CN114836489A - 3’-羟基染料木黄酮的制备方法 - Google Patents

3’-羟基染料木黄酮的制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN114836489A
CN114836489A CN202110509772.8A CN202110509772A CN114836489A CN 114836489 A CN114836489 A CN 114836489A CN 202110509772 A CN202110509772 A CN 202110509772A CN 114836489 A CN114836489 A CN 114836489A
Authority
CN
China
Prior art keywords
reaction
genistein
hydroxygenistein
solution
termination
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202110509772.8A
Other languages
English (en)
Inventor
陈正雄
陈佳琦
陈玉倩
陈政治
陈俊宏
吕梨萍
黄敬翔
刘士荣
杨佳勋
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bio Jourdeness International Group Co ltd
Original Assignee
Bio Jourdeness International Group Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bio Jourdeness International Group Co ltd filed Critical Bio Jourdeness International Group Co ltd
Publication of CN114836489A publication Critical patent/CN114836489A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
    • C12P17/06—Oxygen as only ring hetero atoms containing a six-membered hetero ring, e.g. fluorescein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0055—Oxidoreductases (1.) acting on diphenols and related substances as donors (1.10)
    • C12N9/0057—Oxidoreductases (1.) acting on diphenols and related substances as donors (1.10) with oxygen as acceptor (1.10.3)
    • C12N9/0059—Catechol oxidase (1.10.3.1), i.e. tyrosinase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y110/00—Oxidoreductases acting on diphenols and related substances as donors (1.10)
    • C12Y110/03—Oxidoreductases acting on diphenols and related substances as donors (1.10) with an oxygen as acceptor (1.10.3)
    • C12Y110/03001—Catechol oxidase (1.10.3.1), i.e. tyrosinase

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Pyrane Compounds (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)

Abstract

本发明提供一种3’‑羟基染料木黄酮的制备方法，包含下列步骤：构建一基因重组微生物，其表达酪氨酸酶；进行一反应基质配制步骤，所述反应基质包含硼酸盐、抗坏血酸和染料木黄酮；接着在该反应基质中接种所述基因重组微生物进行一生物转换反应步骤，以获得一生物转换物质；再在生物转换物质中加入盐酸溶液进行一终止反应步骤，以获得一反应液，其中反应液包含3’‑羟基染料木黄酮。由此，本发明提供的3’‑羟基染料木黄酮的制备方法可以大量制备高纯度的3’‑羟基染料木黄酮。

Description

3’-羟基染料木黄酮的制备方法
技术领域
本发明涉及一种含氧有机化合物的制备方法，具体涉及一种3’-羟基染料木黄酮的制备方法。
背景技术
染料木黄酮(genistein)为大豆异黄酮的一种主要活性因子，具有多种生理功能。染料木黄酮在结构上与哺乳动物的雌激素-雌二醇相似，具有雌激素的活性基团-二酚羟基，因此染料木黄酮具有类雌激素活性等多种生理活性，例如可以预防骨质疏松、改善更年期综合症、预防癌症(例如乳腺癌、结肠癌、肺癌、前列腺癌和皮肤癌)、预防阿兹海默症、延缓衰老作用、改善经期不适、降低胆固醇和调节血脂。
3’-羟基染料木黄酮(3’-hydroxygenistein，又称Orobol)为染料木黄酮的衍生物，异黄酮结构上的改变常会造成化合物的生物活性具有显著变化。例如染料木黄酮(genistein)在30μM～60μM浓度时会促进黑色素细胞加速生成黑色素，然而经过生物转换后的3’-羟基染料木黄酮却具有低剂量、高效能的皮肤美白效果，与其生物转换的前驱物具有相反的特性。另有研究指出，3’-羟基染料木黄酮具有抑制T47D致瘤性乳腺上皮细胞生长的活性，以及抑制HIV-1整合酶(HIV-1integrase)、抗发炎和保肝等活性。
然而，3’-羟基染料木黄酮的低生产率仍是阻碍其运用于保健食品或医药产品的主要因素。目前虽有方法可以用来制备得到3’-羟基染料木黄酮，但其产量仍然有限，且所制备而得的3’-羟基染料木黄酮的纯度不高。因此如何开拓出更佳方法以提高3’-羟基染料木黄酮的产量和纯度，成为目前相关产业的发展方向。
发明内容
本发明的目的是提供一种3’-羟基染料木黄酮的制备方法，包含以下步骤：构建一基因重组微生物，通过将一环状重组质粒转化至一微生物表达系统中，以得到基因重组微生物，其中所述环状重组质粒包含如序列辨识编号1所示的可表现出酪氨酸酶(tyrosinase)活性的基因；进行一反应基质配制步骤，其中所述反应基质包含最终浓度为400mM至600mM的硼酸盐、最终浓度为10mM至40mM的抗坏血酸以及最终浓度为500ppm至3000ppm的染料木黄酮；进行一生物转换反应步骤：在所述的反应基质中接种所述的基因重组微生物，并在一生物转换反应温度和一生物转换反应通气量下以一生物转换反应搅拌速度培养一生物转换反应时间，以获得一生物转换物质；再进行一终止反应步骤：在所述的生物转换物质中加入一盐酸溶液，并在一终止反应温度和一终止通气量下以一终止搅拌速度反应一终止反应时间，以获得一反应液，其中所述反应液包含3’-羟基染料木黄酮。
依据前述的3’-羟基染料木黄酮的制备方法，其中所述微生物表达系统可为酵母菌(Yeast)；优选地，其酵母菌为毕赤酵母菌(Pichia pastoris)。
依据前述的3’-羟基染料木黄酮的制备方法，其中反应基质配制步骤可包含以下步骤：将染料木黄酮溶于60mL二甲基亚砜(DMSO)，以得到一染料木黄酮溶液；将抗坏血酸溶于水，以得到一抗坏血酸溶液；将硼酸盐溶于一热水后，调节pH值达8至10，以得到一硼酸盐溶液；再将所述的染料木黄酮溶液和抗坏血酸溶液加入所述的硼酸盐溶液中，以得到所述反应基质。
依据前述的3’-羟基染料木黄酮的制备方法，其中生物转换反应温度可为40℃至60℃；生物转换反应通气量可为2L/min至5L/min，且生物转换反应搅拌速度可为200rpm至400rpm；生物转换反应时间可为250分钟至300分钟。
依据前述的3’-羟基染料木黄酮的制备方法，其中盐酸溶液的最终浓度可为100mM至200mM。
依据前述的3’-羟基染料木黄酮的制备方法，其中终止反应温度可为40℃至60℃；终止反应通气量可为2L/min至5L/min，且终止反应搅拌速度可为200rpm至400rpm；终止反应时间可为5分钟至15分钟。
依据前述的3’-羟基染料木黄酮的制备方法，还可包含一萃取步骤：在所述反应液中加入乙酸乙酯，并以一震荡转速重复震荡一震荡时间2～3次。
依据前述的3’-羟基染料木黄酮的制备方法，其中反应液与乙酸乙酯的体积比可为1：1至1.5：1。
依据前述的3’-羟基染料木黄酮的制备方法，其中震荡转速可为2000rpm至3000rpm，且每次震荡时间可为5分钟至20分钟。
由此，本发明的3’-羟基染料木黄酮的制备方法，以基因工程微生物进行3’-羟基染料木黄酮的转换，其制备方法可进行大规模工业化的生产，通过控制起始产物、生物转换反应条件等生产过程，使得所生产的3’-羟基染料木黄酮质量稳定且纯度高，故而解决3’-羟基染料木黄酮低生产率的问题。
附图说明
图1为3’-羟基染料木黄酮的制备方法的步骤流程图；
图2为挑菌后的菌株进行小体积发酵的结果示意图；
图3为酵母菌培养的温度影响示意图；
图4为酵母菌培养的pH影响示意图；
图5为酵母菌培养的铜离子浓度影响示意图；
图6为酵母菌培养在不同碳源中的影响示意图；
图7为酵母菌培养的葡萄糖浓度影响示意图；
图8为酵母菌中酪氨酸酶的pH稳定性示意图；
图9为酵母菌中酪氨酸酶的温度稳定性示意图；
图10为3’-羟基染料木黄酮标准品、染料木黄酮标准品的HPLC层析示意图；
图11为酵母菌转换3’-羟基染料木黄酮的HPLC层析示意图；
图12为酵母菌转换3’-羟基染料木黄酮的反应时间示意图；
图13为酵母菌转换3’-羟基染料木黄酮的转换率示意图。
附图标识
100：3’-羟基染料木黄酮的制备方法；
S1～S4：步骤。
具体实施方式
本发明提供的3’-羟基染料木黄酮的制备方法
制备例1
请参阅图1，图1为3’-羟基染料木黄酮的制备方法的之步骤流程图。图1中，3’-羟基染料木黄酮的制备方法100包含步骤S1、步骤S2、步骤S3以及步骤S4。
步骤S1为构建一基因重组微生物，通过将一环状重组质粒转化至一微生物表达系统中，以得到基因重组微生物，所述环状重组质粒包含如序列辨识编号1所示可表现出酪氨酸酶(tyrosinase)活性的基因。其中，所述微生物表达系统可为酵母菌(Yeast)；优选地，所述的酵母菌为毕赤酵母菌(Pichia pastoris)。
步骤S2为进行一反应基质配制步骤，其中所述反应基质包含最终浓度为400mM至600mM的硼酸盐、最终浓度为10mM至40mM的抗坏血酸以及最终浓度为500ppm至3000ppm的染料木黄酮。优选地，反应基质配制步骤可包含以下步骤：将染料木黄酮溶于60mL二甲基亚砜(DMSO)，以得到一染料木黄酮溶液；将抗坏血酸溶于水，以得到一抗坏血酸溶液；将硼酸盐溶于一热水后，调节pH值达8至10，以得到一硼酸盐溶液；再将染料木黄酮溶液和抗坏血酸溶液加入硼酸盐溶液中，以得到所述反应基质。
步骤S3为进行一生物转换反应步骤：在所述的反应基质中接种基因重组微生物，并在一生物转换反应温度和一生物转换反应通气量下以一生物转换反应搅拌速度培养一生物转换反应时间，以获得一生物转换物质。优选地，生物转换反应温度可为40℃至60℃；生物转换反应通气量可为2L/min至5L/min，且生物转换反应搅拌速度可为200rpm至400rpm；生物转换反应时间可为250分钟至300分钟。
步骤S4为进行一终止反应步骤：在所述的生物转换物质中加入一盐酸溶液，并在一终止反应温度和一终止通气量下以一终止搅拌速度反应一终止反应时间，以获得一反应液，其中所述反应液包含3’-羟基染料木黄酮。优选地，盐酸溶液的最终浓度可为100mM至200mM，终止反应温度可为40℃至60℃，终止反应通气量可为2L/min至5L/min，且终止反应搅拌速度可为200rpm至400rpm，终止反应时间可为5分钟至15分钟。
此外，3’-羟基染料木黄酮的制备方法100还可包含一萃取步骤：在所述反应液中加入乙酸乙酯，并以一震荡转速重复震荡一震荡时间2～3次。优选地，反应液与乙酸乙酯的体积比可为1：1至1.5：1，震荡转速可为2000rpm至3000rpm，且每次震荡时间可为5分钟至20分钟。
接下来通过结合具体实施例进一步详细说明本发明，用以有利于本发明所属技术领域的普通技术人员，可在不需过度解读的情形下完整利用并实施本发明，这些实施例仅用于示范说明本发明，指示如何实施本发明的材料及方法，不应将这些实施例视为对本发明范围的限制。
构建基因重组微生物
制备例2
在本实施例中，先构建环状重组质粒。所使用的表达载体为pGAPZαA载体(购自Thermo Fisher)，而插入片段(insert)为如序列辨识编号1所示的可表现出酪氨酸酶(tyrosinase)活性的基因，其源自巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)所抽取出的酪氨酸酶基因体，再以人工方式设计出可在酵母菌上表现出良好酪氨酸酶活性的人造基因。所使用的微生物表达系统为毕赤酵母菌X-33(购自Thermo Fisher)。
将内插子片段克隆(clone)至pGAPZαA载体，得到构建完成的环状重组质粒pGAPZαA-JDTYR。再将环状重组质粒pGAPZαA-JDTYR转化至毕赤酵母菌X-33((Pichia pastoris X-33)菌株(购自Thermo Fisher)，以形成基因重组微生物。转化的方式可以包含但不限定以氯化钙处理等化学方式或电穿孔等物理方式进行。
将前述构建完成的基因重组微生物活化后，挑选一单一菌落，种入5ml的YPD培养基(蛋白胨20g/L；酵母萃取物10g/L；葡萄糖20g/L；zeocin(博来霉素)1000μL/ml)，放置于30℃培养箱、250rpm下隔夜培养。取1mL菌液接种至含有50ml YPD培养基(含zeocin(博来霉素)1000μL/ml、硫酸铜0.1mM)的500mL锥形瓶中，以30℃、250rpm下培养3～4天。将菌液以6000xg、4℃离心10分钟去除上清液，取菌体进行冻干以获得冻干菌体。
酵母菌最佳培养条件试验
试验例1
基因重组微生物(酵母菌)的重组酪氨酸酶基因表现
请参阅图2，图2为挑菌后的菌株进行小体积发酵的结果示意图。图2中，所述菌株于YPD培养基中进行小体积发酵，四支样品管的内容物分别为含有基因重组后的毕赤酵母菌X-33以及L-Dopa(L-多巴)，其样品管中毕赤酵母菌添加量由左至右依次为1％、0.4％、0.2％、0.1％(重量百分比)，经反应后，颜色越黑表示L-Dopa转换黑色素量越高。由此初步结果可得知，此基因重组的毕赤酵母菌X-33具有酪氨酸酶活性，导入毕赤酵母菌X-33的可表现出酪氨酸酶(tyrosinase)活性的基因确实成功导入且有明显启动活性。
试验例2
温度对于基因重组微生物(酵母菌)的影响
挑选一单一菌落，接种入5mL YPD培养基(蛋白胨20g/L；酵母萃取物10g/L；葡萄糖20g/L；zeocin(博来霉素)1000μL/ml)，放置于30℃培养箱、250rpm下隔夜培养。取1mL菌液接种至有50ml YPD培养基(含zeocin(博来霉素)1000μL/ml、硫酸铜1mM)的500mL锥形瓶中，分别放置于20℃和30℃培养箱中，在250rpm下培养4天。
请参阅图3，图3为酵母菌培养的温度影响示意图。由图3所显示的结果可知，酵母菌培养于20℃和30℃，其酵素活性分别为15.8Unit/mL、9.8Unit/mL，培养于20℃的酵母菌有较高的活性。
试验例3
pH值对于基因重组微生物(酵母菌)的影响
挑选一单一菌落，接种入5mL YPD培养基(蛋白胨20g/L；酵母萃取物10g/L；葡萄糖20g/L；zeocin(博来霉素)1000μL/ml)，放置于30℃培养箱、250rpm下隔夜培养。取1mL菌液接种至有50ml BMGY培养基(磷酸钾缓冲液50mM、蛋白胨20g/L；酵母萃取物10g/L；葡萄糖20g/L；zeocin(博来霉素)1000μL/ml、硫酸铜1mM)的500mL锥形瓶中，放置于20℃培养箱中，在250rpm下培养4天。
将上述酵母菌培养于pH 5以及pH 6的环境中，观察在不同pH下其酵素活性变化。请参阅图4，图4为酵母菌培养的pH影响示意图。由图4所显示的结果可知，在pH 5以及pH 6的环境中，其酵母菌的酵素活性分别为3.2Unit/mL、3.9Unit/mL，并未有太大差异。
试验例4
铜离子浓度对于基因重组微生物(酵母菌)的影响
挑选一单一菌落，接种入5mL YPD培养基(蛋白胨20g/L；酵母萃取物10g/L；葡萄糖20g/L；zeocin(博来霉素)1000μL/ml)，放置于30℃培养箱、250rpm下隔夜培养。取1mL菌液接种至有50ml BMGY培养基(磷酸钾缓冲液50mM、蛋白胨20g/L；酵母萃取物10g/L；葡萄糖20g/L；zeocin(博来霉素)1000μL/ml、硫酸铜1mM)的500mL锥形瓶中，放置于20℃培养箱中，在250rpm下培养4天。取1mL菌液接种至不同铜离子浓度(0mM、0.1mM、1mM、2mM)的50mL YPD培养基(含zeocin(博来霉素)1000μL/ml)的500mL锥形瓶中，在20℃、250rpm下培养4天。
请参阅图5，图5为酵母菌培养的铜离子浓度影响示意图。由图5所显示的结果可知，将酵母菌培养在不同铜离子浓度0mM、0.1mM、1mM、2mM时，其活性分别为0.43、1.33、6.53、2.20Unit/mL，故酵母菌培养于1mM铜离子浓度中具有最高的活性。
试验例5
不同碳源对于基因重组微生物(酵母菌)的影响
挑选一单一菌落，接种入5mL YPD培养基(蛋白胨20g/L；酵母萃取物10g/L；葡萄糖20g/L；zeocin(博来霉素)1000μL/ml)，放置于30℃培养箱、250rpm下隔夜培养。取出1mL菌液接种至2％(重量百分比)不同碳源(葡萄糖、甘油、山梨糖醇)的50mL YPD培养基(蛋白胨20g/L；酵母萃取物20g/L；zeocin(博来霉素)1000μL/ml、硫酸铜1mM)的500mL锥形瓶中，在20℃、250rpm下培养4天。
请参阅图6，图6为酵母菌培养在不同碳源中的影响示意图。由图6所显示的结果可知，将酵母菌分别培养在2％的葡萄糖、甘油、山梨糖醇时，其活性分别为5.4、4.4、2.6Unit/mL，故酵母菌培养在葡萄糖中具有最高的活性。
试验例6
不同浓度的碳源对于基因重组微生物(酵母菌)的影响
挑选一单一菌落，接种入5mL YPD培养基(蛋白胨20g/L；酵母萃取物10g/L；葡萄糖20g/L；zeocin(博来霉素)1000μL/ml)，放置于30℃培养箱、250rpm下隔夜培养。取出1mL菌液接种至不同浓度的葡萄糖碳源(0g/L、20g/L、40g/L、60g/L)的50mL YPD培养基(蛋白胨20g/L；酵母萃取物10g/L；zeocin(博来霉素)1000μL/ml、硫酸铜1mM)的500mL锥形瓶中，在20℃、250rpm下培养4天。
请参阅图7，图7为酵母菌培养的葡萄糖浓度影响示意图。由图7所显示的结果可知，将酵母菌分别培养在葡萄糖浓度为0g/L、20g/L、40g/L、60g/L时，其活性分别为2.9、5.6、7.4、8.5Unit/mL，随着葡萄糖浓度越高，酪氨酸酶活性越强。
酵素活性稳定性试验
试验例7
不同pH值对于酪氨酸酶的稳定性
将冻干后的酵母菌粉取0.01g，以不同缓冲溶液稀释溶解(15mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠、50mM氯化钠、pH 6～8；15mM甘氨酸-氢氧化钠、50mM氯化钠、pH 9～10)，使其复溶最终浓度为1mg/ml，并于固定时间取样检测活性，实验方法：取100μL菌液加入900μL、2.5mML-DOPA，使用分光亮度计于475nm下测的吸光值，并计算活性。
请参阅图8，图8为酵母菌中酪氨酸酶的pH稳定性示意图。由图8所显示的结果可知，酵母菌的酪氨酸酶分别于pH 6、7、8、9、10环境下，0～6小时酵素可维持稳定，且在pH 9～10中有最高活性，但6小时后在各别pH值环境中酪氨酸酶活性皆有下降趋势。
试验例8
不同温度对于酪氨酸酶的稳定性
将冻干后的酵母菌粉取0.01g，以缓冲溶液pH 7.5复溶最终浓度1mg/mL，放置于30℃、37℃、40℃、50℃、60℃下，并于固定时间取样检测活性，实验方法：取100μL菌液加入900μL、2.5mM L-DOPA，使用分光光度计于475nm下测的吸光值，并计算活性。
请参阅图9，图9为酵母菌中酪氨酸酶的温度稳定性示意图。由图9所显示的结果可知，酵母菌的酪氨酸酶分别于30℃、37℃、40℃、50℃、60℃环境下，在6小时内有缓慢下降，温度在40℃、50℃有较高活性，且在50℃较为稳定，但6小时后在各温度下，酵素活性有快速下降的趋势。
综合以上酵母菌优化培养方式的试验，将成功转化后的酵母菌落，随机挑选单一菌落，接种入5mL YPD培养基(蛋白胨20g/L；酵母萃取物10g/L；葡萄糖20g/L；zeocin(博来霉素)1000μL/ml)，放置于30℃培养箱、250rpm下隔夜培养。取1mL菌液接种至有50mL YPD培养基(含蛋白胨20g/L；酵母萃取物10g/L；葡萄糖60g/L；zeocin(博来霉素)1000μL/ml、硫酸铜1mM)的500mL锥形瓶中，放置于pH 6、20℃培养箱中，以250rpm培养4天，可得最佳酪氨酸酶活性。本实验酵母菌的酪氨酸酶在pH 9～10，温度50℃时，有较佳的酪氨酸酶活性。
酵母菌发酵转换的3’-羟基染料木黄酮评估试验
酵母菌发酵转换的3’-羟基染料木黄酮的方法中，选择在pH 9的环境中进行转换反应，其温度控制在50℃，选此条件下进行酵母菌发酵转换3’-羟基染料木黄酮试验研究。
实施例1
建立3’-羟基染料木黄酮(3’-hydroxygenistein)以及染料木黄酮(genistein)的高效能液相层析仪(HPLC)分析方法。使用的仪器为高效能液相层析仪(LC-2040C 3D,SHIMADZU)，其对应使用的管柱为高效能液相层析仪管柱(Kinetex 2.6um polar C18,100x4.6mm)，分析条件如下表1所示。
表1
Figure BDA0003059879780000091
精秤0.0100g的3’-羟基染料木黄酮标准品、染料木黄酮标准品，并以DMSO(二甲基亚砜)稀释溶液定量至1mL为最高储备溶液100ppm，再取适当体积以甲醇(Methanol)往下稀释配制6.25、12.5、25、50、100ppm，以HPLC进行分析。
请参阅图10，图10为3’-羟基染料木黄酮标准品、染料木黄酮标准品的HPLC层析示意图。由图10所显示的结果可知，染料木黄酮的滞留时间(retention time,RT)为2.8分钟(min)，而3’-羟基染料木黄酮的滞留时间为2.6分钟(min)，通过这两者数据可判断染料木黄酮通过酵母菌发酵转换的3’-羟基染料木黄酮的效率。
实施例2
染料木黄酮转换量测定，其测定步骤如下：
1.分别于反应前(第0分钟)与反应期间，取0.1mL生物转换反应液，以甲醇稀释定量至1mL，利用超声波震荡3分钟。以0.22μm滤膜进行过滤至澄清，经HPLC分析其样品吸光值(面积)。
2.反应后分别在固定时间(如0、40、60、80、100、120min...等)取样进行转换率的含量检测。
3.将所得的吸光值套入公式并计算出染料木黄酮转换率。其公式如下所示：
转换率(％)＝[(反应前样品吸光值-反应后样品吸光值)/反应前样品吸光值]×100％
请参阅图11图12，图11为酵母菌转换3’-羟基染料木黄酮的HPLC层析示意图，图12为酵母菌转换3’-羟基染料木黄酮的反应时间示意图。由图11和图12所显示的结果可知，经HPLC检测在初始反应0min时，其染料木黄酮的滞留波峰在2.8min处，再反应150min后可看见染料木黄酮慢慢转换成3’-羟基染料木黄酮，其3’-羟基染料木黄酮滞留时间为2.6min，最终经300min时，转换率可达90.91±2.63％。具体转换率如下表2所示。
表2
Figure BDA0003059879780000101
Figure BDA0003059879780000111
实施例3
酵母菌生物转换的3’-羟基染料木黄酮含量测定，其测定步骤如下：
1.取0.01g样品，以甲醇稀释定量至10mL，利用超声波震荡10分钟，将样品完全溶解至澄清透明。
2.从稀释10倍的样品中，取0.1mL稀释至1mL，进行样品测定。
3.以0.22μm滤膜过滤至澄清，经HPLC分析其样品浓度。
4.将所得的浓度套入公式并计算出3’-羟基染料木黄酮含量。其公式如下所示：
含量(％)＝[(由检量线求得浓度(μg/mL)×稀释体积(mL)×10-6)/称取克数]×100％
请参阅图13，图13为酵母菌转换3’-羟基染料木黄酮的转换率示意图。由图13所显示的结果可知，其染料木黄酮的转换率在300min时为91.18％，且纯度达25％以上，产量平均约为10g。具体纯度及产量如下表3所示。
表3
Figure BDA0003059879780000112
综上所述，本发明的3’-羟基染料木黄酮的制备方法，以基因工程微生物进行3’-羟基染料木黄酮的转换，其制备方法可进行大规模工业化的生产，通过控制起始产物、生物转换反应条件等生产制程，使得所制得的3’-羟基染料木黄酮质量稳定且纯度高，故而解决3’-羟基染料木黄酮低生产率的问题。此外，所制得的3’-羟基染料木黄酮可进一步配制高产量的液态原料，且所配制的液态原料具有高稳定性，所以本发明提供的3’-羟基染料木黄酮的制备方法所制得的3’-羟基染料木黄酮可应用于化妆品组合物、生医药组合物、饲料组合物、饮料组合物、营养补充组合物、食用组合物以及保健食用组合物上，具有运用于生医保健市场的潜能。
尽管本发明已通过上述实施例做了详细介绍，但应当认识到上述描述不应被认为是对本发明的限定，任何熟习此技术的本领域人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作各种的更改与修饰，因此本发明的保护范围当视权利要求书所界定的为准。
序列表
<110> 佐登妮丝国际股份有限公司
<120> 3’-羟基染料木黄酮的制备方法
<141> 2021-05-10
<150> 110103721
<151> 2021-02-01
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 996
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> gene
<223> 可于酵母菌(Pichia pastoris)上表现出酪氨酸酶活性的基因
<400> 1
gaattcatgt ctaataaata cagagtccgt aagaatgtcc ttcatttgac cgatactgag 60
aaaagagact ttgtaagaac agtgctgatt ttgaaggaga agggaatcta tgatagatac 120
atcgcttggc atggcgcagc aggtaagttc catactcccc ctggttctga tagaaacgca 180
gctcacatgt cttcagcttt cctgccatgg catagagaat atttactgcg tttcgaaaga 240
gatttgcaat caattaaccc tgaggtcaca ctgccttact gggaatggga aactgatgca 300
caaatgcaag acccaagtca atctcaaatt tggtctgcag actttatggg tggtaatgga 360
aacccaataa aggacttcat agtggatacc ggtccatttg ctgcaggacg ttggacaacc 420
attgatgaac aaggcaatcc ttccggtggt ttgaagagaa actttggtgc aaccaaggaa 480
gcccctactt taccaacaag agatgatgtg ctaaatgcac ttaaaataac ccaatacgac 540
acacctccct gggacatgac cagtcaaaac tctttcagga atcagttgga gggctttatt 600
aatggtccac aactgcacaa tcgtgttcat aggtgggttg gaggccaaat gggagtggtt 660
ccaaccgccc caaatgaccc tgttttcttt cttcaccacg caaacgtgga tagaatttgg 720
gctgtgtggc aaatcgtgca ccgaaaccag aattaccagc ctatgaaaaa cggaccattc 780
ggacaaaatt tcagagaccc aatgtaccca tggaacacta cccctgaaga cgttatgaat 840
catagaaagc ttggctacgt gtatgacatt gaacttcgta aatcaaagag aagttcggta 900
cctcgagccg cggcggccgc cagctttcta gaacaaaaac tcatctcaga agaggatctg 960
aatagcgccg tcgaccatca tcatcatcat cattga 996

Claims (9)

1.一种3’-羟基染料木黄酮的制备方法，其特征在于，该制备方法包含：
构建基因重组微生物，通过将环状重组质粒转化至微生物表达系统中，以得到所述的基因重组微生物，其中所述的环状重组质粒包含如序列辨识编号1所示的可表现出酪氨酸酶(tyrosinase)活性的基因；
进行反应基质配制步骤，其中该反应基质包含最终浓度为400mM至600mM的硼酸盐、最终浓度为10mM至40mM的抗坏血酸以及最终浓度为500ppm至3000ppm的染料木黄酮；
进行生物转换反应步骤：在所述的反应基质中接种所述的基因重组微生物，并在生物转换反应温度和生物转换反应通气量下以生物转换反应搅拌速度培养生物转换反应时间，以获得生物转换物质；以及
进行终止反应步骤：在所述的生物转换物质中加入盐酸溶液，并在终止反应温度和终止通气量下以终止搅拌速度反应终止反应时间，以获得反应液，其中该反应液包含3’-羟基染料木黄酮。
2.如权利要求1所述的3’-羟基染料木黄酮的制备方法，其特征在于，所述的微生物表达系统为毕赤酵母菌。
3.如权利要求1所述的3’-羟基染料木黄酮的制备方法，其特征在于，所述的反应基质配制步骤包含：
将染料木黄酮溶于二甲基亚砜，以得到染料木黄酮溶液；
将抗坏血酸溶于水，以得到抗坏血酸溶液；
将硼酸盐溶于热水后，调节pH值达8至10，以得到硼酸盐溶液；以及
将所述的染料木黄酮溶液和抗坏血酸溶液加入该硼酸盐溶液中，以得到所述的反应基质。
4.如权利要求1所述的3’-羟基染料木黄酮的制备方法，其特征在于，所述的生物转换反应步骤中：所述的生物转换反应温度为40℃至60℃，所述的生物转换反应通气量为2L/min至5L/min，所述的生物转换反应搅拌速度为200rpm至400rpm，以及所述的生物转换反应时间为250分钟至300分钟。
5.如权利要求1所述的3’-羟基染料木黄酮的制备方法，其特征在于，所述的终止反应步骤中：所述的盐酸溶液的最终浓度为100mM至200mM，所述的终止反应温度为40℃至60℃，所述的终止反应通气量为2L/min至5L/min，所述的终止反应搅拌速度为200rpm至400rpm，以及所述的终止反应时间为5分钟至15分钟。
6.如权利要求1所述的3’-羟基染料木黄酮的制备方法，其特征在于，还可包含一萃取步骤：在所述的反应液中加入乙酸乙酯，并以一震荡转速重复震荡一震荡时间2～3次。
7.如权利要求6所述的3’-羟基染料木黄酮的制备方法，其特征在于，所述的反应液与所述的乙酸乙酯的体积比为1：1至1.5：1。
8.如权利要求6所述的3’-羟基染料木黄酮的制备方法，其特征在于，所述的震荡转速为2000rpm至3000rpm，所述的震荡时间为5分钟至20分钟。
9.如权利要求2所述的3’-羟基染料木黄酮的制备方法，其特征在于，所述的基因重组微生物在pH 9～10、温度为50℃的条件下，有较佳的酪氨酸酶活性。
CN202110509772.8A 2021-02-01 2021-05-11 3’-羟基染料木黄酮的制备方法 Pending CN114836489A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
TW110103721A TWI781527B (zh) 2021-02-01 2021-02-01 3'-羥基染料木黃酮之製備方法
TW110103721 2021-02-01

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN114836489A true CN114836489A (zh) 2022-08-02

Family

ID=82562084

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110509772.8A Pending CN114836489A (zh) 2021-02-01 2021-05-11 3’-羟基染料木黄酮的制备方法

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN114836489A (zh)
TW (1) TWI781527B (zh)

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW201602350A (zh) * 2014-07-08 2016-01-16 國立臺南大學 具抑制黑色素生成能力之類黃酮代謝產物及其製備方法
TWI545198B (zh) * 2015-09-15 2016-08-11 嘉藥學校財團法人嘉南藥理大學 製備鄰位-羥基異黃酮的方法
CN106166119A (zh) * 2015-05-21 2016-11-30 佐登妮丝国际股份有限公司 3’-羟基染料木黄酮用于制备抑制黑色素生成的组合物的用途
TWI602580B (zh) * 2016-11-14 2017-10-21 國立臺南大學 具美白與抗老化之3’-羥基異黃酮糖苷及其製備方法與用途
TW201832764A (zh) * 2017-03-06 2018-09-16 嘉藥學校財團法人嘉南藥理大學 3’-甲氧基染料木黃酮於抑制或治療黑色素瘤之用途
CN109825518A (zh) * 2019-02-25 2019-05-31 佐登妮丝（广州）美容化妆品有限公司 3′-羟基染料木黄酮的制备方法及其用途
TW202014520A (zh) * 2018-10-11 2020-04-16 佐登妮絲國際股份有限公司 ３’－羥基染料木黃酮之製備方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW201602350A (zh) * 2014-07-08 2016-01-16 國立臺南大學 具抑制黑色素生成能力之類黃酮代謝產物及其製備方法
CN106166119A (zh) * 2015-05-21 2016-11-30 佐登妮丝国际股份有限公司 3’-羟基染料木黄酮用于制备抑制黑色素生成的组合物的用途
TWI545198B (zh) * 2015-09-15 2016-08-11 嘉藥學校財團法人嘉南藥理大學 製備鄰位-羥基異黃酮的方法
TWI602580B (zh) * 2016-11-14 2017-10-21 國立臺南大學 具美白與抗老化之3’-羥基異黃酮糖苷及其製備方法與用途
TW201832764A (zh) * 2017-03-06 2018-09-16 嘉藥學校財團法人嘉南藥理大學 3’-甲氧基染料木黃酮於抑制或治療黑色素瘤之用途
TW202014520A (zh) * 2018-10-11 2020-04-16 佐登妮絲國際股份有限公司 ３’－羥基染料木黃酮之製備方法
CN109825518A (zh) * 2019-02-25 2019-05-31 佐登妮丝（广州）美容化妆品有限公司 3′-羟基染料木黄酮的制备方法及其用途

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHIEN-MIN CHIANG ET AL.: ""Production and Anti-Melanoma Activity of Methoxyisoflavones from the Biotransformation of Genistein by Two Recombinant Escherichia coli Strains"", 《MOLECULES》, vol. 22, no. 87, 4 January 2017 (2017-01-04), pages 1 - 9 *
赵晓佳等: ""大豆异黄酮微生物转化研究进展"", 《微生物学报》, vol. 60, no. 2, 5 September 2019 (2019-09-05), pages 211 - 226 *

Also Published As

Publication number Publication date
TW202231870A (zh) 2022-08-16
TWI781527B (zh) 2022-10-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11198890B2 (en) Preparation of (R)-3-hydroxybutyric acid or its salts by one-step fermentation
CN109439701B (zh) 生物合成制备麦角硫因的方法和发酵培养基
KR102102241B1 (ko) 유글레나속 미세 조류, 다당류의 제조 방법, 및 유기 화합물의 제조 방법
CN106191170B (zh) 一种酶法制备三磷酸腺苷的方法
Zahan et al. Monitoring the effect of pH on bacterial cellulose production and Acetobacter xylinum 0416 growth in a rotary discs reactor
Petruccioli et al. Effect of stirrer speed and buffering agents on the production of glucose oxidase and catalase by Penicillium variabile (P16) in benchtop bioreactor
JP7225086B2 (ja) 新規微生物、およびそれを用いたウロリチン類の製造方法
US20230220428A1 (en) Yeast strain and use thereof and preparation method of ergothioneine
CN114703113B (zh) 一株重组拟无枝酸菌、其构建方法及应用
CN112538504A (zh) 利用混菌发酵生产2-苯乙醇的方法
CN102220396A (zh) 阿卡波糖简易的发酵方法
CN114836489A (zh) 3’-羟基染料木黄酮的制备方法
Abi et al. Improved laminaribiose phosphorylase production by Euglena gracilis in a bioreactor: a comparative study of different cultivation methods
CN109971651B (zh) 一种烟草内生真菌及其在制备麦角甾醇5,8过氧化物中的应用
CN107723300B (zh) 过表达CgGsh1基因提高产甘油假丝酵母2-苯乙醇耐受性及产量
CN110004099A (zh) 一种红景天苷的发酵生产方法
CN113502306A (zh) 一种催化香紫苏醇生产香紫苏内酯的方法
WO2008052630A1 (en) Semi-continuous fermentation process for pantothenate production
CN102399845A (zh) 基于尾气中co2浓度的维生素b12发酵生产控制工艺
CN113817795B (zh) 一种醋酸泼尼松的发酵方法
CN113881735B (zh) 一种麦芽糖浆的制备方法及其应用
CN115820471A (zh) 一种利用微生物发酵法提取蛋白核小球藻蛋白的方法
KR101058246B1 (ko) 코엔자임 ｑ10 생성능을 가지는 로도박터 스페어로이즈를 이용한 코엔자임 ｑ10의 대량생산 방법
CN111073830B (zh) 一株高产γ-谷氨酰转肽酶的干酪乳杆菌及其在L-茶氨酸生产中的应用
CN106591155A (zh) 尖孢镰刀菌株及其在制备3β，7α，15α‑三羟基雄甾‑5‑烯‑17‑酮中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination