系首先由Thomson及其同事建立(Thomson等(1998),Science 282:1145-1147)。最近，人类ESC研究使得能够开发一种新技术，将机体细胞重编程为ES样细胞。该技术由Yamanaka及其同事在2006年开创(Takahashi&Yamanaka(2006),Cell,126:663-676)。所得到的诱导多潜能细胞(iPSC)显示出与ESC非常相似的行为，并且重要的是，还能够分化成身体的每个细胞。因此，在一个实施方式中，术语iPSC包括ESC。然而，在本发明的上下文中，优选不使用涉及修饰人类种系遗传身份或涉及将人类胚胎用于工业或商业目的方法来产生这些多能干细胞。优选地，所述多能干细胞是灵长类来源的，更优选是人来源的。
仅举几个来源，合适的诱导PSC可例如获自NIH人胚胎干细胞登记库、诱导多能干细胞欧洲库(EBiSC)、德国心血管研究中心的干细胞储存库(DZHK)或ATCC。诱导多能干细胞也可用于商业用途，例如，来自NINDS人类序列和细胞库(https://stemcells.nindsgenetics.org)，其由美国国家神经疾病和中风研究所(NINDS)操作，并将人类细胞资源广泛地分配给学术和工业研究人员。可用于本发明的合适细胞系的一个说明性实例是细胞系TC-1133，一种衍生自脐带血干细胞的诱导(未编辑)多能干细胞。该细胞系为例如可直接从美国NINDS获得。优选地，TC-1133是符合GMP的。可用于本发明的其它示例性iPSC细胞系包括但不限于，GibcoTM(序号A18945，Thermo Fisher Scientific)的HumanEpisomal iPSC系，或获自ATTC的iPSC细胞系ATCC ACS-1004，ATCC ACS-1021，ATCC ACS-1025，ATCC ACS-1027或ATCC ACS-1030。或者，重编程领域的任何技术人员可通过已知方案容易地产生合适的iPSC系，例如Okita等人，“A more efficient method to generateintegration-free human iPS cells”Nature Methods，Vol.8No.5,May 2011,第409-411页或Lu等人，“A defined xeno-free and feeder-free culture system for thederivation,expansion and direct differentiation of transgene-free patient-specific induced pluripotent stem cells”Biomaterials 35(2014)2816e2826所述的方案。
所述细胞可以选自由TC-1133、Gibco ATCC ACS-1004的Human Episomal iPSC细胞系、ATCC ACS-1021、ATCC ACS-1025、ATCC ACS-1027、ATCC ACS-1030、HEK293T、HEK293T、BHK 21、CHO、NS0、Sp2/0-Ag14组成的组。
如本文所解释的，用于本发明的(诱导)多能干细胞可以衍生自任何合适的细胞类型(例如，衍生自干细胞如间充质干细胞，或上皮干细胞或分化细胞如成纤维细胞)和衍生自任何合适的来源(体液或组织)。仅举几个例子，这些来源(体液或组织)的实例包括脐带血、皮肤、牙龈、尿、血液、骨髓、脐带的任何区室(例如，脐带羊膜或华顿氏胶)、脐带-胎盘连接处、胎盘或脂肪组织。在一个说明性实例中，是从脐带血中分离CD34阳性细胞，例如通过使用特异性针对CD34的抗体的磁性细胞分选，然后重编程，如Chou等人,(2011)，CellResearch,21:518-529中所述。Baghbadeerani等人,(2015),Stem Cell Reports,5(4)：647-659表明iPSC的生产工艺可以符合良好生产规范的规定生产细胞系ND50039。
因此，多能干细胞优选满足良好生产规范的要求。
本文概述的本发明方法需要在步骤(ii)中沉降悬浮细胞。沉降所需的时间可随细胞的大小、形式和质量而变化。确定细胞充分沉降所需的时间在本领域技术人员的知识范围内。因此，在本发明方法的步骤(ii)中，使细胞沉降的时间可以是至少1min、至少2min、至少3min、至少4min、至少5min、至少6min、至少7min、至少8min、至少9min、至少10min、至少11min、至少12min、至少13min、至少14min、至少15min、至少16min、至少17min、至少18min、至少19min或至少20min。
“充分沉降”是指在步骤(iii)中，将步骤(i)中转移的细胞的至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97.5％、至少99％或基本上所有细胞分配(回)到悬浮培养物中。因此，优选将步骤(i)中转移的细胞的至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97.5％、至少99％或基本上所有细胞分配(回)到步骤(iii)中的悬浮培养物中。
****
注意，如本文所用，除非上下文另有明确指示，单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数指代。因此，例如，提及“一种试剂”包括一种或多种这样的不同试剂，并且提及“该方法”包括提及本领域普通技术人员已知的等同步骤和方法，其可以针对本文所述的方法进行修改或替代。
除非另有说明，在一系列元件之前的术语“至少”应理解为是指该系列中的每个元件。本领域技术人员将认识到或能够弄清使用不超过常规实验确定本文所述的本发明的具体实施方式的许多等同方案。这些等同物也旨在包括在本发明中。
术语“和/或”无论在本文中任何一处使用，都包括“和”、“或”以及“由所述术语连接的元件的全部或任何其它组合”的含义。
术语“小于”或“大于”不包括具体的数字。
例如，小于20意味着小于所指示的数字。类似地，大于或超过意味着大于或超过所指示的数字，例如大于80％意味着大于或超过所指示数字80％。
在整个说明书和随后的权利要求书中，除非上下文另有要求，词语“包括”及其变体如“包含”和“含有”应理解为暗示包括所述的整体或步骤或整体或步骤的组，但不排除任何其它整体或步骤或整体或步骤的组。当在本文中使用时，术语“包含”可以用术语“含有”或“包括”代替，或者有时当在本文中使用时用术语“具有”代替。当在本文中使用时，“由...组成”排除未指定的任何要素、步骤或成分。
术语“包括”是指“包括但不限于”。“包括”和“包括但不限于”可互换使用。
如本文所用，术语“约”、“大约”或“基本上”是指在给定值或范围的20％内，优选在15％内，优选在10％内，更优选在5％内。它还包括具体的数字，即“约20”包括数字20。
应当理解，本发明不限于本文所述的特定方法、方案、材料、试剂和物质等，因此可以变化。本文所用的术语仅用于描述特定实施方式的目的，而不是要限制本发明的范围，本发明的范围仅由权利要求书限定。
本说明书全文中引用的所有出版物(包括所有专利、专利申请、科学出版物、说明书等)，无论在上文或下文中，均通过引用以其整体并入本文。本文中没有任何内容被解释为承认本发明无权凭借先前发明而先于此类公开。如果通过引用并入的材料与本说明书矛盾或不一致，本说明书将取代任何这样的材料。
本文引用的所有文献和专利文献的内容均通过引用以其整体并入。
实施例
从以下仅用于说明目的实施例，将清楚地更好地了解本发明及其优点。这些实施例不以任何方式限制本发明的范围。
材料和方法
除非另有说明，在整个实施例中使用以下材料和方法。
细胞培养
·细胞：TC1133，NINDS
·播种密度：5×105细胞/mL
·培养条件：37℃，pH 7.4，dO 50％，300rpm下搅拌。
·第2天开始更换培养基。
材料
·ambr15细胞培养24个一次性生物反应器，低温，无喷射器，零件号：001-2B81
·StemMACS iPS-Brew XF，基础培养基，订单号：130-107-086
·StemMACSTM iPS-Brew XF 50x补充剂；订单号：130-107-087
·Ambr15生物反应器，Sartorius Stedim
·Nucleocounter NC-200型900-0201
·Cellavista细胞成像仪
·流式细胞仪：BD LSR II Special Order System
培养基更换
容器沉降：
1.停止培养站搅拌
2.暂停5min，使聚集物沉降到底部
3.吸取移液管尖与管底之间的距离为1.4cm的培养基
4.加入新鲜培养基
5.启动培养站的搅拌
6.培养基的整体更换：66％
尖端沉降：
1.摄取900μl细胞悬浮液进入移液管尖端
2.暂停5min，悬浮液保留在尖端
3.将100μl返还到容器中。丢弃剩余的用过的培养基。
4.向容器中加入800μl新鲜培养基
5.6次重复步骤1-4
6.培养基的整体更换：57％
实施例1:作为在最大容量下ambr15系统中iPSC培养物的培养基更换手段的容器 沉降策略和尖端沉降策略的评估
本发明人比较了用于在最大容量为24个容器的ambr15中iPSC培养的两种培养基更换策略。为了平行测试两种策略，在培养站1中进行容器沉降策略，在培养站2中进行尖端沉降策略，模拟ambr15系统的最大容量，如下：在容器设置期间包括激活搅拌(860秒；模拟相反培养站的容器的培养基更换)和失活搅拌(881秒；模拟相同培养站中的容器的更换)的重复间隔。该持续时间是预先根据经验确定的。在每个尖端沉降培养基更换间隔之间包括2.5小时的暂停。
结果
形态学
iPSC聚集物的形态在开始培养基更换之前是相当的(图2)。在培养基更换后，容器沉降策略的聚集物具有漫射或管状并且是大的。这个观察结果表明聚集物的融合。相反，尖端沉降策略的聚集物是圆的和小的。
细胞数目和扩增率
使用容器沉降策略，悬浮培养4天后的细胞数增加3.61倍。尖端沉降策略导致在相同时间段期间21.81倍的平均增加(图3)。
多能性
使用尖端沉降策略，在悬浮培养四天后，多能性相关基因(OCT4，TRA-1-60，NANOG)的表达量高(90％OCT4/TRA-1-60双阳性细胞，91％OCT4/NANOG双阳性细胞，图4)。在用容器沉降策略培养的细胞中表达量显着降低(11％OCT4/TRA-1-60双阳性细胞，9％OCT4/NANOG双阳性细胞，图4)。
分析
与容器沉降策略相比，尖端沉降策略更适合于在生物反应器如ambr15系统中以最大容量进行细胞培养物、特别是iPSC的培养基更换。考虑到多能性相关标志物的低表达量，容器沉降策略甚至可能完全不适合用于培养基更换，特别是在最大容量为24个容器的ambr15中。其原因可能是在没有搅拌的时间段内聚集物的融合导致自发分化。
参考文献
Amit,Michal；Chebath,Judith；Margulets,Victoria；Laevsky,Ilana；Miropolsky,Yael；Shariki,Kohava et al.(2010):Suspension culture ofundifferentiated human embryonic and induced pluripotent stem cells.In:Stemcell reviews 6(2),S.248–259.
Kwok,Chee Keong；Ueda,Yuichiro；Kadari,Asifiqbal；Günther,Katharina；Ergün,Süleyman；Heron,Antoine et al.(2018):Scalable stirred suspension culture forthe generation of billions of human induced pluripotent stem cells usingsingle-use bioreactors.In:Journal of tissue engineering and regenerativemedicine 12(2),e1076-e1087.DOI:10.1002/term.2435.
Lipsitz,Yonatan Y.；Tonge,Peter D.；Zandstra,Peter W.(2018):Chemicallycontrolled aggregation of pluripotent stem cells.In:Biotechnology andbioengineering 115(8),S.2061–2066.DOI:10.1002/bit.26719.
Olmer,Ruth；Lange,Andreas；Selzer,Sebastian；Kasper,Cornelia；Haverich,Axel；Martin,Ulrich；Zweigerdt,Robert(2012):Suspension Culture of HumanPluripotent Stem Cells in Controlled,Stirred Bioreactors.In:Tissueengineering.Part C,Methods 18(10),S.772–784.DOI:10.1089/ten.tec.2011.0717.

Claims (18)

1.一种改变悬浮培养物的培养基的方法，所述悬浮培养物包含悬浮在所述培养基中的细胞，所述方法包括：
(i)将所述悬浮培养物的一部分转移到容器中，其中所述容器在底部包含至少一个开口；
(ii)使包含在所述悬浮液的部分中的细胞通过重力沉降在所述容器的底部的至少一个开口处，从而形成上清液；
(iii)将沉降在所述容器的底部的细胞分配(回)到所述悬浮培养物中；
(iv)弃去上清液。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法在生物反应器中进行，其中所述生物反应器优选为搅拌式生物反应器、摇摆式生物反应器和/或多并行生物反应器。
3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中连续搅拌所述悬浮培养物；
和/或其中所述细胞基本上均匀地分布在所述培养基中。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述容器是管状的；和/或其中所述容器具有圆锥形底部；和/或
其中所述容器是移液管尖端、(一次性使用的)袋或(一次性使用的)袋的圆锥形/锥形部分。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤(i)中将所述悬浮培养物的部分吸取到所述容器中。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞是真核细胞如人细胞、真菌细胞如酵母细胞如P.pastoris、昆虫细胞如Drosophila melanogaster S2和Spodopterafrugiperda Sf9细胞、细菌细胞如E.coli、Streptomyces和Salmonella typhimurium细胞、或植物细胞。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞是悬浮培养的贴壁细胞。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞选自由原代细胞、从组织或器官获得的细胞、永生化细胞、多能干细胞组成的组，优选地所述细胞是多能干细胞，更优选诱导多能干细胞(iPSC)。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞选自由TC-1133、Gibco ATCCACS-1004的Human Episomal iPSC系、ATCC ACS-1021、ATCC ACS-1025、ATCC ACS-1027、ATCC ACS-1030、HEK293、HEK293T、BHK 21、CHO、NS0、Sp2/0-Ag14组成的组。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞是人的。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞是细胞聚集物，其中所述细胞聚集物优选具有约50至800μm、约150至800μm、至少约800μm、至少约600μm、至少约500μm、至少约400μm、至少约300μm、至少约200μm、至少约150μm、约300至500μm、约150至300μm、约50至150μm、约80至100μm、约180至250μm或约200至250μm的平均直径。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包括
(v)向所述悬浮培养物中添加与所述上清液等体积的培养基。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤(ii)中，使所述细胞沉降的时间为至少1min、至少2min、至少3min、至少4min、至少5min、至少6min、至少7min、至少8min、至少9min、至少10min、至少11min、至少12min、至少13min、至少14min、至少15min、至少16min、至少17min、至少18min、至少19min或至少20min。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤(iii)中，将步骤(i)中转移的所述细胞的至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97.5％、至少99％或基本上所有细胞分配(回)到所述悬浮培养物中。
15.根据权利要求1-7、9-10和12-14中任一项所述的方法，其中所述细胞在微载体颗粒上生长和/或其中所述悬浮培养物是微载体培养物。
16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤(ii)中，所述悬浮液的部分保持静止，从而使包含在所述悬浮液的部分中的细胞通过重力沉降在所述容器的底部的至少一个开口处。
17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤(i)中，所述悬浮液的部分通过所述容器的底部的至少一个开口转移到所述容器中。
18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤(iii)中，沉降在所述容器的底部的细胞通过所述容器的底部的至少一个开口分配(回)到所述悬浮培养物中。
CN202080085212.8A 2019-12-11 2020-12-11 用于悬浮细胞的自动培养基更换策略 Pending CN114846131A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP19215115.7A EP3835403A1 (en) 2019-12-11 2019-12-11 Automated medium exchange strategy for suspension cells
EP19215115.7 2019-12-11
PCT/EP2020/085663 WO2021116361A1 (en) 2019-12-11 2020-12-11 Automated medium exchange strategy for suspension cells

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN114846131A true CN114846131A (zh) 2022-08-02

Family

ID=68886743

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202080085212.8A Pending CN114846131A (zh) 2019-12-11 2020-12-11 用于悬浮细胞的自动培养基更换策略

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20230002718A1 (zh)
EP (2) EP3835403A1 (zh)
JP (1) JP2023505407A (zh)
KR (1) KR20220111250A (zh)
CN (1) CN114846131A (zh)
AU (1) AU2020401338A1 (zh)
CA (1) CA3152882A1 (zh)
WO (1) WO2021116361A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024056037A1 (zh) * 2022-09-14 2024-03-21 北京华龛生物科技有限公司 抽液装置、生物反应器以及抽液方法

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024008773A1 (en) 2022-07-05 2024-01-11 Repairon Gmbh Differentiation of ipscs in bioreactors

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104160013B (zh) * 2012-01-18 2017-07-28 拜尔健康护理有限责任公司 灌流式生物反应器系统及操作其的方法
US20170191022A1 (en) * 2012-03-15 2017-07-06 Flodesign Sonics, Inc. Bioreactor using acoustic standing waves
DK2840132T3 (en) 2013-08-22 2017-02-20 Georg-August-Universität Göttingen Stiftung Öffenlichen Rechts Universitätsmedizin Method of Manufacturing Constructed Heart Muscle (EHM)
SG11201601798RA (en) 2013-09-20 2016-04-28 Repairon Gmbh A method to direct differentiation of pluripotent stem cells into functional heart muscle
US9944894B2 (en) * 2015-01-16 2018-04-17 General Electric Company Pluripotent stem cell expansion and passage using a rocking platform bioreactor

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024056037A1 (zh) * 2022-09-14 2024-03-21 北京华龛生物科技有限公司 抽液装置、生物反应器以及抽液方法

Also Published As

Publication number Publication date
CA3152882A1 (en) 2021-06-17
JP2023505407A (ja) 2023-02-09
KR20220111250A (ko) 2022-08-09
WO2021116361A1 (en) 2021-06-17
AU2020401338A1 (en) 2022-04-21
EP3835403A1 (en) 2021-06-16
US20230002718A1 (en) 2023-01-05
EP4073220A1 (en) 2022-10-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101910685B1 (ko) 세포 수집 방법 및 시스템
Kehoe et al. Scalable stirred-suspension bioreactor culture of human pluripotent stem cells
Sargent et al. Hydrodynamic modulation of embryonic stem cell differentiation by rotary orbital suspension culture
CA2882108C (en) Three dimensional devices for supporting monolayer cell growth and methods of culturing cells therewith
US9102915B2 (en) In vitro expansion of postpartum-derived cells using microcarriers
US7790456B2 (en) Scalable process for cultivating undifferentiated stem cells in suspension
CN107075476B (zh) 使用水凝胶诱导干细胞三维成骨分化的方法
JP7510247B2 (ja) 細胞凝集塊を解離させる方法
JP2007535902A (ja) 自動細胞培養システムおよび方法
US20230002718A1 (en) Automated medium exchange strategy for suspension cells
Badenes et al. Microcarrier culture systems for stem cell manufacturing
Sart et al. Characterization of 3D pluripotent stem cell aggregates and the impact of their properties on bioprocessing
JP6475322B2 (ja) ３次元細胞培養システム及びこれを用いた細胞培養方法
KR20220113349A (ko) 생물반응기의 현탁액에서 줄기세포의 확장
US20240093155A1 (en) Method of changing culture medium of a culture using spinfilters
WO2024157985A1 (ja) 細胞凝集塊解離剤
EP3098304A1 (en) Hybrid cell detachment-free cell expansion system for adherent cell culturing and related proceeding protocol

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination