CN114790230A - 蛋白质TaARE1在调控植物耐低氮中的应用 - Google Patents
蛋白质TaARE1在调控植物耐低氮中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了蛋白质TaARE1在调控植物耐低氮中的应用。该蛋白质TaARE1为a1)或a2)或a3)或a4)：a1)氨基酸序列是序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的蛋白质；a2)在序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；a3)将序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同生物学功能的蛋白质；a4)与序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3限定的氨基酸序列具有80％或80％以上同一性，来源于小麦且具有相同生物学功能的蛋白质。该蛋白质TaARE1负调控植物对低氮胁迫的耐受性，敲除TaARE1基因提高植物对低氮胁迫的耐受性。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及蛋白质TaARE1在调控植物耐低氮中的应用。
背景技术
小麦是全球主要粮食作物之一，其种植面积和产量均居粮食作物之首。随着世界人口的急速增长，对粮食产量的需求大幅度增加，但是工业化进程的加快和环境条件的恶化对现有耕地产生严重冲击，依靠增加耕地面积提高粮食产量的措施难以实现，而提高单位耕地面积的粮食产量将成为解决粮食危机的最佳选择。
在长期农业生产中，借助良种选育推广、化肥农药使用和耕作灌溉方式改善等措施，使得小麦产量的提高取得重大突破。但是，一味地追求产量将对农业可持续发展带来严重的负面影响。氮素是植物生长发育和产量形成的重要元素，施用氮肥是提高小麦产量的重要农艺措施。然而，过度施用氮肥不仅增加作物的种植成本，降低其氮肥利用效率，还会带来严重的环境污染。因此，提高小麦的氮素利用效率，对于减少氮肥的过量施用、降低种植成本、减轻环境污染和实现农业可持续发展具有重要意义。
植物体内氮素的最初来源主要是土壤，土壤中的氮源存在两种形式，即无机态氮和有机态氮。有机态氮需水解成无机态氮的形式被植物吸收再利用；无机态氮主要包括硝态氮和铵态氮，是植物生长过程中的主要氮源。硝态氮是小麦的主要氮素吸收形式，但是铵态氮常作为硝态氮之外的植物氮素补充形式。作物的氮素利用具有基因型差异，在低氮条件下，作物产量的基因型差异主要取决于氮素的吸收效率，在高氮条件下，作物产量则由氮素吸收效率和氮素同化效率共同决定。因此，培育并推广氮高效小麦品种是提高氮肥利用效率的有效途径。深入理解小麦氮素利用效率的分子机理对于氮高效小麦的分子育种具有重要的指导意义。
提高小麦产量对解决粮食危机具有重要意义。适量增施氮肥能大幅度提高小麦产量，但是过量施加氮肥会造成严重的环境污染，增加种植成本。提高植物的氮素利用效率，在不降低产量的前体下减少氮肥的使用，是实现农业可持续发展的有效措施。目前已鉴定了多个与植物氮素利用有关的基因，但是植物的氮素利用是一个复杂的调控过程，涉及众多基因与环境因子的相互作用，目前仍有许多相关基因有待分离鉴定。挖掘新的植物氮素利用相关基因，有助于从分子水平对作物氮素利用效率遗传改良提供新线索。
发明内容
本发明所要解决的技术问题之一是如何调控植物的耐低氮性。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了蛋白质TaARE1的应用，可为如下A1)至A15)中的至少一种：
A1)蛋白质TaARE1在调控植物的千粒重中的应用；A2)蛋白质TaARE1在调控植物的株高中的应用；A3)蛋白质TaARE1在调控植物的产量中的应用；A4)蛋白质TaARE1在调控植物的单株产量中的应用；A5)蛋白质TaARE1在调控植物的衰老中的应用；A6)蛋白质TaARE1在调控植物的穗粒数中的应用；A7)蛋白质TaARE1在调控植物的穗长中的应用；A8)蛋白质TaARE1在调控植物的分蘖数中的应用；A9)蛋白质TaARE1在调控植物的根冠比中的应用；A10)蛋白质TaARE1在调控植物的生物量中的应用；A11)蛋白质TaARE1在调控植物根的生物量中的应用；A12)蛋白质TaARE1在调控植物耐低氮性中的应用；A13)蛋白质TaARE1在调控植物的氮素吸收效率中的应用；A14)蛋白质TaARE1在调控植物的氮素利用效率中的应用；A15)蛋白质TaARE1在调控植物在低氮生长条件下对氮的吸收中的应用。
所述蛋白质TaARE1来源于禾本科小麦属小麦种(Triticum aestivum L.)，全称为ABC1 REPRESSOR1。所述蛋白质TaARE1可为a1)或a2)或a3)或a4)：
a1)氨基酸序列是序列表中SEQ ID NO.1(TaARE1-A)、SEQ ID NO.2(TaARE1-B)和SEQ ID NO.3(TaARE1-D)所示的蛋白质；a2)在序列表中SEQ ID NO.1(TaARE1-A)、SEQ IDNO.2(TaARE1-B)和SEQ ID NO.3(TaARE1-D)所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；a3)将序列表中SEQ ID NO.1(TaARE1-A)、SEQ ID NO.2(TaARE1-B)和SEQ IDNO.3(TaARE1-D)所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同生物学功能的蛋白质；a4)与序列表中SEQ ID NO.1(TaARE1-A)、SEQ IDNO.2(TaARE1-B)和SEQ ID NO.3(TaARE1-D)限定的氨基酸序列具有80％或80％以上同一性，来源于小麦且具有相同生物学功能的蛋白质。
其中，序列表中SEQ ID NO.1(TaARE1-A)、SEQ ID NO.2(TaARE1-B)和SEQ ID NO.3(TaARE1-D)均由421个氨基酸残基组成。
为了使a1)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中SEQ ID NO.1(TaARE1-A)、SEQ IDNO.2(TaARE1-B)和SEQ ID NO.3(TaARE1-D)所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1标签的序列
| 标签 | 残基 | 序列 |
| Poly-Arg | 5-6(通常为5个) | RRRRR |
| Poly-His | 2-10(通常为6个) | HHHHHH |
| FLAG | 8 | DYKDDDDK |
| Strep-tag II | 8 | WSHPQFEK |
| c-myc | 10 | EQKLISEEDL |
上述a3)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
上述蛋白质，均可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述序列如SEQ ID NO.1(TaARE1-A)、SEQ ID NO.2(TaARE1-B)和SEQ ID NO.3(TaARE1-D)的蛋白质的编码基因可分别通过将序列表中SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQID NO.6自5′末端第375-1640位、第389-1654位和第377-1642位所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′末端和/或3′末端连上表1所示的标签的编码序列得到。
编码所述蛋白质TaARE1相关的生物材料的应用也属于本发明的保护范围；编码所述蛋白质TaARE1相关的生物材料的应用可为如下B1)至B15)中的至少一种：
B1)与所述蛋白质TaARE1相关的生物材料在调控植物的千粒重中的应用；B2)与所述蛋白质TaARE1相关的生物材料在调控植物的株高中的应用；B3)与所述蛋白质TaARE1相关的生物材料在调控植物的产量中的应用；B4)与所述蛋白质TaARE1相关的生物材料在调控植物的单株产量中的应用；B5)与所述蛋白质TaARE1相关的生物材料在调控植物的衰老中的应用；B6)与所述蛋白质TaARE1相关的生物材料在调控植物的穗粒数中的应用；B7)与所述蛋白质TaARE1相关的生物材料在调控植物的穗长中的应用；B8)与所述蛋白质TaARE1相关的生物材料在调控植物的分蘖数中的应用；B9)与所述蛋白质TaARE1相关的生物材料在调控植物的根冠比中的应用；B10)与所述蛋白质TaARE1相关的生物材料在调控植物的生物量中的应用；B11)与所述蛋白质TaARE1相关的生物材料在调控植物根的生物量中的应用；B12)与所述蛋白质TaARE1相关的生物材料在调控植物耐低氮性中的应用；B13)与所述蛋白质TaARE1相关的生物材料在调控植物的氮素吸收效率中的应用；B14)与所述蛋白质TaARE1相关的生物材料在调控植物的氮素利用效率中的应用；B15)与所述蛋白质TaARE1相关的生物材料在调控植物在低氮生长条件下对氮的吸收中的应用。
所述生物材料为下述C1)至C7)和D1)至D7)中的任一种：
C1)编码所述蛋白质TaARE1的核酸分子；C2)含有C1)所述核酸分子的表达盒；C3)含有C1)所述核酸分子的重组载体、或含有C2)所述表达盒的重组载体；C4)含有C1)所述核酸分子的重组微生物、或含有C2)所述表达盒的重组微生物、或含有C3)所述重组载体的重组微生物；C5)含有C1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有C2)所述表达盒的转基因植物细胞系；C6)含有C1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有C2)所述表达盒的转基因植物组织；C7)含有C1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有C2)所述表达盒的转基因植物器官；D1)抑制或降低所述蛋白质TaARE1编码基因表达的核酸分子；D2)含有D1)所述核酸分子的表达盒；D3)含有D1)所述核酸分子的重组载体、或含有D2)所述表达盒的重组载体；D4)含有D1)所述核酸分子的重组微生物、或含有D2)所述表达盒的重组微生物、或含有D3)所述重组载体的重组微生物；D5)含有D1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有D2)所述表达盒的转基因植物细胞系；D6)含有D1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有D2)所述表达盒的转基因植物组织；D7)含有D1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有D2)所述表达盒的转基因植物器官。
上述应用中，C1)编码所述蛋白质TaARE1的核酸分子可为如下c1)或c2)或c3)或c4)或c5)所示的DNA分子：
c1)核苷酸序列是序列表中SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的DNA分子；c2)核苷酸序列是SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示的DNA分子；c3)编码区如序列表中SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6分别自5′末端起第375-1640位、第389-1654位和第377-1642位所示的DNA分子；c4)与c1)或c2)或c3)限定的核苷酸序列具有90％或90％以上同一性，来源于小麦且编码所述蛋白质TaARE1的DNA分子；c5)在严格条件下与c1)或c2)或c3)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述蛋白质TaARE1的DNA分子。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。所述核酸分子可为编码所述蛋白质TaARE1的基因及其调控序列形成的核酸分子。
序列表中SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6分别由2032、2131和2127个核苷酸组成，序列表中SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6自5′末端第375-1640位、第389-1654位和第377-1642位所示的核苷酸序列分别编码序列表中SEQ ID NO.1(TaARE1-A)、SEQ ID NO.2(TaARE1-B)和SEQ ID NO.3(TaARE1-D)所示的氨基酸序列。
SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列(如图8-9)是蛋白质TaARE1的基因组DNA(TaARE1-A)序列。SEQ ID NO.7由8783个碱基组成，自5′末端起第1至374位为5′UTR区，第8392至8783位为3′UTR区，第375至962位为第一个外显子，第963至1168位为第一个内含子，第1169至1254位为第二个外显子，第1255至1352位为第二个内含子，第1353至1526位为第三个外显子，第1527至1689位为第三个内含子，第1690至1804位为第四个外显子，第1805至6986位为第四个内含子，第6987至7084位为第五个外显子，第7085至7764位为第五个内含子，第7765至7900位为第六个外显子，第7901至8322位为第六个内含子，第8323至8391位为第七个外显子。
SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列(如图10-11)是蛋白质TaARE1的基因组DNA(TaARE1-B)序列。SEQ ID NO.8由8522个碱基组成，自5′末端起第1至388位为5′UTR区，第8045至8522位为3′UTR区，第389至976位为第一个外显子，第977至1420位为第一个内含子，第1421至1506位为第二个外显子，第1507至1604位为第二个内含子，第1605至1778位为第三个外显子，第1779至1947位为第三个内含子，第1948至2062位为第四个外显子，第2063至6638位为第四个内含子，第6639至6736位为第五个外显子，第6737至7419位为第五个内含子，第7420至7555位为第六个外显子，第7556至7975位为第六个内含子，第7976至8044位为第七个外显子。
SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列(如图12-14)是蛋白质TaARE1的基因组DNA(TaARE1-D)序列。SEQ ID NO.9由11388个碱基组成，自5′末端起第1至376位为5′UTR区，第10904至11388位为3′UTR区，第377至964位为第一个外显子，第965至1155位为第一个内含子，第1156至1241位为第二个外显子，第1242至1339位为第二个内含子，第1340至1513位为第三个外显子，第1514至1679位为第三个内含子，第1680至1794位为第四个外显子，第1795至9389位为第四个内含子，第9390至9487位为第五个外显子，第9488至10164位为第五个内含子，第10165至10300位为第六个外显子，第10301至10834位为第六个内含子，第10835至10903位为第七个外显子。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码蛋白质TaARE1的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明的蛋白质TaARE1的核苷酸序列90％或者更高同一性的核苷酸，只要编码蛋白质TaARE1且来源于小麦，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码蛋白质TaARE1的核苷酸序列具有90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。
所述编码所述蛋白质TaARE1的核酸分子既可为TaARE1基因的cDNA序列，也可为TaARE1基因的基因组基因序列；与TaARE1基因具有90％以上同一性且编码蛋白质TaARE1的DNA序列，是将TaARE1基因的cDNA用已知的方法进行分离和/或修饰和/或设计得到的。本领域的技术人员应该理解，特定基因序列中核苷酸同一性的微小改变可能会导致该基因效能的降低或者加强，而且在一些应用(例如，反义或共抑制技术)中，部分序列经常会和全长序列同样有效的发挥作用。基因序列变化或缩短的方法，以及测试这些发生变异的基因的有效性的方法均是本领域技术人员熟知的。
上述D1)至D7)中的任一种生物材料也属于本发明的保护范围内。
可选地，D1)所述核酸分子为表达靶向C1)所述核酸分子的sgRNA的DNA分子。所述sgRNA在植物中识别的靶标DNA为编码蛋白质TaARE1的DNA片段，具体可为SEQ ID NO.4、SEQID NO.5和SEQ ID NO.6自5′末端起第492-510位、第506-524位和第494-512位所示的DNA分子。
可选地，D1)所述核酸分子为特异RNA分子，所述特异RNA分子如式(I)所示：A反向-Y-A正向(I)；所述A正向的序列为编码所述蛋白质TaARE1的基因中的200-500bp DNA片段转录得到的单链RNA分子；所述A反向的序列与所述A正向的序列反向互补；所述Y是所述A正向与所述A反向之间的间隔序列，在序列上，所述Y与所述A正向及所述A反向均不互补。所述A正向的序列具体可为SEQ ID NO.10(如图15)自5′末端起第808至1074位所示。其中，序列表中SEQ ID NO.4自5′末端第899至1165位、SEQ ID NO.5自5′末端第913至1179位和SEQ ID NO.6自5′末端第901至1167位核苷酸序列转录出SEQ ID NO.10自5′末端第808至1074位核苷酸。
可选地，D1)所述核酸分子为特异DNA分子，所述特异DNA分子可为特异DNA分子甲或特异DNA分子乙。
所述特异DNA分子甲如式(II)所示：SEQ反向-X-SEQ正向(II)；所述SEQ正向的序列为编码所述蛋白质TaARE1的基因中的200-500bp DNA片段；所述SEQ反向的序列与所述SEQ正向的序列反向互补；所述X是所述SEQ正向与所述SEQ反向之间的间隔序列，在序列上，所述X与所述SEQ正向及所述SEQ反向均不互补。
所述特异DNA分子乙可包括DNA片段一、间隔序列和DNA片段二；所述DNA片段一的序列为编码所述蛋白质TaARE1的基因中的200-500bp DNA片段；所述DNA片段二与所述DNA片段一的序列反向互补。
上述任一所述A正向的序列可为编码所述蛋白质TaARE1的基因中5′UTR区或3′UTR区的200-500bp DNA片段转录得到的单链RNA分子。
上述任一所述SEQ正向的序列或上述任一所述DNA片段一的序列可为编码所述蛋白质TaARE1的基因中5′UTR区或3′UTR区的200-500bp DNA片段。
上述任一所述SEQ正向的序列或上述任一所述DNA片段一的序列具体可为SEQ IDNO.11(如图16)自5′末端起第808至1074位所示。其中，序列表中SEQ ID NO.4自5′末端第899至1165位、SEQ ID NO.5自5′末端第913至1179位和SEQ ID NO.6自5′末端第901至1167位核苷酸序列转录出SEQ ID NO.11自5′末端第808至1074位核苷酸。
上述任一所述SEQ反向的序列或上述任一所述DNA片段二的序列具体可为SEQ IDNO.11自5′末端起第14至280位所示。
上述任一所述间隔序列的核苷酸序列可如SEQ ID NO.11自5′末端起第281至807位所示。
上述任一所述特异DNA分子甲或上述任一所述特异DNA分子乙的核苷酸序列可为如下s1)或s2)或s3)或s4)所示的DNA分子：
s1)核苷酸序列是SEQ ID NO.11自5′末端起第14至1074位所示的DNA分子；
s2)核苷酸序列是SEQ ID NO.11所示的DNA分子；
s3)与s1)或s2)限定的核苷酸序列具有70％或70％以上同一性，来源于小麦且具有相同生物学功能的DNA分子；
s4)在严格条件下与s1)或s2)限定的核苷酸序列杂交，来源于小麦且具有相同生物学功能的DNA分子。
D3)所述的重组载体可为植物基因组编辑的载体，所述植物基因组编辑的载体具体可为TaARE1基因敲除载体。所述TaARE1基因敲除载体为将序列表中SEQ ID NO.4自5′末端起第492-510位、SEQ ID NO.5自5′末端起第506-524位和SEQ ID NO.6自5′末端起第494-512位所示的DNA分子插入pYLCRISPR/Cas9-MH载体BsaI识别位点得到的重组表达载体。TaARE1基因敲除载体特异识别SEQ ID NO.7自5′末端起第492至510位、SEQ ID NO.8自5′末端起第506至524位和SEQ ID NO.9自5′末端起第494至512位所示的DNA分子。
包含上述生物材料的产品也属于本发明的保护范围，产品具体可为1)增加植物的产量的产品；2)增加植物的单株产量的产品；3)使植物晚衰的产品；4)增加植物的株高的产品；5)增加植物的穗粒数的产品；6)增加植物的穗长的产品；7)增加植物的千粒重的产品；8)增加植物的分蘖数的产品；9)增加植物的根冠比的产品；10)增加植物的生物量的产品；11)增加植物根的生物量的产品；12)增加植物耐低氮性的产品；13)增加植物的氮素吸收效率的产品；14)增加植物的氮素利用效率的产品；15)增加植物在低氮生长条件下对氮的吸收的产品。
本发明还提供了培育转基因植物的方法。本发明所提供的培育转基因植物的方法，具体可为方法一，可包括向出发植物甲中导入提高所述蛋白质TaARE1的含量和/或活性的物质，得到转基因植物甲的步骤；所述出发植物甲为含有或不含有所述蛋白质TaARE1的编码基因的植物；所述转基因植物甲与所述出发植物甲相比，所述转基因植物甲至少具有如下一种特性：
1)植物的产量降低；2)植物的单株产量降低；3)植物出现早衰表型；4)植物的株高降低；5)植物的穗粒数降低；6)植物的穗长降低；7)植物的千粒重降低；8)植物的分蘖数降低；9)植物的根冠比降低；10)植物的生物量降低；11)植物根的生物量降低；12)植物耐低氮性降低；13)植物的氮素吸收效率降低；14)植物的氮素利用效率降低；15)植物在低氮生长条件下对氮的吸收降低。
上述方法一中，所述“提高所述蛋白质TaARE1的含量和/或活性”可通过多拷贝、改变启动子、调控因子、转基因等本领域熟知的方法，达到表达或过量表达所述蛋白质、或提高所述蛋白质的活性的效果。
上述方法一中，所述“向出发植物甲中导入提高所述蛋白质TaARE1的含量和/或活性的物质”具体可为向出发植物甲中导入编码所述蛋白质TaARE1的核酸分子。例如，上述C1)至C7)中任一种生物材料。
上述方法一中，所述“向出发植物甲中导入编码所述蛋白质TaARE1的核酸分子”通过重组表达载体导入所述出发植物甲。
本发明所提供的培育转基因植物的方法，具体可为方法二，可包括向出发植物乙中导入抑制所述蛋白质TaARE1的含量和/或活性的物质，得到转基因植物乙的步骤；所述出发植物乙为含有所述蛋白质TaARE1的编码基因的植物；所述转基因植物乙与所述出发植物乙相比，所述转基因植物以至少具有如下一种特征：
1)植物的产量增加；2)植物的单株产量增加；3)植物出现晚衰表型；4)植物的株高增加；5)植物的穗粒数增加；6)植物的穗长增加；7)植物的千粒重增加；8)植物的分蘖数增加；9)植物的根冠比增加；10)植物的生物量增加；11)植物根的生物量增加；12)植物耐低氮性增加；13)植物的氮素吸收效率增加；14)植物的氮素利用效率增加；15)植物在低氮生长条件下对氮的吸收增加。
上述方法二中，所述“抑制所述蛋白质TaARE1的含量和/或活性”可通过RNA干扰、同源重组、基因定点编辑等本领域熟知的方法，达到抑制所述蛋白质的表达量和/或活性的目的。
上述方法二中，所述“抑制所述蛋白质TaARE1的含量和/或活性的物质”可为上述D1)至D7)中任一种生物材料，例如上述的特异RNA分子。
上述方法二中，所述“在出发植物乙中导入特异RNA分子”的实现方法可如下：将上述特异DNA分子甲导入出发植物乙。
上述方法二中，所述特异DNA分子甲通过重组表达载体导入所述出发植物乙；所述重组表达载体为将序列表中的SEQ ID NO.11第14至1074位所示的DNA分子插入pTCK303载体的SacI和BamHI识别位点之间得到的重组表达载体。
上述方法二中，所述“抑制所述蛋白质TaARE1的含量和/或活性的物质”可为植物基因组编辑的载体；所述植物基因组编辑的载体含有sgRNA编码基因；所述sgRNA在植物中识别的靶标DNA为编码蛋白质TaARE1的DNA片段。
本发明所提供的培育转基因植物的方法，具体可为方法三，包括将通过上述方法一或上述方法二获得的转基因植物与待改良植物杂交，得到后代转基因植物的步骤；所述后代转基因植物与所述转基因植物(即作为亲本的转基因植物)表型基本一致。
本发明还保护植物育种方法一或植物育种方法二：
所述植物育种方法一，可包括如下步骤：增加植物中所述蛋白质TaARE1的含量和/或活性，从而植物具有下述至少一种特性：
1)植物的产量降低；2)植物的单株产量降低；3)植物出现早衰表型；4)植物的株高降低；5)植物的穗粒数降低；6)植物的穗长降低；7)植物的千粒重降低；8)植物的分蘖数降低；9)植物的根冠比降低；10)植物的生物量降低；11)植物根的生物量降低；12)植物耐低氮性降低；13)植物的氮素吸收效率降低；14)植物的氮素利用效率降低；15)植物在低氮生长条件下对氮的吸收降低。
所述植物育种方法二，可包括如下步骤：降低植物中所述蛋白质TaARE1的含量和/或活性，从而植物具有下述至少一种特征：
1)植物的产量增加；2)植物的单株产量增加；3)植物出现晚衰表型；4)植物的株高增加；5)植物的穗粒数增加；6)植物的穗长增加；7)植物的千粒重增加；8)植物的分蘖数增加；9)植物的根冠比增加；10)植物的生物量增加；11)植物根的生物量增加；12)植物耐低氮性增加；13)植物的氮素吸收效率增加；14)植物的氮素利用效率增加；15)植物在低氮生长条件下对氮的吸收增加。
上述任一所述植物的生物量为植物的鲜重。
上述任一所述植物根的生物量为植物根的鲜重。
上述任一所述植物可为如下e1)至e5)中的任一种：e1)双子叶植物；e2)单子叶植物；e3)禾本科植物；e4)小麦；e5)小麦品种科农199。
上述任一所述低氮具体可为氮含量90kg/ha。
上述任一所述低氮生长条件为氮含量90kg/ha的生长条件。
上述任一所述双子叶植物还可为拟南芥、油菜、花生、棉花、大豆、向日葵、棕榈树、橄榄树、蓖麻、马铃薯或烟草。上述任一所述单子叶植物还可为玉米、大麦、燕麦、黑麦、高梁或草坪草。
试验证明，蛋白质TaARE1负调控植物对低氮胁迫的耐受性，敲除TaARE1基因提高植物对低氮胁迫的耐受性。利用植物基因工程技术对TaARE1基因进行定点改造，为培育耐低氮胁迫作物新品种提供了有效分子策略。
附图说明
图1为利用CRISPR-Cas9系统编辑TaARE1基因；A为CRISPR-Cas9系统靶向的小麦TaARE1同源基因第一外显子保守区域内的位点，带下划线的是目标序列；B为CRISPR编辑鉴定的TaARE1突变体，-和+分别表示给定数量核苷酸的缺失和插入。
图2为小麦野生型和are1突变体在成熟期的表型，标尺为30厘米。
图3为小麦TaARE1基因编辑突变体的表型分析；小麦are1突变体植物农艺性状的统计数据，包括株高、单株穗数、主穗长度、主穗穗粒数、千粒重和单株产量，数值表示平均值±标准偏差，样本容量为20株植物；*表示在t测验中二者差异达到显著水平(P＜0.05)，**表示在t测验中二者差异达到极显著性水平(P＜0.01)。
图4为小麦are1突变体的缺氮响应分析；A为野生型材料和小麦are1突变体在正常(+N)和缺氮(-N)生长条件下培养20天后的表型，标尺为5厘米；B为野生型材料和小麦are1突变体在正常(+N)和缺氮(-N)生长条件下生长20天后根冠比(根/冠)的定量分析，数值表示平均值±标准偏差，样本容量为10株植物；*表示在t测验中二者差异达到显著水平(P＜0.05)，**表示在t测验中二者差异达到极显著性水平(P＜0.01)。
图5为不同施氮水平下小麦are1突变体的田间表型。
图6为不同施氮水平下小麦TaARE1基因编辑突变体的表型分析；小麦野生型和are1突变体植物的与产量相关农艺性状的统计数据，包括千粒重、单位面积穗数、穗粒数和小区产量，统计数据源自图5中的氮肥试验材料，数值表示平均值±标准偏差，由3次生物重复结果统计而来；*表示在t测验中二者差异达到显著水平(P＜0.05)，**表示在t测验中二者差异达到极显著性水平(P＜0.01)。
图7为小麦TaARE1基因在缺氮条件下的表达分析；数值表示平均值±标准偏差，由三次技术重复结果统计而来，每个样品包含6株植物。
图8为序列SEQ ID NO.7的第1位-4260位。
图9为序列SEQ ID NO.7的第4261位-8783位。
图10为序列SEQ ID NO.8的第1位-4140位。
图11为序列SEQ ID NO.8的第4141位-8522位。
图12为序列SEQ ID NO.9的第1位-4800位。
图13为序列SEQ ID NO.9的第4801位-9900位。
图14为序列SEQ ID NO.9的第9901位-11388位。
图15为序列SEQ ID NO.10。
图16为序列SEQ ID NO.11。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。如无特殊说明，以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
表2引物汇总
实施例1、小麦are1突变体的分离鉴定
本发明的发明人对小麦的基因进行了功能分析，发现小麦的三个基因组中分别具有TaARE1-A(SEQ ID NO.7)、TaARE1-B(SEQ ID NO.8)和TaARE1-D(SEQ ID NO.9)基因。基于基因序列的高度保守性，我们在TaARE1同源基因第一外显子中设计靶点，利用CRISPR-Cas9系统对TaARE1进行基因编辑(图1中A)。
序列表中SEQ ID NO.4第492-510位(即SEQ ID NO.5第506-524位和SEQ ID NO.6第494-512位)所示的DNA分子表达gRNA中与靶点序列互补的RNA片段。将表2中的ARE1-Cas9-F和ARE1-Cas9-R形成的双链DNA分子插入pU6-gRNA载体(Wang et al.，2014.Simultaneous editing of three homoeoalleles in hexaploid bread wheatconfers heritable resistance to powdery mildew.Nature biotechnology，32(9)，947-951)AarI识别位点得到重组表达载体，该重组表达载体为TaARE1基因敲除载体。该重组表达载体是将pU6-gRNA载体的两个AarI识别位点之间的片段(小片段)替换为SEQ IDNO.4第492-510位(即SEQ ID NO.5第506-524位和SEQ ID NO.6第494-512位)所示的DNA分子，保持pU6-gRNA载体其它核苷酸保持不变得到的重组载体。该重组载体表达的gRNA特异识别SEQ ID NO.7第492至510位(即SEQ ID NO.8第506至524位和SEQ ID NO.9第494至512位)所示的DNA分子(即靶点序列)。
将10μg pJIT163-Ubi-Cas9质粒和10μg前述制备的重组表达载体混合后转化小麦原生质体。使用PDS1000/He粒子轰击系统(Bio-Rad)进行小麦的生物转化。在轰击前，将质粒DNA(pJIT163-Ubi-Cas9，重组表达载体和pAHC20)以1∶1∶1的摩尔比混合，其中pJIT163-Ubi-Cas9质粒是Cas9的表达载体(Wang et al.，2014.Simultaneous editing of threehomoeoalleles in hexaploid bread wheat confers heritable resistance topowdery mildew.Nature biotechnology，32(9)，947-951)，pAHC20质粒含有bar筛选基因(Christensen and Quail，1996.Ubiquitin promoter-based vectors for high-levelexpression of selectable and/or screenable marker genes in monocotyledonousplants.Transgenic Research，5(3)，213-218)。轰击后，将胚胎转移到愈伤组织诱导培养基中。在第三或第四周，将所有的愈伤组织转移到含有5mg/L草胺膦(PPT)的选择性再生培养基中。PPT在随后所有的组织培养过程均添加中，包括2轮再生(4周)和2轮生根(4周)。10-12周后，获得T0转基因植物，将其转移到土壤中并在温室中生长。
分别以T0转基因植物和小麦科农199(野生型小麦)的基因组DNA为模板，PCR扩增包括剪切位点的基因组DNA片段，对扩增产物进行测序检测小麦A、B和D基因组中TaARE1的敲除情况。所使用的引物分别为表2中的ARE1-A-617F和ARE1-A-617R、ARE1-B-433F和ARE1-B-433R、ARE1-D-948F和ARE1-D-948R。利用表2中的Cas9-free-452F和Cas9-free-452R引物鉴定TaARE1敲除突变体中是否含有Cas9序列。以不含Cas9序列的T1代TaARE1敲除突变体完成下述实施例。
经过基因型鉴定，我们获得7种纯合突变体，突变的形式包括碱基缺失、插入和缺失/插入(图1中B)。各突变体中TaARE1同源基因被编辑后均造成基因的移码突变。具体突变包括：are1-a1在TaARE1-A(SEQ ID NO.7)的第504-507位缺失4个核苷酸；are1-a2在TaARE1-A(SEQ ID NO.7)的第507-508位间插入1个核苷酸；are1-a3在TaARE1-A(SEQ IDNO.7)的第507-508位缺失2个核苷酸；are1-a4在TaARE1-A(SEQ ID NO.7)的第497-508位缺失12个核苷酸并插入170个核苷酸；are1-b1在TaARE1-B(SEQ ID NO.8)的第521-522位缺失2个核苷酸；are1-b2在TaARE1-B(SEQ ID NO.8)的第522-522位缺失1个核苷酸；are1-d1在TaARE1-D(SEQ ID NO.9)的第496-510位缺失15个核苷酸；are1-a1b1在TaARE1-A(SEQ IDNO.7)的第507-508位间插入1个核苷酸，在TaARE1-B(SEQ ID NO.8)的第521-522位插入1个核苷酸；are1-a2b2在TaARE1-A(SEQ ID NO.7)的第507-507位缺失1个核苷酸并插入68个核苷酸，在TaARE1-B(SEQ ID NO.8)的第521-522位缺失2个核苷酸；are1-a1d1在TaARE1-A(SEQ ID NO.7)的第507-508位缺失2个核苷酸，在TaARE1-D(SEQ ID NO.9)的第508-510位缺失3个核苷酸；are1-a2d2在TaARE1-A(SEQ ID NO.7)的第497-508位缺失12个核苷酸并插入170个核苷酸，在TaARE1-D(SEQ ID NO.9)的第509-510位缺失2个核苷酸并插入1个核苷酸；are1-b1d1在TaARE1-B(SEQ ID NO.8)的第521-522位缺失2个核苷酸，在TaARE1-D(SEQID NO.9)的第496-510位缺失15个核苷酸；are1-a1b1d1在TaARE1-A(SEQ ID NO.7)的第508-508位缺失1个核苷酸并插入194个核苷酸，在TaARE1-B(SEQ ID NO.8)的第521-522位缺失2个核苷酸，在TaARE1-D(SEQ ID NO.9)的第503-535位缺失33个核苷酸；are1-a2b2d2在TaARE1-A(SEQ ID NO.7)的第499-500位和第502-513位共缺失14个核苷酸，在TaARE1-B(SEQ ID NO.8)的第512-522位缺失11个核苷酸并插入76个核苷酸，在TaARE1-D(SEQ IDNO.9)的第509-510位缺失2个核苷酸；are1-a3b3d3在TaARE1-A(SEQ ID NO.7)的第499-500位和第502-513位共缺失14个核苷酸，在TaARE1-B(SEQ ID NO.8)的第521-522位间插入1个核苷酸，在TaARE1-D(SEQ ID NO.9)的第509-510位插入66个核苷酸；are1-a4b4d4在TaARE1-A(SEQ ID NO.7)的第497-508位缺失12个核苷酸并插入170个核苷酸，在TaARE1-B(SEQ ID NO.8)的第521-522位缺失2个核苷酸，在TaARE1-D(SEQ ID NO.9)的第510-511位插入1个核苷酸。
实施例2、小麦are1突变体的田间表型分析
植物材料种植于北京自然条件下，株距×行距为15×20厘米，标尺为30厘米；
野生型材料(WT)为小麦品种科农199，are1系列突变体为实施例1中利用CRISPR-Cas9系统编辑TaARE1基因得到的纯合突变体。
统计小麦野生型和are1系列突变体植物的农艺相关性状，株高、主穗长度用直尺测量，千粒重和单株产量用天平称重，统计样本容量为20株植物，取平均值。
小麦are1突变体在成熟期表现出不同程度的晚衰表型(图2)，are1-b1晚衰表型最明显，当野生型植株衰老时，are1-b1植株仍为绿色；are1-a1b1和are1-a2b2也有较为明显的晚衰表型，主要表现为麦穗和部分旗叶持绿；TaARE1-A基因突变的are1-a突变体以及are1-b1d1也有一定程度的晚衰，are1-d1以及三突变体与野生型相比没有明显差别。结果表明，针对小麦晚衰表型的调控，TaARE1-B基因发挥主要功能，TaARE1-A次之，TaARE1-D的功能最弱。
本发明的发明人对小麦are1突变体的表型统计分析发现，与野生型相比，只有are1-a3、are1-b1和are1-a1d1突变体的株高降低，其余are1-a以及are1-d1突变体的株高明显增加；are1-a3、are1-b1和are1-a4b4d4的穗数明显减少，其余are1突变体没有显著变化；除了are1-a4、are1-a1b1d1和are1-a2b2d2外，are1突变体的主穗长都有所降低；只有are1-a1b1的主穗粒数高于野生型；大多数are1突变体的千粒重高于野生型；are1突变体的单株产量与野生型相比没有明显差别，但是部分are1突变体的单株产量略有增加。综合分析产量构成三要素发现，are1突变体产量主要由单位面积穗数和千粒重决定，受穗粒数的影响相对较小(图3)。
实施例3、小麦are1突变体对低氮胁迫的耐受性分析
为应对养分缺乏造成的生长抑制，植物演化出各种应对策略以维持正常的生命活动，其中包括增加低氮生长条件下的根冠比。为明确are1突变是否改变小麦对低氮胁迫的耐受性，本发明的发明人分析比较了小麦野生型和are1突变体在低氮生长条件下的根冠比。
幼苗材料于培养间水培种植，野生型材料(WT)为小麦品种科农199，are1系列突变体为实施例1中利用CRISPR-Cas9系统编辑TaARE1基因得到的纯合突变体。正常生长条件的水培营养液为改进的Hoagland营养液(微量元素：KCl 50μM，MnSO4 10μM，H3BO3 50μM，ZnSO42μM，CuSO4 1.5μM，(NH4)6Mo7O24 0.075μM；大量元素：KNO3 1.25mM，Ca(NO3)2 1.5mM，MgSO40.75mM，KH2PO4 0.5mM，Fd-EDTA 0.072mM，Na2SiO3 0.1mM)，缺氮处理条件下的水培营养液(微量元素：KCl 50μM，MnSO4 10μM，H3BO3 50μM，ZnSO4 2μM，CuSO4 1.5μM，H2MoO4 0.525μM；大量元素：KCl 1.25mM，CaCl2 1.5mM，MgSO4 0.75mM，KH2PO4 0.5mM，Fd-EDTA 0.072mM，Na2SiO3 0.1mM)不包含任何氮源。培养20天后，对不同处理条件下培养的小麦幼苗拍照，并对小麦根系和地上部组织分别称重，计算根冠比(根系重量/地上部组织重量)。
与正常培养条件下的材料相比，缺氮条件下的野生型和突变体地上部的生物量均减少，根长增加(图4中A)。在正常培养条件下，除are1-a1和are1-a3外，其余are1突变体的根冠比都显著高于野生型；缺氮条件下，与野生型相比，are1-a2、are1-b1、are1-b2、are1-d1、are1-a2b2和are1-a3b3d3突变体的根冠比略有增加，其余are1突变体的根冠比均显著高于野生型(图4中B)，暗示小麦are1突变体的氮素吸收能力增强，可能具有较强的耐低氮能力。
实施例4、不同施氮水平下小麦are1突变体的田间表型分析
为了进一步分析小麦are1突变体的氮素吸收能力，本发明的发明人在河北省采用田间随机区组氮肥试验方案，进行了are1突变体的氮肥试验。
野生型材料(WT)为小麦品种科农199，are1系列突变体为实施例1中利用CRISPR-Cas9系统编辑TaARE1基因得到的纯合突变体。2019年种植于河北省石家庄市栾城区自然生长条件下，检测小麦are1突变体在低氮生长条件下的表型，选择连续多年用于氮肥试验的地块进行试验，选用尿素作为氮源，设置高氮和低氮两个处理，其中高氮区施肥量为225kg/ha，低氮区(土壤含氮量约为90kg/ha)不施肥，高氮区和低氮区试验各设三个生物学重复，各材料分别种植于4.5×0.9米的小区内，播种方式选择机播，每亩15万基本苗。
从田间表型来看，在高氮和低氮生长条件下，are1-b1突变体都有明显的晚衰表型，这与北京地区的表型一致；are1-b1d1突变体则表现为生育期缩短、成熟期提前，这种表型在低氮条件下更为明显；are1-a2b2突变体的生育期有所延迟，但在高氮和低氮条件下均表现为植株青枯的早衰表型，可能与其在成熟后期不耐高温有关；其余突变体的表型与野生型差异不明显(图5)。
为了评估小麦are1突变对低氮条件下产量的影响，本发明的发明人调查了上述氮肥试验材料的千粒重、单位面积穗数和穗粒数等产量构成要素(图6)。千粒重的测量是将各基因型小麦突变体的小麦种子随机挑选三份1000粒，分别称重，取其平均值；单位面积穗数是统计在1m2的区域内的小麦穗数，统计三次，取其平均值；穗粒数为统计不少于20株植物的主穗粒数，取其平均值。
在高氮和低氮生长条件下，are1-b1和are1-a1b1d1的穗数下降造成其小区产量显著降低；are1-a2b2的千粒重和穗粒数减少导致其在高氮条件下产量下降，而千粒重和穗数则是影响低氮条件下产量的主要因素；在高氮生长条件下，are1-a2的产量主要受千粒重和穗数的影响，而are1-a4的产量主要是由千粒重决定的，千粒重和穗粒数决定了are1-a2和are1-a4在低氮条件下的产量；are1-b1d1在高氮条件下的产量由千粒重和穗数决定，低氮条件下的产量则主要受千粒重和穗粒数的影响。上述结果表明，TaARE1-B基因对小麦植株在低氮生长条件下的衰老和产量具有重要影响，TaARE1-A基因突变可在一定程度上提高小麦在低氮条件下的产量，TaARE1-D基因在小麦生长发育过程中的功能相对较弱，可能发挥辅助功能。
实施例5、小麦TaARE1基因在缺氮条件下的表达分析
为进一步明确小麦TaARE1基因在氮响应中的作用，本发明的发明人分析了缺氮条件下小麦TaARE1基因的表达模式。
小麦野生型材料为小麦品种科农199。将在正常生长条件下培养两周苗龄的野生型幼苗转至缺氮条件(微量元素：KCl 50μM，MnSO4 10μM，H3BO3 50μM，ZnSO4 2μM，CuSO4 1.5μM，H2MoO4 0.525μM；大量元素：KCl 1.25mM，CaCl2 1.5mM，MgSO4 0.75mM，KH2PO4 0.5mM，Fd-EDTA 0.072mM，Na2SiO3 0.1mM)下处理24h，在处理0h、0.5h、1h、2h、3h、6h、12h和24h分别取样，检测TaARE1基因在地上部和根系中的表达水平。
收集叶片(地上部)或根系(根系)并提取总RNA，反转录成cDNA。利用TaActin基因作为内参，将样品cDNA浓度均一化。然后用TaARE1-A、TaARE1-B和TaARE1-D基因的特异引物进行实时荧光定量PCR(RT-qPCR)分析，用2-ΔΔCT法(Livak KJ，SchmittgenTD.2001.Analysis of relative gene expression data using real-timequantitative PCR and the 2-△△CT method.Methods.25：402-408)分析基因的表达情况。TaARE1-A、TaARE1-B和TaARE1-D基因的特异引物对详见表2 TaARE1-A292F、TaARE1-A292R、TaARE1-B309F、TaARE1-B309R、TaARE1-D232F和TaARE1-D232R。内参基因TaActin的引物对详见表2 qPCR-TaActin-F、qPCR-TaActin-R。
结果如图7，缺氮处理会诱导TaARE1-A和TaARE1-B基因在小麦根和地上部的表达，且两基因的表达模式较为一致；TaARE1-D基因不受缺氮处理诱导，在根和地上部均未检测到其表达水平。以上结果表明，TaARE1-A和TaARE1-B基因可能在小麦的氮素利用中发挥主要作用。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 中国科学院遗传与发育生物学研究所
<120> 蛋白质TaARE1在调控植物耐低氮中的应用
<130> 210428
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 421
<212> PRT
<213> 小麦(Triticum aestivum)
<400> 1
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20 25 30
Asp Val Gly Pro Gln Arg Arg Arg Val Gly Arg Arg Leu Val Gly Phe
35 40 45
Ala Lys Lys Arg Arg Arg Ser Lys Arg Gln Gln Pro Trp Trp Lys Ala
50 55 60
Trp Phe Ser Asp Trp Asn Asp Glu Glu Glu Ser Leu Ala Gly Trp Arg
65 70 75 80
Glu Asp Asp Glu Leu Leu Gln Gln Val Val Ser Asn Glu Asp Leu Ser
85 90 95
Glu Asp Asp Lys Phe Gln Thr Trp Lys Ser Lys Ala Glu Ala Ile Val
100 105 110
Asp Leu Arg Glu Ala Gln Gln Gly Ala Glu Asn Ala Glu Gly Arg Ser
115 120 125
Trp Glu Asp Trp Ile Gly Trp Gly Ser Thr Ser Gly Asp Gly Asp Trp
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Leu Ser Asp Gln Ile Thr Asp Asp Pro Thr Glu
145 150 155 160
Ile Val Arg Asp Lys Gly Ile Ala Glu Ala Phe Arg Asp Ser Asn Asp
165 170 175
Glu Asp Tyr Asn Asp Met Leu Phe Glu Asp Arg Val Phe Leu Tyr Ala
180 185 190
Ser Thr Lys Ser Ala Lys Phe Leu Ala Leu Leu Ile Val Val Pro Trp
195 200 205
Val Leu Asp Leu Leu Val His Asp Tyr Val Met Met Pro Phe Leu Asp
210 215 220
Arg Tyr Val Glu Lys Val Pro Leu Ala Ala Glu Met Leu Asp Val Arg
225 230 235 240
Arg Ser Gln Lys Ile Gln Met Ile Lys Asp Leu Asn Ile Glu Lys Ala
245 250 255
Arg Phe Arg Phe Glu Val Glu Ile Gly Lys Ser Pro Pro Leu Ser Asp
260 265 270
Glu Glu Phe Trp Ser Glu Leu Arg Glu Lys Ala Val Glu Leu Arg Asp
275 280 285
Glu Trp Arg Leu Glu Asn Arg Gln Ala Phe Ala Asn Ile Trp Ser Asp
290 295 300
Met Val Tyr Gly Val Ala Leu Phe Leu Leu Met Tyr Phe Asn Gln Ser
305 310 315 320
Lys Val Ala Ile Ile Lys Phe Thr Gly Tyr Lys Leu Leu Asn Asn Ile
325 330 335
Ser Asp Ser Gly Lys Ala Phe Leu Ile Ile Leu Val Ser Asp Ile Leu
340 345 350
Leu Gly Tyr His Ser Glu Ala Gly Trp His Ser Leu Val Glu Ile Ile
355 360 365
Leu Asp His Tyr Gly Leu Glu Thr Asp Gln Ala Ala Val Thr Phe Phe
370 375 380
Val Cys Leu Val Pro Val Ala Leu Asp Val Phe Ile Lys Phe Trp Val
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Tyr Lys Tyr Leu Pro Arg Leu Ser Pro Ser Val Gly Asn Ile Leu Asp
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<213> 小麦(Triticum aestivum)
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aagaagaggg gttgactgta ttccggcctt ccgggagttc gaaaattctt ggtttcttga 240
tgtggatact gctaccttgc aatgacaacg ggtggcaaga agggaattct gtgaggctgt 300
gagcacatgg ttgccagagg tgcgtccgcc cccgttctgt agcccggaag atgtggtctt 360
cgttgcatga cctttaatga gttgctacgt ggtcagctct agcggcgttg cggtctggtt 420
cgccgtagag gagaggatcg ggcaccggag ggtttgcgca tgcaagatgt tcgatgtcgg 480
tccccagagg aggagggtgg ggaggcgcct ggtgggtttt gccaagaaga ggaggcgttc 540
caagaggcag cagccatggt ggaaggcgtg gttctctgat tggaacgatg aggaagagag 600
cctcgccggc tggagggagg atgatgaatt gctccagcag gttgttagca acgaagacct 660
gtcggaggat gacaagtttc agacgtggaa gagcaaggcc gaggcgattg tcgacctgcg 720
ggaagcccag caggatgccg aaaatgcaga agggcggtca tgggaggatt ggataggttg 780
gggcagcacg tccggcgatg gtgattgggg cgggggtggg agcttgtcgg accagataac 840
ggatgatccg acggagatag tgagggacaa gggcatcgct gaagctttta gggactctat 900
tgatgaagat tacaacgaca tgttgtttga ggaccgggtt tttctatacg cttcgacgaa 960
atcggccaaa ttcctagcat tgttgatcgt tgttccatgg gtgttggatc ttctagtaca 1020
tgactatgtt atgatgccat ttctagacag gtatgtcgag aaggtaccac tcgccgctga 1080
aatgcttgat gtaagacgca gccagaagat tcagatgata aaggacctaa atattgagaa 1140
agcaagattc cgttttgaag tagagattgg taaatctcct ccactttccg atgaggagtt 1200
ctggtcagag ttgcgggaaa aagcggtaga gctgagggat gaatggagat tagaaaaccg 1260
acaagcattt gcaaatatct ggtctgatat ggtttatggg gttgccctat tccttcttat 1320
gtacttcaac cagagtaaag ttgcaatgat aaagttcaca ggatataagt tgctaaacaa 1380
tatctcggac agtgggaagg cttttcttat cattttagtg tcagatatcc ttctagggta 1440
ccattcagag gcaggttggc attcattggt ggaaattatt cttgaccact atggactgga 1500
aaccgatcaa gctgcagtca cctttttcgt ttgtctggtt ccagttgccc tggacgtatt 1560
tataaagttt tgggtgtaca aataccttcc aagattatca cctagtgtgg gaaacatctt 1620
ggatgaaata aggcgtcact aggaattctt tccatcagga attttagttc cttcctttag 1680
gaaattgcta gtagaatttc acaatccagg tatgtattga cttgcatgta ctgttggctc 1740
ctacttgtgt tgctgccaat gtttgataaa cagtgaaaaa actacctgtg actgatacgg 1800
ttattcattc acccttcaaa tatatttttt ggtgaaagcc cttaaattat attgaagttg 1860
gtttctgcag tatgccgtta ccaattattc tgatgagaaa attaataata gctggtaaat 1920
tgcaagtgta atttaaggca actctttgtg atggtgtatt caagctattt atactatttc 1980
ttgattcttg ttcaggtgat tgaaacttca aatgttccaa tctttttata aatgaagtaa 2040
aatgcctaaa ttcaaacaat tgtaaacaag tctaatacgt ggcaaatagt aggggtggcc 2100
cgatcttaat gaattggaag tgaattt 2127
Claims (9)
1.应用，其特征在于：所述应用为如下A1)至A15)中的至少一种：
A1)蛋白质TaARE1在调控植物的千粒重中的应用；
A2)蛋白质TaARE1在调控植物的株高中的应用；
A3)蛋白质TaARE1在调控植物的产量中的应用；
A4)蛋白质TaARE1在调控植物的单株产量中的应用；
A5)蛋白质TaARE1在调控植物的衰老中的应用；
A6)蛋白质TaARE1在调控植物的穗粒数中的应用；
A7)蛋白质TaARE1在调控植物的穗长中的应用；
A8)蛋白质TaARE1在调控植物的分蘖数中的应用；
A9)蛋白质TaARE1在调控植物的根冠比中的应用；
A10)蛋白质TaARE1在调控植物的生物量中的应用；
A11)蛋白质TaARE1在调控植物根的生物量中的应用；
A12)蛋白质TaARE1在调控植物耐低氮性中的应用；
A13)蛋白质TaARE1在调控植物的氮素吸收效率中的应用；
A14)蛋白质TaARE1在调控植物的氮素利用效率中的应用；
A15)蛋白质TaARE1在调控植物在低氮生长条件下对氮的吸收中的应用；
所述蛋白质TaARE1为a1)或a2)或a3)或a4)：
a1)氨基酸序列是序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的蛋白质；
a2)在序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
a3)将序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同生物学功能的蛋白质；
a4)与序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3限定的氨基酸序列具有80％或80％以上同一性，来源于小麦且具有相同生物学功能的蛋白质。
2.应用，其特征在于：所述应用为如下B1)至B15)中的至少一种：
B1)与权利要求1中所述蛋白质TaARE1相关的生物材料在调控植物的千粒重中的应用；
B2)与权利要求1中所述蛋白质TaARE1相关的生物材料在调控植物的株高中的应用；
B3)与权利要求1中所述蛋白质TaARE1相关的生物材料在调控植物的产量中的应用；
B4)与权利要求1中所述蛋白质TaARE1相关的生物材料在调控植物的单株产量中的应用；
B5)与权利要求1中所述蛋白质TaARE1相关的生物材料在调控植物的衰老中的应用；
B6)与权利要求1中所述蛋白质TaARE1相关的生物材料在调控植物的穗粒数中的应用；
B7)与权利要求1中所述蛋白质TaARE1相关的生物材料在调控植物的穗长中的应用；
B8)与权利要求1中所述蛋白质TaARE1相关的生物材料在调控植物的分蘖数中的应用；
B9)与权利要求1中所述蛋白质TaARE1相关的生物材料在调控植物的根冠比中的应用；
B10)与权利要求1中所述蛋白质TaARE1相关的生物材料在调控植物的生物量中的应用；
B11)与权利要求1中所述蛋白质TaARE1相关的生物材料在调控植物根的生物量中的应用；
B12)与权利要求1中所述蛋白质TaARE1相关的生物材料在调控植物耐低氮性中的应用；
B13)与权利要求1中所述蛋白质TaARE1相关的生物材料在调控植物的氮素吸收效率中的应用；
B14)与权利要求1中所述蛋白质TaARE1相关的生物材料在调控植物的氮素利用效率中的应用；
B15)与权利要求1中所述蛋白质TaARE1相关的生物材料在调控植物在低氮生长条件下对氮的吸收中的应用；
所述生物材料为下述C1)至C7)和D1)至D7)中的任一种：
C1)编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子；
C2)含有C1)所述核酸分子的表达盒；
C3)含有C1)所述核酸分子的重组载体、或含有C2)所述表达盒的重组载体；
C4)含有C1)所述核酸分子的重组微生物、或含有C2)所述表达盒的重组微生物、或含有C3)所述重组载体的重组微生物；
C5)含有C1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有C2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
C6)含有C1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有C2)所述表达盒的转基因植物组织；
C7)含有C1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有C2)所述表达盒的转基因植物器官；
D1)抑制或降低权利要求1所述蛋白质编码基因表达的核酸分子；
D2)含有D1)所述核酸分子的表达盒；
D3)含有D1)所述核酸分子的重组载体、或含有D2)所述表达盒的重组载体；
D4)含有D1)所述核酸分子的重组微生物、或含有D2)所述表达盒的重组微生物、或含有D3)所述重组载体的重组微生物；
D5)含有D1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有D2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
D6)含有D1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有D2)所述表达盒的转基因植物组织；
D7)含有D1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有D2)所述表达盒的转基因植物器官。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：
C1)所述核酸分子为如下c1)或c2)或c3)或c4)或c5)所示的DNA分子：
c1)核苷酸序列是序列表中SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示的DNA分子；
c2)核苷酸序列是SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.9所示的DNA分子；
c3)编码区如序列表中SEQ ID NO.4第375-1640位、SEQ ID NO.5第389-1654位或SEQID NO.6第377-1642位所示的DNA分子；
c4)与c1)或c2)或c3)限定的核苷酸序列具有90％或90％以上同一性，来源于小麦且编码权利要求1中所述蛋白质TaARE1的DNA分子；
c5)在严格条件下与c1)或c2)或c3)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1中所述蛋白质TaARE1的DNA分子；
D1)所述核酸分子为表达靶向权利要求2中C1)所述核酸分子的sgRNA的DNA分子。
4.权利要求2或3中的D1)至D7)中的任一种生物材料。
5.培育转基因植物的方法一或培育转基因植物的方法二：
所述培育转基因植物的方法一，包括向出发植物甲中导入提高权利要求1中所述蛋白质TaARE1的含量和/或活性的物质，得到转基因植物甲的步骤；所述出发植物甲为含有或不含有权利要求1中所述蛋白质TaARE1的编码基因的植物；
所述转基因植物甲与所述出发植物甲相比，所述转基因植物甲至少具有如下一种特性：
1)植物的产量降低；
2)植物的单株产量降低；
3)植物出现早衰表型；
4)植物的株高降低；
5)植物的穗粒数降低；
6)植物的穗长降低；
7)植物的千粒重降低；
8)植物的分蘖数降低；
9)植物的根冠比降低；
10)植物的生物量降低；
11)植物根的生物量降低；
12)植物耐低氮性降低；
13)植物的氮素吸收效率降低；
14)植物的氮素利用效率降低；
15)植物在低氮生长条件下对氮的吸收降低；
所述培育转基因植物的方法二，包括向出发植物乙中导入抑制权利要求1中所述蛋白质TaARE1的含量和/或活性的物质，得到转基因植物乙的步骤；所述出发植物乙为含有权利要求1中所述蛋白质TaARE1的编码基因的植物；
所述转基因植物乙与所述出发植物乙相比，所述转基因植物以至少具有如下一种特征：
1)植物的产量增加；
2)植物的单株产量增加；
3)植物出现晚衰表型；
4)植物的株高增加；
5)植物的穗粒数增加；
6)植物的穗长增加；
7)植物的千粒重增加；
8)植物的分蘖数增加；
9)植物的根冠比增加；
10)植物的生物量增加；
11)植物根的生物量增加；
12)植物耐低氮性增加；
13)植物的氮素吸收效率增加；
14)植物的氮素利用效率增加；
15)植物在低氮生长条件下对氮的吸收增加。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：
所述提高权利要求1中所述蛋白质TaARE1的含量和/或活性的物质为权利要求2中C1)至C7)中任一种生物材料；
所述抑制权利要求1中所述蛋白质TaARE1的含量和/或活性的物质为权利要求2中D1)至D7)中任一种生物材料。
7.植物育种方法一或植物育种方法二：
所述植物育种方法一，包括如下步骤：增加植物中权利要求1中所述蛋白质TaARE1的含量和/或活性，从而植物具有下述至少一种特性：
1)植物的产量降低；
2)植物的单株产量降低；
3)植物出现早衰表型；
4)植物的株高降低；
5)植物的穗粒数降低；
6)植物的穗长降低；
7)植物的千粒重降低；
8)植物的分蘖数降低；
9)植物的根冠比降低；
10)植物的生物量降低；
11)植物根的生物量降低；
12)植物耐低氮性降低；
13)植物的氮素吸收效率降低；
14)植物的氮素利用效率降低；
15)植物在低氮生长条件下对氮的吸收降低；
所述植物育种方法二，包括如下步骤：降低植物中权利要求1中所述蛋白质TaARE1的含量和/或活性，从而植物具有下述至少一种特征：
1)植物的产量增加；
2)植物的单株产量增加；
3)植物出现晚衰表型；
4)植物的株高增加；
5)植物的穗粒数增加；
6)植物的穗长增加；
7)植物的千粒重增加；
8)植物的分蘖数增加；
9)植物的根冠比增加；
10)植物的生物量增加；
11)植物根的生物量增加；
12)植物耐低氮性增加；
13)植物的氮素吸收效率增加；
14)植物的氮素利用效率增加；
15)植物在低氮生长条件下对氮的吸收增加。
8.包含权利要求2中所述生物材料的下述任意一种产品：
1)增加植物的产量的产品；
2)增加植物的单株产量的产品；
3)使植物晚衰的产品；
4)增加植物的株高的产品；
5)增加植物的穗粒数的产品；
6)增加植物的穗长的产品；
7)增加植物的千粒重的产品；
8)增加植物的分蘖数的产品；
9)增加植物的根冠比的产品；
10)增加植物的生物量的产品；
11)增加植物根的生物量的产品；
12)增加植物耐低氮性的产品；
13)增加植物的氮素吸收效率的产品；
14)增加植物的氮素利用效率的产品；
15)增加植物在低氮生长条件下对氮的吸收的产品。
9.根据权利要求1-3任一所述的应用，根据权利要求5-7任一所述方法，根据权利要求8所述的产品，其特征在于：
所述植物为如下e1)至e4)中的任一种：e1)双子叶植物；e2)单子叶植物；e3)禾本科植物；e4)小麦。
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| CN113136398A (zh) * | 2021-04-29 | 2021-07-20 | 黑龙江八一农垦大学 | GsHA24蛋白及其相关生物材料在调控植物耐逆性中的应用 |
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