CN114832164B - 一种3d打印双相磷酸钙支架及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于陶瓷骨支架的制备与表面改性技术领域，公开了一种3D打印双相磷酸钙支架及其制备方法，包括如下步骤：将羟基磷灰石、β‑磷酸三钙、羟丙基甲基纤维素和去离子水按设定质量比配制浆料，浆料的固液比为1:0.96～1.01；将配制浆料采用3D打印技术打印双相磷酸钙支架，并将打印的双相磷酸钙支架进行烧结；将烧结的支架在壳聚糖溶液中真空浸泡，得到壳聚糖表面改性的双相磷酸钙支架；将干燥的壳聚糖表面改性的双相磷酸钙支架置于聚多巴胺溶液中，进行涂敷，干燥、清洗、再次干燥后，制得壳聚糖/聚多巴胺复合表面改性的双相磷酸钙支架。

Description

一种3D打印双相磷酸钙支架及其制备方法
技术领域
本发明属于陶瓷骨支架的制备与表面改性技术领域，具体涉及一种3D打印双相磷酸钙支架及其制备方法。
背景技术
这里的陈述仅提供与本发明相关的背景技术，而不必然地构成现有技术。
目前，陶瓷骨支架的传统制备方法包括泡沫浸渍法、造孔剂法以及发泡法等，制备的块状陶瓷骨支架不具有三维贯通的孔隙，植入体内后不利于骨细胞向支架内部长入，进而支架的骨整合能力较差。此外，现有的支架对细胞的黏附、增殖以及成骨分化方面的促进作用较差，且力学性能难以保证。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种3D打印双相磷酸钙支架及其制备方法。通过3D打印双相磷酸钙支架并在支架表面构建一层壳聚糖/聚多巴胺复合涂层，提高双相磷酸钙支架的抗压强度、促成骨分化能力和骨整合能力。
为了实现上述目的，本发明是通过如下的技术方案来实现：
第一方面，本发明提供了一种3D打印双相磷酸钙支架的制备方法，包括如下步骤：
将羟基磷灰石、β-磷酸三钙、羟丙基甲基纤维素和去离子水按设定质量比配制浆料，浆料的固液比为1:0.96～1.01；
将配制浆料采用3D打印技术打印双相磷酸钙支架，并将打印的双相磷酸钙支架进行烧结；
将烧结的支架在壳聚糖溶液中真空浸泡，得到壳聚糖表面改性的双相磷酸钙支架；
将干燥的壳聚糖表面改性的双相磷酸钙支架置于聚多巴胺溶液中，进行涂敷，干燥、清洗、再次干燥后，制得壳聚糖/聚多巴胺复合表面改性的双相磷酸钙支架。
第二方面，本发明提供一种3D打印双相磷酸钙支架，由所述制备方法制备而成。
上述本发明的一种或多种实施方式取得的有益效果如下：
采用优化的浆料配制工艺和3D打印参数设置以及直写成型3D打印机制备多孔双相磷酸钙支架，能够提高支架的骨整合能力。此外，通过溶液浸渍的方式在双相磷酸钙支架表面制备了壳聚糖和聚多巴胺复合涂层，该涂层能提高支架的抗压强度，同时发挥壳聚糖和聚多巴胺的生物化学特性，且生成表面微纳结构，能够协同促进小鼠胚胎成骨细胞前体细胞在支架表面的黏附、增殖和成骨分化。因材料获取方便，涂层制备方式简便，可批量制备。
β-磷酸三钙支架的力学强度比羟基磷灰石支架高，但体内降解速率较快，而羟基磷灰石在体内几乎不降解，因此由羟基磷灰石和β-磷酸三钙混合组成的双相磷酸钙(BCP)具有力学强度、降解速率可调的优点。
聚多巴胺没有生物毒性，在生物体内可在酶产生的H2O2或自由基的作用下降解。涂敷有聚多巴胺的基底可通过共价偶联蛋白质增强对蛋白质的吸附性，进而促进细胞在基底表面的黏附。壳聚糖(CS)为天然多糖甲壳素脱除部分乙酰基的产物，具有良好的生物相容性和生物可降解性，其降解产物可被人体吸收，无免疫原性，具有良好的抗菌性，是一种优异的天然生物活性材料。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1是本发明实施例1中双相磷酸钙支架的扫描电镜图。
图2是实施例1中带有壳聚糖/聚多巴胺复合涂层的双相磷酸钙支架的扫描电镜图。
图3是实施例1中支架抗压强度对比图。
图4是实施例1中支架表面接触角测量结果对比图。
图5是实施例1中支架在模拟体液中浸泡28天中的质量变化对比图。
图6是实施例1中用扫描电镜拍摄的小鼠胚胎成骨细胞前体细胞在双相磷酸钙支架表面的黏附与形貌图。
图7是实施例1中用扫描电镜拍摄的小鼠胚胎成骨细胞前体细胞在带有壳聚糖/聚多巴胺复合涂层的双相磷酸钙支架表面的黏附与形貌图。
图8是实施例1中用共聚焦显微镜拍摄的小鼠胚胎成骨细胞前体细胞在双相磷酸钙支架表面的黏附与形貌图。
图9是实施例1中用共聚焦显微镜拍摄的小鼠胚胎成骨细胞前体细胞在带有壳聚糖/聚多巴胺复合涂层的双相磷酸钙支架表面的黏附与形貌图。
图10是实施例1中小鼠胚胎成骨细胞前体细胞在支架表面的增殖情况对比图。
图11是实施例1中小鼠胚胎成骨细胞前体细胞培养7天后的COL-1基因表达水平对比图。
图12是实施例1中小鼠胚胎成骨细胞前体细胞培养7天后的Runx-2基因表达水平对比图。
图13是实施例1中小鼠胚胎成骨细胞前体细胞培养7天后的OCN基因表达水平对比图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
第一方面，本发明提供了一种3D打印双相磷酸钙支架的制备方法，包括如下步骤：
将羟基磷灰石、β-磷酸三钙、羟丙基甲基纤维素和去离子水按设定质量比配制浆料，浆料的固液比为1:0.96～1.01；
将配制浆料采用3D打印技术打印双相磷酸钙支架，并将打印的双相磷酸钙支架进行烧结；
将烧结的支架在壳聚糖溶液中真空浸泡，得到壳聚糖表面改性的双相磷酸钙支架；
将干燥的壳聚糖表面改性的双相磷酸钙支架置于聚多巴胺溶液中，进行涂敷，干燥、清洗、再次干燥后，制得壳聚糖/聚多巴胺复合表面改性的双相磷酸钙支架。
在一些实施例中，羟基磷灰石、β-磷酸三钙、羟丙基甲基纤维素和去离子水的质量比为：3：2：0.2：5.15～5.42。
在一些实施例中，采用3D打印技术打印的双相磷酸钙支架的填充率为50％-70％，优选为55％-65％。
优选的，支架孔隙形状为方形，3D打印使用的针头内径为0.6～0.8mm，气压阀的气压为0.2～0.4MPa，打印速度为6～12mm/s。
在一些实施例中，支架的烧结温度最高为1100℃～1245℃。
在一些实施例中，所述壳聚糖溶液用壳聚糖和乙酸制备，壳聚糖的浓度为1～5mg/mL，乙酸溶剂的体积浓度为0.1％～1％。壳聚糖不溶于水或碱性溶液，只能溶于一些稀的无机酸或有机酸中，用盐酸或硫酸等强酸容易使壳聚糖降解为小分子物质，用乙酸能够保持壳聚糖的高分子结构。
优选的，支架在壳聚糖溶液中真空浸渍的时间为4-6h。真空浸渍可以使壳聚糖快速黏附在支架表面且渗入孔隙中，提高壳聚糖涂敷的能力。
优选的，支架在壳聚糖溶液中浸渍完成后，还包括对其进行干燥、清洗、再干燥的步骤。
在一些实施例中，聚多巴胺溶液的浓度为1～5mg/mL，采用pH值为7～10的Tris-HCl溶液配制。
优选的，支架涂敷聚多巴胺是在摇床中进行的，摇床的温度为35-40℃，转速为100～160r/min，涂敷时间为4-6h。
第二方面，本发明提供一种3D打印双相磷酸钙支架，由所述制备方法制备而成。
针对背景技术中所介绍的块状双相磷酸钙的骨整合能力和骨诱导性有待提高的问题，该方法以羟基磷灰石、β-磷酸三钙、羟丙基甲基纤维素、去离子水、壳聚糖、乙酸、盐酸多巴胺、乙醇等为原料，使用直写成型3D打印机制备多孔支架，以及通过溶液浸渍的方法制备壳聚糖和聚多巴胺复合涂层的方法最终得到壳聚糖/聚多巴胺复合表面改性的双相磷酸钙支架。
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。
实施例1
(1)双相磷酸钙陶瓷浆料的制备
称取3g羟基磷灰石，2gβ-磷酸三钙和0.2g羟丙基甲基纤维素，量取5.2mL去离子水，将其混合以制备双相磷酸钙陶瓷浆料；
(2)3D打印多孔双相磷酸钙支架
使用直写成型打印机，将陶瓷浆料装入打印机料筒，选用内径为0.6mm的针头，设置气压阀的气压为0.3MPa，打印速度为10mm/s，打印尺寸为14mm×14mm×2.5mm和14mm×14mm×10mm、填充率为60％的多孔双相磷酸钙支架；
(3)烧结支架
将打印完成并晾干后的支架放入马弗炉中，采用马弗炉原始烧结程序进行烧结，其中最高温度为1245℃；
(4)壳聚糖表面改性
以1％(v/v)的乙酸为溶剂配制5mg/mL的壳聚糖溶液；将烧结后的支架放入盛有壳聚糖溶液的烧杯中，将烧杯置于干燥皿中并抽真空处理，使支架在真空环境下浸泡5h，过后取出支架并置于干燥箱中于45℃下干燥12h，之后冲洗支架4次以去除未附着在支架表面的壳聚糖并再次干燥处理，得到壳聚糖表面改性的双相磷酸钙支架；
(5)聚多巴胺表面改性
用10mmol·L-1、pH8.5的Tris-HCl溶液配制5mg/mL的聚多巴胺溶液，将壳聚糖改性的双相磷酸钙支架置于盛有聚多巴胺溶液的离心管中，将离心管置于摇床上，设置摇床的温度为37℃，转速为160r/min，涂敷时间为5h。过后将支架置于干燥箱中于45℃下干燥12h，之后冲洗支架4次以去除未附着在支架表面的聚多巴胺，并再次干燥处理，得到壳聚糖/聚多巴胺复合表面改性的双相磷酸钙支架。
实施例2
本实施例步骤(3)中设置马弗炉的烧结过程为以5℃/分钟的速度升温，之后在1200℃下恒温2h，然后随炉冷却；
本实施例步骤(4)中以1％(v/v)的乙酸为溶剂配制5mg/mL的壳聚糖溶液，使支架在真空环境下浸泡2h；
本实施例步骤(5)中用10mmol·L-1、pH10的Tris-HCl溶液配制5mg/mL的聚多巴胺溶液；设置摇床的温度为37℃，转速为160r/min，涂敷时间为2h。
其它与实施例1相同。
实施例3
本实施例步骤(3)中设置马弗炉的烧结过程为以5℃/分钟的速度升温，之后在1100℃下恒温3h，然后随炉冷却；
本实施例步骤(4)中以1％(v/v)的乙酸为溶剂配制2mg/mL的壳聚糖溶液，使支架在真空环境下浸泡5h；
本实施例步骤(5)中用10mmol·L-1、pH8.5的Tris-HCl溶液配制2mg/mL的聚多巴胺溶液；设置摇床的温度为37℃，转速为160r/min，涂敷时间为5h。
其它与实施例1相同。
实施例4
本实施例步骤(3)中设置马弗炉的烧结过程为以5℃/分钟的速度升温，之后在1100℃下恒温2h，然后随炉冷却；
本实施例步骤(4)中以1％(v/v)的乙酸为溶剂配制2mg/mL的壳聚糖溶液，使支架在真空环境下浸泡2h；
本实施例步骤(5)中用10mmol·L-1、pH8.5的Tris-HCl溶液配制2mg/mL的聚多巴胺溶液；设置摇床的温度为37℃，转速为160r/min，涂敷时间为2h。
其它与实施例1相同。
用实施例1制备得到的壳聚糖/聚多巴胺复合表面改性3D打印双相磷酸钙支架进行以下实验：
1、采用扫描电子显微镜观察双相磷酸钙支架表面形貌的变化：
选取未涂敷涂层的双相磷酸钙支架和有壳聚糖/聚多巴胺复合涂层的双相磷酸钙支架，采用场发射扫描电子显微镜(SEM，JSM-7610F，日本JEOL)观察支架的微观形态。由于陶瓷材料不导电，观察前，支架表面在10kV的冷溅射镀膜机(德国莱卡Scd005)中溅射镀金。
双相磷酸钙支架表面形貌变化如图1、2所示，可见没有涂层的双相磷酸钙支架表面的晶粒光滑，晶界清晰可见，在涂敷了壳聚糖后，支架表面有一层薄薄的壳聚糖膜，而在聚多巴胺溶液中动态涂敷聚多巴胺后，支架表面沉积了聚多巴胺纳米球及其团簇，并将部分壳聚糖膜转变为壳聚糖丝，从而形成了更加复杂的表面形貌。这种物理形貌特征以及壳聚糖和聚多巴胺生物化学特性的共同作用可对细胞黏附、增殖等起到协同促进作用。
2、采用电子万能试验机测试双相磷酸钙支架的抗压强度
选取打印尺寸为14mm×14mm×10mm的未涂敷涂层的双相磷酸钙支架和有壳聚糖/聚多巴胺复合涂层的双相磷酸钙支架，使用电子万能试验机(ME 50，Senkein，中国)测试支架的抗压强度。压力方向沿脚手架通孔方向，加载速度为0.5mm/min。
双相磷酸钙支架的抗压强度变化如图3所示，未涂敷涂层的双相磷酸钙支架的平均抗压强度为14.3817MPa，经壳聚糖/聚多巴胺复合表面改性的双相磷酸钙支架的平均抗压强度为24.5537MPa，几乎是双相磷酸钙支架的1.5倍，说明复合涂层的涂敷提高了双相磷酸钙支架的抗压强度。而一般认为松质骨的抗压强度约为2-20MPa，因此壳聚糖/聚多巴胺复合表面改性的双相磷酸钙支架虽然具有降解特性，在植入体内后的初始阶段仍能保持约20MPa的抗压强度。
3、对支架表面的亲疏水性采用接触角测量设备进行测试：
选取未涂敷涂层的双相磷酸钙支架和有壳聚糖/聚多巴胺复合涂层的双相磷酸钙支架，使用接触角测量仪(SL200KS，美国)通过悬滴法测量蒸馏水滴在支架表面的接触角。
测量得到的接触角结果如图4所示，壳聚糖/聚多巴胺涂层增大了双相磷酸钙支架的接触角，说明双相磷酸钙本身的亲水性优于聚多巴胺，但壳聚糖/聚多巴胺涂层组的接触角仍小于90°，说明仍是亲水性表面。
4、通过测量支架在模拟体液浸泡过程中的质量变化评估支架矿化情况：
选取未涂敷涂层的双相磷酸钙支架和有壳聚糖/聚多巴胺复合涂层的双相磷酸钙支架，将支架放置在超净台中用紫外线消毒，然后放置在24孔板中。向每个孔中加入1.5mL模拟体液，然后将24孔板置于37℃和含有5％CO2浓度的培养箱中孵育。测量实验总共进行了四周，期间在每周的最后一天更换模拟体液，分别在第7天、第14天、第21天和第28天取出支架，用去离子水清洗3次，并在37℃的干燥箱中干燥6h。然后测量支架的质量，称重后将支架置于超净台中再次用紫外线消毒，然后放入24孔板中加入模拟体液继续实验。
支架在模拟体液中浸泡28天中的质量变化率如图5所示，总体来说，在浸泡28天后，壳聚糖/聚多巴胺复合表面改性的双相磷酸钙支架的质量增长率高于没有涂层的双相磷酸钙支架，说明壳聚糖/聚多巴胺复合涂层有利于双相磷酸钙的生物矿化，即提高双相磷酸钙支架的生物活性。
5、用扫描电镜和共聚焦显微镜观察小鼠胚胎成骨细胞前体细胞在支架表面的形貌
选取未涂敷涂层的双相磷酸钙支架和有壳聚糖/聚多巴胺复合涂层的双相磷酸钙支架，将支架置于超净台中用紫外线灭菌，然后将无菌支架放入24孔板中，每孔加入1mL1.5×104个/mL的细胞悬液，然后将24孔板置于37℃和含有5％CO2浓度的培养箱中孵育。细胞培养2天后，分别用扫描电镜和共聚焦显微镜观察细胞在支架表面的形貌。
细胞形貌的观察如图6～9所示，两组支架上的细胞均有较长的伪足，且壳聚糖/聚多巴胺表面改性的支架上的细胞伪足倾向于黏附在聚多巴胺颗粒上，此外带有涂层的支架表面上也有铺展面积较大的细胞，这得益于壳聚糖的生物粘附性。研究表明三角形或梭形的小鼠胚胎成骨细胞前体细胞更有利于其迁移和增殖。
6、采用CCK-8方法检测小鼠胚胎成骨细胞前体细胞在支架表面的增殖情况
选取未涂敷涂层的双相磷酸钙支架和有壳聚糖/聚多巴胺复合涂层的双相磷酸钙支架，在细胞培养后的第8小时和第1、2、3、5和7天，分别用细胞计数试剂盒8(CCK-8，Biosharp，中国)定量检测细胞的增殖，使用酶标仪(ThermoLabsysterms，美国)检测450nm处混合物的吸光度。
吸光度检测结果如图10所示，可见复合涂层组的吸光度值略高，表明复合涂层对初始细胞粘附有一定的促进作用。第1天和第3天时，复合涂层支架的吸光度值与双相磷酸钙支架之间存在显著性差异(p<0.05)，从第5天开始两组间的显著性差异增大(p<0.01)，说明壳聚糖和聚多巴胺在促进细胞增殖方面的协同作用十分明显，这是因为壳聚糖和聚多巴胺都暴露在支架最外层，可以同时发挥它们的生化特性。此外，复合涂层形成的微纳米形貌也可以为细胞提供更多粘附位点。
7、采用实时定量PCR检测支架表面小鼠胚胎成骨细胞前体细胞的相关成骨基因表达水平
选取未涂敷涂层的双相磷酸钙支架和有壳聚糖/聚多巴胺复合涂层的双相磷酸钙支架，在细胞培养7天后，检测3个成骨相关基因的表达水平，即I型胶原(COL-1)、Runx-相关转录因子2(Runx-2)和骨钙素(OCN)，同时使用甘油醛-3磷酸脱氢酶(GAPDH)作为参考基因使靶基因表达水平正常化。使用快速实时PCR反应系统(7900HT，美国应用生物系统公司)分析基因表达并读取数据，所得结果通过相对定量比较法(2-ΔΔCT)进行处理和分析。
三个成骨相关基因的表达水平分别如图11～13所示，从结果可以看出带有壳聚糖/聚多巴胺复合涂层的双相磷酸钙支架组的三个基因的表达水平均高于未涂敷涂层的双相磷酸钙支架组(p<0.01)，且复合涂层组的OCN基因表达水平格外高，这是由于OCN是一种末端外分泌蛋白，其表达水平高于转录因子。产生这种结果的原因可能是聚多巴胺颗粒的存在使细胞更细长，一些研究表明这种形状更有利于细胞分化，此外壳聚糖和聚多巴胺的生物化学特性和构成的表面形貌可能协同刺激了小鼠胚胎成骨细胞前体细胞成骨分化的信号通路。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种3D打印双相磷酸钙支架的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
将羟基磷灰石、β-磷酸三钙、羟丙基甲基纤维素和去离子水按设定质量比配制浆料，浆料的固液比为1: 0.96~1.01；
将配制浆料采用3D打印技术打印双相磷酸钙支架，并将打印的双相磷酸钙支架进行烧结；
将烧结的支架在壳聚糖溶液中真空浸泡，得到壳聚糖表面改性的双相磷酸钙支架；
将干燥的壳聚糖表面改性的双相磷酸钙支架置于聚多巴胺溶液中，进行涂敷，干燥、清洗、再次干燥后，制得壳聚糖/聚多巴胺复合表面改性的双相磷酸钙支架；
支架在壳聚糖溶液中真空浸渍的时间为4-6h，支架在壳聚糖溶液中浸渍完成后，还包括对其进行干燥、清洗、再干燥的步骤；
通过溶液浸渍的方式在双相磷酸钙支架表面制备壳聚糖和聚多巴胺复合涂层。
2.根据权利要求1所述的3D打印双相磷酸钙支架的制备方法，其特征在于：羟基磷灰石、β-磷酸三钙、羟丙基甲基纤维素和去离子水的质量比为：3：2：0.2：5.15~5.42。
3.根据权利要求1所述的3D打印双相磷酸钙支架的制备方法，其特征在于：采用3D打印技术打印的双相磷酸钙支架的填充率为50%-70%。
4.根据权利要求3所述的3D打印双相磷酸钙支架的制备方法，其特征在于：采用3D打印技术打印的双相磷酸钙支架的填充率为55%-65%。
5.根据权利要求1所述的3D打印双相磷酸钙支架的制备方法，其特征在于：支架孔隙形状为方形，3D打印使用的针头内径为0.6~0.8mm，气压阀的气压为0.2~0.4MPa，打印速度为6~12 mm/s。
6.根据权利要求1所述的3D打印双相磷酸钙支架的制备方法，其特征在于：支架的烧结温度最高为1100℃~1245℃。
7.根据权利要求1所述的3D打印双相磷酸钙支架的制备方法，其特征在于：所述壳聚糖溶液用壳聚糖和乙酸制备，壳聚糖的浓度为1~5 mg/mL，乙酸溶剂的体积浓度为0.1%~1%。
8.根据权利要求1所述的3D打印双相磷酸钙支架的制备方法，其特征在于：聚多巴胺溶液的浓度为1~5 mg/mL，采用pH值为7~10的Tris-HCl溶液配制。
9.根据权利要求8所述的3D打印双相磷酸钙支架的制备方法，其特征在于：支架涂敷聚多巴胺溶液是在摇床中进行的，摇床的温度为35-40℃，转速为100~160 r/min，涂敷时间为4-6h。
10.一种3D打印双相磷酸钙支架，其特征在于：由权利要求1-9任一所述制备方法制备而成。
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