CN114787377A - 微生物的dna分析方法 - Google Patents

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Abstract

本文提供了使用离心或过滤两个分离步骤从完整细胞、污染死细胞、细胞碎片和生物膜样本中的完整细胞中分离核酸的方法，离心或过滤按顺序进行。还提供了一种从完整细胞中分离核酸的方法，使用第一次分离步骤随后使用核酸酶处理，然后使用第二次分离步骤。本文提供了一种从完整细胞中分离DNA的相关方法，使用核酸酶在双链DNA上产生DNA切割，随后使用第二次分离步骤。

Description

微生物的DNA分析方法
相关申请的交叉引用
本国际申请基于美国法典35U.S.C.§120要求2020年3月12日提交的待审美国非临时申请序号16/816,481的优先权，该申请基于美国法典35U.S.C.§119(e)要求2019年7月19日提交的美国临时申请序号62/876,054的优先权，两个申请的全部内容通过引用并入本文。
背景技术
技术领域
本发明涉及基于DNA的细胞分析技术领域。更具体地，本发明涉及从污染死细胞、生物膜和细胞碎片中分离完整细胞的方法。
相关技术的描述
严格的安全标准对于保护大麻消费者免受病原微生物的侵害是必要的。在诊断界有这样的担心，即基于PCR的方法(包括qPCR和终点PCR)会产生假阳性，因为样本制备策略的不佳，由此不经意间扩增了来自死亡细胞的污染DNA。这导致对病原体存在的错误诊断，这些病原体已不再对作物和/或消费者造成健康危害。由于不必要的健康召回和作物损失，这种误诊的经济影响是非常严重的。
过滤和离心是收集微生物用于后续DNA分析的有用方法。当作为气溶胶颗粒物悬浮时，微生物(例如细菌或真菌)可以通过孔径小于约0.5μm的过滤器收集，因为这种微生物的最长尺寸通常大于这种膜0.5μm的截止尺寸。同样，水中的微生物也可以通过过滤或通过1000×g-15000×g的离心来收集，因为悬浮的微生物颗粒比水的密度更大，且尺寸>0.5μm，尺寸足够大以沉淀到离心管的底部以形成微生物细胞沉淀物(pellet)。
尽管基于过滤和基于离心的微生物收集和纯化是已知的可用于农业、食品和环境筛选方面中的DNA分析，但在表面微生物污染的特别情况下(尤其是植物表面、动物皮肤、机械设备和加工表面)，生物膜的出现会使通过这些方法收集微生物变得复杂，特别是当目标是从收集材料进行DNA分析时。
生物膜已经成为微生物学中一个众所周知的现象(1)。简言之，当微生物(尤其是细菌和真菌)在表面生长时，逐渐形成一层厚的水凝胶“生物膜”，将微生物包裹在表面上，从而在植物、皮肤、机械设备或加工表面下层的微生物能够稳定附着和生长(2)。这种生物膜提供了一种厚的基质以包围表面上的活微生物，在某种程度上保护了微生物免受脱水，并提供了支撑微生物生长的营养。这种生物膜的成分包括活的微生物本身(细菌和真菌)，活的微生物被由先于这些活微生物在表面生长、已经死去的微生物形成的聚合物基质包围。物理上，这种生物膜基质显示出了聚合物水凝胶的一般性能(2)。
这种生物膜水凝胶的聚合物成分包括微生物衍生的蛋白质、多糖和DNA以及包裹在生物膜中的其他成分，包括灰尘、土壤和其他污染物。已发现这种生物膜的微生物DNA补体具有相对高的分子量(约30000碱基对＝约200万道尔顿)，并且占这种生物膜总质量的1％-10％(3)。这种质量分数为1％-10％的相对高分子量的DNA已知其本身就能形成稳定的水凝胶(4)。在具有过量蛋白质和多糖(它们本身可以形成水凝胶)的复杂情况下，所形成的复合水凝胶生物膜在物理上表现出耐久性。
当微生物从表面分散到空气或液体中时，它们会伴随着生物膜的碎片。无论是否仍然连在一起，微生物和生物膜会在大多数情况下被过滤器捕获或通过离心沉淀，在某种程度上，无法单独地区分捕获的纯微生物。因此，来源于生物膜的微生物DNA(包括活微生物和死微生物的DNA)变得无法与捕获的活微生物的微生物DNA区分。这导致使用微生物DNA分析对活微生物的错误评估。
目前区分混合物中活细胞和死细胞的方法是使用完整细胞而非死细胞的特性，以从细胞质中排除DNA活性染料。例如，染料叠氮化丙啶不会穿透完整的细胞，从而选择性地使死亡细胞群中的DNA失活(5-7)。由死细胞形成的DNA叠氮化丙啶结合物对PCR和其他类型的基于DNA的分析(8)没有反应，从而PCR形成的扩增子仅对应于完整细胞中的DNA。然而，这种方法是存在问题的，因为像叠氮化丙啶的染料会干扰PCR的检测。因此，需要一种耗时的纯化步骤从样本中去除未反应的叠氮化丙啶，这也会导致目的微生物DNA的显著损失。
因此，现有技术在区分死微生物DNA和活微生物DNA的DNA分析的系统和方法是有缺陷的。本发明实现了本领域这个长期存在的需求和愿望。
发明内容
本发明涉及一种从完整细胞中分离核酸的方法。在该方法中，获得包含完整细胞、污染死细胞、细胞碎片和生物膜的样本。进行第一次分离，以获得包含完整细胞和污染死细胞的第一部分。将第一部分悬浮在缓冲液中，并进行第二次分离，以获得包含完整细胞的第二部分，从第二部分中分离核酸。
本发明涉及的相关方法还包括在进行第一次分离之前，通过过滤捕获完整细胞、污染死细胞、细胞碎片和生物膜和将完整细胞、污染死细胞、细胞碎片和生物膜悬浮在缓冲液中的步骤。
本发明涉及的另一个相关的方法还包括测量样本中完整细胞的相对丰度。在该方法中，确定样本中的总细胞数。使用具有与目标核苷酸序列互补的核苷酸序列的引物对，对从完整细胞中分离的核酸中的目标核苷酸序列进行至少一次扩增，以产生多个扩增子。量化多个扩增子，并将其与样本中的完整细胞数相关联。在完整细胞数与总细胞数之间进行比较，从而确定样本中完整细胞的相对丰度。本发明涉及的另一种相关方法还包括当核酸为RNA时，在扩增目标核苷酸序列之前，执行反转录。
本发明还涉及一种从完整细胞中分离核酸的方法。在该方法中，获得包含完整细胞、污染死细胞、细胞碎片和生物膜的样本。进行第一次分离，以获得包含完整细胞和污染死细胞的第一部分。将第一部分悬浮在核酸酶反应缓冲液中，并与核酸酶一起孵育以降解污染死细胞中的核酸，以获得部分核酸酶降解的样本。对部分核酸酶降解的样本进行第二次分离，以获得包含完整细胞的第二部分，从第二部分中分离核酸。本发明涉及如上所述的从完整细胞中分离DNA的相关方法。
本发明还涉及一种从完整细胞中分离DNA的方法。获得包含完整细胞、污染死细胞、细胞碎片和生物膜的样本。进行第一次分离，以获得包含完整细胞和污染死细胞的第一部分。将第一部分悬浮在脱氧核糖核酸酶反应缓冲液中，并与双链DNA特异性脱氧核糖核酸酶孵育，以降解污染死细胞中的DNA，以获得部分脱氧核糖核酸酶降解的样本。对部分脱氧核糖核酸酶降解的样本进行第二次分离，以获得包含完整细胞的第二部分，从第二部分中分离DNA。
本发明涉及的相关方法还包括在进行第一次分离之前，通过过滤捕获完整细胞、污染死细胞、细胞碎片和生物膜和将完整细胞、污染死细胞、细胞碎片和生物膜悬浮在缓冲液中的步骤。
本发明涉及的另一种相关的方法包括测量样本中完整细胞的相对丰度。确定样本中的总细胞数。使用具有与目标核苷酸序列互补的核苷酸序列的引物对，对从完整细胞中分离的DNA中的目标核苷酸序列进行至少一次扩增，以产生多个扩增子。量化多个扩增子，并将其与样本中的完整细胞数相关联。在完整细胞数与总细胞数之间进行比较，从而确定样本中完整细胞的相对丰度。
鉴于本发明的目的，从下面本发明中目前优选的实施例的描述中，本发明的其他和进一步的方面、特征和优点将变得显而易见。
附图说明
通过参考附图中所示的本发明的某些实施例，以便上述列举的本发明的特征、优点和目的以及其他方面变得清晰得以实现且能够被详细地理解，可以获得对上文简要总结的本发明的更具体的描述。这些附图形成本发明的一部分。然而，应注意，附图说明了本发明的优选实施例，因此不应被认为限制本发明的范围。
图1显示了使用所述方法分离的大肠杆菌(E.coli)DNA的活细胞(白色)与死细胞(灰色)的qPCR分析。
图2A-2B显示了大肠杆菌DNA的qPCR分析。图2A显示了在有或没有DNAse I(一种在DNA中产生单链断裂的核酸内切酶)下孵育的活的和热灭活的大肠杆菌沉淀物(pellet)的qPCR分析的平均Ct数据。图2B显示了使用无模板对照(NTC)以及离心大肠杆菌细胞悬浮液以获得图2A所述沉淀物后获得的活的和热灭活的大肠杆菌上清液进行的qPCR的平均Ct。
图3显示了沉淀物中DNA和在有或没有DNase I孵育后活的和热灭活的大肠杆菌沉淀物上清液样本中DNA的熔融曲线图。
图4显示了代表性扩增图。
图5A-5B显示了代表性QUANTXTM微阵列结果，表现为每克菌量。图5A显示了死大肠杆菌的微阵列结果。图5B显示了肠道沙门氏菌(S.enterica)的微阵列结果。
图6A-6C显示了有和没有微球菌核酸酶处理的样本中进行qPCR分析的比较。图6A是没有(“单独MN缓冲液”)或有(“MN”)微球菌核酸酶处理的黑曲霉(A.niger)样本的代表性qPCR分析。图6B是没有或有微球菌核酸酶处理的大肠杆菌样本的代表性qPCR分析。图6C是没有或有微球菌核酸酶处理的肠道沙门氏菌样本的代表性qPCR分析。
图7A-7C显示了物理富集和生化富集的微阵列结果的比较。图7A显示了大肠杆菌的微阵列结果。图7B显示了肠道沙门氏菌的微阵列结果。图7C显示了黑曲霉的微阵列结果。
图8A-8B显示了生化富集在清除游离DNA的优势。图8A是对肠道沙门氏菌的单独物理富集与物理富集结合使用微球菌核酸酶生化富集的比较。图8B是对酿酒酵母(S.cerevisiae)的单独物理富集与物理富集结合使用微球菌核酸酶生化富集的比较。
图9显示了存在微球菌核酸酶和DNase I的生化富集的比较。
具体实施方式
如本文所使用的，以下术语和短语应具有下文所陈述的含义。除非另有定义，本文所使用的所有技术和科学术语具有本领域普通技术人员通常理解的相同含义。
如本文所使用的，术语“一个(a)”或“一个(an)”可以指一个或多个。如本文权利要求中所使用的，当与“包含”一词一起使用时，单词“一个a”或“一个an”可指一个或一个以上。如本文所使用的，“另一个”或“其他”可以指其中相同或不同权利要求元素或成分中的至少第二个或更多个。术语“包括(comprise)”和“包括(comprising)”以包含的和开放的形式使用，意味着可以包含其他的元素。
如本文所使用的，权利要求中的术语“或”指的是“和/或”，除非明确说明仅仅指替代品或所述替代品是相互排斥的，尽管本发明支持仅仅指替代品和“和/或”的定义。
如本文所使用的，“完整细胞”指能够生长和复制的活细胞。
如本文所使用的，“双链DNA特异性脱氧核糖核酸酶”指产生50％以上的双链DNA特异性切割的脱氧核糖核酸酶。
如本文所使用的，无论是否明确说明，术语“大约”指数值，例如包括整数、分数和百分比。术语“大约”一般指数值的一个范围(例如，+/-5-10％的列举值)，本领域的普通技术人员会认为其等同于列举值(例如，具有相同的功能或结果)。在某些情况下，术语“大约”可以包括四舍五入至最接近有效数字的数值。例如，900至16500×g的相对离心速度被约1000×g至约15000×g所包含。
在本发明的一个实施例中，提供了一种从完整细胞中分离核酸的方法，包括以下步骤：获得包含完整细胞、污染死细胞、细胞碎片和生物膜的样本；对样本进行第一次分离，以获得包含完整细胞和污染死细胞的第一部分；将第一部分悬浮在缓冲液中以获得悬浮液；对悬浮液进行第二次分离，以获得包含完整细胞的第二部分；从第二部分的完整细胞中分离核酸。
在另一个实施例中，在执行第一次分离之前，所述方法还包括步骤：通过过滤捕获完整细胞、污染死细胞、细胞碎片和生物膜；将完整细胞、污染死细胞、细胞碎片和生物膜悬浮在缓冲液中。
在另一个实施例中，所述方法包括测量样本中完整细胞的相对丰度，包括步骤：确定样本中的总细胞数；使用具有与目标核苷酸序列互补的核苷酸序列的引物对，对从完整细胞中分离的核酸中的目标核苷酸序列进行至少一次扩增，以产生多个扩增子；量化多个扩增子；将扩增子的数量与样本中的完整细胞数相关联；以及将完整细胞数与总细胞数进行比较，从而确定样本中完整细胞的相对丰度。在本进一步实施例中，所述引物对还可以包括荧光标记，其中所述方法产生多个荧光标记的扩增子。在本进一步实施例的一方面，所述核酸是RNA，在扩增步骤之前，所述方法还包括对其执行反转录的步骤。
在所有这些实施例及其方面，执行第一次分离和第二次分离的步骤独立地可以包括离心或过滤或其组合。同样，在所有实施例和方面中，分离核酸的步骤可以包括步骤：破坏完整细胞以释放核酸；并从其中分离核酸。此外，所述核酸可以是DNA或RNA。此外，所述完整细胞可以是细菌细胞、真菌细胞、藻类细胞、原生动物细胞、动物细胞或植物细胞。
在本发明的另一个实施例中，提供了一种从完整细胞中分离核酸的方法，包括步骤：获得包含完整细胞、污染死细胞、细胞碎片和生物膜的样本；对样本进行第一次分离，以获得包含完整细胞和污染死细胞的第一部分；将第一部分悬浮在核酸酶反应缓冲液中以获得悬浮液；将悬浮液与核酸酶孵育，以降解污染死细胞中的核酸，以获得部分核酸酶降解的样本；对部分核酸酶降解的样本进行第二次分离，以获得包含完整细胞的第二部分；从第二部分的完整细胞中分离核酸。
在本实施例中，进一步的方法步骤可以包括如上所述在执行第一次分离之前执行的那些方法步骤、用于执行第一次分离和第二次分离的那些方法步骤以及用于分离核酸的那些方法步骤。此外，在本实施例中，利用或不利用荧光标记的引物对测量样本中完整细胞的相对丰度的那些方法步骤和由此产生扩增子的那些方法步骤，以及其中核酸为RNA，在测量完整细胞的相对丰度之前，对其执行反转录的那些方法步骤如上所述。此外，完整细胞可以如上所述。
在所有实施例中，所述核酸可以是DNA或RNA。此外，所述核酸酶可以是核酸内切酶、核酸外切酶或核酸内外切酶。特别地，所述核酸酶可以是单链核酸特异性核酸酶或双链核酸特异性核酸酶。核酸酶的代表性例子是脱氧核糖核酸酶I、脱氧核糖核酸酶II、核酸外切酶IV、核酸外切酶V、核酸外切酶VI、核糖核酸酶A、核糖核酸酶H、核糖核酸酶III、核糖核酸外切酶I、核糖核酸外切酶II或微球菌核酸酶或其组合。核酸酶的一个具体例子是微球菌核酸酶。
在本发明的另一个实施例中，提供了一种从完整细胞中分离DNA的方法，包括步骤：获得包含完整细胞、污染死细胞、细胞碎片和生物膜的样本；对样本进行第一次分离，以获得包含完整细胞和污染死细胞的第一部分；将第一部分悬浮在脱氧核糖核酸酶反应缓冲液中以获得悬浮液；将悬浮液与双链DNA特异性脱氧核糖核酸酶孵育，以降解污染死细胞中的DNA，以获得部分脱氧核糖核酸酶降解的样本；对部分脱氧核糖核酸酶降解的样本进行第二次分离，以获得包含完整细胞的第二部分；从第二部分的完整细胞中分离DNA。在本实施例中，脱氧核糖核酸酶可以是微球菌核酸酶。
在本实施例中，进一步的方法步骤可以包括如上所述在执行第一次分离之前执行的那些方法步骤、用于执行第一次分离和第二次分离的那些方法步骤以及用于分离核酸的那些方法步骤。此外，在本实施例中，利用或不利用荧光标记的引物对测量样本中完整细胞的相对丰度的方法步骤和由此产生扩增子的那些方法步骤如上文所述。此外，完整细胞可以如上所述。
本文提供了从完整细胞中分离核酸的方法。获得包含完整细胞、污染死细胞、细胞碎片和生物膜的样本。完整细胞通过两个部分与样本的其余部分分离，且DNA通过破坏完整细胞来分离。还可以确定样本中完整细胞的相对丰度。通常，包含上面描述的细胞的样本可以从空气中获得，或从液体(例如水或缓冲液)中获得，或从固体表面(包括但不限于不锈钢、玻璃表面、塑料表面、植物表面或皮肤表面或鼻腔表面)上取下的拭子中获得。从细胞中分离的核酸可以是DNA或RNA。
更特别地，所述样本离心以使包括完整细胞和污染死细胞的第一部分沉淀。将第一部分悬浮在缓冲液中，并进行第二次分离，以获得包含完整细胞的第二部分。通过破坏第二部分中的完整细胞来分离核酸。
当样本体积较大时，所述方法包括通过过滤捕获，并在第一次分离之前悬浮在较小体积的等渗水或缓冲液中。使用孔径从约0.001至约10μm的任何类型的膜过滤器。过滤器由任何材料制成，包括但不限于聚碳酸酯膜、硝酸纤维素膜、醋酸纤维素膜、聚偏氟乙烯膜、聚四氟乙烯膜、聚醚砜膜、尼龙膜和聚丙烯膜。过滤是通过正气压或通过施加真空的负气压完成的。为了将细胞悬浮在较小的体积中，本领域普通技术人员能够选择适当的膜过滤器。
第一次分离可以通过过滤进行，这导致捕获在膜过滤器上的细胞作为第一部分。在进行第二次分离之前，然后将包含完整细胞和污染死细胞的第一部分悬浮在等渗水中或缓冲液中。具有上述特征的膜过滤器用于此目的。第二次分离也可以通过如第一次分离所述的过滤进行。
或者，第一次分离可以通过离心进行，这导致细胞沉淀物作为第一部分。离心可以在约1000×g至约15000×g的相对离心力下进行。本领域普通技术人员能够根据待离心的细胞选择适当的相对离心力值。第二次分离也可通过如第一次分离所述的离心进行。
在所述方法中，任何适当的破坏细胞壁、细胞膜和/或核膜的细胞破坏方法都可以使用。例如包括，使用离液剂、洗涤剂和螯合剂和/或使用强碱(如NaOH)的化学破坏，以及通过均质化、冻融、超声波或空穴作用的物理破坏。
本文还提供了一种利用核酸酶从完整细胞中分离核酸的可替代方法。将样本离心以使包括完整细胞和污染死细胞的第一部分沉淀。将第一部分悬浮在核酸酶反应缓冲液中，并与核酸酶一起孵育，以降解污染死细胞、细胞碎片和生物膜中的核酸，以获得部分核酸酶降解的样本。对核酸酶降解的样本进行第二次分离，以获得包含完整细胞的第二部分。如本文所述，通过破坏完整细胞来分离核酸。
可以使用任何核酸酶。核酸酶可以是核酸内切酶、核酸外切酶或核酸内外切酶。核酸酶可以是单链核酸特异性核酸酶或双链核酸特异性核酸酶。核酸酶包括但不限于微球菌核酸酶、脱氧核糖核酸酶I、脱氧核糖核酸酶II、核酸外切酶IV、核酸外切酶V、核酸外切酶VI、核糖核酸酶A、核糖核酸酶H、核糖核酸酶III、核糖核酸外切酶I、核糖核酸外切酶II或其组合。特别地，核酸酶可以是双链DNA的特异性脱氧核糖核酸酶。一个非限制性的例子是微球菌核酸酶。孵育混合物中的核酸酶活性和消化的时间调整至约10倍的在相同缓冲液中消化等量纯化DNA所需的活性和时间。在非限制性例子中，所述核酸酶可以是DNase 1或微球菌核酸酶在37℃下以每104个细胞为5个单位孵育10分钟。
从完整细胞中分离核酸的任一方法可以包括测量样本中完整细胞相对丰度的方法。通常，总细胞数是确定的，引物对扩增从完整细胞分离的核酸中的目标核苷酸序列，且产生的扩增子与样本中的完整细胞数相关。总细胞数和完整细胞数的比较确定了样本中完整细胞的相对丰度。如果核酸是RNA，在扩增前进行反转录以产生cDNA，所述cDNA用作靶核苷酸序列。
样本中的总细胞数可以通过手动或自动细胞计数方法确定。或者，总细胞数通过使用从总细胞中分离的核酸作为模板进行至少一次扩增，并量化产生的多个扩增子获得。
可以使用任何方法进行扩增，包括但不限于单个PCR反应、串联PCR反应、qPCR、实时PCR、基于凝胶的PCR和等温扩增。所述引物对具有与分离的核酸中的目标核苷酸序列互补的核苷酸序列。所述引物可以包括也可以不包括荧光标记。例如，在测量步骤之前执行单个扩增，其中所述引物被荧光标记以产生多个荧光标记的扩增子。或者，通过PCR扩增，其包括两个扩增步骤，其中第一个扩增使用非荧光引物以产生多个非荧光扩增子。所述非荧光扩增子用作第二次扩增的模板，所述第二次扩增使用荧光引物以产生多个荧光扩增子，其中荧光信号与样本中完整细胞的相对丰度成比例。任何荧光标记可以使用，包括但不限于SYBR Green、CY5，DYLIGHTTMDY647，ALEXA
Figure BDA0003555599860000081
647，CY3，DYLIGHTTMDY547或ALEXA
Figure BDA0003555599860000082
550。
给出以下示例的目的是为了说明本发明的各种实施例，并不意味着以任何方式限制本发明。
实施例1
DNase处理：过滤法
之前从空气或水悬浮液中捕获了活微生物和污染死细胞、细胞碎片和生物膜的过滤器在过滤器的表面经受选择性的DNase处理。活微生物中的DNA不易受到DNase降解的影响，因为它们的细胞壁和细胞膜没有受损。另一方面，作为过滤器DNase处理的直接结果，死细胞、细胞碎片和生物膜中的DNA会降解成更小的片段，且因此释放在溶液相中。因此，原始样本中的活微生物补体可以保留在过滤器上。然后移除并处理过滤器，并通过任何标准方法(包括PCR和qPCR)用于微生物的DNA分析。
DNase处理：离心法
之前包含活微生物和污染死细胞、细胞碎片和生物膜的离心得到的沉淀物经受选择性DNase处理。完整微生物中的DNA不易受DNase降解的影响，因为它们的细胞壁和细胞膜没有受损。另一方面，作为过滤器DNase处理的直接结果，死细胞、细胞碎片和生物膜中的DNA会降解成更小的片段，其在离心期间不会沉淀。因此，在第二次离心步骤后，原始样本的完整微生物补体会保留在沉淀物中。然后移除和处理沉淀物，并通过任何标准方法(包括PCR和qPCR)用于微生物DNA分析。
使用本发明所述的方法是有益的，因为人们可以对释放的核酸进行DNA分析而无需进一步纯化。DNase可以在不影响微生物DNA后续DNA测试的条件下通过蛋白酶处理和热处理选择性地失活，从而绕过了DNA分析前的纯化步骤。
实施例2
“活”大肠杆菌细胞中DNA的DNase 1反应性与“死”大肠杆菌细胞释放DNA的DNase 1反应性，通过基于离心的收集加上定量实时PCR(qPCR)评估。
为了模拟生物膜和相关细胞碎片中释放的“死细胞”DNA的物理状态，以便于其可以与活菌中完整的“活细胞”DNA进行比较，使用大肠杆菌作为模型。大肠杆菌在标准生长培养基中培养至对数后期。细胞液体培养后，通过定量细菌平板培养测量每单位体积的“活”大肠杆菌细胞数。为了在受控条件下产生匹配的“死”大肠杆菌细胞部分，创建了两等份活的大肠杆菌(每份105个完整细胞)，但其中一份在100℃下热处理10分钟，因此产生一份具有样本全部化学成分的“死”大肠杆菌部分，包括与“活”细胞部分匹配的DNA量。
然后每个匹配样本的100μL添加到10μL的10×脱氧核糖核酸酶I(DNase I)反应缓冲液(500mM Tris，50mM CaCl2，pH 7.5)，以提供最终缓冲液的浓度(50mM Tris，5mM CaCl2，pH 7.5)，然后用1μL(2单位)或2μL(4单位)或4μL(8单位)的DNase I在37℃下处理10分钟。DNase I孵育后，加入1μL的EDTA(500mM储备)使酶失活，用35uL PathogenDx裂解缓冲液(PDx，Inc.，Tucson AZ亚利桑那州图森市)处理悬浮液，且加热至95℃，随后用5uLPathogenDx中和缓冲液(PDx，Inc.，Tucson AZ)进行裂解物淬灭以将pH调节至约7。添加35μL PathogenDx样本缓冲液(PDx，Inc.，Tucson AZ)，在55℃下孵育45分钟，以降解微生物蛋白质和剩余的DNase。然后将1μL所得的中和裂解物添加到14μL特用于扩增a≈细菌基因组200个碱基对片段的qPCR反应(表1)。
用标准SYBR Green检测对qPCR反应定量，以提供所得“实时”PCR曲线(9)的定量循环(Ct)值(阈值交叉值)。
表1
大肠杆菌的qPCR参数
Figure BDA0003555599860000091
Figure BDA0003555599860000101
结果
众所周知，这种Ct值与保留的>200碱基对长的DNA的浓度有关。因此，这个方法适用于支持大肠杆菌目标区域的200碱基对的PCR扩增。一般来说，Ct值与适用于支持PCR的输入DNA浓度的以2为底的对数(Log2)成比例。在本实施例中，由于DNase 1处理样本中的大肠杆菌数量与匹配的未处理样本中的大肠杆菌数量相同，由DNase I处理导致的任何Ct值变化是对经DNase I处理降解的DNA部分的直接测量。例如，如果分析匹配的未处理的与经DNase I处理的细胞，并显示Ct分别呈现为21和25，则所获得的Ct变化(25-21＝4)可以表明多于200个碱基对的DNA数量减少了25倍。
图1和表2显示了使用所述方法对大肠杆菌的活细胞和死细胞分析的代表性数据。
表2
大肠杆菌中活细胞和死细胞的平均qPCR Ct值
DNase(单位) 平均Ct值(活细胞) 平均Ct值(死细胞)
2 20.932 24.976
4 20.988 26.309
8 20.526 25.341
在那里可以看到，添加2μL(4单位)和4μL(8单位)的DNase I时，Ct值增加约5个相对单位，表明“死”细胞部分中的DNA量相对于“活”大肠杆菌细胞中的DNA量减少了25倍(32倍)。因此，可以得出结论，DNase I的敏感性可以用于实现本发明中区分“活”大肠杆菌和“死”大肠杆菌的方法。
实施例3
“活”大肠杆菌细胞中DNA的DNase 1反应性与“死”大肠杆菌细胞释放DNA的DNase 1反应性，通过基于离心的收集加上台盼蓝染色液和显微技术以及定量实时PCR(qPCR)
评估。
200μL等份的大肠杆菌悬浮液(104CFU/mL)被分发到三个试管中，并使用标准程序通过离心分离细胞。因此，获得了三个管，每个管都有细胞沉淀物。
沉淀物1的处理(测试样本)
将第一沉淀物悬浮在20μL的1×DNase I反应缓冲液(10mM Tris，0.5mM CaCl2，2.5mM MgCl2 pH 7.6)，并用1μL(2单位)或2μL(4单位)的DNase I在37℃下处理10分钟，随后通过加入1μL的500mM EDTA中和。
随后，200μL的磷酸盐缓冲盐水(PBS)加入样本中。通过离心使细胞沉淀，并将上清液放在一边。由此获得的DNase I处理的细胞沉淀物用于如下所述的台盼蓝排斥分析。
沉淀物2的处理(热灭活样本)
将第二沉淀物悬浮在20μL的DNase I反应缓冲液，随后在100℃下加热10分钟灭活细胞。然后用0μL(阴性对照)或1μL(2单位)或2μL(4单位)的DNase I在37℃处理沉淀物。10分钟后，200μL的磷酸盐缓冲盐水(PBS)加入样本中。通过离心使细胞沉淀，并将上清液放在一边。由此获得的细胞沉淀物用于台盼蓝排斥分析或裂解后通过PCR和微阵列分析，如下所述。没有添加DNase I的阴性对照的目的是确定单独热灭活是否会降低再形成沉淀物中的DNA含量，通过PCR和微阵列分析评估。
沉淀物3的处理(对照样本)
将第三沉淀物悬浮在20μL的DNase I反应缓冲液，但没有热灭活或酶处理。在37℃下10分钟后，200μL的磷酸盐缓冲盐水(PBS)加入样本中。通过离心使细胞沉淀，并将上清液放在一边。由此获得的细胞沉淀物用于如下所述的台盼蓝排斥分析或裂解后通过PCR和微阵列分析。
台盼蓝染色
来自于上述每种处理的细胞沉淀物立即用台盼蓝处理。
用于qPCR的样本制备
将来自于上述每种处理的细胞沉淀物制备用于qPCR，如实施例2所述。加入1μL500mM的EDTA，然后加入35μL PathogenDx裂解缓冲液，且加热至95℃，随后用5μL的PathogenDx中和缓冲液淬灭裂解液，以调节pH至约7。加入35uL的PathogenDx样本缓冲液，且在55℃下孵育45分钟，以降解微生物蛋白质和剩余的DNAse。然后将1μL所得的中和裂解物添加到14μL特用于扩增大肠杆菌基因组200个碱基对片段的qPCR反应。
qPCR参数如实施例2所示。用标准SYBR Green检测对qPCR反应定量，以提供所得“实时”PCR曲线(9)中的定量循环(Ct)值(阈值交叉值)。
表3
活大肠杆菌细胞和死大肠杆菌细胞的平均Ct值和Tm值
Figure BDA0003555599860000111
Figure BDA0003555599860000121
结果
图2A和2B以及表3显示了从对如上述处理的样本执行的qPCR中计算的平均Ct值。从本实验的熔融曲线(图3)中获得的平均熔融温度(Tm)显示，没有经DNase I处理的样本2A、样本3、Live和NTC的Tm发生了变动。图4显示了代表性的扩增曲线。
实施例4
“活”大肠杆菌细胞中DNA的微球菌核酸酶(MN)反应性与“死”大肠杆菌细胞释放 DNA的MN反应性，通过基于离心的收集加上微阵列分析评估。
对于大麻行业的微生物检测，从死的病原微生物中区分活的病原微生物可以在防止健康召回中改变现状。本发明的方案确保从沉淀细胞中消除非活细胞，从而避免DNA扩增期间的假阳性。
1.基于处理和制备的样本数量(表4)，通过添加正确体积的10×MN酶缓冲液(500mM Tris，50mM CaCl2，pH 7.9)、MN酶(新英格兰生物实验室2×10+6单位/mL)、BSA和分子级水，在干净的1.5mL的试管中制备微球菌核酸酶-MN酶混合物(每次新鲜制备)。
表4
用于活的/死的样本制备的酶混合物
Figure BDA0003555599860000122
2.向离心产生的微生物样本中添加100μL的MN酶混合物(见下文)。
3.在37℃下加热样本15分钟，并从热中移开样本。
4.向样本中添加5μL的0.5M pH 8.0的EDTA，旋转5秒。
5.在14000×G下离心样本3分钟。注意：离心机中的管方向与跟踪沉淀物位置的方向相同。
6.在没有搅乱细胞沉淀物下去除上清液。
7.向样本中添加35μL PathogenDx裂解缓冲液，并旋转以使细胞沉淀物脱落。
8.在95℃下加热样本10分钟，从热中移开并进行快速旋转。
9.向样本中添加5μL中和缓冲液，例如PathogenDx中和缓冲液。旋涡以确保适当的混合。
10.向每个样本管中加入35uL PathogenDx样本缓冲液混合物。旋涡以使细胞沉淀物脱落。
11.在55℃下加热样本45分钟，以考虑到蛋白酶活性。
12.从热中移开样本并进行快速旋转。
13.在95℃下加热样本15分钟。
14.用于PCR的样本即准备好了。(使用前稍微旋转和离心。)
活的/死的方案
细胞分为两类：“活的”和“死的”。通过在100℃下加热10分钟来裂解死细胞。然后使活细胞和死细胞沉淀，吸出上清液，如表4中用微球菌核酸酶(MN)孵育所得沉淀物样本或缓冲液对照，在37℃下孵育15分钟。经酶处理的细胞在15,000×g下沉淀，倒掉上清液，然后进行细胞裂解(PathogenDx裂解缓冲液)、中和(PathogenDx中和缓冲液)，然后与PathogenDx样本缓冲液混合物孵育以降解残留的细胞蛋白。然后加热样本裂解物至95℃以热灭活PathogenDx样本缓冲液混合物。
结果
通过标准的2步PCR部署然后杂交到QUANTXTM微阵列试剂盒(PDx，Inc.)，获得经上述处理后的样本的数据，如图5A和5B所示。使用本方案，大肠杆菌和肠道沙门氏菌的样本显示，通过酶处理，死的DNA的清除率有所提高。结果表明，单独的离心是不足以清除死的DNA。相反，酶降解来自死的或受损细胞中的游离DNA是必要的，这从最后一个条形柱中酶处理的死酿酒酵母样本中缺乏DNA扩增得以证明。
结论
在单独离心不足以消除样本(尤其是真菌细胞)中死的DNA的情况下，使用核酸酶(尤其是微球菌核酸酶)进行细胞外的DNA酶降解是非常有效的。这些方法的评估表明，酶在清除溶液中残留的游离DNA和非活细胞是有效的。在样本制备前加入该约20分钟的可选步骤确保了只有完整细胞的DNA会被扩增。
实施例5
使用微球菌核酸酶评估“活”与“死”微生物，通过qPCR评估。
为了确定核酸酶消化对活细胞与死细胞分析的影响，使用真菌(黑曲霉)和细菌(大肠杆菌和肠道沙门氏菌)样本作为模型，使用核酸内外切酶、微球菌核酸酶MN。所述样本如实施例2进行培养。为了在对照条件下产生匹配的“死”样本，创建了两等份活的真菌和细菌的样本，但其中一份在100℃下热处理，因此产生具有全部化学成分的“死”样本，包括如匹配的“活”细胞部分中的DNA含量。将“活”和“死”样本在15000×g下沉淀，且每个样本使用MN缓冲液中的微球菌核酸酶(如实施例4所示)或单独使用微球菌核酸酶缓冲液(没有酶)处理。孵育后，加入1μL的EDTA(500mM储备)使酶失活，随后用PathogenDx裂解缓冲液裂解微球菌核酸酶处理的产物，以释放所有剩余的DNA，随后用PathogenDx中和缓冲液淬灭裂解物，随后在PathogenDx样本缓冲液中进行酶处理，以降解残余的蛋白质(参见实施例4)。然后将1μL所得的中和裂解物添加到14μL的特用于扩增细菌(大肠杆菌和肠道沙门氏菌)和真菌(黑曲霉)的特异性基因(表5)的qPCR反应。对qPCR反应定量并表示为“RFU”。
结果
图6A-6C显示了使用微球菌核酸酶(MN)或单独缓冲液(“单独MN缓冲液”)处理的样本的qPCR数据的比较。如图所示，加入微球菌核酸酶导致“活”细胞和“死”细胞之间的区别得以改善，尤其对于真菌细胞。
表5
qPCR参数
Figure BDA0003555599860000141
Figure BDA0003555599860000151
实施例6
通过PCR然后微阵列分析评估活细胞与死细胞的物理富集和生化富集
材料和方法
将大肠杆菌(ATCC 35150)和肠道沙门氏菌(ATCC 700720)分别从新鲜的隔离板接种到LB培养基(Luria Bertani Broth)或TS培养基(Trypticase Soy Broth)中，并在29℃下以200rpm的转速摇动培养过夜。监视其生长，直到达到600nm处的光密度为0.4，然后在磷酸盐缓冲盐水中制备10倍系列稀释的细胞至终浓度为104或103CFU/mL。黑曲霉(ATCC16888)生长在马铃薯葡萄糖琼脂平板上，直到6-14天后出现孢子生成。孢子收集在分子级水中，并通过5μm的滤膜过滤。在血细胞计数器上计数孢子。在分子级水中制备10倍系列稀释的细胞至终浓度为104或103CFU/mL。酿酒酵母(ATCC 24657)在YPD培养基(Yeast PeptoneDextrose broth)中过夜生长，并将其覆盖在胰酶大豆琼脂平板上，在29℃下以200rpm的转速摇动培养。对于酵母，监视其生长，直到达到600nm处的光密度为0.5，在磷酸盐缓冲盐水中制备10倍系列稀释细胞至终浓度为104或103CFU/mL。对于所有生物体，将悬浮液中的1mL细胞等份加入1.5mL的微量离心管中。为了准备“死细胞”部分，新鲜培养的细菌或真菌悬浮在PBS中，然后在95℃下加热15分钟。
物理富集
细胞(活细胞和死细胞)在14000×g下离心3分钟使细胞沉淀，在该条件下裂解细胞的碎片会比完整细胞沉积更慢。这个过程可以被视为完整细胞的“物理富集”。
生化富集
将来自“物理富集”步骤的上清液吸走。然后所得的沉淀物悬浮在100μL的50mMTris-HCl和5mM CaCl2中(补充有100μg/mL的牛血清白蛋白和2000个凝胶单位的微球菌核酸酶)或100μL的10mM Tris-HCl、2.5mM MgCl2、0.5mM CaCl2中(补充有24单位的DNase1)。样本在37℃下经历孵育15分钟。然后向样本中添加5μL的0.5M EDTA以猝灭酶反应。然后在14000×g下细胞第二次沉淀，持续3分钟，倒出上清液。然后所得的沉淀物进行样本准备。
裂解和样本准备
将来自生化富集步骤的细胞沉淀物悬浮在35uL PathogenDx裂解缓冲液中，然后在95℃下经15分钟热处理裂解。然后5uL的PathogenDx中和缓冲液添加到悬浮细胞以中和裂解，然后添加25uL PathogenDx样本缓冲液混合物之后进行旋转，如实施例4所述。样本在55℃下孵育45分钟。然后在95℃下加热样本，以热灭活PathogenDx样本缓冲液(PDx，Inc.，Tucson AZ)。
两步PCR
使用了两种不同的商业微阵列检测试剂盒(DetectXTM和QuantXTM)。这两种都从PathogenDx(PDx，Inc.，Tucson AZ，产品编号：DF001、DB001、QF001、QB001)获得。对于这两种测试，方法从基因座增强PCR反应开始，然后是随后的标记PCR反应。有关详细信息，请参见制造商产品说明书。根据试验(DetectX或QuantX)的产品插页说明书制备基因座增强PCR的主混合物。简单地说，24uL添加到96孔板中。向每个孔中加入1uL的中和裂解物(见上文)。在放入Applied Biosystems热循环仪3720之前，96孔板进行短暂离心。在本实施例中，DetectX的基因座增强PCR程序按如下方式进行(30个PCR循环)：95℃4分钟，(95℃30秒，55℃30秒，72℃1分钟)30个循环，然后72℃7分钟，最终冷却至15℃。QuantX的基因座增强PCR程序遵循相同的循环参数，但是用15个PCR循环代替。
根据试验(DetectX或QuantX)产品插页制备标记PCR的主混合物。在96孔板的每个孔中，将1uL的基因座增强PCR添加到49μL标记PCR的主混合物中，并将其置于AppliedBiosystems热循环仪3720中，对于DetectX用以下的循环参数：30个循环，95℃4分钟，(95℃20秒，55℃20秒，72℃30秒)30个循环，然后72℃7分钟，最终冷却至15℃。对于QuantX，PCR循环参数与DetectX相同，但调整为25个循环。
杂交
DetectXTM或者QuantXTMDNA微阵列(PDx，Inc.，Tucson AZ)具有通过序列特异性杂交分析多种细菌和真菌(包括本实施例中的那些细菌和真菌)的能力，其使用两次分子级水洗涤进行水合，随后使用预杂交缓冲液(PDx，Inc.，Tucson AZ)孵育。18uL的杂交缓冲液(PDx，Inc.，Tucson AZ)直接添加到96孔PCR板格式中的标记PCR产物中。向微阵列孔中加入50uL的杂交混合液，并允许在室温下孵育30分钟。在室温下，将孔用洗涤缓冲液(PDx，Inc.，Tucson AZ)抽吸和洗涤共三次。在成像之前，通过30秒的离心干燥平板。
成像和分析
使用
Figure BDA0003555599860000171
荧光微阵列分析仪(Sensovation公司)扫描DetectXTM和QuantXTMDNA微阵列板。图像文件被上传到云端，并通过DetectXTM和QuantXTMDNA微阵列检测试剂盒提供的
Figure BDA0003555599860000172
软件处理。提供了相对荧光数据(RFU)，其是基于从成像中获得的杂交信号的直接荧光测量。数据以5次重复的平均值以及标准平均误差呈现。进行双尾学生t检验以证实统计学意义(p<0.05)。
结果
图7A-7C证明生化富集清除了样本中的游离、非活细胞的DNA。对于每个图，第一列代表经历包括物理富集(PE，离心)的样本制备的103个细胞。第二列代表在DetectXTM样本制备程序之前经历了使用生化富集(BE)灭活程序的细胞。数据以相对荧光单位(RFU)展示。绘制的平均值带有每组5次实验的平均标准误差。
图8A和8B显示了肠道沙门氏菌和酿酒酵母的结果，并证明了生化富集对于清除游离的DNA是必要的。对于每一张图，104细胞/mL经历了活的/死的方案。完整细胞经历了QuantXTM样本制备程序。“死细胞”组先经历了灭活步骤，再使用微球菌核酸酶和标准QuantXTM微阵列样本制备程序进行生化富集。数据以相对荧光单位展示。
图9显示了使用微球菌核酸酶MN的生化富集比使用DNase I的生化富集在清除游离的DNA方面更有效。104细胞/mL的黑曲霉经过了灭活程序。第一列代表通过物理富集(PE；离心)制备的样本。第二列代表经历了通过离心(PE)的物理富集，随后使用微球菌核酸酶(MN)的生化富集(BE)的死细胞组。第三列代表死黑曲霉细胞的相同组，其经历了物理富集和随后使用DNAse I的生化富集。所有组的粗样本裂解物均在QuantXTMDNA微阵列平台上运行。代表性的微阵列杂交数据以相对荧光单位绘制。这些数据一起表明，对于生化富集，微球菌核酸酶比DNAse 1更优选。
实施例7
用杀菌剂的液体溶液进行微生物灭菌
本领域已知，可使用物理或化学试剂处理气溶胶悬浮体或水悬浮液或表面上的活微生物以杀死这些微生物。这种物理灭菌的例子包括加热、高压灭菌、紫外线辐射、伽马辐射或微波辐射的应用。化学灭菌的例子包括使用如H2O2、高氯酸和过氧乙酸等氧化剂处理，或使用破坏细胞结构的药剂处理，包括醇类(如乙醇和异丙醇)、洗涤剂(如十二烷基硫酸钠和N-月桂酰肌氨酸钠)，阳离子两亲性物质(如洗必泰)，有机金属化合物(如聚维酮碘和汞溴红)，以及活性有机化合物(如环氧乙烷蒸汽)。这些处理与微生物发生物理和化学反应，以破坏它们的物理完整性，导致细胞死亡和释放微生物核酸。原始(完整)活细胞结构中的核酸从通过上述离心与DNase处理的组合在物理或化学灭菌期间释放的核酸中分离出来。
用溶解在超临界CO2的H2O2、过氧乙酸溶液进行灭菌
本领域已知，包含H2O2和过氧乙酸的溶液在高压下溶解于超临界CO2(sCO2)中可以在相对低的温度条件下用于对食品、农业物质、药物或精致的表面(例如医疗设备)进行灭菌。这些灭菌剂不会在处理的材料中留下任何残留物，因为所有这些成分在常压下是挥发性的，因此会在灭菌完成后自动蒸发走。
真菌样本
黑曲霉在标准马铃薯葡萄糖肉汤(PDB)培养基中生长至约106细胞/mL的密度。细胞悬浮液等份稀释在PDB中至4×104细胞/mL，并施加0.25mL到每个晶片上，其代表任何固体表面(例如不锈钢、玻璃、塑料)。等份的真菌可以在25℃下风干1小时，以在表面上产生一系列风干黑曲霉。其中一半的这些干燥真菌表面用溶于sCO2的H2O2和过氧乙酸处理15分钟(大约5％H2O2和大约5％过氧乙酸)。
灭菌完成后，用能够容纳1mL液体的聚氨酯拭子擦拭灭菌的晶片和匹配的未处理晶片，用1mL PBS湿润。其表面包含黑曲霉的拭子通过旋转分散到5mL PBS中。离心1mL所得的分散黑曲霉悬浮液，且用微球菌核酸酶(MN)处理所得的沉淀物。然后细胞被裂解，且样本被中和。PCR和微阵列分析按照实施例6所述的进行。
结果
当与没有灭菌的匹配的表面样本比较时，使用H2O2-过氧乙酸-sCO2灭菌剂杀死了95％以上表面附着的黑曲霉细胞。相对于没有灭菌的样本，灭菌样本获得的微阵列信号减少了10倍以上，因此证明本发明可以区分活的和死的黑曲霉细胞。
细菌样本
金黄色葡萄球菌(S.aureus)在标准TS培养基(TSB)中生长至约106细胞/mL的密度。等份的细胞悬浮液在TS培养基中稀释至4×104细胞/mL，并施加0.25mL到每个晶片上，其代表任何固体表面(例如不锈钢、玻璃、塑料)。等份的细菌可以在25℃下风干1小时，以在表面上产生一系列风干的金黄色葡萄球菌。其中一半的这些干燥细菌表面用溶于sCO2的H2O2和过氧乙酸处理15分钟(大约5％H2O2和大约5％过氧乙酸)。
灭菌完成后，用能够容纳1mL液体的聚氨酯拭子擦拭灭菌的晶片和匹配的未处理晶片，用1mL PBS湿润。其表面包含金黄色葡萄球菌的拭子通过旋转分散到5mL的PBS中。离心1mL所得的分散金黄色葡萄球菌悬浮液，并用微球菌核酸酶(MN)处理所得的沉淀物。然后细胞被裂解，且样本被中和。PCR和微阵列分析按照实施例6所述的进行。
结果
当与没有灭菌的匹配的表面样本比较时，使用H2O2-过氧乙酸-sCO2灭菌剂杀死了95％以上表面附着的金黄色葡萄球菌细胞。相对于没有灭菌的样本，灭菌样本获得的微阵列信号减少了10倍以上，因此证明本发明可以区分活的和死的金黄色葡萄球菌细胞。
实施例8
用4％洗必泰溶液灭菌
本领域已知，4％洗必泰溶液可以用作人类皮肤、医疗设备和其他医学相关表面上的真菌感染的灭菌方法。
真菌样本
耳念珠菌(C.auris)在标准PDB培养基中生长至约106细胞/mL的密度。等份的细胞悬浮液在PDB中稀释至4×104细胞/mL，并施加0.25mL到每个晶片上，其代表任何固体表面(例如不锈钢、玻璃、塑料)。等份的真菌可以在25℃下风干1小时，以在表面上产生一系列风干的黑曲霉。一半的这些干燥真菌表面喷洒1mL的4％洗必泰，并孵育15分钟。
灭菌完成后，用能够容纳1mL液体的聚氨酯拭子擦拭灭菌的晶片和匹配的未处理晶片，用1mL PBS湿润。其表面包含耳念珠菌的拭子通过旋转分散到5mL的PBS中。离心1mL所得的分散耳念珠菌悬浮液，并用微球菌核酸酶处理所得的沉淀物。然后细胞被裂解，且样本被中和。PCR和微阵列分析按照实施例6所述的进行。
结果
当与没有灭菌的匹配的表面样本比较时，使用洗必泰杀死了95％以上表面附着的耳念珠菌细胞。相对于没有灭菌的样本，灭菌样本获得的微阵列信号减少了10倍以上，因此证明本发明可以区分活的和死的耳念珠菌细胞。
细菌样本
金黄色葡萄球菌(S.aureus)在标准TS培养基(TSB)中生长至约106细胞/mL的密度。等份的细胞悬浮液在TS培养基中稀释至4×104细胞/mL，并施加0.25mL到每个晶片上，其代表任何固体表面(例如不锈钢、玻璃、塑料)。等份的细菌可以在25℃下风干1小时，以在表面上产生一系列风干的金黄色葡萄球菌。一半的这些干燥细菌表面喷洒1mL的4％洗必泰，并孵育15分钟。
灭菌完成后，用能够容纳1mL液体的聚氨酯拭子擦拭灭菌的晶片和匹配的未处理晶片，用1mL PBS湿润。其表面包含金黄色葡萄球菌的拭子通过旋转分散到5mL的PBS中。离心1mL所得的分散金黄色葡萄球菌悬浮液，并用微球菌核酸酶处理所得的沉淀物。然后细胞被裂解，且样本被中和。PCR和微阵列分析按照实施例6所述的进行。
结果
当与没有灭菌的匹配的表面样本比较时，使用洗必泰杀死了95％以上表面附着的金黄色葡萄球菌细胞。相对于没有灭菌的样本，灭菌样本获得的微阵列信号减少了10倍以上，因此证明本发明可以区分活的和死的金黄色葡萄球菌细胞。
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Claims (30)

1.一种从完整细胞中分离核酸的方法，包括以下步骤：
获得包含完整细胞、污染死细胞、细胞碎片和生物膜的样本；
对样本进行第一次分离，以获得包含完整细胞和污染死细胞的第一部分；
将第一部分悬浮在缓冲液中以获得悬浮液；
对悬浮液进行第二次分离，以获得包含完整细胞的第二部分；和
从第二部分的完整细胞中分离核酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在进行第一次分离之前，所述方法还包括以下步骤：
通过过滤捕获完整细胞、污染死细胞、细胞碎片和生物膜；和
将完整细胞、污染死细胞、细胞碎片和生物膜悬浮在缓冲液中。
3.根据权利要求1所述的方法，还包括测量样本中完整细胞的相对丰度，包括以下步骤：
确定样本中的总细胞数；
使用具有与目标核苷酸序列互补的核苷酸序列的引物对，对从完整细胞中分离的核酸中的目标核苷酸序列进行至少一次扩增，以产生多个扩增子；
量化多个扩增子；
将扩增子的数量与样本中的完整细胞数相关联；和
将完整细胞数与总细胞数进行比较，从而确定样本中完整细胞的相对丰度。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述引物对还包括荧光标记，所述方法产生多个荧光标记的扩增子。
5.根据权利要求3所述的方法，其中所述核酸是RNA，在所述扩增步骤之前，所述方法还包括对其执行反转录的步骤。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸是DNA或RNA。
7.根据权利要求1所述的方法，其中执行第一次分离和第二次分离的步骤独立地包括离心或过滤或其组合。
8.根据权利要求1所述的方法，其中分离核酸的步骤包括以下步骤：
破坏完整细胞以释放核酸；和
从其中分离核酸。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述完整细胞是细菌细胞、真菌细胞、藻类细胞、原生动物细胞、动物细胞或植物细胞。
10.一种从完整细胞中分离核酸的方法，包括以下步骤：
获得包含完整细胞、污染死细胞、细胞碎片和生物膜的样本；
对样本进行第一次分离，以获得包含完整细胞和污染死细胞的第一部分；
将第一部分悬浮在核酸酶反应缓冲液中以获得悬浮液；
将悬浮液与核酸酶孵育，以降解污染死细胞中的核酸，以获得部分核酸酶降解的样本；
对部分核酸酶降解的样本进行第二次分离，以获得包含完整细胞的第二部分；和
从第二部分的完整细胞中分离核酸。
11.根据权利要求10所述的方法，其中在进行第一次分离之前，所述方法还包括以下步骤：
通过过滤捕获完整细胞、污染死细胞、细胞碎片和生物膜；和
将完整细胞、污染死细胞、细胞碎片和生物膜悬浮在缓冲液中。
12.根据权利要求10所述的方法，还包括测量样本中完整细胞的相对丰度，包括以下步骤：
确定样本中的总细胞数；
使用具有与目标核苷酸序列互补的核苷酸序列的引物对，对从完整细胞中分离的核酸中的目标核苷酸序列进行至少一次扩增，以产生多个扩增子；
量化多个扩增子；
将扩增子的数量与样本中的完整细胞数相关联；和
将完整细胞数与总细胞数进行比较，从而确定样本中完整细胞的相对丰度。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述对引物还包括荧光标记，所述方法产生多个荧光标记的扩增子。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述核酸是RNA，在所述扩增步骤之前，所述方法还包括对其执行反转录的步骤。
15.根据权利要求10所述的方法，其中所述核酸是DNA或RNA。
16.根据权利要求10所述的方法，其中执行第一次分离和第二次分离的步骤独立地包括离心或过滤或其组合。
17.根据权利要求10所述的方法，其中分离核酸的步骤包括以下步骤：
破坏完整细胞以释放核酸；和
从其中分离核酸。
18.根据权利要求10所述的方法，其中所述完整细胞是细菌细胞、真菌细胞、藻类细胞、原生动物细胞、动物细胞或植物细胞。
19.根据权利要求10所述的方法，其中所述核酸酶是核酸内切酶、核酸外切酶或核酸内外切酶。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述核酸酶是单链核酸特异性核酸酶或双链核酸特异性核酸酶。
21.根据权利要求19所述的方法，其中所述核酸酶是脱氧核糖核酸酶I、脱氧核糖核酸酶II、核酸外切酶IV、核酸外切酶V、核酸外切酶VI、核糖核酸酶A、核糖核酸酶H、核糖核酸酶III、核糖核酸外切酶I、核糖核酸外切酶II或微球菌核酸酶或其组合。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述核酸酶是微球菌核酸酶。
23.一种从完整细胞中分离DNA的方法，包括以下步骤：
获得包含完整细胞、污染死细胞、细胞碎片和生物膜的样本；
对样本进行第一次分离，以获得包含完整细胞和污染死细胞的第一部分；
将第一部分悬浮在脱氧核糖核酸酶反应缓冲液中以获得悬浮液；
将悬浮液与双链DNA特异性脱氧核糖核酸酶一起孵育，以降解污染死细胞中的DNA，以获得部分脱氧核糖核酸酶降解的样本；
对部分脱氧核糖核酸酶降解的样本进行第二次分离，以获得包含完整细胞的第二部分；和
从第二部分的完整细胞中分离DNA。
24.根据权利要求23所述的方法，其中在进行第一次分离之前，所述方法还包括以下步骤：
通过过滤捕获完整细胞、污染死细胞、细胞碎片和生物膜；和
将完整细胞、污染死细胞、细胞碎片和生物膜悬浮在缓冲液中。
25.根据权利要求23所述的方法，还包括测量样本中完整细胞的相对丰度，包括以下步骤：
确定样本中的总细胞数；
使用具有与目标核苷酸序列互补的核苷酸序列的引物对，对从完整细胞中分离的核酸中的目标核苷酸序列进行至少一次扩增，以产生多个扩增子；
量化多个扩增子；
将扩增子的数量与样本中的完整细胞数相关联；和
将完整细胞数与总细胞数进行比较，从而确定样本中完整细胞的相对丰度。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述引物对还包括荧光标记，所述方法产生多个荧光标记的扩增子。
27.根据权利要求23所述的方法，其中执行第一次分离和第二次分离的步骤独立地包括离心或过滤或其组合。
28.根据权利要求23所述的方法，其中分离DNA的步骤包括以下步骤：
破坏完整细胞以释放DNA；和
从其中分离DNA。
29.根据权利要求23所述的方法，其中所述完整细胞是细菌细胞、真菌细胞、藻类细胞、原生动物细胞、动物细胞或植物细胞。
30.根据权利要求23所述的方法，其中所述脱氧核糖核酸酶是微球菌核酸酶。
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