CN1148438C - 一种新的用于微生物液体培养的生物反应器 - Google Patents

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Abstract

本发明为解决丝状真菌特别是大型丝状真菌在传统机械搅拌反应器中液体培养时菌丝易破损、菌团结壁而不利于生长的难题，针对丝状真菌的生长特点专门设计发明了与现有气升反应器不同的、具有低回流区以及涉及升降循环比等其他特定参数的气升反应器(ALR/ff)，包括种液菌丝培养反应器与液体发酵反应器。本发明中还有新颖有效的脉冲流清壁器，以及适用于絮团状种液接种的双点式接种系统。该生物反应器还可用于部份丝状真菌在一般气升反应器中无法进行的变体积补料液体培养过程。

Description

一种新的用于微生物液体培养的生物反应器
本发明涉及微生物发酵工艺设备领域，具体地说本发明涉及一种新的具有低回流区的气升式反应器。具有以下的特点：反应器内的液流下降段Ad和上升段Ar比，即Ad/Ar值为1.00-2.00范围内，防止菌丝体纤维破损，形成菌絮团结壁。改变“内导流筒高度与反应器高度h/H之比”为≤0.50，有利于菌丝体的正常生长。该气升反应器包含有一层或多层脉冲流清壁器，和双点式接种系统。
丝状真菌及大型丝状真菌中许多都是工业微生物或药用菌，其细胞及其代谢产物的制备与生产具有明显的社会效益和可观的经济效益。特别是近年来国内外专家对药用大型丝状真菌细胞及其产物进行的生理生化、药理与临床研究结果表明了工业规模开发这类药用菌的必要性，从而在子实体栽培基础上正逐步形成可实施规模化生产的液体深层培养工艺。丝状真菌液体培养(特别是大型丝状真菌培养)工艺中的生物反应器(包括种液培养反应器与液体发酵反应器)目前多沿用非丝状微生物(例如细菌，放线菌等)培养的传统机械搅拌发酵罐。由于搅拌器产生的(特别是在较高转速时)液体内湍流剪切场、以及因流体表层旋涡的尾涡气穴与严重的气泡夹带产生的气泡在浆叶区发生剧烈而频繁的分散、聚并与破裂等过程，产生流体剪切使纤细的菌丝破损而影响生长，从而严重降低细胞培养效率。
气升式环流反应器是靠气体喷射形成流体循环而达到物质传递、氧传递与热量传递。由于其混合性能良好，供氧能力强，流场剪切力较低，而避免对细胞生长的不良影响(这些优点也是简单鼓泡式反应器无法比拟的)。
本发明为解决微生物液体培养，特别是大型丝状真菌(MacroFilamentous Fungi)在搅拌反应器中液体培养时菌丝易破损、菌团结壁而不利生长的难题，针对丝状真菌的生长特点，首创性地专门设计了与现有气升反应器不同的具有低回流区等特定结构参数及其他针对性结构的专用气升环流反应器(Air Lift Reactor for Filamentous fungi Cultivation，简称ALR/ff)。ALR/ff主要结构特征为：
1)用于明显好氧性、非丝状微生物(例如，许多细菌、放线菌)的气升环流反应器，主要考虑加强主体湍流、获取较高的氧传递效率KLa值。其关键参数之一的“液流下降段与上升段面积比Ad/Ar值常为0.80-0.90，有时甚至为0.10-0.40。而许多丝状真菌特别是大型丝状真菌具有不强烈的氧要求、多细胞菌丝体纤长易破损、易呈菌絮团结壁生长的生长特点。ALR/ff专用生物反应器的Ad/Ar参数设计值为1.00-2.00(图1)，种液菌丝培养反应器可取较高值。该设计以避免较强主体湍流场下造成过小的湍流旋涡尺度而多向剪切于细胞表面，以及防止狭窄的下降段截面增加菌丝团的结壁率。
2)以上提到的一般的气升环流反应器结构中，其关键参数之二，“内导流筒高度与反应器高度之比h/H”参数值通常＞0.60。ALR/ff专用生物反应器设计为低回流区/高分离区，即h/H参数值≤0.50(0.30-0.50)，种液菌丝培养反应器可取较低值。该设计的高分离区有利于减低待分离气泡(即气泡上升至液流主体与反应器顶部气流空间交界面处崩裂离析)的流速，以及增大气泡尺度、以减小气泡崩裂时菌丝的破损(气泡液膜吸附较多的菌丝体)。低回流区/高分离区使培养结果表现为菌丝生长均匀齐整。另外，较高的分离区可以允许对部份丝状真菌，特别是大型丝状真菌进行渐增体积的补料分批培养过程。因为可以保证补料过程中自始至终保持导流筒内外液体循环(设补料过程始、终体积时料液高度分别为h1、h2，令h1＞h2，补入体积高度差为(h2-h1))。
3)丝状真菌特别是大型丝状真菌生长过程菌絮团结壁不仅降低培养效率(Productivity)，而且阻碍传质、传热过程，以及影响菌丝形态控制，特别对种液菌丝培养的关系更为密切。进一步还对实施微机进行过程自控工作增加了麻烦。这是一个长期来困扰工艺的问题。菌团结壁主要发生在液面位置。本发明ALR/ff生物反应器设计有一层或多层脉冲流清壁器(图2)。使反应器消除结壁现象，还可以辅助解决气升反应器中经常发生的料液失水浓缩问题。该装置构思新颖、结构简单、投资低廉、清壁效果明显。
4)常用生物反应器的摇瓶种液接种操作常用压差法或火焰口倾倒法。后者难于操作又不能确保过程无菌。前者对于丝状真菌特别是大型丝状真菌的絮团状种液，不能通畅接种，而不得不加大压差或增加压差次数，操作繁琐不安全。ALR/ff生物反应器对接种法进行了改进，该反应器顶部设计有“双点式接种系统”。菌絮状接种液可以在平衡压下由液位差驱动而自然流入反应器内。整个接种过程简单、方便、安全、有效。
5)ALR/ff生物反应器结构适用于丝状真菌特别是大型丝状真菌的种液菌丝培养过程与液体发酵过程。附：图1，ALR/ff生物反应器主要结构图；图2，ALR/ff生物反应器的脉冲流清壁器结构图。
实现本发明的具体步骤如下：
ALR/ff生物反应器，可用耐压材质制成，最高工作温度130℃，最高工作压力1.5kg/cm2。主要结构请见图1。其中Ad/Ar参数设计值为1.00-2.00，种液菌丝培养反应器可取较高值；h/H参数值≤0.50(0.30-0.50)，种液菌丝培养反应器应取较低值。反应器的径高比D/H值取1∶4.0-5.0。以上参数值可用于实验室小型反应器设计及其放大到生产规模的反应器。另外，如用不锈钢材质，反应器加工时，焊缝必须双面焊并打光。反应器内壁有光洁度要求。
ALR/ff生物反应器的环状管式脉冲流清壁器的结构见图2。其结构特征在于环管相对于反应器壁的一侧，具有均匀分布的φ3mm孔，分布在环管上，孔的朝向，面向反应器内壁朝下形成45°角，由不锈钢制成。一层或多层。采用可调式定时阀据生长与结壁情况，按设定的脉冲波周期向易结壁位置喷射一定压力的无菌气流或无菌水流。当使用无菌水流时又可辅助解决气升反应器中经常发生的料液失水浓缩问题。
ALR/ff生物反应器装有“双点式接种系统”，结构见图3。装有待接种液的不锈钢材质专用接种器的上端与下端分别连有耐压软管及插入针(特制，针孔Ф6mm)，接种时通过无菌操作，分别插入反应器内。接种口由可替换的、严密紧压的、耐压耐高温弹性橡胶垫所封闭。接种液在平衡压下由液位差驱动下自然、平稳地流入反应器内。上述专用接种器由不锈钢制成，耐压不小于2kg/cm2，为圆柱形结构，柱壁一侧有耐压玻璃视镜，用于计量与观察内部种液情况。圆柱体顶端与下端分别连有上述耐压软管及插入针，它的顶端口与种液上方空气相通，下端口接有可控夹子或阀门与种液相接。
按照发明说明书内容及参照附图1、2、3的结构图可实现本发明不同规格(体积)的生物反应器的制作。
实施例一：实验室用2000ml的ALR/ff生物反应器。用耐压玻璃烧制成筒体及隔套(水浴控温用)，用不锈钢材质构成内导流筒、空气分布管及环管式脉冲流清壁器及反应器顶部具有双点式接种孔。设计参数采用Ad/Ar＝1.158，h/H＝0.420。用于培养药用丝状真菌A.blazei，罐压＜0.1kg/cm2，低通风量1∶1.0v.v.m.条件下，培养6天，菌丝干重可达13.01g/L。至今国内外报道采用其它反应器的该菌培养结果菌丝干重最高仅为3.20g/L。
实施例二：实验室中用作种液培养的1200ml ALR/ff生物反应器。制作方法及要求同实施例一。而设计参数则采用Ad/Ar＝1.980，h/H＝0.380。用作药用丝状真菌G.sinence的菌丝态种液培养。通风量1∶2.5v.v.m.，罐压＜0.1kg/cm2。不用在培养基内加入文献报道常用的促使菌丝分散均匀的增稠剂(如琼脂，纤维素等)。培养20小时，即可获得符合发酵用要求的均匀齐整的短丝状种液。文献报道常采用添加增稠剂方法使菌丝生长均匀齐整，但增稠剂的加入往往影响发酵产品的质量要求。
实施例三：生产用200立升ALR/ff生物反应器。该反应器全由不锈钢制成，包括环管状脉冲流清壁器以及双点式接种系统(见图1，2，3)。空气分布管及放料管设置在罐体底部。设计参数Ad/Ar＝1.08，h/H＝0.46。按发酵工程规范方法进行反应器相应的阀件、管件连接。用常规方法进行反应器空消与培养基实消，注意控制空气分布管进入的蒸气流量以保证料液在灭菌过程中的有效搅拌。用于生产药用丝状真菌灵芝发酵液。反应器的脉冲流清壁器用无菌空气以0.5小时周期连续工作，效果满意。用双点式接种系统正常接种10％接种量的丝状种液。周期五天，菌丝干重达到“企业标准”要求，并且获得的菌丝球外观齐整均匀，几无菌团结块物(该产品“企业标准”的主要指标之一)。与有关文献报道比较，使用其他反应器还未达到上述效果(例如，菌团结块呈大小不等的不定形物，常需进行二次分散性加工处理)。
为更好的理解本发明，做如下附图说明。
图1 ALR/ff生物反应器主要结构图
    Twi：  双点式接种系统
    Cle：  脉冲流清壁器
    H：    反应器筒体高度
    h：    内导流筒高度
    D：    反应器内径
    d：    内导流筒内径
    Ad：   反应器内液流下降段面积
    Ar：   反应器内液流上升段面积
    A-A：  A-A剖面俯视图
    Air：  空气进入口
图2脉冲流清壁器
    Cle：  脉冲流清壁器
    A：    由可控阀脉冲式喷射高压无菌空气或无菌水的入口
    R：    Ф3mm孔分布全圆周，每孔均匀间隔10mm
    I：    I剖面的局部放大图
图3双点式接种系统
    Twi：  双点式接种系统
    A：    接种器的两个插入针分别插入双孔
    R：    拧开A盖后插入针由胶塞插入
    I：    I剖面的局部放大图
参考文献：
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4)莫海涛等：化学反应工程与工艺，vol.14.No.1pp.92-96(1998).
5)“第七届全国生物化工学术会议”论文集，pp.55-58，pp.521-524，pp.525-528(1996).
6)[美]Leon hapidus，Neal R.Amundson.《Chemical Reactor Theory》，周佩正等译，石油工业出版社，1984。

Claims (4)

1、一种用于微生物液体培养的生物反应器，其特征在于反应器是一种具有低回流区的气升式反应器，反应器的液流下降段Ad与上升段Ar的比值为1.00-2.00的范围内，反应器中内导流筒高度h与反应器高度H之比，即h/H的参数设计值≤0.50，反应器中还设有一层或多层脉冲流清壁器和双点式接种系统。
2、根据权利要求1所述的一种用于微生物液体培养的生物反应器，其中所述的反应器设有一个或多个环状管式脉冲流清壁装置，该环状管式脉冲清壁装置的特征在于环管相对反应器壁的一侧具有均匀分布的Ф3mm孔，分布于全环管上，孔的朝向，面向反应器内壁向下，其角度为45°。
3、根据权利要求1所述的一种用于微生物液体培养的生物反应器，其特征在于所述的双点式接种系统是反应器设有二个接种孔，可分别与专用接种器的二端接种针相连。
4、根据权利要求1所述的反应器，其特征在于所述的二个接种孔是在反应器的顶部、由可替换的、严密紧压的、耐高压、耐高温、有弹性的橡胶垫所封闭，接种液可在平衡压下自然、平稳的流入反应器内，与此相配套的辅助装置，即专用接种器为由不锈钢材质制成的耐压圆柱形筒体，一侧有耐压玻璃液位视镜，筒体上、下端分别有软管及接种针相连。
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