CN114836404B

CN114836404B - 一种复合耐热纤维素酶及其制备方法和应用

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Publication number: CN114836404B
Application number: CN202210647486.2A
Authority: CN
Inventors: 王珊珊; 张涛; 王令; 路宏朝
Original assignee: Shaanxi University of Technology
Current assignee: Shaanxi University of Technology
Priority date: 2022-06-09
Filing date: 2022-06-09
Publication date: 2023-04-25
Anticipated expiration: 2042-06-09
Also published as: CN114836404A

Abstract

本发明属于酶工程技术领域。本发明提供了一种复合耐热纤维素酶制剂，主要包括葡聚糖内切酶和葡聚糖外切酶。本发明还提供了一种复合耐热纤维素酶制剂的制备过程，具体包括葡聚糖内切酶的制备过程和葡聚糖外切酶的制备过程。另外，本发明中还提供了所述复合耐热纤维素酶制剂在降解秸秆上的应用，并进一步给出了应用的具体方法。本发明所述的复合耐热纤维素酶制剂能够高效降解秸秆，为生态农业推广奠定了技术基础。

Description

一种复合耐热纤维素酶及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及酶工程技术领域，尤其涉及一种利用基因工程制备高活性耐热复合纤维素酶的过程及其在酶解秸秆中的应用。

背景技术

生物质纤维素是地球上蕴藏丰富、分布广泛且廉价易得的可再生资源。有效开发和综合利用纤维素资源，对解决能源危机、环境污染、粮食安全具有重要的战略意义，也是促进我国绿色可持续发展的有效途径。我国是农业大国，农业生物质资源种类繁多且数量巨大。特别是农作物秸秆大部分地区违规焚烧，不仅生物质资源浪费十分严重，同时造成环境污染、破坏土壤结构、对人体产生极大的危害等不良后果。因此，农作物秸秆的综合利用及其资源化利用成为当今可持续发展中的重要课题。

农作物秸秆的主要成分是纤维素。纤维素酶是一类能够切开β-1,4-糖苷键将纤维素最终降解为葡萄糖的多组分酶系总称。纤维素酶降解纤维素是酶的各组分之间协同作用的结果，包括葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶。其中，葡聚糖内切酶作用于纤维素内部的非结晶区，随机水解β-1,4-糖苷键，将长链纤维素分子截短，产生大量含非还原性末端的小分子纤维素；葡聚糖外切酶作用于纤维素线状分子末端，每次切下一个纤维寡糖(或纤维二糖)分子；β-葡萄糖苷酶BG将纤维二糖和寡糖水解成葡萄糖分子。酶法水解具有转化率高、耗能少、反应条件温和、特异性强的优势。一直以来，开发高效纤维素酶制剂是国内外研究的热点，特别是开发耐热特性的纤维素酶具有重要的现实意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种复合耐热纤维素酶制剂及其制备方法和应用，本发明所述技术方案制备的复合耐热纤维素酶制剂不仅能够克服纤维素酶热稳定性差和半衰期短的问题，还能够高效降解秸秆。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种复合耐热纤维素酶制剂，所述复合耐热纤维素酶制剂包括葡聚糖内切酶和葡聚糖外切酶。

作为优选，所述葡聚糖内切酶和葡聚糖外切酶的摩尔比为0.5-2:1。

本发明还提供了一种复合耐热纤维素酶制剂的制备方法，所述具体包括葡聚糖内切酶的制备过程和葡聚糖外切酶的制备过程。

作为优选，所述葡聚糖内切酶的制备过程，具体步骤如下：

(a1)将所述葡聚糖内切酶的编码基因插入到质粒中获得重组质粒，将所述重组质粒转化至宿主菌中，然后接种至自诱导培养基培养获得发酵液；

(a2)将所述发酵液经离心，固液分离后得湿菌体；将所得湿菌体经细胞破碎处理后，固液分离获得全细胞上清蛋白；

(a3)将所述全细胞上清蛋白通过热处理、真空冷冻操作后，即可获得葡聚糖内切酶；

作为优选，所述葡聚糖外切酶的制备过程，具体步骤如下：

(b1)将所述葡聚糖外切酶的编码基因插入到质粒中获得重组质粒，将所述重组质粒转化至宿主菌中，然后接种至自诱导培养基培养获得发酵液；

(b2)将所述发酵液经离心，固液分离后得湿菌体；将所得湿菌体经细胞破碎处理后，固液分离获得包涵体沉淀；

(b3)将所述包涵体沉淀通过变性、复性、浓缩以及真空冷冻操作后，即可获得葡聚糖外切酶。

作为优选，所述葡聚糖内切酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

作为优选，所述葡聚糖外切酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明还提供了一种复合耐热纤维素酶制剂在降解秸秆上的应用。

作为优选，所述复合耐热纤维素酶制剂在降解秸秆上的应用包括如下步骤：

(c1)将秸秆粉碎后，与丁二酸溶液混合获得秸秆悬液；

(c2)将所述秸秆悬液与所述复合耐热纤维素酶制剂混合，获得混合物，进行酶解反应；

在1L所述混合物中，每添加1000mg的秸秆悬液就需要添加10-50μmol的复合耐热纤维素酶制剂

作为优选，步骤(c1)所述秸秆在粉碎前还包括烘干的步骤，所述烘干的温度为50-65℃，所述烘干的时间为20-25h。

作为优选，步骤(c1)所述粉碎后还包括筛分的步骤，筛网的孔径为0.20-0.28mm。

作为优选，步骤(c1)所述秸秆与丁二酸溶液的质量体积比为0.01-0.03g:8-11ml。

作为优选，步骤(c1)所述丁二酸溶液的浓度为40-60mM。

作为优选，步骤(c2)所述酶解的温度为60-75℃，所述酶解的时间为50-70h，所述酶解的pH为5.8-6.2。

通过采用上述技术方案，本发明具有如下有益效果：

1.基于生物信息学分析，利用大肠杆菌表达系统，分别克隆表达获得耐热葡聚糖内切酶和葡聚糖外切酶。

2.制备复合耐热纤维素酶制剂，得到的复合耐热纤维素酶制剂，通过协同作用的降解机制对秸秆进行作用，增强了对秸秆的水解能力，达到高效降解的目的。

附图说明

图1为重组载体pET28-EG12B的构建(A图为菌落PCR鉴定结果；B图为酶切鉴定结果；C图为重组质粒pET28-EG12B示意图)；

图2为重组酶EG12B的诱导表达及分离纯化(A图为重组菌的产物表达情况；B图为重组酶EG12B的纯化情况)；

图3为葡聚糖内切酶的制备流程；

图4为重组质粒pET22-CelS的构建(A图为酶切鉴定结果；B图为重组质粒pET22-CelS示意图)；

图5为重组酶CelS的诱导表达及分离纯化(左图为重组菌的产物表达情况；右图为重组酶CelS的纯化情况)；

图6为葡聚糖外切酶的制备流程；

图7为葡萄糖标准曲线。

具体实施方式

本发明提供了一种复合耐热纤维素酶制剂，该复合耐热纤维素酶制剂包括葡聚糖内切酶和葡聚糖外切酶。

在本发明中，所述葡聚糖内切酶和葡聚糖外切酶的摩尔比为0.5-2:1，进一步优选为1-2:1，更进一步优选为1:1。

在本发明中，所述葡聚糖内切酶来源于海栖热袍菌中的潜在耐热葡聚糖内切酶EG12B(NCBI登录号：NP_229325)信号肽序列中的成熟肽24-274区，该葡聚糖内切酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：

SVGATDISFNGFPVTMELNFWNVKSYEGETWLKFDGEKVEFYADLYNIVLQNPDSWVHGYPEIYYGYKPWAGHNSGVEFLPVKVKDLPDFYVTLDYSIWYENNLPINLAMETWITRSPDQTSVSSGDAEIMVWFYNNVLMPGGQKVDEFTTTVEINGVKQETKWDVYFAPWGWDYLAFRLTTPMKEGKVKINVKDFVQKAAEVVKKHSTRIDNFEELYFCVWEIGTEFGDPNTTAAKFGWTFRDFSVEVVKTR。

在本发明中，所述葡聚糖外切酶来源于热纤梭菌中的潜在耐热葡聚糖外切酶CelS(GenBank登录号：L06942)信号肽序列中的成熟肽28-741区，该葡聚糖外切酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：

GPTKAPTKDGTSYKDLFLELYGKIKDPKNGYFSPDEGIPYHSIETLIVEAPDYGHVTTSEAFSYYVWLEAMYGNLTGNWSGVETAWKVMEDWIIPDSTEQPGMSSYNPNSPATYADEYEDPSYYPSELKFDTVRVGSDPVHNDLVSAYGPNMYLMHWLMDVDNWYGFGTGTRATFINTFQRGEQESTWETIPHPSIEEFKYGGPNGFLDLFTKDRSYAKQWRYTNAPDAEGRAIQAVYWANKWAKEQGKGSAVASVVSKAAKMGDFLRNDMFDKYFMKIGAQDKTPATGYDSAHYLMAWYTAWGGGIGASWAWKIGCSHAHFGYQNPFQGWVSATQSDFAPKSSNGKRDWTTSYKRQLEFYQWLQSAEGGIAGGATNSWNGRYEKYPAGTSTFYGMAYVPHPVYADPGSNQWFGFQAWSMQRVMEYYLETGDSSVKNLIKKWVDWVMSEIKLYDDGTFAIPSDLEWSGQPDTWTGTYTGNPNLHVRVTSYGTDLGVAGSLANALATYAAATERWEGKLDTKARDMAAELVNRAWYNFYCSEGKGVVTEEARADYKRFFEQEVYVPAGWSGTMPNGDKIQPGIKFIDIRTKYRQDPYYDIVYQAYLRGEAPVLNYHRFWHEVDLAVAMGVLATYFPDMTYKVPGTPSTKLYGDVNDDGKVNSTDAVALKRYVLRSGISINTDNADLNEDGRVNSTDLGILKRYILKEIDTLPYKN。

本发明中还提供了所述复合耐热纤维素酶制剂的制备方法，具体包括葡聚糖内切酶的制备过程和葡聚糖外切酶的制备过程。

本发明中所述葡聚糖内切酶的制备过程的具体步骤如下：

(a3)将所述全细胞上清蛋白通过热处理、真空冷冻操作后，即可获得葡聚糖内切酶。

在本发明中，步骤(a1)中所述葡聚糖内切酶的编码基因序列为CAI值优化至0.80-0.96的EG12B基因序列；所述的表达质粒优选为pET28a、pET32a中的任一种；所述培养的温度为20-28℃，所述培养的时间为20-27h。

在本发明中，步骤(a2)中所述发酵液离心的转速为4000rpm-8000rpm，进一步优选为5000rpm-7000rpm；所述发酵液离心的时间为20-35min，进一步优选为25-30min。所述获得全细胞上清蛋白的离心转速为10000rpm-15000rpm，进一步优选为12000rpm-13000rpm；所述获得全细胞上清蛋白的离心时间为20-35min，进一步优选为25-30min；所述获得全细胞上清蛋白的离心温度为2-6℃，进一步优选为3-4℃。

在本发明中，步骤(a3)中所述热处理的温度为40-60℃，进一步优选为40-50℃；所述热处理的时间为5-15min，进一步优化为8-12min。所述真空冷冻干燥的温度为-30～-60℃，进一步优选为-40～-50℃；所述真空冷冻干燥的真空度为10-15帕，进一步优选为10-13帕；所述真空冷冻干燥的时间为8-15h，进一步优选为10-12h。

在本发明中，所述葡聚糖内切酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示：

TCTGTTGGCGCCACAGATATTAGCTTTAATGGCTTTCCGGTGACAATGGAACTGAATTTTTGGAATGTTAAGTCTTACGAAGGTGAAACATGGCTGAAATTTGATGGTGAAAAAGTTGAATTCTACGCCGATCTGTATAATATTGTTCTGCAGAATCCGGATAGCTGGGTGCATGGCTATCCGGAAATCTATTATGGTTATAAACCGTGGGCCGGCCATAATAGCGGTGTGGAATTTCTGCCGGTGAAAGTGAAAGATCTGCCGGATTTTTATGTGACCCTGGATTATAGCATTTGGTATGAAAATAACCTGCCGATTAATCTGGCCATGGAAACCTGGATTACACGTTCTCCGGATCAGACCTCTGTTTCTTCTGGTGACGCAGAAATTATGGTTTGGTTTTATAATAACGTGCTGATGCCGGGCGGCCAGAAAGTTGATGAATTCACTACAACCGTTGAAATTAATGGTGTGAAACAGGAAACAAAATGGGATGTGTATTTTGCCCCGTGGGGTTGGGATTATCTGGCATTTCGCCTGACCACCCCGATGAAAGAAGGTAAAGTTAAAATTAACGTGAAGGATTTCGTGCAGAAAGCAGCCGAAGTGGTTAAAAAACATTCTACCCGTATTGATAACTTCGAAGAACTGTATTTTTGCGTTTGGGAAATTGGCACCGAATTTGGTGACCCGAATACCACAGCCGCCAAATTTGGTTGGACATTTCGTGATTTTAGCGTTGAAGTGGTGAAAACACGT。

本发明中所述葡聚糖外切酶的制备过程的具体步骤如下：

在本发明中，步骤(b1)中所述葡聚糖外切酶的编码基因序列为优化后的CelS基因序列；所述的表达质粒优选为pET22b、pET28a中的任一种；所述培养的温度为20-28℃，所述培养的时间为20-27h。

在本发明中，步骤(b2)中所述发酵液离心的转速为4000rpm-8000rpm，进一步优选为5000rpm-7000rpm；所述发酵液离心的时间为20-35min，进一步优选为25-30min。所述获得包涵体沉淀的离心转速为10000rpm-15000rpm，进一步优选为12000rpm-13000rpm；所述获得包涵体沉淀的离心时间为20-35min，进一步优选为25-30min；所述获得包涵体沉淀的离心温度为2-6℃，进一步优选为3-4℃。

在本发明中，步骤(b3)中所述变性前还包括洗涤操作，所述洗涤液由25mmol/LTris-HCl、2mol/L尿素、0.5mol/L NaCl、1mmol/L EDTA、2％TritonX-100组成的，所述洗涤液的pH＝8.0。所述变性液由25mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)、8mol/L尿素、0.5mol/L NaCl、0.2mmol/L DTT、2％TritonX-100组成，所述变性时间为20-60min，进一步优选为30-60min。所述复性液pH＝8.0，由25mmol/LTris-HCl、2-6mol/L尿素、0.3-0.8mol/LNaCl组成；所述真空冷冻干燥的真空度为10-15帕，进一步优选为10-13帕；所述真空冷冻干燥的时间为8-15h，进一步优选为10-12h。

在本发明中，所述葡聚糖外切酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示：

GGTCCGACCAAAGCCCCGACCAAAGATGGCACCAGCTATAAAGATCTGTTTCTGGAACTGTATGGTAAAATTAAGGACCCTAAAAATGGTTATTTCAGTCCGGATGAAGGTATTCCGTATCATAGCATTGAAACCCTGATTGTGGAAGCCCCGGATTATGGTCATGTTACCACCAGCGAAGCATTTTCATATTATGTGTGGCTGGAAGCCATGTATGGTAATCTGACCGGTAATTGGAGTGGTGTTGAAACCGCATGGAAAGTTATGGAAGATTGGATTATTCCGGATAGCACCGAACAGCCGGGCATGAGCAGTTATAATCCGAATAGTCCGGCCACCTATGCCGATGAATATGAAGATCCGAGCTATTATCCGAGTGAACTGAAATTTGATACCGTTCGCGTTGGTAGCGATCCGGTTCATAATGATCTGGTGAGTGCATACGGTCCGAATATGTATCTGATGCATTGGCTGATGGATGTGGATAATTGGTATGGTTTTGGTACAGGCACCCGTGCCACCTTTATTAATACCTTTCAGCGCGGTGAACAGGAAAGCACCTGGGAAACCATTCCGCATCCGAGTATTGAAGAGTTTAAATATGGTGGCCCGAATGGTTTTCTGGATCTGTTTACCAAAGATCGCAGTTATGCAAAACAGTGGCGCTATACCAATGCCCCGGATGCAGAAGGTCGTGCCATTCAGGCAGTTTATTGGGCCAATAAGTGGGCAAAAGAACAGGGCAAAGGTAGCGCCGTTGCCAGTGTTGTGAGCAAAGCCGCCAAAATGGGCGATTTTCTGCGTAATGATATGTTTGATAAGTACTTTATGAAGATCGGCGCACAGGATAAAACCCCGGCCACCGGCTATGATAGTGCACATTATCTGATGGCATGGTATACCGCCTGGGGCGGTGGCATTGGTGCCAGCTGGGCCTGGAAAATTGGCTGTAGTCATGCCCATTTTGGTTATCAGAATCCGTTTCAGGGCTGGGTGAGCGCCACCCAGAGCGATTTTGCACCGAAAAGCAGTAATGGCAAACGTGATTGGACCACCAGTTATAAACGCCAGCTGGAATTTTATCAGTGGCTGCAGAGCGCCGAAGGCGGCATTGCCGGCGGTGCAACCAATAGTTGGAATGGTCGCTATGAAAAATATCCGGCAGGCACCAGCACCTTTTATGGCATGGCATACGTTCCGCATCCGGTGTATGCCGATCCGGGCAGTAATCAGTGGTTTGGTTTTCAGGCATGGAGTATGCAGCGCGTTATGGAATATTATCTGGAAACCGGTGACAGCAGCGTTAAAAATCTGATTAAGAAATGGGTGGATTGGGTTATGAGTGAAATTAAGCTGTATGATGATGGTACATTTGCAATTCCGAGCGATCTGGAATGGAGTGGTCAGCCGGATACCTGGACCGGCACCTATACCGGCAATCCGAATCTGCATGTGCGTGTTACCAGTTATGGCACCGATCTGGGCGTGGCAGGTAGCCTGGCAAATGCACTGGCAACCTATGCAGCAGCAACCGAACGTTGGGAAGGCAAACTGGATACCAAAGCCCGTGATATGGCCGCCGAACTGGTGAATCGTGCATGGTATAATTTTTATTGCAGTGAAGGTAAAGGCGTGGTTACCGAAGAAGCACGTGCCGATTATAAACGCTTTTTCGAACAGGAAGTTTATGTGCCGGCCGGTTGGAGCGGTACAATGCCGAATGGCGATAAAATTCAGCCGGGTATTAAGTTTATTGATATTCGTACCAAGTACCGTCAGGACCCTTATTATGATATTGTGTATCAGGCCTATCTGCGCGGTGAAGCACCGGTGCTGAATTATCATCGCTTTTGGCATGAAGTTGATCTGGCAGTGGCAATGGGTGTGCTGGCCACCTATTTTCCGGATATGACCTATAAAGTGCCGGGTACACCGAGTACCAAACTGTATGGCGATGTTAATGATGATGGTAAAGTGAATAGCACCGATGCCGTGGCACTGAAACGCTATGTGCTGCGCAGCGGTATTAGTATTAATACCGATAATGCAGATCTGAATGAAGATGGTCGCGTTAATAGCACCGACCTGGGCATTCTGAAACGCTACATTCTGAAAGAAATTGATACCCTGCCGTATAAAAAT。

本发明中还提供了一种所述复合耐热纤维素酶制剂在降解秸秆上的应用。

在本发明中所述复合耐热纤维素酶制剂在降解秸秆上的应用的具体步骤如下：

(c1)将秸秆粉碎后，与丁二酸溶液混合获得秸秆悬液；

(c2)将所述秸秆悬液与所述复合耐热纤维素酶制剂混合，获得混合物，进行酶解反应。

在本发明中，步骤(c1)所述秸秆在粉碎前还包括烘干的步骤，所述烘干采用烘箱进行，所述烘干的温度为50-65℃，进一步优选为55-65℃；所述烘干的时间为20-25h，进一步优选为23-24h。

本发明在烘干秸秆后、粉碎秸秆前还包括切段的步骤，所述切段采用裁刀进行，所述得到的秸秆段长为0.5-3cm，进一步的优选为1-2cm。

在本发明中，步骤(c1)所述粉碎采用固体粉碎机进行，所述秸秆粉碎后还包括筛分的步骤，筛网的孔径为0.20-0.28mm，进一步优选为0.25-0.28mm。

在本发明中，步骤(c1)所述丁二酸溶液的浓度为40-60mM，进一步优选为45-55mM；所述秸秆与丁二酸溶液的质量体积比为0.01-0.03g:8-11ml，进一步优选为0.01-0.02g:9-10ml。

在本发明中，步骤(c2)所获得的混合物中，每1L混合物中，添加1000mg的秸秆悬液就需要添加10-50μmol的复合耐热纤维素酶制剂。

在本发明中，步骤(c2)酶解的温度为60-75℃，进一步优选为65-75℃，更进一步优选为65-70℃；所述酶解的时间为50-70h，进一步优选为55-65h，更进一步优选为58-60h；所述酶解的pH为5.8-6.2，进一步优选为5.9-6.1，更进一步优选为6.0。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

本发明利用大肠杆菌表达系统，克隆表达耐热葡聚糖内切酶，对其酶学性质进行分析，并设计优化了酶制剂生产工艺。

基于海栖热袍菌(Thermotoga maritima)全基因组信息(GenBank ID：AE000512.1)，分析发现一段属于糖苷水解酶第12家族的潜在耐热葡聚糖内切酶EG12B(NCBI登录号：NP_229325)。

自诱导培养基配制：底液(胰蛋白胨1％、酵母粉0.5％、50mmol/LNH₄Cl0.5％、25mmol/LNa₂HPO₄、25mmol/LKH₂PO₄、5mmol/LNa₂SO₄、2mmol/L MgSO₄)和糖液(甘油0.5％、葡萄糖0.05％、乳糖0.2％)分别在121℃灭菌20min后再混合。

将来源于海栖热袍菌(Thermotoga maritima)的耐热葡聚糖内切酶EG12B进行分析，一级序列共有274个氨基酸，自身含有信号肽序列(N端1-23位氨基酸残基)，成熟肽为24-274区。为了实现EG12B在大肠杆菌中的胞内高效表达，利用大肠杆菌密码子偏好性原则，经序列优化后，CAI值从0.77提高至0.96。将优化后序列(SEQ ID NO.3)送至通用生物系统(安徽)有限公司进行合成。将EG12B基因插入骨架载体pET28a的BamH I和Xho I中，经菌落PCR、酶切鉴定、DNA测序，构建重组质粒pET28-EG12B(图1)。

将重组质粒pET28-EG12B转化至BL21(DE3)中，重组菌在LB培养基中37℃、200rpm扩大培养，经0.1mmol/L IPTG诱导表达，SDS-PAGE检测表明，与未诱导对照相比，在29kDa处有明显条带，且与理论分子大小相符。凝胶定量分析目的蛋白约占胞内全细胞蛋白的36％。经细胞破碎、镍离子亲和层析、热处理后，获得纯化后EG12B(图2)。酶学特性分析结果表明，EG12B的最适反应温度为90℃，最适反应pH为5.2，此条件下对底物CMC-Na的酶活力达214.0U。

葡聚糖内切酶制剂的制备工艺：为了获得大量的目的蛋白，将OD₆₀₀达到0.1后的重组菌按1％接种量接种到自诱导培养基中，在25℃、160rpm条件下进行自诱导表达24h，获得发酵液(一方面可以提高菌体生物量和总蛋白表达量，另一方面简化诱导步骤，节省时间)。1L发酵液在6000rpm、30min条件下离心，实现固液分离，并利用25mmol/LTris-HCl(pH＝8.0)缓冲液进行洗涤，进而获得湿菌体8.2g，可溶蛋白3.6g；将湿菌体在4℃、1000bar条件下破碎2次后得到4.4g全细胞蛋白；然后在4℃、12000rpm条件下分离30min得到3.6g全细胞上清蛋白；再通过热处理(50℃、10min)和离心(4℃、12000rpm、30min)去除不耐热的杂蛋白，来得到2.8g上清蛋白；最后将蛋白样品经-80℃预冻后，通过真空冷冻干燥(-50℃，真空度13帕，12h)获得1.7g粗酶制剂(图3)。

实施例2

本发明利用大肠杆菌表达系统，克隆表达耐热葡聚糖外切酶，对其酶学性质进行分析，并设计优化了酶制剂生产工艺。

基于热纤梭菌(Clostridium thermocellum)全基因组信息(GenBank ID：203119)，分析发现一段潜在耐热葡聚糖外切酶基因序列CelS(GenBank登录号：L06942)。

自诱导培养基配制：同实施例1一样。

将来源于热纤梭菌(Clostridium thermocellum)的耐热葡聚糖外切酶CelS进行分析，一级序列共含有741个氨基酸残基，含有信号肽序列(N端1-27位氨基酸残基)，切割位点位于第27和28位残基之间，切割后的成熟肽为28-741区。为了实现CelS在大肠杆菌中的胞内高效表达，将成熟肽基因序列经密码子优化后送至通用生物系统(安徽)有限公司进行合成，将CelS基因插入骨架载体pET22b中，构建重组质粒pET22-CelS(图4)。

将重组质粒pET22-CelS转化至BL21(DE3)中，重组菌在LB培养基中37℃、200rpm扩大培养，经0.1mmol/L IPTG诱导表达，SDS-PAGE检测表明，与未诱导对照相比，在78kDa处有目的蛋白条带，表达量约占全细胞蛋白40％以上，且绝大多数葡聚糖外切酶CelS以包涵体形式表达，可溶性表达量较低。将包涵体沉淀经洗涤纯化、变性溶解、梯度复性后，获得电泳纯可溶性CelS(图5)。酶学特性分析结果表明，CelS的最适反应温度均为70℃，最适反应pH为6.0，对CMC-Na、无定形纤维素、结晶纤维素Avicel三种底物均具有水解活性，对CMC-Na的活性最高，达168.7U。

葡聚糖外切酶制剂的制备工艺：将OD₆₀₀达到0.1后的重组菌按1％接种量接种到自诱导培养基中，在25℃、160rpm条件下进行自诱导表达24h，获得发酵液。1L发酵液在6000rpm、30min条件下离心，实现固液分离，并利用25mmol/LTris-HCl(pH＝8.0)缓冲液进行洗涤，进而可获得湿菌体8.7g；将湿菌体在4℃、10000bar条件下破碎3次后得到5.1g全细胞蛋白；然后将全细胞蛋白在4℃、12000rpm下离心30min，得到3.8g包涵体沉淀；所述包涵体沉淀经预冷的洗涤液(25mmol/L Tris-HCl，2mol/L尿素，0.5mol/L NaCl，1mmol/L EDTA，2％TritonX-100，pH 8.0)洗涤2次，充分搅拌20min，4℃，12000r/min离心30min，弃上清，取沉淀，去除膜碎片和膜蛋白；再将沉淀用含8mol/L尿素的溶解液(25mmol/L Tris-HCl，8mol/L尿素，0.5mol/LNaCl，0.2mmol/L DTT，2％TritonX-100，pH 8.0)溶解，依次梯度透析至含6mol/L、4mol/L、2mol/L尿素的复性液(25mmol/L Tris-HCl，2-6mol/L尿素，0.5mol/LNaCl，pH 8.0)中，最后滴定至10体积无尿素的复性液(25mmol/LTris-HCl，0.5mol/LNaCl，pH 8.0)中(该操作可以降低蛋白浓度和尿素浓度，提高CelS复性的成功率)，得到复性蛋白2.1g。最后将复性蛋白经PEG4000固体浓缩之后，通过真空冷冻干燥(-50℃，真空度13帕，12h)获得0.5g粗酶制剂。即，1L发酵液可获得包涵体沉淀3.8g，最终获得0.5g纯酶制剂(图6)。

实施例3复合耐热纤维素酶制剂的制备和应用

将制备的葡聚糖内切酶和葡聚糖外切酶两种酶制剂进行等摩尔比混合复配即可得到复合耐热纤维素酶制剂。

为使玉米秸秆得到充分水解，将秸秆置于60℃烘箱中烘干24h，裁刀切成小段，放入固体粉碎机中粉碎后，过0.25mm(60目)筛，称取0.01g，加入10mL 50mmol/L丁二酸溶液(pH＝5.7)，摇匀放置室温备用。将制备的葡聚糖内切酶和葡聚糖外切酶分别用于水解0.1％玉米秸秆，添加量均为10μmol/L。同时将两种酶制剂进行等摩尔比混合复配得到10μmol/L，同样水解0.1％玉米秸秆，均在70℃，pH为6.0的条件下反应60h，通过测定生成还原糖(葡萄糖)的含量计算酶活力。

酶活单位定义为：每小时催化产生1μmol还原糖所需的酶量，定义为一个酶活力单位，以U表示。

(1)葡萄糖标准曲线的绘制

称取0.01g葡萄糖，溶于H₂O，定容10mL。配制为不同浓度的葡萄糖溶液(见表1)。加入30μL DNS试剂，煮沸10min。12000rpm离心3min，吸取20μL上清加入96孔板中，加入180μLH₂O，混合均匀。酶标仪测定在540nm处的吸光度，每组做3个平行对照。

表1不同浓度的葡萄糖溶液

管号	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11
												葡萄糖(μL)	0	2	4	6	8	10	12	14	16	18	20
<![CDATA[H<sub>2</sub>O(μL)]]>	20	18	16	14	12	10	8	6	4	2	0

配制的不同浓度的葡萄糖溶液在540nm处测定的吸光度值如表2所示，绘制的葡萄糖标准曲线见图7。

表2不同浓度的葡萄糖溶液在540nm处的吸光度值

(2)根据实施例3中记载的葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶以及复合纤维素酶水解玉米秸秆的反应，分别测定三者水解反应完成后的溶液在540nm处的吸光度，结果如表3。

表3三种酶水解后溶液在540nm处的吸光度

分组	<![CDATA[A<sub>540</sub>平均值]]>
		复合纤维素酶	0.7177
葡聚糖内切酶	0.5393
		葡聚糖外切酶	0.2810

(3)根据复合纤维素酶、葡聚糖内切酶以及葡聚糖外切酶三种酶作用后的溶液在540nm处的吸光度，结合制得的葡萄糖标准曲线来计算酶活力。

计算公式为：

生成葡萄糖质量(μg)＝(A₅₄₀-0.034)/0.027(根据标准曲线计算)

酶活力(U)＝生成葡萄糖质量×100×1000/60/180.2

(其中：100是稀释倍数，1000是单位换算常数，60是反应时间，180.2是葡萄糖分子量)

酶活力提高倍数＝复合纤维素酶酶活力/[(葡聚糖内切酶酶活力+葡聚糖内切酶酶活力)×50％]-1

计算的结果如表4：

表4三种酶作用生成葡萄糖质量以及酶活力

由以上实施例可知，本发明提供了一种可高效降解秸秆的复合耐热纤维素酶制剂，其中，通过实验结果表明，当复合纤维素酶用于水解玉米秸秆时的酶活力达234.2U，而当葡聚糖内切酶作用于秸秆时，酶活力为173.1U，当葡聚糖外切酶作用于秸秆时，酶活力为84.6U。可见，相对于比单独降解，本发明复合耐热纤维素酶酶活提高了81.8％。所述复合纤维素酶经过协同作用的降解机制对秸秆进行作用，首先是葡聚糖内切酶随机切割纤维素链的β-1,4-糖苷键，将长链纤维素分子截短并暴露出还原末端或非还原末端，随后葡聚糖外切酶从局部断裂的纤维素分子链非还原端开始切割，进而产生纤维二糖、纤维糖和葡萄糖，增强对秸秆的水解能力，最终实现高效降解秸秆。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 陕西理工大学

<120> 一种复合耐热纤维素酶及其制备方法和应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 253

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Ser Val Gly Ala Thr Asp Ile Ser Phe Asn Gly Phe Pro Val Thr Met

1 5 10 15

Glu Leu Asn Phe Trp Asn Val Lys Ser Tyr Glu Gly Glu Thr Trp Leu

20 25 30

Lys Phe Asp Gly Glu Lys Val Glu Phe Tyr Ala Asp Leu Tyr Asn Ile

35 40 45

Val Leu Gln Asn Pro Asp Ser Trp Val His Gly Tyr Pro Glu Ile Tyr

50 55 60

Tyr Gly Tyr Lys Pro Trp Ala Gly His Asn Ser Gly Val Glu Phe Leu

65 70 75 80

Pro Val Lys Val Lys Asp Leu Pro Asp Phe Tyr Val Thr Leu Asp Tyr

85 90 95

Ser Ile Trp Tyr Glu Asn Asn Leu Pro Ile Asn Leu Ala Met Glu Thr

100 105 110

Trp Ile Thr Arg Ser Pro Asp Gln Thr Ser Val Ser Ser Gly Asp Ala

115 120 125

Glu Ile Met Val Trp Phe Tyr Asn Asn Val Leu Met Pro Gly Gly Gln

130 135 140

Lys Val Asp Glu Phe Thr Thr Thr Val Glu Ile Asn Gly Val Lys Gln

145 150 155 160

Glu Thr Lys Trp Asp Val Tyr Phe Ala Pro Trp Gly Trp Asp Tyr Leu

165 170 175

Ala Phe Arg Leu Thr Thr Pro Met Lys Glu Gly Lys Val Lys Ile Asn

180 185 190

Val Lys Asp Phe Val Gln Lys Ala Ala Glu Val Val Lys Lys His Ser

195 200 205

Thr Arg Ile Asp Asn Phe Glu Glu Leu Tyr Phe Cys Val Trp Glu Ile

210 215 220

Gly Thr Glu Phe Gly Asp Pro Asn Thr Thr Ala Ala Lys Phe Gly Trp

225 230 235 240

Thr Phe Arg Asp Phe Ser Val Glu Val Val Lys Thr Arg

245 250

<210> 2

<211> 714

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Gly Pro Thr Lys Ala Pro Thr Lys Asp Gly Thr Ser Tyr Lys Asp Leu

1 5 10 15

Phe Leu Glu Leu Tyr Gly Lys Ile Lys Asp Pro Lys Asn Gly Tyr Phe

20 25 30

Ser Pro Asp Glu Gly Ile Pro Tyr His Ser Ile Glu Thr Leu Ile Val

35 40 45

Glu Ala Pro Asp Tyr Gly His Val Thr Thr Ser Glu Ala Phe Ser Tyr

50 55 60

Tyr Val Trp Leu Glu Ala Met Tyr Gly Asn Leu Thr Gly Asn Trp Ser

65 70 75 80

Gly Val Glu Thr Ala Trp Lys Val Met Glu Asp Trp Ile Ile Pro Asp

85 90 95

Ser Thr Glu Gln Pro Gly Met Ser Ser Tyr Asn Pro Asn Ser Pro Ala

100 105 110

Thr Tyr Ala Asp Glu Tyr Glu Asp Pro Ser Tyr Tyr Pro Ser Glu Leu

115 120 125

Lys Phe Asp Thr Val Arg Val Gly Ser Asp Pro Val His Asn Asp Leu

130 135 140

Val Ser Ala Tyr Gly Pro Asn Met Tyr Leu Met His Trp Leu Met Asp

145 150 155 160

Val Asp Asn Trp Tyr Gly Phe Gly Thr Gly Thr Arg Ala Thr Phe Ile

165 170 175

Asn Thr Phe Gln Arg Gly Glu Gln Glu Ser Thr Trp Glu Thr Ile Pro

180 185 190

His Pro Ser Ile Glu Glu Phe Lys Tyr Gly Gly Pro Asn Gly Phe Leu

195 200 205

Asp Leu Phe Thr Lys Asp Arg Ser Tyr Ala Lys Gln Trp Arg Tyr Thr

210 215 220

Asn Ala Pro Asp Ala Glu Gly Arg Ala Ile Gln Ala Val Tyr Trp Ala

225 230 235 240

Asn Lys Trp Ala Lys Glu Gln Gly Lys Gly Ser Ala Val Ala Ser Val

245 250 255

Val Ser Lys Ala Ala Lys Met Gly Asp Phe Leu Arg Asn Asp Met Phe

260 265 270

Asp Lys Tyr Phe Met Lys Ile Gly Ala Gln Asp Lys Thr Pro Ala Thr

275 280 285

Gly Tyr Asp Ser Ala His Tyr Leu Met Ala Trp Tyr Thr Ala Trp Gly

290 295 300

Gly Gly Ile Gly Ala Ser Trp Ala Trp Lys Ile Gly Cys Ser His Ala

305 310 315 320

His Phe Gly Tyr Gln Asn Pro Phe Gln Gly Trp Val Ser Ala Thr Gln

325 330 335

Ser Asp Phe Ala Pro Lys Ser Ser Asn Gly Lys Arg Asp Trp Thr Thr

340 345 350

Ser Tyr Lys Arg Gln Leu Glu Phe Tyr Gln Trp Leu Gln Ser Ala Glu

355 360 365

Gly Gly Ile Ala Gly Gly Ala Thr Asn Ser Trp Asn Gly Arg Tyr Glu

370 375 380

Lys Tyr Pro Ala Gly Thr Ser Thr Phe Tyr Gly Met Ala Tyr Val Pro

385 390 395 400

His Pro Val Tyr Ala Asp Pro Gly Ser Asn Gln Trp Phe Gly Phe Gln

405 410 415

Ala Trp Ser Met Gln Arg Val Met Glu Tyr Tyr Leu Glu Thr Gly Asp

420 425 430

Ser Ser Val Lys Asn Leu Ile Lys Lys Trp Val Asp Trp Val Met Ser

435 440 445

Glu Ile Lys Leu Tyr Asp Asp Gly Thr Phe Ala Ile Pro Ser Asp Leu

450 455 460

Glu Trp Ser Gly Gln Pro Asp Thr Trp Thr Gly Thr Tyr Thr Gly Asn

465 470 475 480

Pro Asn Leu His Val Arg Val Thr Ser Tyr Gly Thr Asp Leu Gly Val

485 490 495

Ala Gly Ser Leu Ala Asn Ala Leu Ala Thr Tyr Ala Ala Ala Thr Glu

500 505 510

Arg Trp Glu Gly Lys Leu Asp Thr Lys Ala Arg Asp Met Ala Ala Glu

515 520 525

Leu Val Asn Arg Ala Trp Tyr Asn Phe Tyr Cys Ser Glu Gly Lys Gly

530 535 540

Val Val Thr Glu Glu Ala Arg Ala Asp Tyr Lys Arg Phe Phe Glu Gln

545 550 555 560

Glu Val Tyr Val Pro Ala Gly Trp Ser Gly Thr Met Pro Asn Gly Asp

565 570 575

Lys Ile Gln Pro Gly Ile Lys Phe Ile Asp Ile Arg Thr Lys Tyr Arg

580 585 590

Gln Asp Pro Tyr Tyr Asp Ile Val Tyr Gln Ala Tyr Leu Arg Gly Glu

595 600 605

Ala Pro Val Leu Asn Tyr His Arg Phe Trp His Glu Val Asp Leu Ala

610 615 620

Val Ala Met Gly Val Leu Ala Thr Tyr Phe Pro Asp Met Thr Tyr Lys

625 630 635 640

Val Pro Gly Thr Pro Ser Thr Lys Leu Tyr Gly Asp Val Asn Asp Asp

645 650 655

Gly Lys Val Asn Ser Thr Asp Ala Val Ala Leu Lys Arg Tyr Val Leu

660 665 670

Arg Ser Gly Ile Ser Ile Asn Thr Asp Asn Ala Asp Leu Asn Glu Asp

675 680 685

Gly Arg Val Asn Ser Thr Asp Leu Gly Ile Leu Lys Arg Tyr Ile Leu

690 695 700

Lys Glu Ile Asp Thr Leu Pro Tyr Lys Asn

705 710

<210> 3

<211> 759

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tctgttggcg ccacagatat tagctttaat ggctttccgg tgacaatgga actgaatttt 60

tggaatgtta agtcttacga aggtgaaaca tggctgaaat ttgatggtga aaaagttgaa 120

ttctacgccg atctgtataa tattgttctg cagaatccgg atagctgggt gcatggctat 180

ccggaaatct attatggtta taaaccgtgg gccggccata atagcggtgt ggaatttctg 240

ccggtgaaag tgaaagatct gccggatttt tatgtgaccc tggattatag catttggtat 300

gaaaataacc tgccgattaa tctggccatg gaaacctgga ttacacgttc tccggatcag 360

acctctgttt cttctggtga cgcagaaatt atggtttggt tttataataa cgtgctgatg 420

ccgggcggcc agaaagttga tgaattcact acaaccgttg aaattaatgg tgtgaaacag 480

gaaacaaaat gggatgtgta ttttgccccg tggggttggg attatctggc atttcgcctg 540

accaccccga tgaaagaagg taaagttaaa attaacgtga aggatttcgt gcagaaagca 600

gccgaagtgg ttaaaaaaca ttctacccgt attgataact tcgaagaact gtatttttgc 660

gtttgggaaa ttggcaccga atttggtgac ccgaatacca cagccgccaa atttggttgg 720

acatttcgtg attttagcgt tgaagtggtg aaaacacgt 759

<210> 4

<211> 2142

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggtccgacca aagccccgac caaagatggc accagctata aagatctgtt tctggaactg 60

tatggtaaaa ttaaggaccc taaaaatggt tatttcagtc cggatgaagg tattccgtat 120

catagcattg aaaccctgat tgtggaagcc ccggattatg gtcatgttac caccagcgaa 180

gcattttcat attatgtgtg gctggaagcc atgtatggta atctgaccgg taattggagt 240

ggtgttgaaa ccgcatggaa agttatggaa gattggatta ttccggatag caccgaacag 300

ccgggcatga gcagttataa tccgaatagt ccggccacct atgccgatga atatgaagat 360

ccgagctatt atccgagtga actgaaattt gataccgttc gcgttggtag cgatccggtt 420

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gtggataatt ggtatggttt tggtacaggc acccgtgcca cctttattaa tacctttcag 540

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tatggtggcc cgaatggttt tctggatctg tttaccaaag atcgcagtta tgcaaaacag 660

tggcgctata ccaatgcccc ggatgcagaa ggtcgtgcca ttcaggcagt ttattgggcc 720

aataagtggg caaaagaaca gggcaaaggt agcgccgttg ccagtgttgt gagcaaagcc 780

gccaaaatgg gcgattttct gcgtaatgat atgtttgata agtactttat gaagatcggc 840

gcacaggata aaaccccggc caccggctat gatagtgcac attatctgat ggcatggtat 900

accgcctggg gcggtggcat tggtgccagc tgggcctgga aaattggctg tagtcatgcc 960

cattttggtt atcagaatcc gtttcagggc tgggtgagcg ccacccagag cgattttgca 1020

ccgaaaagca gtaatggcaa acgtgattgg accaccagtt ataaacgcca gctggaattt 1080

tatcagtggc tgcagagcgc cgaaggcggc attgccggcg gtgcaaccaa tagttggaat 1140

ggtcgctatg aaaaatatcc ggcaggcacc agcacctttt atggcatggc atacgttccg 1200

catccggtgt atgccgatcc gggcagtaat cagtggtttg gttttcaggc atggagtatg 1260

cagcgcgtta tggaatatta tctggaaacc ggtgacagca gcgttaaaaa tctgattaag 1320

aaatgggtgg attgggttat gagtgaaatt aagctgtatg atgatggtac atttgcaatt 1380

ccgagcgatc tggaatggag tggtcagccg gatacctgga ccggcaccta taccggcaat 1440

ccgaatctgc atgtgcgtgt taccagttat ggcaccgatc tgggcgtggc aggtagcctg 1500

gcaaatgcac tggcaaccta tgcagcagca accgaacgtt gggaaggcaa actggatacc 1560

aaagcccgtg atatggccgc cgaactggtg aatcgtgcat ggtataattt ttattgcagt 1620

gaaggtaaag gcgtggttac cgaagaagca cgtgccgatt ataaacgctt tttcgaacag 1680

gaagtttatg tgccggccgg ttggagcggt acaatgccga atggcgataa aattcagccg 1740

ggtattaagt ttattgatat tcgtaccaag taccgtcagg acccttatta tgatattgtg 1800

tatcaggcct atctgcgcgg tgaagcaccg gtgctgaatt atcatcgctt ttggcatgaa 1860

gttgatctgg cagtggcaat gggtgtgctg gccacctatt ttccggatat gacctataaa 1920

gtgccgggta caccgagtac caaactgtat ggcgatgtta atgatgatgg taaagtgaat 1980

agcaccgatg ccgtggcact gaaacgctat gtgctgcgca gcggtattag tattaatacc 2040

gataatgcag atctgaatga agatggtcgc gttaatagca ccgacctggg cattctgaaa 2100

cgctacattc tgaaagaaat tgataccctg ccgtataaaa at 2142

Claims

1.一种复合耐热纤维素酶制剂，其特征在于，所述复合耐热纤维素酶制剂由葡聚糖内切酶和葡聚糖外切酶组成；

所述葡聚糖内切酶和葡聚糖外切酶的摩尔比为0.5-2:1；

所述葡聚糖内切酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述葡聚糖外切酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

2.权利要求1所述复合耐热纤维素酶制剂的制备方法，其特征在于，包括葡聚糖内切酶的制备过程，具体步骤如下：

还包括葡聚糖外切酶的制备过程，具体步骤如下：

3.权利要求1所述复合耐热纤维素酶制剂、权利要求2所述制备方法制备获得的所述复合耐热纤维素酶制剂在降解秸秆上的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：

(c1)将秸秆粉碎后，与丁二酸溶液混合获得秸秆悬液；

在1L所述混合物中，每添加1000mg的秸秆悬液就需要添加10-50μmol的复合耐热纤维素酶制剂。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤(c1)所述秸秆在粉碎前还包括烘干的步骤，所述烘干的温度为50-65℃，所述烘干的时间为20-25h；所述粉碎后还包括筛分的步骤，筛网的孔径为0.20-0.28mm；所述秸秆与丁二酸溶液的质量体积比为0.01-0.03g:8-11ml。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤(c1)所述丁二酸溶液的浓度为40-60mmol/L。

7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤(c2)所述酶解的温度为60-75℃，所述酶解的时间为50-70h，所述酶解的pH为5.8-6.2。