CN114807135A - 一种牛骨骼肌发育相关环状RNA circMYH8的生物学鉴定方法及应用 - Google Patents

一种牛骨骼肌发育相关环状RNA circMYH8的生物学鉴定方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种牛骨骼肌发育相关环状RNA circMYH8的生物学鉴定方法及应用，所述环状RNA circMYH8来源于秦川牛不同发育时期背最长肌环状RNA测序结果，通过生物学鉴定其为环状RNA；合成circMYH8的干扰片段circMYH8‑si，转染原代培养的牛骨骼肌细胞后，牛肌原代细胞增殖效率显著提高，可作为肉牛转基因育种的重要候选分子，为利用分子育种技术改良我国地方牛种提供理论依据，从而加快高产肉量秦川牛育种进程。

Description

一种牛骨骼肌发育相关环状RNA circMYH8的生物学鉴定方法 及应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种牛骨骼肌发育相关环状RNAcircMYH8的生物学鉴定方法及应用。
背景技术
秦川牛是我国从役用方向长期选育而来的地方黄牛，具有肉质好、耐粗饲的特点，但其产肉率低、生长缓慢。近年来，不断发展的分子育种技术具有缩短育种周期、提高育种效率的优势，然而牛肌肉发育的分子研究基础还很薄弱，极大限制了牛分子育种技术的应用与发展。因此，深入开展秦川牛肌肉发育相关分子机制的研究是利用分子育种技术改良秦川牛品种的前提。
骨骼肌是哺乳动物最大的器官，约占总体重的40％，维持着机体新陈代谢、呼吸和运动等基本功能。脊椎动物的骨骼肌主要来源于中胚层生皮肌节，由生肌祖细胞经增殖分化形成梭形单核成肌细胞，而后向肌肉形成部位迁移，经过一系列的增殖、分化和融合过程最终形成成熟肌纤维，另有一部分成肌细胞不发生融合形成卫星细胞用于损伤肌肉的再生。脊椎动物骨骼肌纤维在胎儿期就已保持数目恒定，出生后主要通过肌纤维的肥大增加肌肉量。牛骨骼肌原代细胞是从出生前牛背最长肌组织中分离的，作为一种体外模型细胞，可用于研究早期牛骨骼肌的增殖过程。
骨骼肌的生长发育是一个极其复杂的过程，对其转录调控机制的研究一直是分子遗传领域的热点。随着转录组测序技术的飞速发展，围绕骨骼肌生长发育相关基因的功能鉴定及转录调控机制研究已取得大量的成果。近年来，非编码RNA研究逐渐兴起，其对骨骼肌发育的调控也成为研究热点。环状RNA是由一类不具有5'末端帽子和3'末端poly(A)尾，以共价键形成环状闭合结构的非编码RNA。与线性mRNA相比，环状RNA共价闭合的结构使其不易被核酸外切酶RNase R降解，具有更高的稳定性。根据环状RNA的起源，其主要被分为四类：外显子环状RNA，外显子-内含子环状RNA，内含子环状RNA以及基因间环状RNA。环状RNA是一种反向剪接的产物，具有时空特异性及组织细胞特异性。大量的研究证实环状RNA广泛参与调控动物机体生长发育过程，其中涉及最为广泛的是环状RNA作为miRNA的分子海绵的ceRNA调控，此外，环状RNA可以和功能蛋白结合参与剪接调控、转录调控、表观遗传修饰以及蛋白翻译调控。
在骨骼肌发育研究领域，环状RNA调控骨骼肌细胞增殖的研究也逐渐增多。例如，牛circRILPL1通过吸附miR-138促进牛成肌细胞的增殖；牛circCPE能够吸附miR-133a促进牛成肌细胞的增殖；鸡circPTPN4竞争性地结合miR-499-3p促进鸡成肌细胞的增殖；牛circSVIL通过抑制STAT1的磷酸化促进牛成肌细胞的增殖等。circMYH8位于秦川牛19号染色体上，是由MYH8基因的29-33外显子环化形成，秦川牛不同发育时期背最长肌环状RNA测序结果显示circMYH8在胎牛背最长肌的表达水平很高，可能参与牛骨骼肌早期发育。
发明内容
本发明的目的在于提供一种牛骨骼肌发育相关环状RNA circMYH8的生物学鉴定方法及应用，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种牛骨骼肌发育相关的环状RNAcircMYH8的生物学鉴定方法，包括以下步骤：
设计合成circMYH8的divergent primer及convergent primer两组引物，分别以牛背最长肌cDNA、RNAse R处理的牛背最长肌cDNA以及牛背最长肌gDNA为模板进行PCR扩增，通过测序及琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。
优选的，所述的circMYH8的divergent primer为：
上游引物F1：5′-TAGAGGAAGCAGAGGTGAAT-3′，
下游引物R1：5′-CTGACGTTTCAGTTCCTCAATC-3′；
所述的circMYH8的convergent primer为：
上游引物F1：5′-GCACTGGCCTTGGATGAAAC-3′，
下游引物R1：5′-CCAGTTCCTTCCTTTTGGCCT-3′。
优选的，所述的RNAse R处理过程为：37℃条件下利用20U/μL的RNaseR处理牛背最长肌总RNA 4h。
优选的，所述的PCR的扩增体系(20μL)为：50ng/μL模板DNA 1μL、10pmol/L的引物divergent primer或convergent primer对应的上下游引物各1μL、PCR Mix 10μL、去离子水7μL。
优选的，所述的PCR的反应程序包括以下步骤：95℃预变性5min；95℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸1min，共15个循环；95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，共20个循环；72℃延伸10min。
优选的，所述的circMYH8预期琼脂糖凝胶电泳结果为：以牛背最长肌cDNA或RNAseR处理的牛背最长肌cDNA作为模板，circMYH8 divergent primer能够成功扩增出产物，但以牛背最长肌gDNA作为模板时，circMYH8 divergent primer不能扩增出产物；以牛背最长肌cDNA或牛背最长肌gDNA作为模板，circMYH8 convergent primer能够成功扩增出产物，但当使用RNAse R处理的牛背最长肌cDNA作为模板时，circMYH8 convergent primer不能扩增出产物。
一种促进牛骨骼肌原代细胞增殖的方法，包括：降低所述牛circMYH8的表达水平。
进一步地，通过circMYH8-si抑制所述牛circMYH8，以降低所述牛circMYH8的表达水平。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明成功鉴定出来源于MYH8基因的29-33外显子的牛环状RNA circMYH8，并对其进行了功能探究，结果表明牛环状RNA circMYH8可以调控牛骨骼肌细胞的增殖，干扰circMYH8可以显著提高牛骨骼肌原代细胞增殖效率，可作为肉牛转基因育种的重要候选分子，为利用分子育种技术改良我国地方牛种提供理论依据，从而加快高产肉量秦川牛育种进程。
附图说明
图1为本发明中牛circMYH8的基因组定位图及Sanger测序图。
图2为本发明中牛circMYH8琼脂糖凝胶电泳鉴定结果。
图3为本发明中干扰circMYH8的EdU结果；图中，*表示差异显著。
图4为本发明中干扰circMYH8的细胞流式结果；图中，*表示差异显著。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：circMYH8的生物学鉴定
1.1实验动物的来源及样品的采集
本发明所使用的的实验动物是我国五大良种黄牛品种之首的秦川牛，在中国陕西宝鸡秦宝牧业有限公司采集了健康胎牛背最长肌样本。为了防止或减少RNA的降解，将所采集的组织样用无酶离心管装，保存在-80℃冰箱。
1.2总RNA的提取
(1)取50～100mg组织样，放入无RNase的研钵中，加液氮研磨成粉末，待液氮基本挥发完全时，加入1mL的Trizol试剂充分研磨，待样品融化后转入无RNase的1.5mL离心管中，室温静置15min。
(2)在超速离心机中，4℃，12000r/min，离心10min。
(3)转移上清至一新的无RNase的1.5mL离心管中。
(4)加入0.2mL的三氯甲烷(Trizol体积的1/5)，剧烈震荡15s，冰上静置5min。
(5)4℃，12000r/min，离心15min，小心取出离心管。
(6)小心转移上清液至一新的1.5mL离心管(注意不要吸到中间的蛋白层)，加入与上清液等体积的异丙醇。
(7)轻轻颠倒混匀后，冰上静置10min。
(8)4℃，12000r/min，离心10min。
(9)弃上清，加入1mL的75％乙醇(用无RNase的水配制)，洗涤。
(10)4℃，12000r/min，离心10min。并重复(9)、(10)步骤一次。
(11)弃上清，室温干燥沉淀5～10min(过于干燥会导致RNA的溶解性大大降低)。
(12)加入30μL的DEPC水溶解，用于后续实验或-80℃保存。提取后用NanoDrop2000对总RNA的浓度和OD值进行检测，RNA的OD260/280的比值要在1.8～2.0之间，才能确保无蛋白质、酚的污染且没有发生降解。
1.3 gDNA的分离、提取、纯化
参考文献Sambrock et al(2002)方法。
1.4 circMYH8引物设计
用NCBI中的primer design tool软件设计circRNA引物，由于circRNA与mRNA不同，它不具有5’和3’末端，而是RNA剪切过程中反向拼接产生的闭合的环状结构，因此设计引物时与mRNA也不相同，设计circRNA的引物时，应包含其环化位点，也就是要设计发散引物(divergent primer)。设计引物时：Tm值应不低于40℃；GC含量最好在40％～60％之间；上下游引物的Tm值和GC含量均应相差不大；引物的长度最好在18-25nt之间；circRNA的扩增产物长度最好在100bp-250bp之间，不宜太长。
circMYH8的divergent primer：
上游引物F1：5′-TAGAGGAAGCAGAGGTGAAT-3′，
下游引物R1：5′-CTGACGTTTCAGTTCCTCAATC-3′。
为了验证所筛选出的RNA是环状RNA，需要设置对照组，因此设计了它的mRNA的引物，即收敛引物(convergent primer)。
circMYH8的convergent primer:
上游引物F1：5′-GCACTGGCCTTGGATGAAAC-3′，
下游引物R1：5′-CCAGTTCCTTCCTTTTGGCCT-3′。
1.5 RNase R处理
RNase R即Ribonuclease R，是一种可以切割降解RNA的核糖核酸外切酶，来源于大肠杆菌，能够消化几乎所有的线性RNA分子，但不易消化环状RNA以及套索结构，因此可以用于circRNA的鉴定。用20U/μL的RNaseR处理牛背最长肌总RNA 4h，再进行反转录后即可通过PCR检测circMYH8的稳定性。
1.6将所提取的总RNA进行反转录
用Nano Drop2000测定RNA的浓度和OD260/280的值，若没有污染，且没有发生降解，则用Takara试剂盒进行反转录：
(1)进行基因组DNA的除去反应，在无RNase的PCR管中加入gDNA Clean Reagent 1μL，加入5×gDNA Clean Buffer 2.0μL，Total RNA 1μg，最后加RNase Free ddH2O至10μL，在PCR仪中42℃孵育2min。
(2)反转录反应，在上一步的PCR管中加入Evo M-ML V Rtase Enzyme Mix 1.0μL，RT Primer Mix 1.0μL，5×RTase Reaction Buffer MixⅠ4.0μL,最后加RNase Free ddH20至20μL，在PCR仪中37℃孵育15min，85℃孵育5s即完成总RNA的反转录过程。
1.7 PCR扩增及产物测序
1.7.1 PCR扩增
利用circMYH8引物，以上述反转录样本作为模板进行PCR扩增，所述的PCR的扩增体系(20μL)为：50ng/μL模板DNA 1μL、10pmol/L的引物divergent primer或convergentprimer对应的上下游引物各1μL、PCR Mix10μL、去离子水7μL。所使用PCR的反应程序包括以下步骤：95℃预变性5min；95℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸1min，共15个循环；95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，共20个循环；72℃延伸10min。
1.7.2琼脂糖凝胶电泳
用2％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，看扩增产物的长度与我们的目的序列长度是否一致。2％的琼脂糖凝胶电泳操作步骤：
(1)制作含有核酸染料的2％的琼脂糖凝胶，点样后120V电压，电泳30min；
(2)待片段分离清晰时，在BIO-RAD Gel Doc 2000凝胶成像系统成像；
(3)根据琼脂糖凝胶电泳成像中marker和片段条带位置的对比分析扩增产物的序列长度。
1.8Sanger测序
若分析琼脂糖凝胶电泳结果发现扩增产物的序列长度与目的片段序列长度相同则进行Sanger测序，检查测序结果，是否扩增出环化位点，若能扩增出环化位点，则证实其为环状RNA(参见图1)。
1.9 circMYH8在不同的PCR模板中的扩增
分别以牛骨骼肌的cDNA、RNase R处理的cDNA以及gDNA为模板用divergentprimer和convergent primer进行PCR扩增，所使用的程序同1.6.1，PCR扩增产物通过2％的琼脂糖凝胶鉴定circMYH8的扩增情况。circMYH8鉴定阳性结果为：以牛背最长肌cDNA或RNAse R处理的牛背最长肌cDNA作为模板，circMYH8 divergent primer能够成功扩增出产物，但以牛背最长肌gDNA作为模板时，circMYH8 divergent primer不能扩增出产物；以牛背最长肌cDNA或牛背最长肌gDNA作为模板，circMYH8 convergent primer能够成功扩增出产物，但当使用RNAse R处理的牛背最长肌cDNA作为模板时，circMYH8 convergent primer不能扩增出产物(参见图2)。
实施例2：circMYH8功能验证
2.1骨骼肌原代细胞分离培养
(1)首先将整个胎牛放入大培养皿内，用酒精棉球擦拭皮肤，后用手术刀剥离皮肤，筋膜，取适量肌肉组织并用无菌PBS冲洗3次。
(2)将肌肉组织放入培养皿中，加入少量PBS，用灭菌剪刀将肌肉组织尽量剪碎后加入10mL离心管中静置分钟，去上清后加入组织4倍体积的0.2％Ⅱ型胶原酶，37℃水浴摇床消化3小时。
(3)400目的滤网过滤消化后的细胞，并将过滤得到的细胞用无菌PBS清洗3次(1500r/min)。
(4)用20％胎牛血清的完全培养基悬浮细胞并继续培养。
2.2 circMYH8干扰片段的设计及合成
siRNA设计：(1)片段长度：19-21nt；(2)GC含量：40％～60％；(3)避免出现超过4个连续A/T；(4)首位尽量避免重复；(5)序列位置应在环化位点两侧分布均匀；(6)一般会在干扰片段的3’末端加TT悬垂。circMYH8-si的序列为:GGAAGCAGAGGTGAATATT，设计好送公司合成。
2.3 circMYH8对牛肌原代细胞生长发育的影响
将合成的circMYH8-si转染至牛肌原代细胞中，检测circMYH8对牛肌肉细胞增殖的影响，检测手段包括EdU及流式细胞术。
2.4细胞转染
(1)培养细胞，并将细胞接种到12孔板中。转染前，将孔板里的培养基换为OPTI-MEM培养基。
(2)以12孔板规格为例：根据载体或RNA寡核苷酸的浓度，将50pmol的RNA寡核苷酸溶解于100μL OPTI-MEM培养基中(A)，同时用100μLOPTI-MEM培养基溶解1.5μL R0531，室温静置5min(B)。
(4)将(A)缓缓加入(B)中，轻轻混匀，室温孵育15min。
(5)将(A)(B)混合液加入相应的孔板中，“十字法”将培养基摇匀，放入培养箱中继续培养。
2.5 EdU检测细胞增殖
参考锐博生物试剂盒(Cell-Light EdU Apollo567 In Vitro Kit)说明书，根据试剂盒说明书处理96孔板细胞，并采用荧光显微镜(DM5000B；德国)获取EdU图像，结果观察到干扰circMYH8对牛肌原代细胞增殖的显著促进作用(参见图3)。
2.6流式细胞术检测细胞周期
(1)以15％～20％的接种密度接种牛肌原代细胞于中皿中，待细胞密度达到50％左右时进行转染，细胞汇合度为80％左右时胰酶消化细胞，收集至2mL离心管中，PBS清洗细胞2次。
(2)PBS清洗细胞后离心弃上清，加入预冷70％乙醇于4℃固定过夜。
(3)细胞染色：离心收集细胞，以1mL的PBS洗细胞两次，加入500μLPI染液(含50μg/mL碘化丙啶(PI)的PBS，100μg/mL RNase A，0.2％TritonX-100)，4℃避光孵育30分钟。
(4)流式细胞仪进行检测，计数2-3万个细胞，使用细胞周期拟和软件分析数据。结果显示：干扰circMYH8增加牛肌原代细胞S期细胞比例(参见图4)。
以上结果成功鉴定所述circMYH8是牛环状RNA，利用circMYH8-si在牛肌原代细胞上干扰circMYH8后，EdU细胞增殖活性上升，S期细胞比例上升，这些均表明干扰circMYH8能够促进牛肌原代细胞增殖，circMYH8可作为肉牛转基因育种的重要候选分子
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (9)

1.一种与牛骨骼肌发育相关的环状RNA，被命名为circMYH8，其特征在于：circMYH8来源于MYH8基因的29-33外显子，位于牛19号染色体上，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.含有权利要求1所述的circMYH8的生物学鉴定方法，其特征在于：包括以下步骤：设计合成circMYH8的divergent primer及convergent primer两组引物，分别以牛背最长肌cDNA、RNAse R处理的牛背最长肌cDNA以及牛背最长肌gDNA为模板进行PCR扩增，通过测序及琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。
3.如权利要求2所述的circMYH8的生物学鉴定方法,其特征在于：所述的circMYH8的divergent primer为：
上游引物F1：5′-TAGAGGAAGCAGAGGTGAAT-3′，
下游引物R1：5′-CTGACGTTTCAGTTCCTCAATC-3′；
所述的circMYH8的convergent primer为：
上游引物F1：5′-GCACTGGCCTTGGATGAAAC-3′，
下游引物R1：5′-CCAGTTCCTTCCTTTTGGCCT-3′。
4.如权利要求2所述的circMYH8的生物学鉴定方法,其特征在于：所述的RNAse R处理过程为：37℃条件下利用20U/μL的RNaseR处理牛背最长肌总RNA 4h。
5.如权利要求2所述的circMYH8的生物学鉴定方法,其特征在于：所述的PCR的反应程序包括以下步骤：95℃预变性5min；95℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸1min，共15个循环；95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，共20个循环；72℃延伸10min。
6.如权利要求2-5中任意一项权利要求所述的方法在牛环状RNA生物学鉴定上的应用，其特征在于：以牛背最长肌cDNA或RNAse R处理的牛背最长肌cDNA作为模板，circMYH8divergent primer能够成功扩增出产物，但以牛背最长肌gDNA作为模板时，circMYH8divergent primer不能扩增出产物；以牛背最长肌cDNA或牛背最长肌gDNA作为模板，circMYH8 convergent primer能够成功扩增出产物，但当使用RNAse R处理的牛背最长肌cDNA作为模板时，circMYH8 convergent primer不能扩增出产物。
7.如权利要求1中所述的牛环状RNA促进牛骨骼肌原代细胞增殖的应用，其特征在于，抑制如权利要求1所述的circMYH8的表达水平，通过转染circMYH8-si干扰权利要求1所述circMYH8，以抑制所述circMYH8的表达水平，circMYH8-si的序列为：GGAAGCAGAGGTGAATATT。
8.如权利要求1所述的牛环状RNA的生物材料的应用，其特征在于，所述生物材料包括权利要求1所述的circMYH8，所述生物材料为gDNA、cDNA、siRNA或牛骨骼肌原代细胞。
9.如权利要求1所述circMYH8或权利要求8所述生物材料，其特征在于，在负调控牛骨骼肌细胞增殖的应用，以及在高产肉量牛的育种中的应用，牛为高产肉量秦川牛。
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