CN114794014A - 粪菌移植法建立阿尔茨海默病阴虚证和/或阿尔茨海默病非阴虚证动物模型、评价及应用 - Google Patents

粪菌移植法建立阿尔茨海默病阴虚证和/或阿尔茨海默病非阴虚证动物模型、评价及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种动物模型的构建方法，具体涉及一种运用粪菌移植法建立阿尔茨海默病阴虚证人动物模型建立与评价。本发明通过制备阿尔茨海默病阴虚证和/或非阴虚证患者的粪菌液、小鼠灌服和饮水方式服用四联抗生素药物后移植制备的粪菌液，得到相应的阿尔茨海默病阴虚证和/或非阴虚证动物模型，同时采用多种方法进行动物模型评价，确认模型建立是否成功。本发明提供一种稳定性高、易于推广、重复性好、成功率高，经济实用的阿尔茨海默病阴虚证和/或非阴虚证动物模型，为中医药治疗阿尔茨海默病研究提供基础，为实现阴虚证模型评价的标准化与规范化提供思路。

Description

粪菌移植法建立阿尔茨海默病阴虚证和/或阿尔茨海默病非 阴虚证动物模型、评价及应用
技术领域
本发明属于一种动物模型构建方法领域，具体涉及一种运用粪菌移植法建立阿尔茨海默病阴虚证和/或阿尔茨海默病非阴虚证动物模型、评价及应用。
背景技术
阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)即老年痴呆症。随着老龄化社会的到来，老年痴呆症的发病率正日益增多。它是当前世界上的“流行病”之一，在发达国家也被列为最常见的死亡原因之一。老年痴呆症病人的主要临床表现为记忆障碍，认知能力下降，甚至意识模糊。探索和应用理想的动物模型进行相关机理研究是AD研究中的重要内容，这也是目前AD病因、病理研究、治疗药物研发以及临床诊断与治疗有待突破的难点。
肠道菌群是一个复杂且庞大的群体，在一个健康的成年人体内，肠道菌群总重量可达约1 -2千克，其中包含的细胞数量高达1013 -1014个，约是人体细胞数目的10倍，肠道微 生物编码基因组数目约为人体编码基因数目的100倍，因此也被称为“第二基因组”。
粪菌移植”（Fecal microbiota transplantation，FMT），其定义是，将健康人粪便中的功能菌群，移植到患者胃肠道内，重建新的肠道菌群，实现肠道及肠道外疾病的治疗，粪菌移植(fecal microbiota transplantation,FMT) 作为重建肠道菌群的有效手段。
目前，粪便移植试验的小鼠模型不仅构建繁琐、模型效果较差、难以反映真实情况；且未发现通过粪便移植方法建立阿尔茨海默阴虚证和/或阿尔茨海默非阴虚证动物模型相关报道。
发明内容
本发明的目的克服了现有技术的不足，提供了一种建立阿尔茨海默病阴虚证和/或阿尔茨海默病非阴虚证动物模型方法、评价方法和应用。
本发明由如下技术方案实现的。
第一方面。
本发明提供一种运用粪菌移植法建立阿尔茨海默病阴虚证和/或阿尔茨海默病非阴虚证动物模型的方法，具体包括如下步骤：
（1）制备粪菌液：将来源于临床确诊为阿尔茨海默病阴虚证和/或阿尔茨海默病非阴虚证患者的粪便制成粪菌液；
（2）小鼠灌服和饮水方式服用四联抗生素药物，所述的四联抗生素为氨苄青霉素、硫酸新霉素、盐酸万古霉素、甲硝唑；
（3）模型建立：步骤2中小鼠分别移植步骤1制备的粪菌液，得到阿尔茨海默病阴虚证和/或阿尔茨海默病非阴虚证动物模型。
进一步的，所述的一种运用粪菌移植法建立阿尔茨海默病阴虚证和/或阿尔茨海默病非阴虚证动物模型的方法，所述步骤(1)具体包括如下步骤：
A:配置0.9%生理盐水内含10%甘油、0.1%L-半胱氨酸混合溶液，作为粪便保护液，高压灭菌锅内115℃煮熟20 min，粪便样本置入装有粪便保护液中，混匀；
B: 将步骤A得到的混匀粪便的粪便保护液过滤，得到滤液进行离心处理，弃上清液，所得沉淀为收集到的菌体；
C:使用粪便保护液重悬步骤B所得沉淀菌体；
D:根据需要分装粪菌液，-80℃保存。
优选的的，所述的一种运用粪菌移植法建立阿尔茨海默病阴虚证和/或阿尔茨海默病非阴虚证动物模型的方法，步骤B中通过无菌200目尼龙网进行过滤；离心条件为4000rpm 10min。
优选的，所述的一种运用粪菌移植法建立阿尔茨海默病阴虚证和/或阿尔茨海默病非阴虚证动物模型的方法，步骤B、C、D均在厌氧环境下完成，其中厌氧环境要求O2浓度<2%。
进一步的。所述的一种运用粪菌移植法建立阿尔茨海默病阴虚证和/或阿尔茨海默病非阴虚证动物模型的方法，其特征在于，步骤(2)具体包括如下步骤：
步骤1：小鼠选取阶段，选取SPF级雄性C57BL/6小鼠，鼠龄6周；
步骤2：小鼠分类阶段，将C57BL/6小鼠分类，分为健康菌液组（C组）、阿尔茨海默病阴虚证菌液组（AY组）、阿尔茨海默病非阴虚证菌液组（ANY组）；
步骤3：清除菌群阶段，步骤2所述小鼠于第1周灌胃给药，第2周饮水给药。
步骤 4：造模阶段，步骤3所述小鼠分别灌胃移植健康志愿者、阿尔茨海默病阴虚证患者及非阴虚患者粪菌液。
优选的，所述的一种运用粪菌移植法建立阿尔茨海默病阴虚证和/或阿尔茨海默病非阴虚证动物模型的方法步骤(3)灌胃给药量为氨苄青霉素100μL/只、硫酸新霉素100μL/只、盐酸万古霉素100μL/只，甲硝唑500μL/只；饮水给药量为氨苄青霉素1g/L、万古霉素0.5g/L、新霉素1g/L、甲硝唑1g/L。
优选的，所述的一种运用粪菌移植法建立阿尔茨海默病阴虚证和/或阿尔茨海默病非阴虚证动物模型的方法，步骤4移植粪菌时连续移植3次，200μL/次；之后隔1天粪菌移植1次。
第二方面。
本发明提供一种运用粪菌移植法建立阿尔茨海默病阴虚证和/或阿尔茨海默病非阴虚证动物模型评价方法，通过旷场实验、新物体识别实验、避暗实验、Morris水迷宫实验、体重、进食量、饮水量、唾液流率、粪便含水量、皮肤含水量、体温、尿色、24小时尿量进行评价。
进一步的，上述的旷场试验为小鼠5min内正中格停留时间、穿格次数、运动距离、运动速度；Morris水迷宫实验包括位航行逃逸潜伏期、找到平台时间、穿越平台的次数、停留在目标象限的时间。
第三方面。
本发明提供所述的运用粪菌移植法建立阿尔茨海默病阴虚证和/或阿尔茨海默病非阴虚证动物模型的方法在阿尔茨海默病治疗中的应用，将所述方法构建的阿尔茨海默病动物模型包括用于研发阿尔茨海默病的早期诊断试剂及方法和研发阿尔茨海默病的治疗药物。
本发明的有益效果主要体现在：
本研究采用阴虚证造模方法进行模型构建，创新性结合 “五心烦热、潮热、口干、皮肤干燥、便干、形体消瘦、尿赤”等阴虚证典型表现制定评价指标，探索阴虚证动物模型评价方法，为实现阴虚证模型评价的标准化与规范化提供思路。
本发明提供一种稳定性高、易于推广、重复性好、成功率高，经济实用的阿尔茨海默病阴虚证和/或阿尔茨海默病非阴虚证动物模型，为中医药治疗阿尔茨海默病临床前期研究提供实验基础，为建立中医病症结合人源肠道菌群动物模型提供了新的研究方向。
肠道菌群是介导AD阴虚证的重要影响因素，研究AD阴虚证患者特异性肠道微生物及代谢物改变及病理机制有重要意义。
附图说明
图1为新物体识别实验结果统计。
图2为避暗实验结果统计。
图3为水迷宫实验-逃逸潜伏期。
图4为水迷宫实验-找到平台时间、穿越平台的次数、找到目标象限时间。
图5为粪菌移植7周小鼠体重-总体统计。
图6为小鼠体重—按供体阿尔茨海默病中重度统计。
图7为小鼠体重-按供体性别统计。
图8为小鼠进食量-总体统计。
图9为小鼠进食量-按供体阿尔茨海默病中重度统计。
图10为小鼠进食量-按供体性别统计。
图11为小鼠饮水量-总体统计。
图12为小鼠饮水量-按供体阿尔茨海默病中重度统计。
图13为小鼠饮水量-按供体性别统计。
图14为小鼠唾液流率-总体统计。
图15为小鼠唾液流率-按供体阿尔茨海默病中重度统计。
图16为小鼠唾液流率-按供体性别统计。
图17为小鼠粪便含水量-总体统计。
图18为小鼠粪便含水量-按供体阿尔茨海默病中重度统计。
图19为小鼠粪便含水量-按供体性别统计。
图20为小鼠皮肤含水量-总体统计。
图21为小鼠皮肤含水量-分部位统计。
图22为小鼠皮肤含水量-移植中度阿尔茨海默病供体菌液。
图23为小鼠皮肤含水量-移植重度阿尔茨海默病供体菌液。
图24为小鼠皮肤含水量-移植男性阿尔茨海默病供体菌液。
图25为小鼠皮肤含水量-移植女性阿尔茨海默病供体菌液。
图26为小鼠肛温-总体统计。
图27为小鼠肛温-按供体阿尔茨海默病中重度统计。
图28为小鼠肛温-按供体性别统计。
图29为小鼠心前区温度-总体统计。
图30为小鼠心前区温度-按供体阿尔茨海默病中重度统计。
图31为小鼠心前区温度-按供体性别处理。
图32为小鼠左上肢温度-总体统计。
图33为小鼠左上肢温度-分开统计。
图34为小鼠左下肢温度-总体统计。
图35为小鼠左下肢温度-分开统计。
图36为小鼠右上肢温度-总体统计。
图37为小鼠右上肢温度-分开统计。
图38为小鼠右下肢温度-总体统计。
图39为小鼠右下肢温度-分开统计。
图40为小鼠体温-按部位统计。
图41为小鼠尿胆原及尿胆红素阳性率。
图42为小鼠24小时尿量统计。
图43为小鼠旷场实验结果统计。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合具体实施例对本发明进一步说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，但凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
实施例1 。
一、粪便液收集和制备。
1）、新鲜粪便收集。
配制粪便保护液：配置0.9%生理盐水内含10%甘油、0.1%L-半胱氨酸混合溶液，作为粪便保护液，高压灭菌锅内115℃煮熟灭菌20 min，粪便样本置入装有粪便保护液中，混匀。
在厌氧工作站内进行粪便收集管准备。即取50 ml无菌离心管在厌氧工作站内操作，每管加入30ml灭好菌的粪便保护液，旋紧盖子后用封口膜密封，作为收集管。
收集供体新鲜粪便样本20g（取样部位为粪便中段内部），置于上述收集管内，立即旋紧管盖并用封口膜密封，密封后震荡粪便。粪便与粪便保护液充分混匀后尽快置于冰袋上，用冰袋包裹四周，另外再收集两管用于冻存的粪便，每管2-3g，置于冰上。冰上运输，2h内运输至江苏集萃药康生物科技公司实验室，用于粪菌液制备的粪便立即进行后续粪菌液制备工作，冻存粪便存于-80℃冰箱内。
2）、制备过程。
在集萃公司厌氧工作站内，将收集的人源粪便样本悬浮在配置好的粪菌保护液中，通过无菌200目尼龙网去除食物残渣，重复2次。在厌氧工作站内将离心管管盖旋紧，并且用封口膜密封管盖后拿出厌氧工作站进行离心，4000rpm离心10min收菌。离心结束后再将其转移至厌氧工作站内，去尽上清液，底部沉淀即为收集到的菌体，使用粪便保护液重悬菌体。粪便初始体积：重悬加入粪便保护液得到的终体积比为1:5，使用粪便保护液重悬菌体，分装在后用于移植，粪菌液分装好后立即转移至-80℃冰箱保存。
实验过程使用的厌氧工作站目的为试验提供厌氧环境，厌氧环境下要求O2浓度<2%，也可使用厌氧培养箱提供厌氧环境。
3）、粪便供体信息。
Figure 971975DEST_PATH_IMAGE001
。
二、动物模型构建
小鼠信息：6周龄雄性C57BL/6J小鼠，体重22.3g±2g，SPF级,购自江苏省南京市江苏集萃药康生物科技股份有限公司
SPF级6周龄C57BL/6小鼠均予四联抗生素清扫肠道微生物2周：
第一周灌胃给药，灌胃量如下：氨苄青霉素100μL/只/次；硫酸新霉素100μL/只/次；盐酸万古霉素100μL/只/次；甲硝唑500μL/只/次，一天一次，每种抗生素单独灌胃，依次按照氨苄青霉素、硫酸新霉素、盐酸万古霉素、甲硝唑的顺序进行灌胃，共计4轮。
第二周进行小鼠抗生素饮水给药：称量好四联抗生素溶于事先灭菌的无菌水后，用0.22μm过滤网过滤掉母液中的细菌；将过滤好的母液用无菌水稀释为氨苄青霉素1g/L，万古霉素0.5g/L，新霉素1g/L，甲硝唑1g/L浓度，按6笼鼠、90mL/笼，分装于6个饮水瓶中，以供小鼠饮水。根据前3日每笼小鼠饮水量的观察，后4日更换一次抗生素饮水，按照110mL/笼给予抗生素饮水。
将小鼠随机分为移植健康菌液组（简称C组）、移植阿尔茨海默病阴虚证患者菌液组（简称AY组）、移植阿尔茨海默病非阴虚证患者菌液组（简称ANY组），每组12只。实验开始时连续移植3次，200 μL/次；之后隔1天粪菌移植1次,连续10周。
三、动物模型评价。
疾病观察指标——阿尔茨海默病行为学评价过程
FMT表型观察周进行行为学评价实验，评估小鼠粪菌移植后认知记忆能力。
①新物体识别实验：通过小鼠对A/B/C 3个物体的识别记忆，计算辨别指数DR=(新奇物体的探究时间) / (熟悉物体探究时间+新奇物体探究时间)，评估3组小鼠认知及记忆能力；
②避暗实验：通过检测总穿梭次数，错误次数，进行条件性记忆的评估。
③水迷宫实验：记录明台实验的游泳速度，检测运动协调性和视觉灵敏性；通过定位巡航、空间探索试验、穿越平台的次数及停留在目标象限时间等，检测小鼠空间学习记忆能力。
证候评价检测——阴虚证证候评价过程
①饮水量+唾液流率检测：评估阴虚证“口干口渴”程度；
唾液流率检测：定性滤纸探入小鼠口中，舌面停留5秒取出，唾液流率(mg/s)=（滤纸湿重-滤纸干重）/5s，评价“口干”程度。
②进食量、体重测定：评估阴虚证“消瘦”程度。
③体温检测：红外测温仪检测小鼠四肢爪心温度、心前区温度、肛温等，评价“阴虚内热”程度。
④皮肤含水量检测：便携弹性水分油光皮肤测试仪，评价“皮肤干燥”程度。
⑤粪便含水量测定：快速水分测定仪，粪便即取即测，记录数值。
⑥尿色检测：采用尿液干化学分析方法检测尿液中尿胆红素及尿胆原含量，评价“尿赤”程度。收集小鼠新鲜尿液，将尿液分析试纸条充分浸入尿液，在色标上按规定时间内与标准色标进行比色，根据目测法读取结果并记录。检测结果表现为阴性(-)、弱阳性(+)、阳性(++)、强阳性(+++)。通过计算尿胆素原弱阳性率、尿胆红素阳性率，反映小鼠尿液中尿胆素原及尿胆红素水平。尿胆素原弱阳性率=尿胆素原弱阳性例数/总例数×100%。尿胆红素阳性率=尿胆红素阳性例数/总例数×100%
⑦24小时尿量测定：通过将小鼠放入代谢笼24小时，禁食不禁水，收集小鼠24小时尿量，评估3组小鼠尿量，评价阴虚证“少尿”程度。
⑧旷场实验：评价阴虚证 “烦躁”指标。根据平行原则进行放鼠，以视频追踪系统记录小鼠的探索行为，并分析小鼠在各区域停留时间及运动距离。每只小鼠实验结束后，用75%乙醇擦拭设备，消除气味对小鼠的影响。观察5min内小鼠活动情况。包括小鼠在正中格停留时间、穿格次数、运动距离、运动速度。
四、评价方法。
测量结果以
Figure 101605DEST_PATH_IMAGE002
±s表示。采用GraphPad 8.0统计软件对两组间数据进行t检验, 多组间数据进行单因素方差分析, P<0.05为差异有统计学意义，其中*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，****P＜0.0001；与ANY组相比，#P＜0.05，##P＜0.01, ###P＜0.001,####P＜0.0001。
行为学实验——评估疾病表型。
（1）新物体识别实验。
三组小鼠辨别指数：由图1可知，AD阴虚证组 vs 正常对照组，辨别指数降低，差异有统计学意义（p<0.01）；AD非阴虚证组 vs 正常对照组，辨别指数降低，差异有统计学意义（p<0.001）；AD阴虚证组与非阴虚证组之间差异无统计学意义。说明AD组小鼠认知及记忆能力较正常对照组小鼠下降。
（2）避暗实验。
三组小鼠潜伏期及错误次数：由图2可知，AD阴虚证组vs正常对照组，进入暗箱的错误次数增加，差异有统计学意义（p<0.05）；AD非阴虚证组 vs正常对照组，进入暗箱的错误次数增加，差异有统计学意义（p<0.05）。同时，与正常对照组相比，移植AD菌液的2组潜伏期差异无统计学意义，但有降低的趋势。说明移植AD患者的菌液，导致AD阴虚证及AD非阴虚证组小鼠条件性记忆能力的降低。
（3）Morris水迷宫实验。
三组小鼠4天定位航行逃逸潜伏期、找到平台时间、穿越平台的次数、停留在目标象限的时间等观察指标。由图3和图4可知，4天定位航行实验中，AD阴虚证组 vs 正常对照组，逃逸潜伏期时间升高，差异有统计学意义（p<0.05），AD非阴虚组，在定位航行的第1/2/4天与正常对照组相比，时间升高，差异有统计学意义（p<0.05）。
空间探索相关指标，差异无统计学意义。但是AD阴虚证及非阴虚证与正常对照组相比，找到平台时间有升高趋势；穿越平台的次数有降低趋势；停留在目标象限的时间有降低趋势。说明移植AD菌液组小鼠出现了空间记忆能力的下降。
证候学评价检测——评估阴虚证证候表型。
（1）阴虚证“消瘦”指标评定——体重检测。
①总体统计：由图5可知，3组小鼠体重差异无统计学意义（p>0.05）；但从FMT第5周开始，AD阴虚证组小鼠与其余2组相比，体重有下降的趋势；AD非阴虚证组小鼠从FMT第2-5周及第7周，体重较其余2组有升高趋势。
②分开统计：按移植中度AD菌液组及移植重度AD菌液组统计，由图6可知：
阴虚证组：移植中度及重度AD菌液小鼠，从FMT第5周到7周之间，体重较其余2组皆有降低趋势；
非阴虚证组：移植重度AD菌液小鼠从FMT第2周起，体重较其余2组有升高趋势；总体3组小鼠体重差异无统计学意义。
③分开统计：按移植男性供体菌液组及移植女性供体菌液组统计，由图7可知，：
从FMT第5周-6周间，移植男性及女性供体菌液组小鼠，与正常对照组比体重皆有降低趋势；
移植男性供体菌液小鼠：阴虚证组小鼠与其余2组相比，体重有降低趋势，在FMT第7周，与非阴虚证组比差异有统计学意义（p<0.05）；可以体现阴虚证“形体消瘦”的评价指标；非阴虚证组与其余2组相比，从FMT第1周起，体重有升高趋势。
移植女性供体菌液小鼠： 3组间无显著性差异。
（2）阴虚证“消瘦”指标评定——进食量检测。
①总体统计：由图8可知，3组小鼠进食量统计：差异无统计学意义（p>0.05）；但阴虚证组与其余2组相比进食量有降低趋势。
②分开统计：按移植中度AD菌液组及移植重度AD菌液组统计，由图9可知：
移植中度AD菌液组在FMT第1周及第5周，阴虚证组与正常对照组相比进食量降低，差异有统计学意义（p<0.01;p<0.05）。
移植重度AD菌液组仅在第6周比其余2组进食量降低，差异有统计学意义（p<0.0001,p<0.001）。
③分开统计：按移植男性供体菌液组及移植女性供体菌液组统计，由图10可知：
移植男性供体菌液鼠：从FMT第1周-5周、7周期间，阴虚证组与正常对照组相比，进食量降低，差异有统计学意义；阴虚证组与非阴虚证组相比，进食量降低，差异有统计学意义。
移植女性供体菌液小鼠：仅在FMT第6周，阴虚证组与正常对照组相比，进食量降低，差异有统计学意义。
（3）阴虚证“口渴”指标评定——饮水量。
①总体统计：由图11可知，3组间无统计学意义，但阴虚证组在FMT第1/4/6周，饮水量与其余2组相比有升高趋势。
②分开统计：按移植中度AD菌液组及移植重度AD菌液组统计，由图12可知：
移植重度AD菌液小鼠，阴虚证组与其余2组相比，饮水量有升高趋势；
移植中度AD菌液小鼠仅在FMT第2周降低，其余时间无明显差异。
③分开统计：按移植男性供体菌液组及移植女性供体菌液组统计，由图13可知：
移植女性供体菌液小鼠：在FMT第1-7周期间，与正常对照组相比，饮水量升高，差异有统计学意义；在FMT第2周及第4-7周期间，与非阴虚证组相比，饮水量升高，差异有统计学意义。可以体现阴虚证“口干咽燥”评价指标。与临床AD女性患者，出现“口干咽燥”症状相符合。
移植男性供体菌液小鼠：仅在FMT第2周降低，其余时间无明显差异。
（4）阴虚证“口干”指标评定——唾液流率。
①总体统计：由图14可知，阴虚证组小鼠与其余2组相比，唾液流率降低，差异有统计学意义（p<0.05）;
②分开统计：按移植中度AD菌液组及移植重度AD菌液组统计，由图15可知：
移植中度AD菌液组，阴虚证组小鼠唾液流率降低，与正常对照组相比差异有统计学意义（p<0.05）；
移植重度AD菌液，阴虚证组小鼠与其余2组比有降低趋势，差异无统计学意义。
③分开统计：按移植男性供体菌液组及移植女性供体菌液组统计，由图16可知：
移植男性供体菌液小鼠，阴虚证组小鼠与正常对照组相比，唾液流率降低，差异有统计学意义（p<0.05）;
移植女性菌液组小鼠仅非阴虚证组与正常组相比升高，有统计学意义。阴虚证组与正常对照组相比未见降低，不与临床信息相符。
（5）阴虚证“大便干燥”指标评定——粪便含水量。
①总体统计：由图17可知，阴虚证组与其余2组相比，粪便含水量有降低趋势，差异无统计学意义。
②分开统计：按移植中度AD菌液组及移植重度AD菌液组统计，由图18可知：
移植重度AD菌液、与正常对照组比，粪便含水量降低，差异有统计学意义（p<0.05）；
移植中度AD菌液小鼠，阴虚证组与其余2组相比粪便含水量有降低趋势，无统计学意义。
③分开统计：按移植男性供体菌液组及移植女性供体菌液组统计，由图19可知：
移植女性供体菌液小鼠，与正常对照组比，粪便含水量降低，差异有统计学意义（p<0.05）；移植男性供体菌液小鼠，粪便含水量差异不显。
（6）阴虚证“皮肤干燥”指标评定——皮肤含水量。
①总体统计：由图20和21可知，统计小鼠四肢皮肤含水量及背部皮肤含水量：
其中左下肢、右上肢、右下肢及背部皮肤含水量，阴虚证组与正常对照组相比降低，差异有统计学意义；左下肢、右上肢、右下肢皮肤含水量，阴虚证组与非阴虚证组相比降低，差异有统计学意义。与临床阴虚证男性及女性出现“皮肤干燥”的症状一致，符合阴虚证“皮肤干燥”的评价指标。
②分开统计：按移植中度AD菌液组及移植重度AD菌液组统计，由图22和图23可知：
移植中度AD菌液小鼠：阴虚证组皮肤含水量降低主要部位为双下肢及背部；其中左下肢阴虚证组vs正常对照组(p<0.01); 阴虚证组vs非阴虚证组(p<0.01);
移植重度AD菌液小鼠：阴虚证组皮肤含水量降低，与正常对照组比主要在双下肢及右上肢（p<0.05）；其中右上肢阴虚证组与非阴虚证组相比降低，差异有统计学意义（p<0.05）。
③分开统计：按移植男性供体菌液组及移植女性供体菌液组统计，由图24和图25可知：
移植男性供体菌液组：阴虚证组与正常对照组及非阴虚证组相比，皮肤含水量降低主要在下肢（p<0.05）及背部（p<0.01）；
移植女性供体菌液组，阴虚证组与正常对照组相比，皮肤含水量降低主要在双下肢及右上肢（p<0.05）；同时与非阴虚证组相比降低（p<0.05）。
（7）阴虚证“五心烦热”指标评定——体温。
体温-肛温。
①总体统计：由图26可知，阴虚证组小鼠在早上8:30-下午15:00期间，肛温较其余2组有升高趋势；在下午15:00，阴虚证组与其余2组相比，肛温升高，差异有统计学意义（p<0.01）;从下午15:00-晚上20:00降低。
② 分开统计：按移植中度AD菌液组及移植重度AD菌液组统计，由图27可知，移植重度AD菌液小鼠，肛温在早上8:30-下午15:00期间有升高趋势，在15:00，阴虚证组与其余2组相比，肛温升高，差异有统计学意义（p<0.01）；从下午15:00-晚上20:00降低。
②移植中度AD菌液组小鼠在早上8:30-下午15:00较其余2组肛温升高，差异有统计学意义；但从早上8:30-晚上20:00，肛温为降低趋势。
③分开统计：按移植男性供体菌液组及移植女性供体菌液组统计，由图28可知：
移植女性AD菌液小鼠，肛温在下午15:00升高，较其余2组差异有统计学意（p<0.001,p<0.05）;与临床女性患者出现“五心烦热”症状一致，符合“五心烦热”的评价指标。
移植男性AD菌液小鼠，在阴虚证组在早上及下午肛温升高，但从早上8:30-晚上20:00，肛温为降低趋势。
体温-心前区温度。
①总体统计：由图29可知，阴虚证组小鼠在早上8:30-下午15:00期间，心前区温度较其余2组有升高趋势；在下午15:00，阴虚证组与其余2组相比，温度升高，差异有统计学意义（p<0.01）;从下午15:00-晚上20:00降低。
②分开统计：按移植中度AD菌液组及移植重度AD菌液组统计，由图30可知：移植中度及重度AD菌液小鼠，在下午15:00阴虚证组小鼠较其余2组心前区温度皆升高，差异有统计学意义；
③分开统计：按移植男性供体菌液组及移植女性供体菌液组统计，由图31可知：
移植男性及女性AD菌液小鼠，心前区在下午15:00皆升高，但仅移植女性菌液小鼠较其余2组差异有统计学意义。
体温-左上肢温度。
① 总体统计：由图32可知，阴虚证组在早8:30及下午15:00有升高趋势，但无统计学意义。
②分开统计：由图33可知，无论按移植疾病中重度供体菌液、或按性别统计，阴虚证组与其余2组相比，体温在下午15:00有升高趋势，但皆无统计学意义。
体温-左下肢温度。
① 总体统计：由图34可知，阴虚证组与其余2组比，在早8:30及下午15:00有升高趋势，无统计学意义。
②分开统计：由图35可知，3组差异不显。
体温-右上肢温度
① 总体统计：由图36可知，阴虚证组与其余2组相比，在早8:30-下午15:00期间温度升高，15:00差异有统计学意义（p<0.05）。
②分开统计：由图37可知，无论是按AD中重度统计或按照性别进行统计，阴虚证组与其余2组相比，在早8:30-下午15:00期间温度升高；其中右上肢温度阴虚证组与其余2组比，移植中度AD菌液组（p<0.05）及移植男性菌液组小鼠(p<0.05)，差异有统计学意义。
体温-右下肢温度。
统计：由图38和图39可知，3组统计无显著差异，仅移植重度AD菌液小鼠，阴虚证组较其余2组在下午15:00有升高趋势。
“五心温度”总体统计（图40）
①肛温及心前区温度：
阴虚证组与其余2组相比，从早上8:30-下午15:00期间，皆有升高趋势，且在下午15:00差异有统计学意义；
②四肢温度：
双上肢及双下肢合并统计表明，阴虚证组小鼠双上肢温度较其余2组升高，差异有统计学意义；双下肢温度3组差异不显；
③按AD中重度统计各部位温度：
不能说明重度AD菌液小鼠阴虚证温度较中度有显著差异。
④按性别统计：
仅肛温和心前区温度，移植女性供体菌液小鼠，阴虚证组较其余2组差异有统计学意义，四肢温度女性及男性供体差异不显著。
（8）阴虚证“尿赤”指标评定——尿胆原及尿胆红素测定及阳性率计算。
①尿胆原含量：移植男性供体菌液小鼠，阴虚证组尿胆原弱阳性率高于其余2组；移植女性供体菌液小鼠，尿胆原仅高于非阴虚证组，3组无统计学意义（p>0.05）。
②尿胆红素：移植男性及女性供体菌液小鼠，阴虚证组尿胆红素阳性率高于其余2组，3组差异无统计学意义（p>0.05）。
由图41可知，虽然尿胆原及尿胆红素测定结果显示，3组间差异无统计学意义；但阴虚证组尿胆原弱阳性率及尿胆红素阳性率有高于其余2组的趋势。
（9）阴虚证“少尿”指标评定——24小时尿量测定
由图42可知：
①按AD中重度统计：AD阴虚证组24h尿量，中度AD组高于重度AD组，AD非阴虚证组中重度供体菌液24h尿量差异不显；
②按性别统计：AD阴虚证组男性供体菌液组高于女性供体菌液组；AD非阴虚证组男性供体菌液组与女性供体菌液组差异不显。
（10）阴虚证“烦躁”指标评定——旷场实验。
由图43可知，经过统计，粪菌移植第7周小鼠总运动距离、运动速度、进入中央区次数、中央区停留时间3组间无显著差异，说明3组小鼠活动度及焦虑程度没有显著差异，未体现阴虚证 “心烦”的评价指标。

Claims (10)

1.一种运用粪菌移植法建立阿尔茨海默病阴虚证和/或阿尔茨海默病非阴虚证动物模型的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
（1）制备粪菌液：将来源于临床确诊为阿尔茨海默病阴虚证和/或阿尔茨海默病非阴虚证患者的粪便制成粪菌液；
（2）小鼠灌服和饮水方式服用四联抗生素药物，所述的四联抗生素为氨苄青霉素、硫酸新霉素、盐酸万古霉素、甲硝唑；
（3）模型建立：步骤2中小鼠分别移植步骤1制备的粪菌液，得到阿尔茨海默病阴虚证和/或阿尔茨海默病非阴虚证动物模型。
2.根据权利要求1所述的一种运用粪菌移植法建立阿尔茨海默病阴虚证和/或阿尔茨海默病非阴虚证动物模型的方法，其特征在于，所述步骤(1)具体包括如下步骤：
A:配置0.9%生理盐水内含10%甘油、0.1%L-半胱氨酸混合溶液，作为粪便保护液，高压灭菌锅内115℃煮熟20 min，粪便样本置入装有粪便保护液中，混匀；
B:将步骤A制备的混匀粪便的粪便保护液过滤，得到滤液进行离心处理，弃上清液，所得沉淀为收集的菌体；
C:使用粪便保护液重悬步骤B所得沉淀菌体；
D:根据需要分装粪菌液，-80℃保存。
3.根据权利要求2所述的一种运用粪菌移植法建立阿尔茨海默病阴虚证和/或阿尔茨海默病非阴虚证动物模型的方法，其特征在于，所述步骤B中离心条件为4000rpm 10min。
4.根据权利要求2所述的一种运用粪菌移植法建立阿尔茨海默病阴虚证和/或阿尔茨海默病非阴虚证动物模型的方法，其特征在于，步骤B、C、D均在厌氧环境下完成，其中厌氧环境要求O2浓度<2%。
5.根据权利要求1-4所述的一种运用粪菌移植法建立阿尔茨海默病阴虚证和/或阿尔茨海默病非阴虚证动物模型的方法，其特征在于，所述步骤(2)具体包括如下步骤：
步骤1：小鼠选取阶段，选取SPF级雄性C57BL/6小鼠，鼠龄6周；
步骤2：小鼠分类阶段，将C57BL/6小鼠分类，分为健康菌液组（C组）、阿尔茨海默病阴虚证菌液组（AY组）、阿尔茨海默病非阴虚证菌液组（ANY组）；
步骤3：清除菌群阶段，步骤2所述小鼠于第1周灌胃给药，第2周饮水给药；
步骤 4：造模阶段，步骤3所述小鼠分别移植健康志愿者、阿尔茨海默病阴虚证患者及非阴虚患者粪菌液。
6.根据权利要求5所述的一种运用粪菌移植法建立阿尔茨海默病阴虚证和/或阿尔茨海默病非阴虚证动物模型的方法，其特征在于，所述步骤(3)灌胃给药量为氨苄青霉素100μL/只/次、硫酸新霉素100μL/只/次、盐酸万古霉素100μL/只/次，甲硝唑500μL/只/次，每天一次；饮水给药量为氨苄青霉素1g/L、万古霉素0.5g/L、新霉素1g/L、甲硝唑1g/L。
7.根据权利要求5所述的一种运用粪菌移植法建立阿尔茨海默病阴虚证和/或阿尔茨海默病非阴虚证动物模型的方法，其特征在于，所述步骤(4)移植粪菌时连续移植3次，200μL/次/天；之后隔1天粪菌移植1次，持续10周。
8.一种运用粪菌移植法建立阿尔茨海默病阴虚证和/或阿尔茨海默病非阴虚证动物模型评价方法，其特征在于，通过新物体识别实验、避暗实验、Morris水迷宫实验、体重、进食量、饮水量、唾液流率、粪便含水量、皮肤含水量、体温、尿色、24小时尿量、旷场实验、进行评价。
9.根据权利要求8所述的一种运用粪菌移植法建立阿尔茨海默病阴虚证和/或阿尔茨海默病非阴虚证动物模型评价方法，其特征在于，所述的旷场试验为小鼠5min内正中格停留时间、穿格次数、运动距离、运动速度；Morris水迷宫实验包括位航行逃逸潜伏期、找到平台时间、穿越平台的次数、停留在目标象限的时间。
10.权利要求1-9中任意一项所述的运用粪菌移植法建立阿尔茨海默病阴虚证和/或阿尔茨海默病非阴虚证动物模型的方法在阿尔茨海默病中的应用，其特征在于，将所述方法构建的阿尔茨海默病动物模型包括用于研发阿尔茨海默病的早期诊断试剂及方法和研发阿尔茨海默病的治疗药物。
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