CN114807017A - 生长因子pdgf-c在维持干细胞多能性的应用和促进干细胞多能性的培养方法及应用 - Google Patents

生长因子pdgf-c在维持干细胞多能性的应用和促进干细胞多能性的培养方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供利用PDGF‑C促进干细胞多能性的培养方法，包括：1)直接在干细胞培养基中添加PDGF‑CC重组蛋白；2)表达PDGF‑C的质粒或病毒；3)在诱导性过表达PDGF‑C的干细胞中通过加入强力霉素诱导PDGF‑C的表达。PDGF‑C可以通过与PDGFRα受体结合，激活PDGFR通路，促进干细胞里多能性因子的表达，从而达到维持干细胞多能性的效果。

Description

生长因子PDGF-C在维持干细胞多能性的应用和促进干细胞多 能性的培养方法及应用
技术领域
本发明属于细胞培养技术领域，具体地，涉及生长因子PDGF-C在维持干细胞多能性的应用和促进干细胞多能性的培养方法及应用。
背景技术
干细胞(stem cell，SC)是一类具有多向分化潜能和自我复制能力的未分化细胞，在体内能够分化产生某种特定组织。由于干细胞的这两大特性，其在临床应用尤其是再生医学领域中具有重要的价值，成为再生与修复各种组织器官的重要材料。根据发生学来源分类，干细胞可分为胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)和成体干细胞(adult stemcells,ASCs)1。两者均为目前干细胞研究的热点领域，但ASCs缺乏分化成三个胚层的潜能，且来源和数量有限2。相比之下，来源于内细胞团的ESCs在体外可无限扩增，来源充沛。ESCs具有自我更新能力和多能性，即在体外培养可以无限增殖并且保持未分化的状态；同时可以多向分化，被诱导分化为几乎所有类型的细胞。
尽管经过了多种优化，现有的ESCs体外培养条件仍存在大量不足。比如，最常规和广泛使用的是含胎牛血清(FBS)和白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)的培养基进行培养，其中LIF是必需的生长因子，能维持多种ESCs在没有饲养细胞情况下的自我更新。然而，如果ESCs长期养在血清+LIF的培养基中、不及时传代或换液，均容易引起细胞分化、细胞多能性丢失等问题。后续有研究发现，通过加入两种小分子抑制剂(2inhibitors,2i)：CHIR99021(抑制Gsk3α/β)和PD0352901(抑制Mek1/2)，可明显保持ESCs的原始不分化状态。因此，ESCs体外培养也会用血清+LIF+2i或完全2i培养基(基础培养基，加入2i，LIF，N2,B27等因子)。但是，尽管ESCs的状态得到了保持，这些培养条件比较复杂，所需因子很多，血清用量很大且成本昂贵，配置步骤较多对操作人员的要求也很高，容易造成污染，因此不利于目前ESCs的基础研究，也阻碍了对于ESCs大规模扩增的需求。因此，改进ESCs体外培养条件是目前亟待解决的问题之一，具有重要的科研价值，相关成果有助于未来对于ESCs的安全应用。
已有报道提出生长因子对ESCs的调控是非常精细的，ESCs发育均需要关键因子的精细调控。比如，碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)是已知的促人ESCs自我更新的关键因子。然而，低浓度的bFGF无法有效维持ESCs的未分化状态，但随着bFGF浓度增加又会降低ESCs的克隆形成能力。而目前的研究手段主要通过敲低/敲除等显著降低细胞内部特定因子的含量，这样可能会导致忽略了那些需要维持在适中含量的因子的作用。
血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor,PDGF)是生长因子家族的重要成员之一，可促进多种细胞，如血管细胞，神经元细胞等的生长，分化和迁移。PGDF家族包含四个亚型(PDGF-A、-B、-C和-D)和两个酪氨酸激酶受体PDGFR-α/β。其中，PDGF-C是中山眼科中心李旭日博士于2000年发现的新的PDGF家族成员，与经典PDGFs不同的是，PDGF-C由345个氨基酸组成，在N端有一个CUB蛋白质结构域，以及一个core domain结构域。CUB结构域在空间上阻断了受体的结合，因而起初会以未活化的前体形式分泌，而后胞外蛋白酶如组织型纤溶酶原激活物(tPA)与尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)及纤溶酶识别并水解CUB结构域，从而剩下的core domain结构域就可结合和激活PDGF受体和下游通路。上述的四种PDGF蛋白亚型通过二硫键可形成5个同源或异源二聚体，包括PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-AB、PDGF-CC和PDGF-DD，它们都通过与细胞膜上两种血小板衍生因子受体α、β(PDGFRα、β)结合并激活其酪氨酸激酶，从而激活下游信号通路。配体与PDGFRs结合后，可促使PDGFRα、β形成同源或异源二聚体PDGFR-αα，-ββ或–αβ，但PDGFs与受体之间的亲和力不同。PDGF-AA只能与PDGFR-αα结合，而PDGF-BB能同时与PDGFRα和β结合，从而形成PDGFR-αα、PDGFR-ββ或PDGFR–αβ二聚体。PDGF-CC能够结合PDGFR-αα和PDGFR–αβ，类似于PDGF-AB。进一步地，激活下游信号通路，调控细胞增殖，分化，迁移和细胞外基质积累等细胞活动。
胚胎干细胞来源于早期胚胎的内细胞团，其与胚胎发育具有非常多的共性机制。在哺乳动物胚胎发育过程，约有30％～70％的胚胎夭折的发生是在胚胎发育的早期，而在体外培养时早期胚胎凋亡概率更高。有许多研究发现，体外培养的条件对胚胎发育具有重要的影响，包括多种生长因子、氨基酸成分等，而目前对其中的重要核心成分和调控机理仍未完全明了，严重制约了对克隆动物的生产、胚胎干细胞的获得以及辅助生殖技术的发展。因此，亟需研究和发现更好的胚胎体外培养方法来提高胚胎发育率。
发明内容
本发明的目的在于提供生长因子PDGF-C在维持干细胞多能性的应用和促进干细胞多能性的培养方法及应用，以使干细胞保持原始不分化状态。
根据本发明的一个方面，提供生长因子PDGF-C在维持干细胞多能性的应用。
根据本发明的另一个方面，提供一种利用PDGF-C促进干细胞多能性的培养方法：利用含有PDGF-C因子的培养基培养干细胞，PDGF-C因子为生长因子PDGF-C或其二聚体蛋白。
优选地，PDGF-C因子为利用昆虫细胞或大肠杆菌系统表达和纯化得到的人源PDGF-CC重组蛋白。
优选地，培养基为向低血清培养基中添加含有PDGF-C因子配制而成；低血清培养基的组分组成为：Knockout DMEM+5％FBS+0.1mM MEM-NEAA+1％P/S+2mM L-Glutamine+0.1mM 2-Me+1000U/mL LIF。
优选地，选择重组蛋白PDGF-CC作为PDGF-C因子，重组蛋白PDGF-CC在培养基中的终浓度为50～100ng/ml。
根据本发明的另一个方面，提供另一种利用PDGF-C促进干细胞多能性的培养方法：构建表达PDGF-C的质粒或病毒液，感染干细胞。可选地，利用低血清培养基培养干细胞，低血清培养基的组分组成为：Knockout DMEM+5％FBS+0.1mM MEM-NEAA+1％P/S+2mM L-Glutamine+0.1mM 2-Me+1000U/mL LIF。
根据本发明的另一个方面，提供另一种利用PDGF-C促进干细胞多能性的培养方法：在构建好的诱导性过表达PDGF-C干细胞中利用强力霉素诱导获得过表达PDGF-C的干细胞。可选地，利用低血清培养基培养诱导性过表达PDGF-C干细胞，低血清培养基的组分组成为：Knockout DMEM+5％FBS+0.1mM MEM-NEAA+1％P/S+2mM L-Glutamine+0.1mM 2-Me+1000U/mL LIF。
优选地，上述三种促进干细胞多能性的培养方法：干细胞为胚胎干细胞。
根据本发明的另一个方面，提供上述维持干细胞多能性的培养方法在胚胎培养中的应用：胚胎为非人哺乳动物胚胎；胚胎培养是指从受精卵发育到囊胚形成的阶段。
根据本发明的另一个方面，提供一种用于促进干细胞多能性的培养基，其组分包括：Knockout DMEM+5％FBS+0.1mM MEM-NEAA+1％P/S+2mM L-Glutamine+0.1mM 2-Me+1000U/mL LIF+50～100ng/ml重组蛋白PDGF-CC。
PDGF-C可以通过与PDGFRα受体结合，激活PDGFR通路，上述方式能够促进干细胞表达多能性因子，达到维持干细胞多能性的效果。干细胞是一种典型的多能性活体，以体外培养的方式培养干细胞，通过直接向其培养基中添加PDGF-C因子，能够有效地促进干细胞的多能性，且不会对干细胞的克隆形成能力带来不利影响，此外，上述方式操作简单，减少了血清的消耗。胚胎干细胞来源于早期胚胎的内细胞团，其与胚胎发育具有非常多的共性机制。可以通过直接注射的形式使PDGF-C因子作用于体内培养的受精卵或胚胎，也可以通过外源加入的方式使PDGF-C因子作用于体外培养的受精卵或胚胎，PDGF-C因子促进早期胚胎中的胚胎干细胞表达核心多能性因子，有利于维护胚胎的多能性以及自我更新能力，同时，也有利于改善胚胎的发育情况。
附图说明
图1为四种PDGF蛋白在小鼠胚胎干细胞和小鼠胚胎成纤维细胞中的表达情况；
图2为靶向siRNA的瞬时转染敲低实验结果；
图3为小鼠胚胎干细胞中核心多能性因子表达情况的实时荧光定量PCR检测结果；
图4为小鼠胚胎干细胞中细胞增殖标记物Ki67表达情况的实时荧光定量PCR检测结果；
图5为为小鼠胚胎干细胞中三个胚层分化标志物表达情况的实时荧光定量PCR检测结果；
图6为在小鼠胚胎干细胞中敲低Pdgf-c后48小时的细胞形态图；
图7为图6的统计结果图；
图8为Pdgf-c野生型(Pdgf-c+/+)和敲除型(Pdgf-c-/-)胚胎干细胞系。在常规血清+LIF条件下培养的细胞形态图；
图9为Pdgf-c野生型(Pdgf-c+/+)和敲除型(Pdgf-c-/-)胚胎干细胞系进行拟胚体形成实验第6天时的细胞形态图；
图10为图9的定量统计图；
图11为建立的诱导性过表达PDGF-C的小鼠胚胎干细胞系的PDGF-C表达情况图；
图12为建立的诱导性过表达PDGF-C的小鼠胚胎干细胞系的核心多能性因子及细胞增殖的标记物的表达水平统计结果；
图13为拟胚体形成实验中诱导性过表达PDGF-C的小鼠胚胎干细胞系(iPDGF-C)和对照组细胞的形态图；
图14为图13的定量统计图；
图15为CCK8实验中诱导性过表达PDGF-C的小鼠胚胎干细胞系(iPDGF-C)和对照组细胞的增殖速度统计图；
图16为加入PDGF-CC重组蛋白刺激小鼠胚胎干细胞的免疫沉淀(IP)联合westernblot实验结果；
图17为小鼠E2.5天的胚胎冲出后、体外培养1天的Nanog和Oct4的表达情况统计图；
图18为诱导性过表达PDGF-C的小鼠胚胎干细胞系(iPDGF-C)及对照组细胞分别加入IgG、针对PDGFR-α/β的中和抗体后的Nanog表达情况统计图；
图19为诱导性过表达PDGF-C的小鼠胚胎干细胞系(iPDGF-C)及对照组细胞分别加入IgG、针对PDGFR-α/β的中和抗体后进行CCK8实验的结果统计图；
图20为Pdgf-c野生型(Pdgf-c+/+)和敲除型(Pdgf-c-/-)小鼠的E3.5胚胎的Nanog表达统计图；
图21Pdgf-c野生型(Pdgf-c+/+)和敲除型(Pdgf-c-/-)小鼠的E3.5胚胎的免疫荧光试验结果图；
图22为图21的定量统计图；
图23为E18.5天小鼠胚胎的体重统计图；
图24为实施例2的小鼠胚胎干细胞的细胞形态图；
图25为实施例2的小鼠胚胎干细胞的细胞增殖统计图。
具体实施例方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。
实施例1
1.所需实验材料
1.1细胞
由于小鼠ESCs与人的ESCs具有许多共同的特性，比如Nanog、Oct4和Sox2是维持小鼠/人ESCs干性的核心多能性转录因子8-10，因此常作为胚胎干细胞的首要研究工具和对象。小鼠胚胎干细胞系E14由美国贝勒医学院提供；小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)购自广州玺美(昭美)生物科技有限公司；A172-loxP小鼠胚胎干细胞系由美国贝勒医学院Dr.ThomasP.Zwaka惠赠。
1.2质粒
pLoxP-3Flag-EGFP：由美国贝勒医学院Dr.Thomas P.Zwaka惠赠。
pSalk-Cre：由美国贝勒医学院Dr.Thomas P.Zwaka惠赠。
1.3抗体和蛋白
本实施例所采用的抗体和蛋白如表1所示。
表1抗体和蛋白的供货商以及对应货号
Figure BDA0002904864070000041
Figure BDA0002904864070000051
1.4siRNA序列
本实施例所采用的siRNA序列如表2所示。
表2 siRNA序列明细
Figure BDA0002904864070000052
2.实验操作
2.1小鼠胚胎干细胞的复苏及培养
1)配制小鼠胚胎干细胞完全培养基：Knockout DMEM 500ml+15％FBS+0.1mM MEM-NEAA+1％P/S+2mM L-Glutamine+0.1mM 2-Me+1000U/mL LIF，4℃保存。
2)0.1％gelatin的配制：将0.1g gelatin粉末溶解于100ml ddH2O中，混合均匀，高温灭菌，常温保存。
3)配制10×PBS：磷酸二氢钾(KH2PO4)2.7g+磷酸氢二钠(Na2HPO4)14.2g+氯化钠(NaCl)80g+氯化钾(KCl)2.0g，加双蒸水定容至1L，混匀，高温灭菌后常温保存。使用时，用灭菌双蒸水稀释成1×PBS。
4)向培养皿中加入0.1％gelatin溶液，在室温放置约30min；
5)用负压泵吸走gelatin溶液，向培养皿中加适量培养基；
6)离心管中预热5mL培养基或PBS；
7)从液氮罐中取出冻存管，将其放入37℃恒温水浴槽中，快速解冻；
8)将悬液转移至离心管中，以1000rpm的转速离心，3min，吸走上清；
9)重悬细胞并转移至干净的培养皿，放入CO2培养箱中培养。待细胞贴壁后，每两天换一次液；
10)显微镜下观察，当细胞克隆长大，细胞密度长至80％～90％时可传代。待传2-3代后，细胞可用于实验。
2.2小鼠胚胎干细胞的传代
1)向培养皿中加入0.1％gelatin溶液，在室温放置30min；
2)用负压泵吸走gelatin溶液；
3)用1×PBS漂洗细胞2次；
4)加0.25％胰蛋白酶消化细胞，在室温孵育约30s后，轻轻摇晃培养皿，显微镜下见细胞克隆松散；
5)加培养基终止消化，按1:3～1:6的比例，将细胞铺到新的培养皿中，摇匀细胞悬液后，将培养皿放回37℃CO2培养箱中培养。
2.3细胞RNA提取，反转cDNA及qRT-PCR
1)取生长至80％密度的细胞，弃培养液，用PBS洗1次，加入500μL Trizol裂解细胞，转移至1.5mL离心管中；
2)加入100μL三氯甲烷，用力摇晃20s，静置3min后4℃离心10min，12000rpm；
3)将上清吸取到新的离心管中，不要吸到中间层；按1:1的比例向上清中加入异丙醇，混匀，静置10min后4℃离心10min；
4)弃上清，加入1mL 75％的乙醇；
5)4℃离心5min，弃上清，加入1mL 75％乙醇，4℃离心5min后，弃上清，将离心管倒立于干净的吸水纸上，待管底的白色沉淀变透明，加入50μl ddH2O，-20℃保存；
6)获得的总RNA，利用FastKing RT kit with DNase(TIANGEN)试剂盒合成cDNA；
7)以合成好的cDNA为模板，参照SYBR Green(ROCHE)试剂盒，在ABI QuantStudio6Flex device(Life Technologies)PCR仪上进行基因表达水平的检测：
8)以GAPDH为内参基因，用delta-delta Ct法对各基因的表达进行计算。各基因的引物序列在Primerbank网站上获取。
2.4Western blot实验
1)配制液体：
①10×Running buffer：依次加入144g甘氨酸、10g SDS粉末、30.3g Tris粉末，加ddH2O定容至1升。使用时需稀释成1×Running buffer；
②5×SDS loading buffer：依次加入SDS粉末4g、溴酚蓝20mg、DTT 3.085g、Tris-HCl(1M pH 6.8)10mL、甘油20mL，加ddH2O定容至40mL；
③10×transfer buffer：依次加入30.3g Tris粉末、144g甘氨酸，加ddH2O定容至1L。使用时稀释成1×transfer buffer，即10×transfer buffer 100mL+甲醇200mL+蒸馏水700mL。
2)配制分离胶和浓缩胶
分别按照表3和表4所提供的配方配制8％分离胶(10mL)和5％的浓缩胶(5mL)。
表3 8％分离胶配方
Figure BDA0002904864070000061
表4 5％的浓缩胶
Figure BDA0002904864070000062
Figure BDA0002904864070000071
3)蛋白凝胶电泳：取出电泳槽，组装蛋白凝胶电泳装置，小心地拔掉梳子，向电泳槽中加入1升1×SDS running buffer，向上样孔中依次加入蛋白Marker及样品。插上装置电源，设置程序：恒压100V，1.5h，开始电泳，直到溴酚蓝接近分离胶下缘时，停止电泳。
4)转膜：取出PVDF膜和滤纸，甲醇浸泡PVDF膜30s。拆除电泳装置，取出凝胶，按照顺序组装好转膜夹(即“三明治”样结构)，组装过程中要注意赶走气泡。组装转膜装置，加入转膜液，设置转膜程序：恒流250mA，1.5～2h，开始转膜。
5)封闭：转膜结束后，取出PVDF膜并放入配制好的封闭液中，在室温摇床上封闭1h；
6)孵育一抗：用1×TBST洗膜数次，至牛奶冲洗干净为止，用封闭液配制好一抗，并放入PVDF膜，孵育盒放入4℃冷库的摇床上过夜孵育；
7)用1×TBST洗膜三次，10min每次；
8)用封闭液按1：5000比例配制二抗，并放入PVDF膜，孵育盒置于摇床上，在室温下孵育1h；
9)同上步骤清洗PVDF膜。
10)显影、曝光：在避光环境中，配制化学显色液，并将PVDF膜放入化学显色液中，正面朝上，孵育1～3min。将PVDF膜放入蛋白凝胶曝光系统中，正面朝上并滴加几滴发光液(避免膜放干)，曝光，拍照，记录和保存结果。
2.5细胞siRNA转染实验(以12孔板为例)
1)准备转染试剂及配制：
1.Opti-mem：100μL，siRNA：2μL(终浓度为40pm)，轻轻混匀。
2.Opti-mem：100μL，Liofectamine 2000：2μL，轻轻混匀。
2)步骤1)1.2配制的液体，室温静置5min；
3)将步骤1)1.2混合，室温静置15min，在此期间可准备好需要转染的细胞；
4)使用小鼠胚胎干细胞E14细胞系，常规消化，将细胞用计数仪Count Star计数后，以5*104/孔，配成1ml细胞悬液，铺于12孔板中；
5)将步骤4中静置好的转染混合液加入细胞悬液，37℃CO2培养箱培养，6小时后更换新鲜培养液；
6)转染48小时后，用Trizol试剂收集细胞，提RNA，及后续实验。
2.6诱导型过表达PDGF-C细胞株的建立(电转法)
基因诱导表达系统(pLoxP2载体，pSalk-Cre载体和A172-LoxP小鼠胚胎干细胞系)是由美国贝勒医学院Dr.Thomas P.Zwaka惠赠。A172-LoxP小鼠胚胎干细胞系表达rtTA/TRE元件：强力霉素(DOX)可以通过Cre重组酶介导的LoxP侧翼靶基因插入到TRE盒(包含LoxP)中诱导目的目标基因的表达(具体参考文献：Fujita,J.,Crane,A.M.,Souza,M.K.,Dejosez,M.,Kyba,M.,Flavell,R.A.,Thomson,J.A.,and Zwaka,T.P.(2008).Caspaseactivity mediates the differentiation of embryonic stem cells.Cell stem cell2,595-601；Lu,W.,Fang,L.,Ouyang,B.,Zhang,X.,Zhan,S.,Feng,X.,Bai,Y.,Han,X.,Kim,H.,He,Q.,et al.(2015).Actl6a protects embryonic stem cells fromdifferentiating into primitive endoderm.Stem Cells 33,1782-1793.)。通过PCR技术从E14小鼠胚胎干细胞系扩增编码鼠PDGF-C核心结构域的cDNA，将其克隆到pLoxP2靶向载体中，并在N端插入3Flag标签。通过测序验证表达载体中PDGF-C核心结构域的序列，然后将表达PDGF-C的载体命名为3Flag-PDGF-C。使用NEPA21电穿孔仪(NEPA GENE)将3Flag-PDGF-C载体(10μg)与表达Cre的pSalk-Cre载体(10μg)一起电穿孔(115V，7.5ms)到A172-LoxPESC(1x106)中。用G418(300μg/ml)选择稳定表达PDGF-C的ESC，并扩增单个克隆。将已确认PDGF-C过表达的两个不同克隆用于实验，重复至少3次。通过向培养基中添加Dox(0，100，500ng/ml，Sigma-Aldrich)处理48小时来诱导PDGF-C表达(iPDGF-C)。
使用NEPA21高效基因转染系统，使用胚胎干细胞A172细胞系，具体操作如下：
1)细胞悬液的制备
S1.根据细胞量1x106/管，准备细胞。
S2.用胰蛋白酶消化、收集细胞。
S3.离心弃上清，加入EP buffer对细胞进行重悬。
S4.重复2-3次，以洗去培养基中的血清。
S5.细胞计数，根据浓度及细胞悬液的总体积，算出总细胞量。
2)细胞+DNA混合液的制备
将细胞与质粒DNA充分混匀，终浓度为100μL混合液中含有1×106细胞及10μLDNA。其中细胞体积为98μL，质粒DNA体积为2μL(质粒：pLoxP-3Flag-Pdgf-c-EGFP质粒、10μgpSalk-Cre质粒)。
3)电转实验
S1.预先在6孔板中加入培养液，37℃培养箱预热。
S2.设置电转染参数：115V，7.5ms。
S3.轻轻敲电转染杯以去除气泡。
S4.将电转杯放入电转槽中。
S5.按下“Ω”键，测定电阻值并做好记录。
S6.按下“start”健，约2～3s即可停止。执行电转程序。记录仪器参数。
S7.取出电转杯，用吸管(仪器配备)吸取少量培养液加入电转杯中，将培养基和细胞液混匀并全部吸出，加入到6孔板中。可重复操作。
S8.重复以上电转步骤，进行下一个转染。
4)24小时后更换干细胞培养基(300μg/mL G418)，筛选克隆约1周左右。
5)待克隆形成变大，肉眼可见(阴性对照全部死亡)，开始进行克隆挑取和扩增。得到稳定克隆细胞株后，可进行诱导表达，强力霉素Doxycyclin培养48小时后做后续鉴定及实验。
2.7拟胚体(Embryoid body，EB)形成实验
1)取生长至80％密度的细胞，消化、中和和重悬，细胞计数后，以4×104个细胞/mL的密度加在不含LIF的常规胚胎干细胞培养基中，放在V型加样槽中备用。
2)每组细胞准备3个150mm的培养皿，往皿中倒入20mL的PBS，皿盖朝上放在桌面。
用多通道移液器吸取细胞悬液，以23μL/液滴的量加到皿盖内部，尽量点多些液滴，但液滴之间也要保有空隙以免粘连。
3)加好后，缓慢轻轻地将皿盖扣回皿上，并将培养皿移回培养箱常规培养。
4)分别在第3、6、9天的时候将一个培养皿/组取出，用PBS将皿盖里的液滴冲下来集中在新的10mm细胞皿里，摇匀聚焦拟胚体在皿中央，显微镜下拍照、统计数目及用imageJ软件分析拟胚体的面积。
2.8集落形成及碱性磷酸酶(AP)染色
1)在一个6孔板的细胞培养板中，以2×105的细胞/孔的密度铺入小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层细胞，培养基为含10％胎牛血清的高糖DMEM。
2)第二天，等饲养层细胞达到90％的密度后，加入10μg/mL的丝裂霉素进行处理，终止细胞的分裂。放入培养箱处理3小时后，取出用PBS洗1次，换上常规胚胎干细胞培养基。
3)小鼠胚胎干细胞进行消化、中和和重悬，细胞计数后以1000个细胞/孔的密度分别铺入6孔板的细胞培养板中。
4)培养板置于培养箱中培养7天，每2天换一次培养基。第7天，进行AP染色实验。根据Vector blue alkaline phosphatase substrate kit(SK-5300，Vector Laboratories)说明书的要求进行试剂的配制，然后将细胞培养基全部吸走，PBS洗1次后，按1.5mL/孔的体积将染色剂加入到细胞中，避光孵育10分钟。
5)弃染色剂，加PBS洗1次，加适量PBS后放在倒置显微镜观察拍照，观察染蓝色的克隆状态及着色程度，判断细胞的自我更新状态。
2.10CCK-8细胞增殖实验
1)小鼠胚胎干细胞常规消化，将细胞用计数仪Count Star计数后，以3000/孔，配制100mL的细胞悬液，密度铺于96孔板；
2)培养板放在37℃CO2培养箱孵育48小时；
3)加CCK-8溶液(10μL/孔)；
4)培养板放入培养箱内，孵育4小时；
5)酶标仪ELx800 Absorbance microplate reader(BioTek)，测定在450nm处的吸光度。
2.11受体激活实验
1)第一天
培养小鼠胚胎干细胞E14细胞系，至80％密度左右,更换无血清的培养基(5ml/10cm皿)，37℃CO2培养箱过夜。
2)第二天
S1.更换无血清培养基，IgG(对照组)和PDGF-CC处理组(50ng/ml，5ml/10cm皿)；
S2.37℃培养箱，培养10min.；
S3.冰上RIPA+PI蛋白裂解液(400μl/皿)搜集皿中蛋白，后续按照免疫沉淀步骤操作；
S4.4℃离心机，133000rpm，离心15min；
S5.将上清转移到新的离心管，使用BCA法测蛋白浓度；
S6.取200μg-1000μg(750μg)蛋白样品；
S7.按1：250比例加入一抗(3μg)：抗-PDGFRα(sc-338；Santa Cruz)加入蛋白样品，4℃摇床过夜。
3)第三天(注意冰上操作)
S1.预洗Agrose beads：取抗兔IgG agarose beads 50μl(1ug的蛋白样品，50ulbeads足够)，加入三倍体积的RIPA裂解液，4℃，9000rpm，离心30sec，重复洗三次；
S2.将4℃过夜的样品，即混有一抗和蛋白样品的离心管取出，上下稍颠倒混匀；
S3.将步骤中的混合液加入预先洗好的beads中，4℃上下摇床，1小时；
S4.4℃，9000rpm，离心30s；
S5.小心吸除上清，注意避免洗到beads；
S6.加入30μL 2×loading buffer(100Mm DTT)，轻轻混匀；
S7.100℃，10min，煮蛋白，将离心管内所有样品全部上样跑胶，后续操作同Western Blot。
2.12小鼠胚胎中PDGF受体抑制试验
收集E3.5的小鼠胚胎并用M2培养基洗涤，然后将20个胚胎培养于50μL覆盖有矿物油(M8410，Sigma-Aldrich)的KSOM培养基中(MR-121-D，Millipore)。培养基中加入Crenolanib(100nM，Cayman)以抑制Pdgfr-αand Pdgfr-β。置于37℃，5％CO2培养箱中培养24h后收集胚胎进行qRT-PCR。
2.13敲除小鼠
Pdgf-c全身敲除小鼠已在C57BL/6J背景上繁殖了六代以上。同窝仔鼠用于实验。用于基因型鉴定Pdgf-c缺陷型小鼠的引物分别为：5’-CTGATGTTCTCGTGACTCTGA-3’；5’-TAGCTAGTCGATACCGTCGA-3’；5’-AGCTGACATTTGATGAGAGAT-3’；5’-AGTAGGTGAAATAAGAGGTGAACA-3’。200bp电泳条带结果代表野生型小鼠，350bp电泳条带结果代表Pdgf-c敲除小鼠。
2.14小鼠胚胎的收集、免疫荧光及挽救实验
使用前述方法从Pdgf-c+/-x Pdgf-c+/-亲本中获得Pdgf-c敲除胚胎，通过腹腔注射5IU HCG(Calbiochem，230734-2.5MG)及46-48h腹腔注射5IU PMSG(Calbiochem，367222-1000IUCN)的方法对3～4周龄的雌鼠进行超数排卵，然后按照1:1的比例将雌雄小鼠合笼配繁。注射HCG 20～21h后若观察到雌鼠阴道栓则标志为0.5d胚胎(dpc)。3.5天后从雌鼠子宫中冲吹出小鼠胚胎并收集培养在M2培养基中(Sigma-Aldrich，M7167)。为了对胚胎进行整体染色，将E3.5胚胎收集在GPS培养皿(LifeGlobal Group)中，洗涤并在冰上固定于4％的多聚甲醛中15min。然后在封闭液(3％BSA in PBS)中使用0.1％Triton X-100透化30min，再于封闭液中孵育1h。胚胎在4℃封闭液中用一抗处理过夜，清洗后，使用二抗在室温下孵育1h，然后在抗荧光淬灭封闭剂固定介质中用DAPI(Vector Laboratories，H1200)核染色法对胚胎进行复染。使用的一抗是：anti-NANOG(ab80892，Abcam)and anti-PDGF-C(AF1447，R&D)。将胚胎放置于培养皿(P35G-0-14-C，MatTek Corp)玻璃板上的矿物油中，使用共聚焦Z1成像仪显微镜检测荧光染色结果。为了进行挽救实验，将所有小鼠在C57BL/6J背景上繁殖六代以上，并将杂合子小鼠用于实验。从E0.5-E15.5天，每3天将前面所述的人PDGF-CC核心结构域蛋白(10μg/mice)或盐水通过腹腔注射到Pdgf-c-/-的妊娠小鼠(与Pdgf-c-/-雄性小鼠配繁)中。在E18.5，收集胚胎并称重。
2.15Pdgf-c-/-and Pdgf-c+/+小鼠胚胎干细胞建系
从Pdgf-c+/-杂合子雌鼠的3.5日龄的胚胎中分别获得Pdgf-c-/-和Pdgf-c+/+小鼠胚胎干细胞系。将胚胎收集在M2培养基中随后分别培养于无MEF、涂有0.1％明胶的无血清2i96孔板培养基中。待囊胚附着贴壁，每天用含有2i培养基换液。培养6-12天后，用0.25％的胰酶将内部细胞团消化并重新培养于涂有0.1％的明胶的96孔板中。小鼠胚胎干细胞会逐渐生长至亚融合状态并将其转移到较大的涂有明胶大的培养皿中。每2-4天对干细胞进行传代培养，并每天更换新的2i培养基。最后通过PCR对胚胎干细胞进行基因型分析。
2.16嵌合体实验
通过将15-20个基因型为Pdgf-c+/+或Pdgf-c-/-的小鼠胚胎注射到Pdgf-c-/-基因型的宿主胚胎中来产生嵌合胚胎。移植到2.5天的假孕CD-1雌鼠子宫中，饲养小鼠至14.5天后处死收取胚胎进行评估及拍照。
2.17PDGFr-αand PDGFr-β中和抗体实验
将具有诱导PDGF-C过表达(iPDGF-C)的小鼠胚胎干细胞以1x105个/孔的密度接或3000个/孔的密度分别接种于有强力霉素(500ng/mL)或无强力霉素的12孔板或96孔板中。加入鼠Pdgfr-α中和抗体(0.6μg/mL，AF1062，R&D)、鼠Pdgfr-β中和抗体(0.6μg/mL，16-1402-82，Invitrogen)或对照的羊抗IgG(0.6μg/mL)，培养72h后，收集细胞进行qPCR或CCK8分析。
3.实验结果
我们利用western blot实验比较小鼠胚胎干细胞(mESCs)及小鼠分化末端细胞(小鼠胚胎成纤维细胞MEF)的细胞裂解物中的蛋白含量。如图1所示，在4个PDGF配体中，只有PDGF-C的含量是在mESCs比MEF中高，其他三个配体含量都在MEF中更高。
利用靶向小鼠PDGF-C序列的两条siRNA靶向PDGF-C的序列，在小鼠的mESCs中进行瞬时转染敲低实验，并通过western blot检测敲低效率，结果证明了敲低的效率非常高，如图2所示。利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)实验检测对照组及敲低PDGF-C组的小鼠胚胎干细胞中核心多能因子(Nanog,Oct4,Sox2)(结果如图3)、细胞增殖标记物Ki67(结果如图4)和三个胚层分化标记物(结果如图5)的表达，发现敲低PDGF-C会下调多能性、增殖标记物的表达，而分化标记物的表达上调，表明PDGF-C敲低会引起细胞分化，干性丢失。
在mESCs中敲低PDGF-C达到48小时后，显微镜下观察细胞形态，发现干细胞的克隆形态消失，细胞变为梭形，显示分化形态，如图6；利用碱性磷酸酶试剂染色(碱性磷酸酶为干细胞表面标记物)，通过统计，统计结果如图7，发现敲低Pdgf-c导致细胞染色程度下。由此，说明Pdgf-c对小鼠ESCs的自我更新维持具有重要作用。
利用Pdgf-c杂合子小鼠(Pdgf-c+/-x Pdgf-c+/-)相互交配，E3.5天获取的胚胎进行胚胎干细胞建系，并通过基因型鉴定得到的Pdgf-c野生型(Pdgf-c+/+)和敲除型(Pdgf-c-/-)胚胎干细胞系。在常规血清+LIF条件下培养，发现Pdgf-c敲除的细胞克隆形态较野生型的要差，边缘不光滑，克隆扁平，细胞趋向分化状态(如图8)。进行拟胚体形成实验(EBformation)，在第6天的时候发现Pdgf-c-/-细胞形成拟胚体的体积更小，说明细胞多能性受到了抑制(图9、图10)。
通过电转法建立了诱导性过表达PDGF-C的小鼠胚胎干细胞系(iPDGF-C)，加入不同剂量的强力霉素(Dox)去诱导PDGF-C外源的表达，western blot检测发现外源PDGF-C随着Dox浓度加大而表达量增高(图11)。进一步利用qRT-PCR检测(图12)发现，随着Dox剂量的加大，PDGF-C表达增高，核心多能性因子(Nanog,Oct4,Sox2)及细胞增殖(Ki67)的标记物的表达水平也逐步上升。
拟胚体形成实验(图13、14)发现，在第3天的时候，诱导性过表达PDGF-C的小鼠胚胎干细胞系(iPDGF-C)比对照组细胞能形成更大更多的拟胚体，证明PDGF-C可促进细胞的多能性。
细胞增殖实验(图15)发现，在第72和96小时的时候，诱导性过表达PDGF-C的小鼠胚胎干细胞系(iPDGF-C)比对照组细胞的细胞量更多，说明PDGF-C可促进细胞的增殖。
在野生型小鼠胚胎干细胞中，加入外源PDGF-CC重组蛋白短暂刺激，可以增强PDGFR-α的磷酸化，如图16所示，说明PDGF-C在小鼠胚胎干细胞中会激活PDGFR-α。进一步为了在体内验证PDGFR受体是否对胚胎发育具有作用，我们先冲出E2.5天的野生型小鼠胚胎，体外培养的同时添加PDGFR-α/β抑制剂进行处理，再通过qRT-PCR检测多能性因子Nanog、Oct4的表达量(图17)，发现两个因子在受体被抑制之后表达显著下降，说明PDGFR通路对胚胎的多能性具有重要维护作用。接着，为证明PDGF-C是通过激活PDGFR-α去发挥维持干性的作用，我们在诱导性过表达PDGF-C的小鼠胚胎干细胞系(iPDGF-C)及对照组细胞中分别加入PDGFR-α、β的中和抗体去拮抗这两个受体的作用，IgG作为阴性对照，通过qRT-PCR检测(图18)发现多能性因子Nanog的表达在过表达PDGF-C后上升，但被PDGFR-α中和抗体抑制，而PDGFR-β的中和抗体并没有起显著作用，证明了我们的猜想。最后，再次利用CCK8实验(图19)验证了细胞的增殖情况，同样，PDGF-C促进的干细胞的增殖能力会被PDGFR-α中和抗体抑制，说明PDGF-C是通过激活PDGFR-α去发挥维持干性的作用。
我们收集了PDGF-C野生型(Pdgf-c+/+)和敲除型(PDGF-C-/-)小鼠的E3.5胚胎，qRT-PCR检测发现在Pdgf-c敲除后，核心多能性因子Nanog的表达量显著下降，如图20所示。再次利用免疫荧光试验进行验证，结果如图21、图22所示，的确发现PDGF-C-/-小鼠胚胎的表达Nanog的细胞数目比野生型胚胎明显下降，说明PDGF-C对小鼠早期胚胎发育、尤其是核心多能性因子Nanog的表达具有重要作用。
小鼠胚胎的发育大概为21天。图23为PDGF-C野生型(PDGF-C+/+)和敲除型(PDGF-C-/-)小鼠的E18.5天的胚胎的体重统计图。发现敲除PDGF-C会降低小鼠胚胎的体重，证明影响了胚胎的正常发育。进一步，为探究PDGF-C的注射是否能挽救这个缺陷，我们先对PDGF-C敲除型(PDGF-C-/-)小鼠进行交配，对见栓的孕鼠进行PDGF-CC重组蛋白的腹腔注射，对照组则注射生理盐水。结果发现，注射PDGF-CC重组蛋白的孕鼠，其E18.5天的胚胎体重有显著回升，基本恢复到野生型小鼠的体重水平，证明PDGF-CC的加入可以保证小鼠胚胎的正常发育。
实施例2
1.利用PDGF-C培养小鼠胚胎干细胞
(1)小鼠胚胎干细胞E14(实验中所使用的小鼠胚胎干细胞由由美国贝勒医学院提供)；PDGF-CC蛋白(购于Peprotech公司，货号100-00cc-100)。
(2)小鼠胚胎干细胞的复苏培养
1)配制小鼠胚胎干细胞完全培养基：Knockout DMEM 500mL+15％FBS+0.1mM MEM-NEAA+1％P/S+2mM L-Glutamine+0.1mM 2-Me+1000U/mL LIF，4℃保存。
2)0.1％gelatin的配制：将0.1g gelatin粉末溶解于100mL ddH2O中，混合均匀，高温灭菌，常温保存。
3)配制10×PBS：磷酸二氢钾(KH2PO4)2.7g+磷酸氢二钠(Na2HPO4)14.2g+氯化钠(NaCl)80g+氯化钾(KCl)2.0g，加双蒸水定容至1L，混匀，高温灭菌后常温保存。使用时，用灭菌双蒸水稀释成1×PBS。
4)向培养皿中加入0.1％gelatin溶液，在室温放置约30min；
5)用负压泵吸走gelatin溶液，向培养皿中加适量培养基；
6)离心管中预热5mL培养基或PBS；
7)从液氮罐中取出冻存管，将其放入37℃恒温水浴槽中，快速解冻；
8)将悬液转移至离心管中，以1000rpm的转速离心，3min，吸走上清；
9)重悬细胞并转移至干净的培养皿，放入CO2培养箱中培养。待细胞贴壁后，每两天换一次液；
10)显微镜下观察，当细胞克隆长大，细胞密度长至80％～90％时可传代。待传2-3代后，细胞可用于实验。
(3)小鼠胚胎干细胞的传代
1)向培养皿中加入0.1％gelatin溶液，在室温放置30min；
2)用负压泵吸走gelatin溶液；
3)用1×PBS漂洗细胞2次；
4)加0.25％胰蛋白酶消化细胞，在室温孵育约30s后，轻轻摇晃培养皿，显微镜下见细胞克隆松散；
5)加培养基终止消化，按1:3～1:6的比例，将细胞铺到新的培养皿中，并分为对照组和实验组，其中：对照组使用仅含5％血清的小鼠胚胎干细胞完全培养基；实验组使用仅含5％血清的小鼠胚胎干细胞完全培养基加入终浓度为10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml的PDGF-CC蛋白；
6)摇匀细胞悬液后，将培养皿放回37℃CO2培养箱中培养。
7)培养48小时后，镜下观察可发现添加PDGF-CC蛋白的实验组细胞克隆集落形态更清晰、克隆更大，并且随浓度增加而增加；此时可进行qpcr、碱性磷酸酶染色及CCK-8细胞增殖实验(见实施例1的2-3，2-8和2-10)检测细胞的自我更新及多能性。
8)若需要继续传代，可每隔2天进行换液，重新补充PDGF-CC蛋白。
2.培养结果
在细胞培养的过程中定时观察细胞状态、统计细胞量，具体结果如图24、25所示。与在培养基中加入了50ng/ml、100ng/ml的PDGF-CC蛋白的实验组细胞相比，对照组细胞边缘不光滑，克隆扁平，细胞趋向分化状态，另外，实验组细胞增殖速度明显大于对照组细胞的增殖速度，随着PDGF-CC蛋白的用量加大，增殖速度的提升幅度增大。由此，可以证明，50-100ng/ml的PDGF-CC蛋白既可以维持胚胎干细胞的多能性，也可以使提高胚胎干细胞的增殖能力。
实施例3
利用PDGF-C保护小鼠早期胚胎发育的培养方法，包括以下步骤：
1)C57BL/6小鼠(6-8周龄)购自集萃药康公司；
2)HCG和PMSG均购自Calbiochem公司。配制：PMSG和hCG粉末按说明书的量用纯水配制为1IU/ul储存液，分装(30,60或90ul体积分装)后-20度保存。使用前，室温解冻约5min,并用0.9％NaCl稀释20倍。
3)培养液：用于冲胚的培养液：M2培养基(Sigma-Aldrich，M7167)KSOM；用于胚胎体外培养的基本培养液：KSOM培养基(Sigma-Aldrich，MR-121-D)。PDGF-CC蛋白(购于Peprotech公司，货号100-00cc-100)。透明质酸酶(Sigma-Aldrich，H-4272)
4)制作可取胚胎的玻璃巴氏吸管：酒精灯外焰烤，待软，离开火源，保持双手平直，拉长约7～8cm。磨石在吸管细长部分约2cm进行旋转打磨，利用吸管的重力在打磨处轻轻压，会自然断开。若断口不平整，可用酒精灯内焰稍作灼烧。加上22μM的滤膜及橡皮管进行吸管的组装。
5)50μL/滴的KSOM在35mm细胞培养小皿做4个液滴，其中一个液滴仅加KSOM，另外三个液滴分别加入10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL的PDGF-CC蛋白，并加入1.5mL矿物油封好；另外准备2个35mm细胞培养小皿，加入2ml的M2培养基，37℃培养箱过夜平衡。
6)小鼠催排处理：C57BL/6雌鼠腹腔注射PMSG 5IU/只，46～48h后再腹腔注射hCG(5IU/只)，并一对一与雄鼠合笼，次日早晨(10点前)检查雌鼠阴栓，有阴栓为交配成功的雌性小鼠，记为Day 0.5，同时准备收取此时的胚胎。
7)胚胎的收取：上午10点前，将雌鼠处死，打开腹腔，剪取输卵管，放在M2培养基中。冲洗一下后转移到透明质酸酶溶液，并用镊子把输卵管壶腹部撕开，让受精卵冲出来，在透明质酸酶中消化约3分钟，去掉卵丘细胞。把培养皿放回培养箱培养。
8)胚胎在培养箱持续饲养4天，每隔24小时在显微镜下观察2-细胞、4-细胞卵裂率、桑椹胚、早期囊胚和晚期囊胚的发育率，以及囊胚的孵化率。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.生长因子PDGF-C在促进干细胞多能性的应用。
2.一种利用PDGF-C促进干细胞多能性的培养方法，其特征在于：在培养干细胞的培养基中添加PDGF-C因子，所述PDGF-C因子为生长因子PDGF-C或其二聚体蛋白。
3.如权利要求2所述利用PDGF-C促进干细胞多能性的培养方法，其特征在于：所述PDGF-C因子为利用昆虫细胞或大肠杆菌系统表达和纯化得到的人源PDGF-CC重组蛋白。
4.如权利要求3所述利用PDGF-C促进干细胞多能性的培养方法，其特征在于：
所述培养基为向低血清培养基中添加含有所述PDGF-C因子配制而成；
所述低血清培养基的组分组成为：Knockout DMEM+5％FBS+0.1mM MEM-NEAA+1％P/S+2mM L-Glutamine+0.1mM 2-Me+1000U/mL LIF。
5.如权利要求4所述利用PDGF-C促进维持干细胞多能性的培养方法，其特征在于：选择重组蛋白PDGF-CC作为所述PDGF-C因子，重组蛋白PDGF-CC在所述培养基中的终浓度为50～100ng/ml。
6.一种利用PDGF-C促进干细胞多能性的培养方法，其特征在于：构建表达PDGF-C的质粒或病毒液，感染所述干细胞。
7.一种利用PDGF-C促进干细胞多能性的培养方法，其特征在于：在构建好的诱导性过表达PDGF-C干细胞中利用强力霉素诱导获得过表达PDGF-C的干细胞。
8.如权利要求2、6、7任一项所述促进干细胞多能性的培养方法，其特征在于：所述干细胞为胚胎干细胞。
9.如权利要求8所述促进干细胞多能性的培养方法在胚胎培养中的应用，其特征在于：所述胚胎为非人哺乳动物胚胎；所述胚胎培养是指从受精卵发育到囊胚形成的阶段。
10.一种用于促进干细胞多能性的培养基，其特征在于，其组分包括：Knockout DMEM+5％FBS+0.1mM MEM-NEAA+1％P/S+2mM L-Glutamine+0.1mM 2-Me+1000U/mL LIF+50～100ng/ml重组蛋白PDGF-CC。
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