CN114787192A

CN114787192A - 靶向前列腺特异性膜抗原(psma)的单域抗体

Info

Publication number: CN114787192A
Application number: CN202080075834.2A
Authority: CN
Inventors: N·帕博; L·罗森菲尔德
Original assignee: National Institute for Biotechnology in the Negev Ltd
Current assignee: National Institute for Biotechnology in the Negev Ltd
Priority date: 2019-08-29
Filing date: 2020-08-30
Publication date: 2022-07-22
Also published as: WO2021038571A1; MX2022002371A; IL290963A; JP2022546422A; EP4021941A4; EP4021941A1; CA3149754A1; BR112022003735A2; KR20220106956A; AU2020335394A1; WO2021038571A8; US20220306764A1

Abstract

本发明在其一些实施方式中涉及对前列腺特异性膜抗原(PSMA)具有增加的结合亲和力的抗原结合多肽。在一些实施方式中，本发明进一步涉及抗原结合多肽在诊断和治疗与升高的PSMA表达相关的疾病比如前列腺癌中的用途。

Description

靶向前列腺特异性膜抗原(PSMA)的单域抗体

相关申请的交叉引用

本申请要求2019年8月29日提交的标题为“靶向前列腺特异性膜抗原(PSMA)的单域抗体”的美国临时专利申请号62/893,264的优先权权益，其内容通过引用以其整体并入本文。

技术领域

本发明属于单域抗体领域。

背景技术

前列腺癌(PCa)通常通过测量前列腺特异性抗原(PSA)的血清浓度的基于抗体的测定来检测，但是这些测定容易出现高错误率。此外，虽然化疗常用于治疗去势抵抗性PCa，但是一些潜在有效的对抗PCa的化学疗法，比如阿霉素(DOX)，在肿瘤内积累不充分，并且分布体积大，导致治疗效果低以及高非特异毒性。因此，迫切需要用于检测PCa和靶向递送细胞毒剂的新方法。可以用来解决这两个问题的一个有希望的目标是前列腺特异性膜抗原(PSMA)；一种在PCa中过度表达的跨膜蛋白，可能是由于其叶酸水解酶活性，可诱导细胞增殖。PSMA主要在PCa细胞的膜上表达，尽管它也在包括PCa在内的许多癌的新血管系统中表达。重要的是，PSMA的过表达与恶性、去势抵抗性PCa、雄激素受体表达降低和PCa预后不良有关；因此，它可用于检测PCa，确定疾病的阶段，并促进个性化的肿瘤特异性药物。值得注意的是，靶向PSMA在治疗侵袭性、雄激素非依赖性PCa肿瘤中尤其重要，其中PSMA的表达增加而PSA的表达降低，并且一线治疗通常无法使化疗药物成为必需品。

PSMA已被多个研究小组广泛用作靶标，这些研究小组提出了主要在核医学领域用于PSMA靶向诊断和抑制的有希望的化合物。然而，迄今为止，发现以足够高的亲和力(纳摩尔范围)结合PSMA细胞外区域的大多数蛋白质是单克隆抗体或抗体片段，它们对于分子成像和癌症治疗目的都有一些注意事项(caveat)。例如，抗体的长血清半衰期和广泛的生物分布通常会降低信噪比并使其长时间保持在循环中。当抗体与细胞毒性放射性同位素结合时，这些作用会增加毒副作用，或者当抗体与药物结合时会降低特异性，因为抗体-药物结合物可能会内化到非肿瘤细胞中。此外，大尺寸的抗体往往会阻碍它们渗透到异常肿瘤组织核心的能力，从而大大降低它们的药物递送效率。抗体片段可以解决其中的一些注意事项，但是它们通常表现出较弱的结合和低稳定性，并且它们可能会暴露以前被掩盖的免疫原性表位。虽然已经描述了一些非抗体PSMA粘合剂和抑制剂并显示出有希望的结果，但是其他工程化PSMA结合肽显示出低亲和力，即在高纳摩尔至微摩尔的范围内。

NB，也称为VHH，是重链抗体(HCAb)的单链可变结构域。由于NB是HCAb中唯一介导抗原结合的片段，因此它可以与HCAb的其余部分分开表达，而不会降低亲和力，从而产生微小的(～15kDa)、非免疫原性、高度靶特异性的蛋白质，它是用作体内成像和靶向治疗应用的支架的绝佳候选者。

仍然非常需要可以特异性靶向PSMA的临床适用的NB-药物缀合物。这些化合物的结构、它们对PSMA活性和细胞活力的影响以及它们作为药物载体的潜力还有待确定。

发明内容

本发明在其一些实施方式中涉及对前列腺特异性膜抗原(PSMA)具有增加的结合亲和力的抗原结合多肽。在一些实施方式中，抗原结合多肽是单域抗体。在一些实施方式中，本发明的单域抗体包括三个互补决定区(CDR)。

根据第一方面，提供了一种抗原结合多肽，其包括选自下列的三个互补决定区(CDR)：(i)GYTDSNYYMS(CDR-H1；SEQ ID NO：1)、GVNTGRGSTSYADSVKG(CDR-H2；SEQ ID NO：2)和AACHFCDSLPKTQDEYIL(CDR-H3；SEQ ID NO：3)；(ii)GWPYSTYSMN(CDR-H1；SEQ ID NO：4)、GISSTMSGIIFAES(CDR-H2；SEQ ID NO：5)和RRDYSLSSSSDDFDY(CDR-H3；SEQ ID NO：6)；和(iii)GYTASFS(CDR-H1；SEQ ID NO：7)、GVAVINVGVGSTYYADSV(CDR-H2；SEQ ID NO：8)和SLRWSRPPNPISEDAYNY(CDR-H3；SEQ ID NO：9)。

根据另一方面，提供了一种药物组合物，其包括治疗或诊断有效量的本发明的抗原结合多肽，以及药学上可接受的载体。

根据另一方面，提供了靶向PSMA的方法，该方法包括使包括PSMA的样品与本发明的抗原结合多肽接触，从而靶向PSMA。

在一些实施方式中，CDR-H2包括如SEQ ID NO：10(GISSTMSGIIFAESKAGQFTISQDNA)中所列的氨基酸序列。

在一些实施方式中，抗原结合多肽是单域抗体。

在一些实施方式中，抗原结合多肽包括以下氨基酸序列：QVQLQESGGGSVQAGGSLRLSCTAPGYTDSNYYMSWFRQAPGKEREWVAGVNTGRGSTSYADSVKGRFTISQDNAKNTMFLQMNSLKPEDTAIYYCAVAACHFCDSLPKTQDEYILWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGS(SEQ ID NO：11)。

在一些实施方式中，抗原结合多肽包括以下氨基酸序列：QVQLQESGGGSVQAGGSLRLSCARSGWPYSTYSMNWFRQAPGKEREAVAGISSTMSGIIFAESKAGQFTISQDNAKNTVYLQMNNLKPEDTAIYYCAARRDYSLSSSSDDFDYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGS(SEQ ID NO：12)。

在一些实施方式中，抗原结合多肽包括以下氨基酸序列：QVQLQESGGGSVQTGGSLRLSCAASGYTASFSWIGYFRQAPGKEREGVAVINVGVGSTYYADSVKGRFTISRDNTENTISLEMNSLKPEDTGLYYCAGSLRWSRPPNPISEDAYNYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGS(SEQ ID NO：13)。

在一些实施方式中，抗原结合多肽包括以下氨基酸序列：QVQLQESGGGSVEAGGSLRLSCARSGWPYSTYSMNWFRQAPGKEREAVAGISSTMSGIIFAESKAGQFTISQDNAKNTVYLQMNNLKPEDTAIYYCAARRDYSLSSSSDDFDYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGS(SEQ ID NO：14)。

在一些实施方式中，抗原结合多肽对前列腺特异性膜抗原(PSMA)具有特异性结合亲和力。

在一些实施方式中，抗原结合多肽的特征在于与所述PSMA的结合常数(K_a)为至少10⁴Molar^-1sec^-1。

在一些实施方式中，抗原结合多肽的特征在于与PSMA的结合常数(K_a)为7.1×10⁵Molar^-1sec^-1。

在一些实施方式中，抗原结合多肽的特征在于与PSMA的结合常数(K_a)为2×10⁴Molar^-1sec^-1。

在一些实施方式中，抗原结合多肽的特征在于与PSMA的结合常数(K_a)为3.6×10⁴Molar^-1sec^-1。

在一些实施方式中，抗原结合多肽的特征在于与PSMA的结合常数(K_a)为2.2×10⁴Molar^-1sec^-1。

在一些实施方式中，抗原结合多肽的特征在于与PSMA的解离常数(K_D)小于15nM。

在一些实施方式中，抗原结合多肽的特征在于与PSMA的解离常数(K_D)为55pM。

在一些实施方式中，抗原结合多肽的特征在于与PSMA的解离常数(K_D)为6nM。

在一些实施方式中，抗原结合多肽的特征在于与PSMA的解离常数(K_D)为0.6nM。

在一些实施方式中，抗原结合多肽的特征在于与PSMA的解离常数(K_D)为3.4nM。

在一些实施方式中，抗原结合多肽的特征在于分子量小于25kDa。

在一些实施方式中，抗原结合多肽对所述PSMA酶的非催化位点具有特异性结合亲和力。

在一些实施方式中，抗原结合多肽进一步包括至少一种非天然存在的氨基酸。

在一些实施方式中，药物组合物进一步包括治疗或诊断有效量的至少一种选自治疗剂、诊断剂和治疗诊断剂的药剂。

在一些实施方式中，该方法用于对患有或怀疑患有PSMA相关病症的受试者中的PSMA成像，该方法包括：(a)向受试者施用有效量的本发明的抗原结合多肽和显像剂；和(b)检测受试者中的PSMA，从而使包括PSMA的细胞成像。

在一些实施方式中，该方法用于在有需要的受试者中治疗PSMA相关病症，该方法包括：向受试者施用包括有效量的本发明的抗原结合多肽、细胞毒剂或治疗诊断剂以及可接受的载体的药物组合物，从而治疗有需要的受试者中的PSMA相关病症。

在一些实施方式中，PSMA相关病症是前列腺癌。

在一些实施方式中，PSMA相关病症是选自下列的神经障碍：帕金森病、阿尔茨海默病、亨廷顿病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)、精神分裂症及其任何组合。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和/或科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管与本文所述的方法和材料相似或等效的方法和材料可以用于本发明的实施方式的实践或测试，但是下文描述了示例性方法和/或材料。在有冲突的情况下，以专利说明书(包括定义)为准。此外，这些材料、方法和实例仅是说明性的，并不意味着必然是限制性的。

从下文给出的详细描述中，本发明的其他实施方式和全部适用范围将变得显而易见。然而，应该理解的是，详细描述和具体实例虽然指示了本发明的优选实施方式，但是其仅以说明的方式给出，因为基于该详细描述，在本发明的精神和范围内的各种变化和修改对于本领域技术人员来说是显而易见的。

附图说明

在此参考附图仅通过示例的方式描述了本发明的一些实施方式。现在详细地具体参考附图，强调所示的细节是示例性的并且出于对本发明的实施方式的说明性讨论的目的。在这点上，连同附图的描述对于本领域技术人员可以如何实践本发明的实施方式来说是显而易见的。

图1A-1F包括显示纳米抗体(NB)在体外结合前列腺特异性膜抗原(PSMA)和表达PSMA的前列腺癌细胞的图。使用表面等离子体共振(SPR)和1:1Langmuir动力学模型测量的响应单位(RU)用于计算固定NB7(1A)、NB8(1B)、NB13(1C)和NB37(1D)与PSMA的亲和力(KD)。NB7传感图的PSMA浓度为25、50、100、1,600或3,200pM，并且NB8、NB13和NB37传感图的PSMA浓度为2.94、5.88、11.75、23.50或47.00nM。每幅传感图中的底部曲线代表最低浓度，而顶部曲线代表最高浓度。FACS分析(n＝3)用于确定这些NB(0.1-1,000nM)与PC3-PIP(PSMA⁺)细胞(1E)和PC3-flu(PSMA^-)细胞(1F)的结合。为方便起见，将每个荧光值归一化至在PC3-PIP细胞的最高和最低浓度下的荧光值。

图2A-2H包括显示NB及其PSMA结合表位的结构分析的图解。(2A-2C)NB7(2A,

PDB 6XXN)、NB8(2B,

PDB 6XXO)和NB37(2C,

PDB 6XXP)的晶体结构解析。CDR1、2和3分别标有星号(*)、箭头头部(▲)和箭头(↑)。(2D-2F)蛋白质复合物的结构重建，基于其SAXS分辨的低分辨率结构(灰色网格)，用仅PSMA(0.5mg/ml)(2D；PDB1Z8L)或其与0.2mg/ml NB7(2E，箭头所指；PDB 6XXN)或NB37(2F，箭头所指；PDB 6XXP)结合的晶体结构拟合。PSMA单体分别用罗马数字标记；生物二聚体由I+II和III+IV形成，而非生物二聚体由I+III和II+IV形成。(2G-2H)PSMA和NB7(2G)以及PSMA和NB37(2H)的计算对接分析。(2G)NB7被全黑线包围。关键交互(根据图20)显示为黑色虚线。(2H)NB37被全黑线包围。关键交互(图21)显示为黑色虚线。

图3A-3G包括显示标记的NB的体内全身NIR成像的显微照片和图。将PC3-flu(PSMA^-)和PC3-PIP(PSMA⁺)PCa细胞作为异种移植物分别共同注射到无胸腺裸鼠的左右上腹。在9天后，给小鼠静脉注射荧光标记的NB(从左到右：NB7、NB13、NB8和NB37；为方便起见，在括号中显示了每个NB的K_D)，并在注射后3小时(3A)和6小时(3B)后以及当不可再检测到信号时(3C)(NB8和NB13为32小时，并且NB37为24小时)拍摄全身图像；注射NB7的小鼠在注射后56小时仍显示荧光信号，此时它们被成像，并且然后被安乐死。在每个单独的图像中，左侧小鼠注射了肿瘤细胞但未注射NB，中间小鼠注射了NB但未注射肿瘤细胞，和右侧小鼠注射了肿瘤细胞和NB。(3D-3G)在NB7(3D)、NB8(3E)、NB13(3F)和NB37(3G)的每个时间点解剖器官的AF₆₈₀荧光信号的定量。PC3-PIP肿瘤表达PSMA，而PC3-flu肿瘤不表达。

图4A-4I包括显示NB内化到前列腺癌细胞中的共焦成像的荧光显微照片。PC3-PIP(PSMA⁺)细胞(4A-4D)和PC3-flu(PSMA^-)细胞(4E-4H)与Hoechst试剂(细胞核染色)、PE抗PSMA抗体和100nM的NB7(4A、4E)、NB8(4B、4F)、NB13(4C、4G)或NB37(4D、4H)(每个都用Dylight 488标记)一起温育10min。可选地，将PC3-PIP细胞与不含任何NB(4I)的PE-抗PSMA抗体温育10min。比例尺＝10μm。

图5A-5H包括显示NB7cys、DOX和NB7cysDOX缀合物内化到PCa细胞中的共焦成像的荧光显微照片。将PC3-PIP(PSMA⁺；5A-5D)和PC3-flu(PSMA^-；5E-5H)细胞与DOX(自发荧光；5B、5F)、用Dylight 650标记的NB7cys(5C、5G)或用Dylight 650标记的NB7cysDOX(5D、5H)一起温育。在温育15分钟后对未经处理的对照细胞(5A、5E)拍摄图像。NB7和DOX的非重叠共定位表明DOX从NB7cysDOX缀合物中裂解。发现一些DOX分子与NB7cys分开(箭头)，而其他分子与NB7cys共定位(箭头)。比例尺＝10μm。

图6A-6D包括显示NB7cysDOX对PC3-PIP(PSMA⁺)肿瘤的体内和原位作用的图和显微照片。用生理盐水(对照)、2mg/kg商业DOX或1.4mg/kg NB7cysDOX处理无胸腺裸鼠中的PC3-PIP异种移植物。(6A)治疗8天后的平均肿瘤体积(在出于伦理考虑将任何小鼠排除在实验之外之前)。相对于对照，*p<0.05(学生t检验；对照n＝7，并且DOX和NB7cysDOX为n＝8)。(6B)治疗组与对照组(T/C)中计算的对数肿瘤生长斜率。相对于对照，*p<0.05(学生t检验；对照n＝7，DOX为n＝4，和NB7cysDOX为n＝8；(6C)在治疗终止后4天，由用NB7cysDOX处理并用PE-anti-PSMA和FITC-anti-His标记以分别识别PSMA和NB7并且细胞核也被染色(Hoechst)的一只小鼠获得的肿瘤的代表性组织切片。白色箭头指向PSMA和NB7的共定位。(6D)在治疗终止后4天获得的苏木精和伊红(H&E)染色(上排)和末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记(TUNEL)和碘化丙啶(PI)染色(下排)的肿瘤组织切片。白色箭头表示TUNEL和PI的共定位。比例尺适用于同一行中的所有三个图像。

图7A-7C包括显示NB选择和纯化的图和显微照片。(7A)酶联免疫吸附试验(ELISA)结果证明了表达不同NB序列的单个细菌菌落与PSMA的结合。选择用于纯化的序列：NB7(克隆7、9、22、28、31-33和46)、NB8(克隆8和21)、NB13(克隆13和18)和NB37(克隆37)。(7B)NB7的代表性尺寸排除色谱图(NB8、NB13和NB37的色谱图与此处显示的相似)。(7C)SDS-PAGE凝胶结果显示四个纯化的NB。所有蛋白质的预期大小为～16kDa。

图8包括显示PSMA活性测定的垂直条形图。在存在或不存在NB的情况下，将PSMA与底物一起温育以测量谷氨酸羧肽酶活性。失活(变性)PSMA和商业PSMA抑制剂(PMPA)作为对照。将结果与未经处理的PSMA的荧光进行比较和归一化。实验一式三份进行，并且结果以平均值±SEM表示。***p<0.005(学生t检验，n＝3)。

图9A-9B包括小角X射线散射(SAXS)分析和单体PSMA的Rg。(9A)PBS中的PSMA(0.5-3mg/ml)的SAXS分析。(9B)由于溶液中物质之间的相互作用，游离PSMA的回转半径(Rg)值随着浓度的增加而略有增加。使用Guinier图确定的Rg值在0.5mg/ml时为

和在3mg/ml时为

两幅图中的颜色都反映了PSMA浓度(更深＝更高)。

图10A-10D包括显示SAXS曲线和PSMA的对应Guinier图随着NB浓度增加的图。PSMA(0.5mg/ml)与范围从0.1mg/ml到0.5mg/ml(这代表PSMA：NB摩尔比从1：0.5到1：5)的浓度递增的NB(10A：NB7，10B：NB8，10C：NB13和10D：NB37)预混合。颜色反映NB浓度(更深＝更高)。

图11包括显示NB对PSMA的Rg的影响的图。SAXS结果显示PSMA(0.5mg/ml)在NB(0.05-0.58mg/ml)浓度递增时的Rg值。虚线表示不含NB的PSMA的Rg。

图12A-12E包括显示SAXS数据的定制脚本(custom-made script)分析结果的图。分析是使用基于脚本和计算机程序GNOM的自动化程序完成的。“总评价(Total estimate)”分数用于选择最佳结果。PSMA(12A)、PSMA+NB7(12B)、PSMA+NB8(12C)、PSMA+NB13(12D)和PSMA+NB37(12E)。

图13包括显示PSMA和NB在1：2摩尔比下的距离分布函数P(r)的图。P(r)是使用程序GNOM确定的。

图14A-14D包括显示前列腺癌异种移植物的离体光学成像的显微照片。在注射了NB7(14A)、NB13(14B)、NB8(14C)或NB37(14D)的小鼠的各种解剖器官中的三个时间点显示了离体信号(数据显示在图3中)。强度条显示在NB13的图像下方，并适用于所有图像。

图15包括显示NB内化到PC3-PIP细胞中的图。PC3-PIP细胞在96孔板中与NB7、NB8、NB13或NB37一起温育1小时。然后，使用Operetta对孔进行成像，并且每40分钟计数一次细胞膜上或细胞质内具有NB的细胞数，以便在温育后1小时和40分钟完成第一轮成像。内化过程反映在其细胞质中具有NB的细胞数量相对于其膜中具有NB的细胞数量(“细胞质/膜比”)，使得较高的比表明更多的NB被内化到细胞质中。

图16A-16D包括显示NB7cys与DOX缀合的过程的图示和图。(16A)缀合过程。(16B)NB7cysDOX的尺寸排阻色谱法，使用Superdex 75 10/300分析。“1”和“2”分别表示280nm和488nm的吸光度。(16C)NB7cys(1)和NB7cysDOX(2)的质谱法，使用基质辅助激光解吸/电离飞行时间(MALDI-TOF)分析。(16D)NB7cys和NB7cysDOX在指定浓度下与PC3-PIP细胞的流式细胞术结合。实验一式三份进行，并将结果表示为平均值±SEM。学生t检验表明，在任何检查浓度下，NB7和NB7cysDOX之间没有显著差异。

图17包括显示DOX-BMPH接头的¹H-核磁共振(NMR)光谱的图。

图18A-18C包括显示NB7cysDOX对细胞活力的影响的图。(18A)在用NB7cys、DOX或NB7cysDOX处理24小时后计算PC3-PIP细胞的数量。实验一式三份进行，并将结果以平均值±SEM表示。*p<0.05，**p<0.01(学生t检验，与未经处理的细胞相比)。(18B)用NB7(1)、DOX(2)或NB7cysDOX(3)处理或未处理(4，部分被“1”直方图掩盖(mask))然后与PI一起温育的PC3-PIP细胞的FACS分析。(18C)将PC3-PIP细胞用NB7、DOX、NB7cysDOX或FCCP处理，或不处理，并且然后与TMRE一起温育，(“无TMRE”)作为阴性对照，并通过使用读板器测量TMRE的荧光信号。未处理样品的荧光设为1，并且所有其他样品均归一化并与其进行比较。实验一式三份进行，结果以平均值±SEM表示。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.005(学生t检验)。

图19A-19B包括显示NB7cysDOX的体内肿瘤生长抑制的图。用盐水(对照)、DOX(2mg/kg)或NB7cysDOX(1.4mg/kg)处理无胸腺裸鼠中的PC3-PIP异种移植物。(19A)在治疗期间每周两次测量肿瘤体积。出于伦理考虑，一些小鼠在试验期间被安乐死，并使用基于对数肿瘤生长的方程估计它们的肿瘤大小(参见材料和方法部分)。曲线的实线部分表示所有动物都包括在分析中的时间点，而虚线部分表示对数外推数据。(19B)在每个时间点被包括在实验中的小鼠的百分比。“1”：对照(n＝7只小鼠)，“2”：DOX(n＝8只小鼠)，“3”：NB7cysDOX(n＝8只小鼠)。

图20包括显示NB7和PSMA之间的预测相互作用的表格(A：PSMA的单体A；B：PSMA的单体B)。CDR1显示与单体B在NB的天冬氨酸29和PSMA的赖氨酸223之间的静电相互作用。CDR2显示与单体A在NB的天冬氨酸62和PSMA的赖氨酸718之间的静电相互作用。CDR3显示了与单体B的两种静电相互作用：一种在NB的谷氨酸113和PSMA的精氨酸281之间，和另一种在NB的赖氨酸109和PSMA的谷氨酸285之间。

图21包括显示NB37和PSMA之间的预测相互作用的表格。CDR显示谷氨酸62与PSMA的两个精氨酸残基(精氨酸363和精氨酸411)之间的静电相互作用。另一种静电相互作用发生在精氨酸19(一种非CDR残基)和PMSA的天冬氨酸654之间。

图22A-22F包括显示将非天然氨基酸合并到NB7中的显微照片、图示和图。(22A)显示将非天然氨基酸BOC赖氨酸合并到NB7(A14、A40、G42、K43和A75)的不同位置的蛋白质印迹分析。(22B)显示将非天然氨基酸BOC赖氨酸合并NB7-Cys(K43和A75)的不同位置的蛋白质印迹分析。(22C)显示PSMA和NB7 cys(+阿霉素)、NB7 K43prop(+Cy5.5)或NB7 cysK43prop(+阿霉素和Cy5.5)之间的结合相互作用的非限制性方案的图示。(22D)是显示尺寸排阻色谱法的图。给出了NB7(1)、NB7cys(2)和NB7 K43prop(3)的280nm吸光度。(22E)NB7(1)、NB7cys(2)和NB7 K43prop(3)的质谱法，使用MALDI-TOF分析。(22F)显示NB7和NB7K43PrK与PC3-PIP细胞结合的垂直条形图，如使用FACS分析确定的。结果显示K43PrK突变后结合没有显著变化。

具体实施方式

在一些实施方式中，本发明涉及对前列腺特异性膜抗原(PSMA)具有增加的结合亲和力的抗原结合多肽。在一些实施方式中，抗原结合多肽是单域抗体。

在详细解释本发明的至少一个实施方式之前，应当理解，本发明的应用不一定限于以下描述中阐述的或通过实施方式举例说明的细节。本发明能够具有其他实施方式或能够以各种方式实践或执行。

如本文所使用的，术语“前列腺特异性膜抗原(prostate specific membraneantigen)”或PSMA是指谷氨酸羧肽酶II，也称为N-乙酰基-L-天冬氨酰-L-谷氨酸肽酶I(NAALADase I或NAAG肽酶)。作为非限制性示例，人PSMA具有UniProt登录号Q04609。

术语“抗体”和“抗原结合多肽”(也称为“免疫球蛋白”或“Ig”)是指包含至少一个对一种抗原特异的结合结构域的多肽或多肽组。在某些实施方式中，本发明还包括嵌合抗体或人源化抗体的使用。

在一些实施方式中，术语“抗体片段”是指完整抗体的一部分，优选地包括其抗原结合区。

术语“单域抗体”是指由单个可变域(V_HH)组成的抗体片段。单域抗体是同样可以结合特定抗原的抗体的较小功能片段。在一些实施方式中，单域抗体比常规抗体具有更好的组织穿透性，并且因此它们有利于临床/诊断用途。

在一些实施方式中，本发明的单域抗体包括三个互补决定区(CDR)。

在一些实施方式中，术语“互补决定区”是指可变重链。在一些实施方式中，可变重链包括能够结合特定PSMA的氨基酸序列。

Kabat等人定义了适用于任何抗体的可变域序列的编号系统。本领域普通技术人员可以明确地将这种“Kabat编号”系统分配给任何可变域序列，而不依赖于序列本身之外的任何实验数据。如本文所使用的，“Kabat编号”是指Kabat等人，U.S.Dept.of Health andHuman Services，“Sequence of Proteins of Immunological Interest”(1983)提出的编号系统。

在一些实施方式中，抗原结合多肽包括三个CDR，其包括：GYTDSNYYMS(CDR-H1；SEQID NO：1)、GVNTGRGSTSYADSVKG(CDR-H2；SEQ ID NO：2)和AACHFCDSLPKTQDEYIL(CDR-H3；SEQID NO：3)。

在一些实施方式中，抗原结合多肽包括三个CDR，其包括：GWPYSTYSMN(CDR-H1；SEQID NO：4)、GISSTMSGIIFAES(CDR-H2；SEQ ID NO：5)和RRDYSLSSSSDDFDY(CDR-H3；SEQ IDNO：6)。

在一些实施方式中，抗原结合多肽包括三个CDR，其包括：GYTASFS(CDR-H1；SEQ IDNO：7)、GVAVINVGVGSTYYADSV(CDR-H2；SEQ ID NO：8)和SLRWSRPPNPISEDAYNY(CDR-H3；SEQID NO：9)。

在一些实施方式中，抗原结合多肽包括三个CDR，其包括：GWPYSTYSMN(CDR-H1；SEQID NO：4)、GISSTMSGIIFAESKAGQFTISQDNA(CDR-H2；SEQ ID NO：10)和RRDYSLSSSSDDFDY(CDR-H3；SEQ ID NO：6)。

在一些实施方式中，抗原结合多肽包括以下氨基酸序列：QVQLQESGGGSVQX₁GGSLRLSCTAPGYTDSNYYMSWFRQX₂PX₃X₄EREWVAGVNTGRGSTSYADSVKGRFTISQDNX₅KNTMFLQMNSLKPEDTAIYYCAVAACHFCDSLPKTQDEYILWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGS(SEQ ID NO：15)，其中：X₁选自丙氨酸或人工或非天然存在的氨基酸，X₂选自丙氨酸或人工或非天然存在的氨基酸，X₃选自甘氨酸或人工或非天然存在的氨基酸，X₄选自赖氨酸或人工或非天然存在的氨基酸，和X₅选自丙氨酸或人工或非天然存在的氨基酸。在一些实施方式中，人工或非天然存在的氨基酸包括氨基酸BOC-赖氨酸或由其组成。

在一些实施方式中，抗原结合多肽包括以下氨基酸序列：QVQLQESGGGSVQX₁GGSLRLSCARSGWPYSTYSMNWFRQX₂PX₃X₄EREAVAGISSTMSGIIFAESKAGQFTISQDNX₅KNTVYLQMNNLKPEDTAIYYCAARRDYSLSSSSDDFDYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGS(SEQ ID NO：16)，其中：X₁选自丙氨酸或人工或非天然存在的氨基酸，X₂选自丙氨酸或人工或非天然存在的氨基酸，X₃选自甘氨酸或人工或非天然存在的氨基酸，X₄选自赖氨酸或人工或非天然存在的氨基酸，和X₅选自丙氨酸或人工或非天然存在的氨基酸。在一些实施方式中，人工或非天然存在的氨基酸包括氨基酸BOC-赖氨酸或由其组成。

在一些实施方式中，抗原结合多肽包括以下氨基酸序列：QVQLQESGGGSVQTGGSLRLSCAASGYTASFSWIGYFRQX₁PX₂X₃EREGVAVINVGVGSTYYADSVKGRFTISRDNTENTISLEMNSLKPEDTGLYYCAGSLRWSRPPNPISEDAYNYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGS(SEQ ID NO：17)，其中：X₁选自丙氨酸或人工或非天然存在的氨基酸，X₂选自甘氨酸或人工或非天然存在的氨基酸，和X₃选自赖氨酸或人工或非天然存在的氨基酸。在一些实施方式中，人工或非天然存在的氨基酸包括氨基酸BOC-赖氨酸或由其组成。

在一些实施方式中，抗原结合多肽包括以下氨基酸序列：QVQLQESGGGSVEX₁GGSLRLSCARSGWPYSTYSMNWFRQX₂PX₃X₄EREAVAGISSTMSGIIFAESKAGQFTISQDNX₅KNTVYLQMNNLKPEDTAIYYCAARRDYSLSSSSDDFDYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGS(SEQ ID NO：18)，其中：X₁选自丙氨酸或人工或非天然存在的氨基酸，X₂选自丙氨酸或人工或非天然存在的氨基酸，X₃选自甘氨酸或人工或非天然存在的氨基酸，X₄选自赖氨酸或人工或非天然存在的氨基酸，和X₅选自丙氨酸或人工或非天然存在的氨基酸。在一些实施方式中，人工或非天然存在的氨基酸包括氨基酸BOC-赖氨酸或由其组成。

在一些实施方式中，抗原结合多肽对PSMA具有特异性结合亲和力。

如本文所使用的，术语“特异性结合(specific binding)”是指两个实体的第一和第二部分的非共价物理缔合(association)。在一些实施方式中，第一和第二部分之间的缔合强度是发生缔合的环境中存在的其他部分的缔合强度的至少10倍、至少50倍或至少100倍。

在一些实施方式中，如果平衡“解离常数”K_D小于10^-3M、小于10^-4M、小于10^-5M、小于10^-6M、小于10^-7M、小于10^-8M、小于10^-9M、小于10^-10M、小于10^-11M或小于10^-12M，或其间的任何值和范围，则可以认为两个或更多个实体的结合是特异性的。每种可能性代表本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，如果平衡“解离常数”K_D为10^-10M-10^-3M、10^-12M-10^-4M，则可以认为两个或更多个实体的结合是特异性的。每种可能性代表本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，特异性结合可以通过多个较弱的相互作用来完成。肽解离常数(K_D)的计算是本领域技术人员已知的并且也显示在下文的实施例部分中。

在一些实施方式中，术语“结合常数”或“缔合常数”是指平衡常数K_a的特殊情况，其是解离常数的倒数。

在一些实施方式中，抗原结合多肽的特征在于与PSMA的结合常数(K_a)为至少10³、至少10×10³、至少10⁴、至少2×10⁴、至少10⁵或至少5×10⁵Molar^-1sec-¹(M^-1s^-1)，或其间的任何值和范围。每种可能性代表本发明的单独实施方式。

在非限制性示例性实施方式中，包括如SEQ ID NO：11中所列的氨基酸序列的抗原结合多肽的特征在于与PSMA的结合常数(K_a)为约7.1×10⁵M^-1s^-1。

在非限制性示例性实施方式中，包括如SEQ ID NO：12中所列的氨基酸序列的抗原结合多肽的特征在于与PSMA的结合常数(K_a)为约2×10⁴M^-1s^-1。

在非限制性示例性实施方式中，包括如SEQ ID NO：13中所列的氨基酸序列的抗原结合多肽的特征在于与PSMA的结合常数(K_a)为约3.6×10⁴M^-1s^-1。

在非限制性示例性实施方式中，包括如SEQ ID NO：14中所列的氨基酸序列的抗原结合多肽的特征在于与PSMA的结合常数(K_a)为约2.2×10⁴M^-1s^-1。

在一些实施方式中，抗原结合多肽的特征在于与PSMA的解离常数(K_D)小于10pM、小于50pM、小于500pM、小于15nM、小于50nM或小于500nM，或其间的任何值和范围。每种可能性代表本发明的单独实施方式。

在非限制性示例性实施方式中，包括如SEQ ID NO：11中所列的氨基酸序列的抗原结合多肽的特征在于与PSMA的解离常数(K_D)为约55pM。

在非限制性示例性实施方式中，包括如SEQ ID NO：12中所列的氨基酸序列的抗原结合多肽的特征在于与PSMA的解离常数(K_D)为约6nM(如下文在实施例部分所述的)。

在非限制性示例性实施方式中，包括如SEQ ID NO：13中所列的氨基酸序列的抗原结合多肽的特征在于与PSMA的解离常数(K_D)为约0.6nM。

在非限制性示例性实施方式中，包括如SEQ ID NO：14中所列的氨基酸序列的抗原结合多肽的特征在于与PSMA的解离常数(K_D)为约3.4nM。

在一些实施方式中，多肽与PSMA的非催化位点结合。在一个实施方式中，该多肽与PSMA的细胞外结构域结合。

如本文所使用的，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用以指代氨基酸残基的聚合物。在另一个实施方式中，本文使用的术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”涵盖天然肽、肽模拟物(通常包括非肽键或其他合成修饰)和肽类似物类肽和半类肽或其任何组合。

在一些实施方式中，与PSMA结合的多肽的特征在于允许与PSMA进一步相互作用。在一些实施方式中，与PSMA结合的多肽的特征在于保留PSMA酶活性。确定PSMA活性的方法在本领域中是已知的，并且在下文中也作为非限制性实例举例说明。

在一些实施方式中，抗原结合多肽的特征在于分子量小于15kDa、小于20kDa、小于25kDa、小于35kDa或小于50kDa，或其间的任何值和范围。每种可能性代表本发明的单独实施方式。

在一些实施方式中，抗原结合多肽的特征在于热稳定性(T_m)为至少60℃、至少70℃、至少90℃或至少95℃，或其间的任何值和范围。每种可能性代表本发明的单独实施方式。

如本文所使用的，术语“热稳定性(thermal stability)”是指物质在高温下抵抗其化学或物理结构的不可逆变化。在一些实施方式中，T_m表示引起蛋白质或肽变性/展开的热能。

在一些实施方式中，抗原结合多肽的N端或C端包含标签基序。在一些实施方式中，标签基序包含至少六个氨基酸。在一些实施方式中，抗原结合多肽包含组氨酸(His)-标签。在一些实施方式中，抗原结合多肽包含人流感血凝素(HA)-标签。

根据另一个实施方式，本发明的多肽包括SEQ ID NO：1-14中任一个的截短形式和/或片段，只要它们能够结合PSMA。

本领域技术人员已知的氨基酸的保守取代在本发明的范围内。保守氨基酸取代包括用具有相同类型的官能团或侧链(例如脂肪族、芳香族、带正电、带负电)的另一种氨基酸取代一种氨基酸。本领域技术人员将认识到，改变、添加或缺失编码序列中单个氨基酸或小百分比氨基酸的肽、多肽或蛋白质序列的个别取代、缺失或添加是“保守修饰的变体”，其中改变导致氨基酸被化学上相似的氨基酸取代。提供功能相似的氨基酸的保守置换表是本领域众所周知的。

以下六组各含有彼此保守取代的氨基酸：1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、缬氨酸(V)；和6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)(参见，例如，Creighton,Proteins,1984)。

术语“保守取代”还包括使用化学衍生的残基代替非衍生的残基，条件是这种肽表现出如本文所述的调节免疫系统先天反应的必要功能。

在一些实施方式中，本发明的多肽包含非天然存在的氨基酸。

将非天然存在的氨基酸整合到多肽中的方法是常见的并且对于本领域普通技术人员来说是显而易见的。

在一些实施方式中，本发明设想任何非天然存在的氨基酸，只要所得的包含非天然存在的氨基酸的多肽保持其活性，例如与PSMA结合的高亲和力，或如本文所公开的任何其他活性。

在一些实施方式中，非天然存在的氨基酸选自：3-碘代-L-酪氨酸、N^ε-苄氧羰基赖氨酸(ZLys)、N^ε-乙酰基赖氨酸(AcLys)、N^ε-环戊氧羰基-L-赖氨酸(Cyc)、N^ε-(((1R,2R)-2-叠氮环戊氧基)羰基)-L-赖氨酸(ACPK)、邻硝基苄基-邻酪氨酸、邻硝基苄氧羰基-N^ε-赖氨酸、N^ε-[(1-(6-硝基苯并[d][1,3]间二氧杂环戊烯-5-基)乙氧基)羰基]-L-赖氨酸、N^ε-[(2-(3-甲基-3H二氮丙啶-3-基)乙氧基)羰基]-赖氨酸、(3-(3-甲基-3H二氮丙啶-3-基)-丙氨基羰基N^ε-L-赖氨酸(DiZPK)、BCN(外异构体)、BCN(内异构体)、TCO、N^ε-(1-甲基环丙-2-烯甲酰胺)赖氨酸(CpK)、N^ε-丙烯酰基-L-赖氨酸、pNO₂ZLys、TmdZLys、N^ε-巴豆酰基-L-赖氨酸(Kcr)、2-氯-L-苯丙氨酸、2-溴代-L-苯丙氨酸、2-碘代-L-苯丙氨酸、2-甲基-L-苯丙氨酸、2-甲氧基-L-苯丙氨酸、2-硝基-L-苯丙氨酸、2-氰基-L-苯丙氨酸和N^ε-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸(BOC-赖氨酸)。

在一些实施方式中，非天然存在的氨基酸包括BOC-赖氨酸或由其组成。

治疗和诊断方法

在另一个实施方式中，本发明提供了一种靶向PSMA的方法，该方法通过使包括PSMA的样品与本发明的抗原结合多肽接触，从而靶向PSMA。

在一个实施方式中，本发明提供了一种用于治疗、诊断、预测或确定对患有PSMA相关病症的受试者的治疗适用性的方法，该方法包括向受试者施用包括有效量的本发明的抗原结合多肽、细胞毒剂或治疗诊断剂以及药学可接受的载体的药物组合物，从而治疗诊断、预测或确定在所述受试者中患有PSMA相关病症的受试者的治疗适用性。

在一个实施方式中，提供了一种用于对受试者，例如患有或怀疑患有PSMA相关病症的受试者中的PSMA成像的方法，该方法包括向受试者施用包括有效量的本发明的抗原结合多肽和显像剂；和检测受试者中的PSMA，从而对受试者中的PSMA成像。

在一些实施方式中，显像剂选自但不限于荧光标记(例如，异硫氰酸荧光素)、生色团(chromophore)、放射性标记、顺磁离子(例如，Gd⁺³)及其任何组合。

在一些实施方式中，术语“生色团”是指吸收从UV到近红外区域的特定波长的光并且可以是或可以不是发射性的材料。

在一个实施方式中，显像剂为放射性标记(例如，同位素)。在另一个实施方式中，治疗剂是放射性标记(例如，同位素)。在一些实施方式中，同位素选自但不限于：¹⁸F、⁴⁷Sc、⁵¹Cr、⁵²Fe、^52mMn、⁵⁶Ni、⁵⁷Ni、⁶²Cu、⁶⁴Cu、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、⁷²As、⁷⁵Br、⁷⁶Br、⁷⁷Br、⁸²Br、⁸⁹Zr、^94mTc、⁹⁷Ru、^99mTc、¹¹¹In、¹²³I、¹²⁴I、¹³¹I、¹⁹¹Pt、¹⁹⁷Hg、²⁰¹Tl、²⁰³Pb、^110mIn、¹²⁰I、¹¹C、¹⁸F和¹³N。

在一些实施方式中，成像技术选自但不限于计算机X射线断层扫描(CT)、超声(US)和磁共振成像(MRI)、正电子发射断层扫描(PET)、单光子发射计算机断层扫描(SPECT)、荧光和放射分析、细胞荧光测定和荧光激活细胞分选。这种技术的原理可以在免疫化学手册，例如：A Johnstone and R.Thorpe,Immunochemistry in practice，第2版(1987)，blackwell Scientific publications,Oxford London Edinburgh Boston Palo AltoMelbourne中找到。

非限制性示例性实施方式证明在施用与荧光标记缀合的抗原结合多肽24小时后通过近红外(NIR)成像在体内诊断前列腺肿瘤。

在一个实施方式中，该方法进一步包括通过施用抗原结合多肽确定PSMA亚群的相对百分比。

在一些实施方式中，本发明的抗原结合多肽可以与其他治疗性治疗方式结合使用，包括手术、冷冻手术、放射、热疗、激素治疗、化学疗法、免疫疗法、疫苗及其任何组合。

在一些实施方式中，治疗剂可以包括能够预防、抑制或阻止疾病的症状和/或进展的任何试剂(例如，分子、药物、药物组合物等)。

在一些实施方式中，治疗剂选自但不限于：化疗剂(例如甲氨蝶呤、顺铂和紫杉醇)、抗癌剂、抗血管生成剂、肿瘤抑制剂、抗微生物剂，或包含编码治疗性蛋白质的核酸的表达构建体。

在一些实施方式中，PSMA相关病症是前列腺癌。

在一些实施方式中，PSMA相关病症是神经障碍。在一些实施方式中，神经障碍选自但不限于：帕金森病、阿尔茨海默病、亨廷顿病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)和精神分裂症。

药物组合物

本发明还考虑用于人类医疗用途的药物组合物，该组合物包含至少一种如本文所述的抗原结合多肽。

本发明还考虑如本文所述的抗原结合多肽在制备用于治疗、诊断、治疗诊断或预防癌症或神经障碍的药物组合物中的用途。

在一些实施方式中，药物组合物包括治疗或诊断有效量的本文所述的抗原结合多肽，以及任选任一种附加治疗成分(一种或多种)、显像剂(一种或多种)及其组合，以及一种或多种药学上可接受的载体。

本发明的药物组合物可以配制成本发明的多肽或其类似物的药学上可接受的盐的形式。药学上可接受的盐包括那些与游离氨基形成的盐，比如衍生自无毒无机酸或有机酸比如盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的盐，以及那些与游离羧基形成的盐，例如衍生自无毒无机或有机碱比如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的盐。在一个实施方式中，本发明的药物组合物通过本领域众所周知的方法，例如通过常规的混合、溶解、制粒、制丸(dragee-making)、研磨、乳化、包封、包埋或冻干方法来制造。

术语“类似物(analog)”包括具有与本文具体显示的序列之一基本相同的氨基酸序列的任何肽，其中一个或多个残基已被功能相似的残基保守取代并且显示出如本文所述的能力。保守取代的实例包括将一个非极性(疏水)残基(比如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或蛋氨酸)替代为另一个、将一个极性(亲水)残基替代为另一个(例如，精氨酸和赖氨酸之间、谷氨酰胺和天冬酰胺之间、甘氨酸和丝氨酸之间)、将一个碱性残基比如赖氨酸、精氨酸或组氨酸替代为另一个、或者将一个酸性残基比如天冬氨酸或谷氨酸替代为另一个。每种可能性代表本发明的单独实施方式。

术语“药学上可接受的”是指适合施用于受试者，例如人。例如，术语“药学上可接受的”可以意指由联邦或州政府的监管机构批准或在美国药典或其他公认的药典中列出可用于动物，更具体地可用于人类。术语“载体(carrier)”是指与治疗化合物一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。这种药物载体可以是无菌液体，比如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的油，比如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等，聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂。当药物组合物静脉内施用时，水是优选的载体。盐水溶液和右旋糖和甘油水溶液也可以用作液体载体，特别是用于可注射溶液。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等。如果需要，该组合物还可包含少量润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂，例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐。抗菌剂，例如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，比如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；并且还设想了用于调节张力的试剂，比如氯化钠或葡萄糖。载体可占本文所述的药物组合物的总重量的约0.1％至约99.99999％。

组合物可以采取溶液、混悬剂、乳膏剂、片剂、丸剂、胶囊剂、散剂、凝胶剂、乳膏剂、软膏剂、泡沫剂、糊剂、缓释制剂等形式。该组合物可以与传统的粘合剂和载体比如甘油三酯、微晶纤维素、黄蓍胶或明胶一起配制成栓剂。口服制剂可以包括标准载体，例如药用级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。在EW Martin的Remington'sPharmaceutical Sciences中描述了合适的药用载体的实例，在此其内容通过引用并入本文。这种组合物将会包含治疗有效量的本发明的活性剂和抗原结合多肽，优选地为基本上纯化的形式，以及合适量的载体以提供向受试者适当施用的形式。

本发明的一个实施方式涉及以单位剂型存在的抗原结合多肽并且通过药学领域中众所周知的任何方法制备。在本发明的一个实施方式中，单位剂型是片剂、胶囊、锭剂、薄片、贴剂、安瓿、小瓶或预填充注射器的形式。此外，可以任选地使用体外测定来帮助确定最佳剂量范围。制剂中使用的精确剂量还取决于施用途径和疾病或病症的性质，并且应根据从业者的判断和每个患者的情况来决定。有效剂量可以从源自体外或体内动物模型试验生物测定或系统的剂量反应曲线推断。

取决于感兴趣的组织的位置，本发明的抗原结合多肽可以以适合将抗原结合多肽提供给感兴趣的组织内的细胞的任何方式提供。因此，例如，可以将包含抗原结合多肽的组合物引入例如体循环中，这会将抗原结合多肽分布到感兴趣的组织。可选地，可以将组合物局部施用于感兴趣的组织(例如，以连续输注注射或泵送，或在组织内推注，施用于皮肤的全部或部分表面等)。

在本发明的一个实施方式中，抗原结合多肽经由口服、直肠、阴道、局部、鼻腔、眼、经皮、皮下、肌内、腹膜内或静脉内施用途径来施用。药物组合物的施用途径将取决于待治疗的疾病或病症。合适的施用途径包括但不限于肠胃外注射，例如皮内、静脉内、肌内、病灶内、皮下、鞘内和本领域已知的任何其他注射方式。尽管通过其他途径施用的抗原结合多肽的生物利用度可能低于通过肠胃外注射施用时的生物利用度，但通过使用合适的制剂，设想可以通过透皮、口服、直肠、阴道、局部、鼻腔、吸入和眼部治疗模式。此外，可能希望通过任何合适的途径引入本发明的药物组合物，包括心室内和鞘内注射；心室内的注射可以通过与例如储库连接的心室内的导管来促进。

对于局部应用，本发明的抗原结合多肽或其类似物可以与药学上可接受的载体、显像剂和一种或多种治疗剂组合，从而基于期望的活性递送有效的剂量。载体可以是例如但不限于软膏、乳膏、凝胶、糊剂、泡沫、气溶胶、栓剂、垫或凝胶棒的形式。

对于口服应用，药物组合物可以是片剂或胶囊剂的形式，其可以包含以下任何成分，或类似性质的化合物：粘合剂，比如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂，比如淀粉或乳糖；崩解剂，比如海藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂比如硬脂酸镁；或助流剂，如胶体二氧化硅。当剂量单位形式是胶囊剂时，除了上述类型的材料之外，它还可以含有液体载体，比如脂肪油。此外，剂量单位形式可以包含改变剂量单位物理形式的各种其他材料，例如糖、虫胶或其他肠溶剂的包衣。本发明的片剂可以进一步被膜包衣。

对于肠胃外施用的目的，可以使用芝麻油或花生油或丙二醇水溶液，以及相应水溶性盐的无菌水溶液。如果需要，可以适当地缓冲这种水溶液，并且首先用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等张。这些水溶液特别适用于静脉内、肌内、皮下和腹膜内注射目的。

本发明的组合物通常以药物组合物的形式施用，该药物组合物包括本发明的抗原结合多肽以及药学上可接受的载体或稀释剂。因此，本发明的组合物可以以任何常规的口服、非肠道或透皮剂型单独或一起施用。

根据本发明的实施方式的药物组合物可以含有0.1％-95％的本发明的抗原结合多肽(一种或多种)和优选地1％-70％的活性剂/显像剂(一种或多种)。在任何情况下，待施用的组合物或制剂可以含有一定量的根据本发明的实施方式的抗原结合多肽和活性剂和/或显像剂，其量可有效治疗或诊断所施用的受试者的病症或疾病。

所述组合物还包括防腐剂，例如苯扎氯铵和硫柳汞等；螯合剂，比如EDTA钠等；缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和乙酸盐；张度剂，例如氯化钠、氯化钾、甘油、甘露醇等；抗氧化剂，比如抗坏血酸、乙酰胱氨酸、焦亚硫酸钠等；芳香剂；粘度调节剂，比如聚合物，包括纤维素及其衍生物；和聚乙烯醇以及酸和碱，以根据需要调节这些水性组合物的pH值。该组合物还可以包括局部麻醉剂或其他活性物质。

此外，组合物还可包含粘合剂(例如阿拉伯胶、玉米淀粉、明胶、卡波姆、乙基纤维素、瓜尔豆胶、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚维酮)、崩解剂(例如玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸、二氧化硅、交联羧甲基纤维素钠、交联聚维酮、瓜尔豆胶、羧甲基淀粉钠)、各种pH和离子强度的缓冲剂(例如，Tris-HCl、乙酸盐、磷酸盐)、添加剂(比如白蛋白或明胶以防止表面吸收)、洗涤剂(例如，Tween 20、Tween 80、Pluronic F68、胆汁酸盐)、蛋白酶抑制剂、表面活性剂(例如十二烷基硫酸钠)、渗透促进剂、增溶剂(例如，甘油、聚乙烯甘油)、抗氧化剂(例如，抗坏血酸、焦亚硫酸钠、丁基羟基茴香醚(butylated hydroxyanisole))、稳定剂(例如羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素)、增粘剂(如卡波姆、胶体二氧化硅、乙基纤维素、瓜尔豆胶)、甜味剂(例如阿斯巴甜、柠檬酸)、防腐剂(例如，硫柳汞、苯甲醇、对羟基苯甲酸酯)、润滑剂(例如，硬脂酸、硬脂酸镁、聚乙二醇、十二烷基硫酸钠)、助流剂(例如胶体二氧化硅)、增塑剂(例如邻苯二甲酸二乙酯、柠檬酸三乙酯)、乳化剂(例如，卡波姆、羟丙基纤维素、十二烷基硫酸钠)、聚合物包衣(例如，泊洛沙姆或泊洛沙胺)、包衣和成膜剂(例如乙基纤维素、丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯)和/或佐剂。

本发明的抗原结合多肽或其类似物可以在控释系统中递送。因此，输液泵可用于施用抗原结合多肽，比如用于将胰岛素或化疗药(chemotherapy)递送至特定器官或肿瘤的多肽。在一个实施方式中，本发明的抗原结合多肽与可生物降解的、生物相容的聚合物植入物组合施用，该植入物在选定的位点在受控的时间段内释放抗原结合多肽。优选的聚合材料的实例包括但不限于聚酸酐、聚原酸酯、聚乙醇酸、聚乳酸、聚乙烯醋酸乙烯酯、它们的共聚物和掺混物(参见，Medical applications of controlled release,Langer and Wise(eds.),1974,CRC Pres.,Boca Raton,Fla.，在此其内容通过引用以其整体并入本文)。在又另一个实施方式中，可以将控释系统放置在治疗目标附近，因此仅需要全身剂量的一部分。

在一个实施方式中，本发明的组合物存在于包装或分配装置中，例如FDA批准的试剂盒，其包含一种或多种含有活性成分的单位剂型。在一个实施方式中，包装或分配装置附有施用说明。

在一个实施方式中，应当理解，与没有靶向剂的治疗相比，本发明的抗原结合多肽可以与活性剂一起提供给个体以实现改善的治疗效果。在另一个实施方式中，对与联合疗法相关的不良副作用采取措施(例如，补充剂的剂量和选择)。

活性剂和抗原结合多肽的“治疗有效量”是足以为施用组合物的受试者提供有益效果的量。更具体地，治疗有效量是指有效预防、减轻或改善被治疗受试者的组织损伤或疾病症状的活性剂和抗原结合多肽的量。

在一些实施方式中，有效量或剂量的制备可以最初从体外测定来估计。在一个实施方式中，可以在动物模型中制定剂量，并且这种信息可以用于更准确地确定人体中的有用剂量。

在一个实施方式中，本文所述的活性剂/靶向剂的毒性和治疗功效可以通过体外、细胞培养物或实验动物中的标准药学程序来确定。在一个实施方式中，从这些体外和细胞培养测定以及动物研究中获得的数据可用于制定用于人的剂量范围。在一个实施方式中，剂量取决于所使用的剂型和所使用的施用途径而变化。在一个实施方式中，具体的制剂、施用途径和剂量可以由个体医生根据患者的状况来选择。[参见例如，Fingl等，(1975)“ThePharmacological Basis of Therapeutics”，Ch.1，第1页]。

在一个实施方式中，取决于待治疗病症的严重性和反应性，施用可以是单次或多次施用，治疗过程持续数天至数周或直至实现治愈或达到疾病状态的消减。在一个实施方式中，要施用的组合物的量当然将取决于被治疗的受试者、病痛(affliction)的严重程度、施用方式、处方医师的判断等。在一个实施方式中，在相容的药物载体中配制的包括本发明的制剂的组合物也被制备，放置在适当的容器中，并贴上标签用于治疗指定的病症。

通用术语

如本文中所使用的，术语“约”指±10％。

术语“包括(comprise)”、“包括(comprising)”、“包括(include)”、“包括(including)”、“具有(having)”及其共轭词意为“包括但不限于”。术语“由……组成(consisting of)”是指“包括并限于(including and limited to)”。术语“基本上由…组成(consisting essentially of)”是指组合物、方法或结构可以包括额外的成分、步骤和/或部分，但前提是额外的成分、步骤和/或部分不会实质性地改变要求保护的基本和新颖的特征组成、方法或结构。

词语“示例性(exemplary)”在本文中用于表示“用作示例、实例或说明”。被描述为“示例性”的任何实施方式不一定被解释为比其他实施方式更优选或有利和/或排除与其他实施方式的特征的结合。

词语“任选地(optionally)”在本文中用于表示“在一些实施方式中提供而不在其他实施方式中提供”。本发明的任何特定实施方式可以包括多个“任选的”特征，除非这些特征冲突。

如本文所使用的，除非上下文另有明确规定，否则单数形式“一(a)”、“一(an)”和“所述(the)”包括复数引用。例如，术语“一种化合物(a compound)”或“至少一种化合物(atleast one compound)”可以包括多种化合物，包括其混合物。

在整篇本申请中，本发明的各种实施方式可以以范围格式呈现。应当理解，范围格式的描述仅仅是为了方便和简洁，而不应理解为对本发明的范围的不灵活限制。因此，范围的描述应该被认为已经具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的各个数值。例如，对诸如1到6的范围的描述应该被认为具体公开了子范围，比如1到3、1到4、1到5、2到4、2到6、3到6等，以及该范围内的单个数字，例如1、2、3、4、5和6。无论该范围的宽度如何，这都适用。

无论何时在本文中指示数字范围，其意在包括在指示范围内的任何引用的数字(分数或整数)。短语“范围在(ranging/ranges)”第一指示数字和第二指示数字“之间(between)”和“范围/范围从(ranging/ranges from)”第一指示数字“到(to)”第二指示数字在本文中可互换使用并且意在包括第一指示数字和第二指示数字以及它们之间的所有分数和整数。

如本文所使用的，术语“方法(method)”是指用于完成给定任务的方式、手段、技术和程序，包括但不限于化学、药理学、生物、生化和医学领域的从业者已知的或从已知的方式手段、技术和程序容易开发的那些方式、手段、技术和程序。

如本文所使用的，术语“治疗”包括消除、基本上抑制、减缓或逆转病状的进展，基本上改善病症的临床或美学症状或基本上防止病症的临床或美学症状的出现。

在类似于“A、B和C等中的至少一个”的惯例的那些情况下，在使用这种结构时，一般来说，这种结构意在本领域技术人员会理解惯例的意义上(例如，“具有A、B和C中的至少一个的系统”将包括但不限于以下系统：仅A、仅B、仅C、A和B、A和C、B和C、和/或A、B和C等)。本领域技术人员将进一步理解，实际上呈现两个或多个替代术语的任何分离词和/或短语，无论是在说明书、权利要求书或附图中，都应被理解为考虑包括这些术语之一、任一个术语或两个术语的可能性。例如，短语“A或B”将被理解为包括“A”或“B”或“A和B”的可能性。

应当理解，为了清楚起见，在单独实施方式的上下文中描述的本发明的某些特征也可以在单个实施方式中组合地提供。相反，为了简洁起见，在单个实施方式的上下文中描述的本发明的各种特征也可以单独提供或以任何合适的子组合或适合于本发明的任何其他描述的实施方式来提供。在各种实施方式的上下文中描述的某些特征不应被认为是那些实施方式的基本特征，除非实施方式在没有这些要素的情况下是无效的。

如上文所述和如在以下权利要求部分中所要求保护的本发明的各种实施方式和方面在以下实施例中找到实验依据。

实施例

通常，本文使用的命名法和本发明中使用的实验室程序包括分子、生物化学、微生物学和重组DNA技术。这些技术在文献中得到了详尽的解释。参见例如，“MolecularCloning:Alaboratory Manual”Sambrook等人，(1989)；“Current Protocols inMolecular Biology”Volumes I-III Ausubel,R.M.,ed.(1994)；Ausubel等人，“CurrentProtocols in Molecular Biology”，John Wiley and Sons,Baltimore,Maryland(1989)；Perbal，“A Practical Guide to Molecular Cloning”，John Wiley&Sons,New York(1988)；Watson等人，“Recombinant DNA”，Scientific American Books,New York；Birren等人，(eds)“Genome Analysis:ALaboratory Manual Series”，第1-4卷，Cold SpringHarbor Laboratory Press,New York(1998)；美国专利4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659和5,272,057中规定的方法；“Cell Biology：A Laboratory Handbook”，VolumesI-III Cellis,J.E.编辑(1994)；Freshney的“Culture of Animal Cells-A Manual ofBasic Technique”，Wiley-Liss，N.Y.(1994)，第3版；“Current Protocols inImmunology”，第I-III卷，Coligan J.E.编辑(1994)；Stites等人，(eds)，“Basic andClinical Immunology”(第8版)，Appleton&Lange,Norwalk,CT(1994)；Mishell andShiigi(eds)，“Strategies for Protein Purification and Characterization-ALaboratory Course Manual”CSHL Press(1996)。

现在参考以下实施例，这些实施例与以上描述一起以非限制性方式说明本发明。

材料和方法

动物程序

所有动物实验均由以色列动物实验伦理委员会批准(骆驼和小鼠程序的授权编号分别为11-220-6和48-07-2012)。进行了广泛的努力，以尽量减少本研究中使用的动物的数量和痛苦。

抗PSMA NB的产生和纯化

NB生成的方案改编自Pardon等人和Vincke等人。简而言之，骆驼(单峰骆驼)被免疫七次，连续注射1mg纯化的PSMA细胞外结构域[残基44-750；购自Caltech ProteinExpression Center,CA]，间隔两周。然后将骆驼淋巴细胞的RNA分离并转化为DNA，并将编码可变重同源二聚体(VHH)的DNA扩增并连接(ligate)到pMECS载体上。将该DNA文库转化到TG1大肠埃希杆菌感受态细胞中，并通过用M13辅助噬菌体感染使用噬菌体展示对所得文库(10⁷个克隆)进行选择。在针对PSMA进行两轮淘选后，使用ELISA单独评估47个细菌菌落的PSMA结合，并且然后进行测序(NIBN测序实验室，Ben-Gurion University of the Negev,Israel)。将编码四个选定的NB(NB7、NB8、NB13和NB37)以及在C-端添加了半胱氨酸的NB7(NB7cys)的DNA转化到WK6大肠埃希杆菌中。细菌在37℃和250rpm的TB培养基(17mM KH₂PO₄、94mM K₂HPO₄、12g/l蛋白胨、24g/l酵母提取物、0.4％甘油)中生长，直到它们达到OD₆₀₀＝0.5。然后，将1mM IPTG加入培养基中并将温度调节至28℃，过夜，然后使用12ml TES缓冲剂(500mM蔗糖、200mM Tris-HCl、0.5mM EDTA、pH 8)3小时，然后使用24ml TES缓冲剂(稀释度1：4)过夜，进行周质提取。在Ni-NTA重力珠(Invitrogen,CA)上使用亲和层析进一步纯化NB。使用Superdex 75 16/600柱(GE Healthcare，MA)对洗脱的级分进行FPLC纯化。通过使用SDS-PAGE凝胶电泳和质谱法评估蛋白质的大小和纯度，确认预期大小约为16kDa和>95％纯度。

表面等离子共振结合测定

通过在ProteOn XPR36芯片(Bio-Rad,CA)上使用表面等离子共振(SPR)光谱测定每个NB与PSMA的亲和力。通过使用磺基-NHS(0.1M N-羟基琥珀酰亚胺)和EDC[0.4M 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺]激活芯片。每个NB(0.2μg)以30μl/min的流速固定在10mM乙酸钠缓冲剂中，pH 5.0。将牛血清白蛋白(BSA)(3μg)固定在芯片上作为阴性对照。在pH 8.5下，用1M乙醇胺HCl使未结合的酯失活。然后将可溶性PSMA以2.94、5.88、11.75、23.50或47.00nM(对于NB 8、13和37)或25、50、100、1,600或3,200pM(对于NB7)的浓度施加在芯片上，流速为25μl/min。在此期间，测量了NB和PSMA之间的关联。在流动50μl/min PBST(即，含有0.005％Tween的磷酸盐缓冲盐水)的同时测量解离。对于每种蛋白质复合物，通过从PSMA对NB的响应值中减去PSMA对BSA的响应值来生成结合传感图。解离常数(K_D)由Langmuir 1：1动力学模型确定。整个结合测量的温度设置为25℃。

PSMA活性测定

通过使用R&D systems建议的重组PSMA的测定方案来确定PSMA的酶促N-乙酰化-α-连接的酸性二肽酶(NAALADase)活性。简而言之，将PSMA稀释至0.4μg/ml，并将Ac-Asp-Glu底物(Sigma Aldrich)在50mM HEPES、0.1M NaCl、pH 7.5中稀释至40μM。通过将125μlPSMA和底物溶液混合生成工作溶液。对于阴性对照，通过热变性使PSMA失活。作为抑制的对照，将0.5nM的商业PSMA抑制剂(PMPA，Tocris，以色列)加入含有PSMA和底物的溶液中。将NB7、NB8、NB13和NB37(各100nM)加入该溶液中，并在37℃下温育1小时，并且然后在95℃下温育5分钟。接下来，将0.2M NaOH和0.1％β-巯基乙醇中的250μl 15mM邻苯二甲醛(phthaldialdehyde)(Sigma Aldrich)加入每个样品中。将样品在室温下温育10分钟并测量它们的荧光(激发：330nm，发射：450nm)。将未经处理的PSMA样品的荧光值设为1，并将所有其他样品相应地进行归一化。

细胞结合测定

使PC3-PIP(PSMA-阳性，PSMA+)细胞和PC3-flu(PSMA-阴性，PSMA^-)细胞在补充有10％胎牛血清(FBS)、L-谷氨酰胺、青霉素和链霉素(Biological Industries，以色列)的RPMI1640培养基中生长。一旦细胞达到70％融合，将10⁵个细胞加入到96孔U形底板(Greiner Bio-One，Austria)的每个孔中，以150g离心5分钟，并用PBSA(即PBS+1g/lBSA)洗涤。将NB以0.1、0.5、2、5、10、20、50、100、500或1000nM的浓度加入细胞中。将细胞与NB一起温育2小时，然后进行三个PBSA洗涤步骤。然后以1：100的稀释度加入与异硫氰酸荧光素(FITC)(Invitrogen)缀合的抗His抗体，与细胞一起温育1小时，并用PBSA洗涤3次。在整个实验过程中将细胞保持在冰上。使用Accuri C6流式细胞术分析仪(BD Biosciences,CA)测量每个样品的荧光。每个实验条件重复3次。为了生成滴定曲线，每个样品的值使用以下等式确定：

[1]

其中F_样品是平均荧光值，F_低是PC3-PIP细胞在最低浓度下的荧光，和F_高是PC3-PIP细胞在最高浓度下的荧光。使用GraphPad Prism 5.0生成结合曲线。

蛋白质结晶、数据收集、结构确定和细化(refinement)

将NB7、NB8和NB37(5mg/ml)与储库溶液以1:1(v/v)的比例混合，并在室温下通过坐滴蒸汽扩散法(sitting-drop vapor diffusion method)在储库上方结晶，储库含有1.7M硫酸铵和6.57％2-丙醇(对于NB7)；0.1M柠檬酸三钠，pH 3.5，和3M NaCl(对于NB8)；或0.1M柠檬酸三钠，pH 3.5，和25％聚乙二醇3350(对于NB37)。然后收获晶体，冷冻保护，并在液氮中快速冷却。X射线衍射(XRD)数据在欧洲同步辐射装置(ESRF，法国格勒诺布尔)的光束线ID30B处收集。数据是在100K时从每个NB的一个晶体中收集的，对于NB8和NB37，衍射到最大分辨率为

对于NB7为

NB7晶体属于P21空间群，晶胞尺寸为a 53.563、b171.716和c 83.479，并且在不对称单元中包含8个蛋白质拷贝。NB8晶体属于I222空间群，晶胞尺寸为a 55.945、b 68.857和c 75.647，并且在不对称单元中包含一个蛋白质拷贝。NB37晶体属于I222空间群，晶胞尺寸为a 55.949、b 69.087和c 75.869，并且在不对称单元中包含一个蛋白质拷贝。使用XDS合并和缩放X射线数据，并使用CCP4中的Phaser通过分子替换解决。蛋白质数据库(PDB)ID：5M7Q用作搜索模型。细化包括在COOT中手动重建和使用Phenix自动细化的交替循环。坐标和结构因子以登录代码6XXN(NB7)、6XXO(NB8)和6XXP(NB37)提交给PDB。

小角度X射线散射、分析和三维结构重建

在PBS中测量单体PSMA的小角X射线散射(SAXS)，最终浓度为0.5-3mg/ml。对于PSMA-NB复合样品，PSMA的浓度为0.5mg/ml，NB的浓度为0.1-0.5mg/ml。测量是在ESRF的光束线BM29中进行的。X射线波长为

和温度为4℃。检测器为Pilatus 1M，并将样品到检测器的距离设置为2.86m，散射矢量(q)范围为

在散射角为2θ时，散射矢量(q)的大小定义为：

[2]

所有样品的实验SAXS数据在低q、Guinier区域中是线性的。回转半径(Rg)源自使用Guinier近似的qRg<1区域中的数据：

[3]

发明人使用嵌入在GNOM方法中的Guinier近似分析了散射剖面的小角度区域

散射曲线反映倒易空间中的结构特征。通过傅里叶变换将散射轮廓转换为真实空间，从而产生成对距离分布函数P(r)。该函数反映了大分子内成对的散射点之间的距离，允许确定粒子的最大尺寸(D_max)。为了获得D_max的可靠定量，发明人将GNOM与内部脚本结合在一起。将从SAXS数据中提取的单体PSMA的Rg与使用CRYSOL从单体PSMA(PDB3D7D)的晶体结构计算的Rg进行比较。使用Dammin从实验散射数据中恢复了PSMA和PSMA-NB复合物的整体三维从头计算的模型(overall three-dimensional ab initio model)。进行形状重建以将分子形状表示为由D_max定义的搜索体积内的紧密堆积的球体组件，对于所有模型选择χ2<1.3。对于所有样品，使用程序DAMAVER对20个低分辨率模型进行平均，以产生代表每个重建的一般结构特征的平均模型。

结合表位的计算分析

选择PSMA的蛋白质晶体结构用于对接程序(PDB 1Z8L)。NB37(PDB 6XXP)和NB7(PDB 6XXN)通过使用带有ZDOCK的Discovery Studio 4.5(Biovia，Dassault Systems，圣地亚哥，加利福尼亚州)与PSMA晶体结构的单体形式和同源二聚体形式对接。然后使用ZRANK方法对ZDOCK预测的对接蛋白复合物进行快速且准确的重新排序。对于每个对接模拟，最终前2000个对接解决方案方向(docking solution orientation)的复合体被聚类成组。分类基于解决方案的空间邻近性，使用距簇中心

的最大配体界面RMSD截止值和定义PSMA和NB之间的界面区域的

界面截止值，以获得更好定义的簇。这个过程使我们能够选择最有前途的对接解决方案进行进一步分析。通过使用能量最小化协议和Biovia SmartMinimizer算法优化了所选对接解决方案的几何形状。对于选定的最小化解决方案，确定了两个蛋白质结构域之间的结合界面，并计算了结构域之间的相互作用。识别界面残基——即，当蛋白质处于复合物中相对于分离时其溶剂可及表面积不同的残基——并确定相互作用的类型(氢键、静电和疏水相互作用等)。在对接所有蛋白质之前，对PSMA和NB进行准备蛋白质协议，该协议通过使用Asp、Glu、ARg、Lys、His、Tyr、Cys和每条链的N-末端和C-末端的标准或预测pKa值来纠正氢的计数，它们是可滴定的。使用该协议的结果是链末端和侧链的首选氢表示和质子化状态。

活体光学成像

通过使用PC3-PIP和PC3-flu细胞在6周龄雄性无胸腺裸鼠中产生肿瘤异种移植物。每只小鼠同时皮下注射每行2×10⁶个细胞，用Matrigel(Corning，USA)以1:1稀释；PC3-PIP细胞注射在右上侧上方，而PC3-flu细胞注射在左侧上方。接种后9天，当肿瘤达到～200mm³大小时，这些小鼠被静脉内注射1.5nmole的用NHS-酯AlexaFluor680(Invitrogen)标记的NB7、NB8、NB13或NB37(每组四只小鼠)。除了这16只小鼠以外，四只荷瘤小鼠没有注射任何NB，而其他四只小鼠注射了标记的NB(每只小鼠不同的NB)，但没有植入异种移植物。在不同的时间点(见下文)用异氟烷(isoflurane)麻醉小鼠，并使用IVIS Lumina系统(PerkinElmer，USA)在近红外(NIR)光学成像中测量荧光标记蛋白质的分布。曝光时间设置为1秒。在注射时以及注射后0.5、1、2、3、6、10、18、24、28、32、36、48和56小时测量荧光信号。在注射后3和6小时采集小鼠图像，并且当不再检测到信号时(在注射后24-56小时)再次采集。在每个时间点，使用Living Image软件对每组注射了NB的荷瘤小鼠中的一只小鼠实施安乐死，以对其器官中的荧光信号进行离体定量。

DOX与NB7cys缀合

根据标准程序(图16A)合成阿霉素缀合物(在图16中呈现)(1)。将N-(β-马来酰亚胺丙酸)酰肼三氟乙酸盐(2，39mg，0.13mmol)加入盐酸阿霉素(DOX，3，29mg，0.05mmol)在10ml无水甲醇中的溶液中。将三氟乙酸(3μl)加入反应混合物中，然后将其在室温下避光搅拌18小时。将反应混合物浓缩至体积为1ml并在搅拌下滴加到乙腈(20ml)中。使所得溶液在4℃下静置至少24小时。最终产物(1)通过离心分离，用新鲜的1：10的甲醇/乙腈溶液洗涤，并真空干燥得到1，25mg，产率71％。¹H-NMR(DMSO-d₆)δ＝10.46(s，1H)，7.94-7.92(m，2H)，7.67(dd，J＝7.4和3.4Hz，1H)，6.87(s，2H)，5.78(t，J＝4.9Hz，1H)，5.51(s，1H)，5.40(d，J＝3.9Hz，1H)，5.26(d，J＝2.0Hz，1H)，4.91(t，J＝7.8Hz，1H)，4.40(t，J＝4.4Hz，2H)，3.99(s，4H)，2.73(d，J＝15.6Hz，1H)，2.34-2.24(m，2H)，2.15-2.10(m，2H)，1.88-1.81(m，2H)，1.71-1.66(m，2H)，1.14(d，J＝6.8Hz，3H)ppm(图S11)。针对C₃₄H₃₇N₄O₁₃[M+H]⁺计算的MS(ESI)：709.23；观察到：709.14。使用基于马来酰亚胺的化学方法，然后将NB7cys以1：20的摩尔比与1结合(在4℃下24小时)。通过FPLC使用Superdex 75 10/300(GE Healthcare，MA)将NB7cysDOX与未结合的NB7cys分离。基于FPLC运行期间488nm处的吸光度和质谱法验证DOX与蛋白质的缀合。

共焦成像

将NB用Dylight 488NHS-酯(Thermo Scientific，IL)以1：3的摩尔比标记。将藻红蛋白(PE)-抗PSMA抗体(BioLegend，加利福尼亚州)和Hoechst 33342(Invitrogen)与3×10⁴个PC3-PIP或PC3-flu细胞一起温育15分钟，在存在或不存在100nM标记的NB的情况下将这些细胞在8孔μ载玻片中培养过夜(ibidi GmbH，德国)。将NB7cys和NB7cysDOX用Dylight650NHS-酯以1：3的摩尔比标记。将Hoechst 33342和1.5μg/ml DOX(Teva,Israel)或等摩尔量的标记的NB7cys或标记的NB7cysDOX与如上所述生长的PC3-PIP和PC3-flu细胞一起温育。用具有长工作距离×60/1.35数值孔径、油浸物镜的Olympus FV1000共聚焦显微镜(Olympus，日本)对细胞进行成像。

NB内化的时间依赖性定量

将各自用Dylight488标记的NB7、NB8、NB13和NB37在96孔板中单独温育1小时(在100nM)。在每个孔上，接种1.5×10⁴个PC3-PIP细胞并过夜生长，并且然后使用OperettaCLS高含量分析系统(Perkin Elmer)每40分钟对孔进行一次成像，总共16小时。每个孔被成像为24个区域，这些区域随后被组合以创建整个孔的图像。使用Operetta分析软件，根据NB的分布将细胞定性分为两组：(i)主要在细胞膜上，和(ii)主要在细胞质内。在每个时间点对每组中的细胞数进行定量，并计算每组中细胞数之间的比率。

细胞定量测定

将PC3-PIP细胞(5×10⁴)接种在24孔板中。将细胞附着在板上后，它们或者不处理，或者用DOX(1.5μg/ml)或等摩尔量的NB7cys或NB7cysDOX处理。在处理24小时后，使用Countess II自动细胞计数器(Invitrogen)计算每个孔中的细胞数。

细胞活力测定

PC3-PIP细胞如上文细胞定量测定部分所述生长和处理。收获细胞，并与0.5μg碘化丙啶(PI；Biolegend)一起温育，并在BD C6流式细胞仪中测量它们的荧光强度。

线粒体电位测定

将PC3-PIP细胞(2×10⁴)接种在96孔板上。在将细胞粘附到板上后，将其用1.5μg/ml DOX或等摩尔量的NB7cys或NB7cysDOX处理，或者不进行处理，作为对照。在24小时后，根据制造商提供的方案加入四甲基罗丹明乙酯(TMRE；Abcam，UK)。在549nm的激发波长和575nm的发射波长下测量荧光强度。将羰基氰化物4-(三氟甲氧基)苯腙(FCCP)作为阴性对照，根据制造商的方案使用。

体内肿瘤生长抑制

如上文体内光学成像部分所述，PC3-PIP异种移植物在无胸腺裸鼠中生长。当平均肿瘤大小达到200mm³时，将小鼠分为三组(以平均肿瘤大小为准)，每组接受不同的处理：150μl盐水(n＝7)、2mg/kg DOX(n＝8),或1.4mg/kg(～40μg)NB7cysDOX(n＝8)。每周两次对尾静脉进行治疗，连续三周。如前所述，在每个样品点计算肿瘤体积(V＝0.5×L×W×H)(Tomayko和Reynolds，1989)。当肿瘤体积达到1,500mm³或身体状况恶化时，根据BGU研究中动物的伦理关怀和使用委员会的指导方针，对小鼠实施安乐死。如前所述确定安乐死前估计的肿瘤体积和基于速率的T/C(Aston等人，2017)。

组织学

在体内肿瘤生长抑制测定中每次处理的最终剂量后四天，对小鼠实施安乐死，并将它们的异种移植物固定在4％甲醛中并包埋在石蜡中。如前所述，对肿瘤切片(5μm厚)进行苏木精和伊红(H&E)染色、TUNEL测定和免疫荧光(IF)(Pittala等人，2018,Fischer等人，2008)。对于IF，与PE缀合的抗PSMA和与FITC缀合的抗HIS分别用于检测PSMA和NB7cysDOX。将4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)用于细胞核染色。使用全景MIDI II扫描仪(3DHISTECHKft.，匈牙利)对H&E染色切片进行可视化。TUNEL、PI和IF在共聚焦显微镜中可视化。

非天然氨基酸的合并

首先，发明人将pMECS上NB7基因3'的TAG终止密码子改变为TAA。然后，发明人将5个不同的AA位置突变为TAG：A14、A40、G42、K43和A75，使得每个NB7基因都包含这些终止密码子选项之一。发明人将含有突变的NB7基因的pMECS和pEVOL共同转化为WK6细菌。所有五个突变体均在37℃下生长以进行小规模纯化，直至它们达到OD0.5，用IPTG诱导并将O.N.的温度设置为28℃。在它们的培养基中为细菌提供了BOC-赖氨酸。然后，收集来自每种培养物的1ml细菌以及GFP阳性对照，离心并用100μlPBS重新悬浮。将细菌在95℃煮沸5分钟，造粒并收集含有NB的上清液。收集二十五(25)μl上清液用于WB，使用小鼠抗His，然后使用HRP-抗小鼠Ab，并使用EZ-ECL试剂盒进行显影。选择K43突变体进行大规模纯化，因为它表现出良好的表达，并且发明人假设将赖氨酸(K)变为PrK不太可能损害蛋白质的稳定性和活性。SEC和MS色谱图证实，在添加PrK后加入NB7的Mw与理论Mw相关。使用FACS测定NB7和NB7K43PrK与PC3-PIP细胞的结合，并显示K43PrK突变后结合没有显著变化。

对NB7cys进行了类似的程序。两个位置显示WB中可检测到NB7cysBOC-赖氨酸水平，但在NB7cysK43PrK的大规模纯化中未检测到蛋白质。

统计分析

除非另有说明，否则每个实验一式三份进行，并将结果表示为平均值±SEM。使用学生t检验确定统计显著性。

实施例1

抗PSMA NB的分离

从注射PSMA的骆驼的淋巴细胞中提取的RNA作为107个变体大小的NB噬菌体展示文库的基础。针对PSMA的噬菌体展示淘选过程产生了47个表达NB变体的细菌菌落，其中鉴定了32个独特的NB序列。其中，选择序列重复数次且在ELISA中显示出与PSMA最强结合的4个NB用于纯化(图7A-7B)。纯化的NB—称为NB7、NB8、NB13和NB37—的预期大小为～16kDa(图7C)，并且产量为4-18mg/l培养物。

实施例2

NB以皮摩尔到纳摩尔的亲和力与PSMA结合

SPR揭示了四种纯化的NB与PSMA的体外结合亲和力在皮摩尔到纳摩尔范围内，但在NB之间差异很大(表1和图1A-1D)。

表1.由SPR测量的PSMA和NB之间相互作用的动力学结合常数.

NB	K<sub>on</sub>[M<sup>-1</sup>s<sup>-1</sup>]	K<sub>off</sub>[s<sup>-1</sup>]	K<sub>D</sub>[nM]
				NB7	7.1×10<sup>5</sup>±4.5×10<sup>2</sup>	3.9×10<sup>-5</sup>±2.8×10<sup>-7</sup>	0.055
NB8	2.0×10<sup>4</sup>±4.2×10<sup>1</sup>	1.2×10<sup>-4</sup>±5.3×10<sup>-7</sup>	6.0
				NB13	3.6×10<sup>4</sup>±8.9×10<sup>1</sup>	2.2×10<sup>-5</sup>±9.9×10<sup>-7</sup>	0.60
NB37	2.2×10<sup>4</sup>±5.3×10<sup>1</sup>	7.5×10<sup>-5</sup>±6.6×10<sup>-7</sup>	3.4

值代表平均值±SD。

基于FACS的滴定曲线显示所有四种NB以剂量依赖性方式与PC3-PIP(PSMA+)前列腺癌细胞结合(图1E)，但它们不与PC3-flu(PSMA-)细胞结合(图1F)。值得注意的是，FACS结合曲线没有达到平台期，可能是因为NB被内化到细胞中(见下文)；因此，该数据集不用于计算K_D值。酶活性测定表明，NB不会损害PSMA的酶NAALADase活性(图8)，表明它们与蛋白质的非功能性表位结合。

实施例3

NB结构及其PSMA结合表位

四个NB的K_D值的相当大的可变性(高达100倍)可能源于它们可能不同的PSMA结合表位。为了测试这种可能性，NB7、NB8和NB37的晶体结构以

或

的分辨率解析(图2A-2C和表2-4)；在任何尝试的生长条件下都无法获得NB13晶体。虽然NB8和NB37的结构非常相似——与它们序列的高度同源性一致，它们在单个氨基酸残基上不同——但NB7的结构明显不同，并且包括更多的β-折叠和更少的随机区域。SAXS分析(图9)表明单体PSMA在PBS中是稳定的，并显示出浓度依赖性的分子间相互作用，表明PSMA单体在溶液中相互作用，这证实了PSMA形成二聚体的能力。在NB浓度增加的情况下单体PSMA的散射曲线表明，Guinier区域

是线性的，表明任何样品中很少或没有聚集(图10)。然而，在PSMA中添加低浓度的NB13，即PSMA：NB13比率在1：0.5和1：3之间，会增加PSMA的回转半径(R_g)(图11)。PSMA-NB复合物的R_g从PSMA的原始R_g(

图11)转变为NB7的较高R_g和NB8、NB13和NB37的较低R_g。单独PSMA的R_g与基于PSMA单体晶体结构计算的R_g值相当。粒子内成对距离的分布(图12)由P(r)表示(参见方法)。PSMA P(r)的D_max为

(图13)，并且P(r)分布的形状表明其为细长结构。PSMA与NB7和NB13的结合增加了D_max，而它与NB8和NB37的结合降低了D_max(表5)。

接下来，发明人从使用DAMMIN和DAMAVER平均的数据计算了20个重构的从头计算的模型。发明人使用了PSMA、NB7和NB37的晶体结构，并将它们与包含仅PSMA(0.5mg/ml)或PSMA(0.5mg/ml)与NB7或NB37(在每种情况中为0.2mg/ml)的样品的重构结构相匹配(图2D-2F)。发明人假设NB8的结合机制与NB37的结合机制相似，因为它们具有高度的序列和结构同源性，并且因此我们没有生成NB13的模型，因为我们没有它的晶体结构。

模型表明，PSMA形成非生物二聚体，在两种单体的N-末端之间具有相互作用(图2D)，类似于在PSMA(PDB 1Z8L)的四聚体晶体结构中观察到的那些。低分辨率结构是不对称的，使得一个单体看起来比另一个小；然而，值得注意的是，这种明显的不对称可能源于溶液中单体和二聚体二者的存在，因此平均尺寸可以反映两种物质的组合尺寸。模型表明，在NB7存在下，通过与其中一种PSMA单体形成生物二聚体，将另一种PSMA单体加入二聚体复合物中。根据该模型，NB7将生物二聚体中的每个单体与不同的互补决定区(CDR)结合(图2E)，导致复合物大小和R_g增加。在PSMA-NB37复合物的情况下，NB37似乎在N-末端与PSMA结合(图2F)，因此破坏了非生物二聚体，导致R_g降低。

实施例4

对接分析

SAXS结果和NB7(PDB 6XXN)与PSMA(PDB 1Z8L)的分子对接模拟显示NB7在靠近二聚化界面的位置与PSMA结合并同时与两种单体相互作用(图2G和图20)。NB7主要通过CDR3和CDR1与一个PSMA单体相互作用，而CDR2和几个非CDR残基与同源二聚体中的第二个单体相互作用(主要贡献的相互作用如图2G所示，并在图20中进一步详述)。根据对接模拟，NB37(PDB 6XXP)与靠近PSMA的N-末端的表位结合(图2H，图21)。预测的NB37和PSMA之间的相互作用主要通过CDR2发生，并且一些通过CDR3发生；主要贡献的相互作用如图2H所示，并在图21中进一步详述。总的来说，NB7比NB37具有更多的相互作用，因为前者的配体接触表面积为

而后者为

(表8)。

实施例5

NB在体内表达PSMA的肿瘤中积累

接下来，发明人旨在确定NB是否在体内特异性结合表达PSMA的PCa肿瘤，以及它们的亲和力之间的差异是否与它们在肿瘤中的体内积累相关。为此，发明人获得了接种PC3-PIP和PC3-flu异种移植物的裸鼠的全身近红外(NIR)光学图像。发明人在注射标记的NB后3小时和6小时(分别为早期和中期时间点)以及在体内不再检测到荧光信号时(晚期时间点)再次拍摄了图像。在一些小鼠中，在注射后56小时仍可检测到信号；出于道德考虑，我们对这些小鼠实施了安乐死，并且我们将这些情况下的晚期时间点表示为>56小时。

在早期成像时间点，在肾脏和PC3-PIP肿瘤中均检测到NB，但是在PC3-flu肿瘤中未检测到。然而，在中间成像时间点，它们从肾脏中完全清除，仅保留在PC3-PIP肿瘤中(图3)。直到不再检测到荧光信号(晚期时间点)的持续时间取决于NB与PSMA的亲和力，使得具有较高亲和力(较低K_D)的NB需要更长的信号清除持续时间(NB37为24小时，NB8和NB13为32小时，和NB7大于56小时)。这些低清除率表明所有四种NB都可能用于体内应用，比如临床成像和肿瘤特异性药物递送。事实上，即使在全身成像无法检测到荧光信号后，它仍然在离体肿瘤中观察到(图14)，其中在PC3-PIP肿瘤中，相对于肾脏，它随着时间的推移而增加(图3D)。在整个实验过程中，其他器官和PC3-flu肿瘤中的信号要弱得多。例如，对于NB8，在3小时后，在PC3-PIP肿瘤中信号强度为171,000个计数/cm²/s，和在肾脏中为94,700个计数/cm²/s，相比之下，在PC3-flu肿瘤中为21,300个计数/cm²/s。这一发现表明，NB特异性地在PSMA⁺肿瘤中积累，并且然后主要被肾脏清除，正如预期的那样，考虑到NB的小尺寸[16kDa，而肾脏截止值为～60kDa]。

实施例6

NB被内化到表达PSMA的细胞中

为了使NB能够将化疗剂递送到PSMA⁺前列腺肿瘤细胞中——许多现有药物的功效的先决条件——它们必须特异性地内化到PSMA⁺细胞中。为了测试四种NB的内化能力，发明人对它们进行荧光标记，并将它们与活的PC3-PIP(PSMA⁺)或活的PC3-flu(PSMA^-)细胞以及PE-抗PSMA抗体和Hoechst核染色溶液一起温育。PC3-PIP细胞的共聚焦成像显示NB与PSMA共定位并出现在细胞膜和细胞内的簇中(图4A-4D)。值得注意的是，在没有NB的情况下，在细胞内未发现抗PSMA抗体(图4I)，这表明NB可能会在仍与抗PSMA抗体结合时促进PSMA的内化。PC3-flu细胞的成像显示NB和抗PSMA抗体均未结合或内化到细胞中(图4E-4H)。长期内化分析表明，对PSMA具有较高亲和力的NB(即NB7和NB13)比具有较低亲和力的NB更快地内化到表达PSMA的细胞中(图15)。基于对PSMA的体外和体内亲和力以及每个NB的纯化产率，发明人选择使用NB7产生NB-药物缀合物。

实施例7

NB7cys与DOX的缀合

NB和PSMA在靶细胞内的聚集模式表明它们的内化是由细胞内囊泡介导的，正如先前对其他PSMA粘合剂所显示的那样。由于两种细胞内囊泡通常都是酸性的，因此发明人通过在pH<6.0时水解的pH敏感接头N-(β-马来酰亚胺丙酸)酰肼(BMPH)将NB7与DOX缀合(图16A和17)。发明人假设囊泡中的酸性条件会水解接头和DOX之间的共价键，从而从缀合物中释放DOX并使其能够扩散到囊泡外并进入细胞质，在那里它可以穿透细胞核，并且推测抑制DNA转录。

使用尺寸排阻色谱法纯化称为NB7cysDOX的缀合蛋白(图16B)。将DOX加入NB7略微增加了其大小(即，～700Da)，但DOX的疏水性降低了其洗脱速率，这使我们能够将缀合的蛋白质与非缀合的蛋白质分开。DOX的荧光(ex.495和em.560)导致仅缀合蛋白在488nm处的吸光度，这充分接近495，并进一步区分了结合和非结合蛋白部分。在酸性pH(pH＝4)中使用质谱法进一步评估NB7cysDOX部分，其中DOX从接头上裂解下来，并且从而从NB上裂解下来。该分析显示，缀合蛋白的质量比仅NB7cys高185Da(即，分别为16,141Da，与16,326Da相比；图16C)；这种差异反映了NB7cys和BMPH接头的组合大小，表明所有NB分子都与DOX缀合，并且DOX在酸性条件下释放。对NB7cys和NB7cysDOX与表达PSMA的PC3-PIP细胞的结合的FACS分析(图16D)显示DOX的缀合不损害NB7cys与这些细胞的结合。

实施例8

NB7cysDOX对表达PSMA的细胞具有细胞毒性

为了评估NB7cysDOX缀合物特异性内化PSMA表达细胞的能力以及DOX从缀合物的连续分离，我们将PC3-PIP和PC3-flu细胞与Hoechst 33342(核染色)，以及1.5μg/ml DOX(荧光)或摩尔当量的Dylight650标记的NB7cys或NB7cysDOX一起温育15分钟(图5)。当仅与PCa细胞一起温育时，DOX(一种小而疏水的分子)会自发扩散到PC3-PIP和PC3-flu细胞中，在那里发现它均匀地分散在整个细胞质中。相反，正如其依赖于PSMA的内化机制所预期的那样(见图4A)，NB7cys仅在PC3-PIP细胞中积累，发现它主要存在于细胞膜中并开始内化到细胞质中。NB7cysDOX的分布与NB7cys的分布非常相似——即在PC3-PIP细胞的膜和细胞质上的特定区域，而不是PC3-flu细胞——但DOX分散在细胞内的多个区域，大部分与NB7cys分离(尽管在DOX簇中发现了少量NB7cys)。为了测试从内化缀合物释放的DOX是否保留其细胞毒活性，发明人将PC3-PIP细胞与1.5μg/ml DOX或摩尔当量的NB7cysDOX或NB7cys一起温育24小时，计算每个孔中的细胞数，并将其与未经处理的细胞进行比较(图18A)。该测定表明，与DOX或更大程度地与NB7cysDOX一起温育显著减少了孔中的细胞数量。接下来，在不同组的实验中，我们将PC3-PIP细胞与DOX、NB7cys或NB7cysDOX一起温育24小时(如上所述)，并且然后用碘化丙啶(PI)(一种晚期细胞凋亡和坏死的荧光标记物)标记细胞。FACS分析(图18B)显示，虽然用NB7cys处理细胞不会改变PI信号，但用DOX或更大程度地用NB7cysDOX处理它们会显著增加信号。用TMRE(一种标记活性线粒体的试剂)处理PC3-PIP细胞显示DOX和NB7cysDOX类似地降低了线粒体膜电位(图18C)。用中断线粒体膜电位并用作阳性对照的FCCP处理细胞也显著降低了PC3-PIP细胞的线粒体膜电位。相反，与未经处理的细胞相比，仅NB7cys不会改变TMRE信号。总之，这些结果表明NB7cysDOX对PSMA⁺细胞的细胞毒性至少与单独的DOX一样。

实施例9

NB7cysDOX抑制小鼠肿瘤生长

为了在体内测试NB7cysDOX的活性，本发明人在无胸腺裸鼠中创建了PC3-PIP肿瘤异种移植物，并且一旦肿瘤达到～200mm³，本发明人用盐水(对照)；2mg/kg(2.86μmol/kg)商业DOX(之前已证明对小鼠有效，并与人类使用的类似)；或1.4mg/kg(0.087μmol/kg)NB7cysDOX(表示DOX的摩尔剂量比单独使用DOX时低42倍)对它们进行静脉内治疗，每周两次，持续三周。发明人在每次注射前测量了肿瘤的大小，但由于伦理考虑(即，肿瘤负荷大或身体恶化)，一些小鼠不得不在治疗开始后8天实施安乐死；在这些小鼠中，我们通过外推法估计了连续时间点的肿瘤大小。

来自所有活小鼠的肿瘤被包括在分析中的最后时间点是治疗开始后8天；在那个时间点，用NB7cysDOX治疗的小鼠的平均肿瘤大小明显小于用盐水治疗的小鼠(图6A)。随时间推移的分析(图19A)和治疗/对照的基于速率的生长斜率(T/C；图6B)显示，用NB7cysDOX处理的小鼠的肿瘤生长速率确实低于用盐水处理的小鼠。此外，虽然施用至NB7cysDOX处理的小鼠的DOX量显著低于施用至DOX处理的小鼠(接受2mg/kg剂量的DOX)，但两组的肿瘤生长速度相似，表明NB7cysDOX缀合物相对于仅施用DOX的有效性。值得注意的是，三只小鼠被排除在DOX处理组之外进行基于速率的分析。根据这些发现，在生理盐水处理组中达到最大肿瘤大小(即，出于伦理考虑对小鼠实施安乐死的小鼠的大小)比在DOX处理组或NB7cysDOX处理组中的更多，后者分别为彼此没有显著差异(图19B)。

接下来，发明人在最终剂量的NB7cysDOX后4天从处理的小鼠中提取肿瘤，并用PE-抗-PSMA和FITC-抗-His标记它们。组织学分析显示，虽然PSMA主要定位于肿瘤细胞的膜，但NB7cysDOX似乎与PSMA共定位或在细胞质中(图6C)，表明NB7cysDOX确实到达并保留在肿瘤内至少四天。用H&E对肿瘤进行染色显示，虽然从用盐水处理的小鼠获得的肿瘤是聚集的并且被H&E强烈标记，但用DOX或用NB7cysDOX处理的小鼠的肿瘤是坏死的、更少的，并且细胞之间有很大的空缺(图6D，上图)。与从DOX或NB7cysDOX处理的小鼠获得的肿瘤中的显著细胞凋亡相比，TUNEL测定显示从盐水处理的小鼠获得的肿瘤中只有少数凋亡细胞(图6D，底部)。这些发现表明，虽然施用至NB7cysDOX处理的小鼠的DOX分子数量少于施用至DOX处理的小鼠的3％，但两组药物的细胞毒性作用相似。

表2：NB7的晶体学统计

¹括号中的数字指示最高分辨率壳层

表3：NB8的晶体学统计

¹括号中的数字指示最高分辨率壳层的统计信息

表4：NB37的晶体学统计表

¹括号中的数字指示最高分辨率壳层的统计信息

表5：用于具有和不具有NB的PSMA的SAXS分析的参数

¹通过对Guinier区域的线性拟合确定。

²使用GNOM软件确定²。对粗略检索的结果进行细化以获得平滑的P(r)。

³通过使用CRYSOL软件³确定PSMA单体[PDB ID 3D7D ⁴]。

表6：PSMA-NB7和PSMA-NB37界面分析

	NB7	NB37
			总π相互作用	1	1
总氢键	43	15
			总盐桥	1	0
配体接触表面积	969.34	443.72
			配体极性接触表面积	548.33	218.82
配体非极性接触表面积	421.02	224.91
			受体接触表面积	989.17	447.68
受体极性接触表面积	598.62	219.73
			受体非极性接触表面积	390.55	227.96

此外，发明人表明将非天然存在的氨基酸合并到本发明的多肽中是可行的(图22)。具体而言，本发明人表明用K43PrK突变取代K43不会显著影响NB7与PSMA的结合(图22E)。

尽管已经结合其具体实施方式描述了本发明，但显然许多替代、修改和变型对于本领域技术人员来说将是显而易见的。因此，旨在涵盖落入所附权利要求的精神和广泛范围内的所有这些替代、修改和变型。

本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请在此通过引用以其整体并入本说明书中，其程度如同每篇单独的出版物、专利或专利申请被具体地和单独地表明通过引用并入本文。此外，本申请中任何对比文件的引用或标识不应被解释为承认此类对比文件可用作本发明的现有技术。就使用章节标题而言，它们不应被解释为必然限制。

序列表

<110> 国家生物技术研究所公司

<120> 靶向前列腺特异性膜抗原(PSMA)的单域抗体

<130> NIBN-P-023-PCT

<150> 62/893,264

<151> 2019-08-29

<160> 18

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 1

Gly Tyr Thr Asp Ser Asn Tyr Tyr Met Ser

1 5 10

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 2

Gly Val Asn Thr Gly Arg Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 3

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 3

Ala Ala Cys His Phe Cys Asp Ser Leu Pro Lys Thr Gln Asp Glu Tyr

1 5 10 15

Ile Leu

<210> 4

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 4

Gly Trp Pro Tyr Ser Thr Tyr Ser Met Asn

1 5 10

<210> 5

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 5

Gly Ile Ser Ser Thr Met Ser Gly Ile Ile Phe Ala Glu Ser

1 5 10

<210> 6

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 6

Arg Arg Asp Tyr Ser Leu Ser Ser Ser Ser Asp Asp Phe Asp Tyr

1 5 10 15

<210> 7

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 7

Gly Tyr Thr Ala Ser Phe Ser

1 5

<210> 8

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 8

Gly Val Ala Val Ile Asn Val Gly Val Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp

1 5 10 15

Ser Val

<210> 9

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 9

Ser Leu Arg Trp Ser Arg Pro Pro Asn Pro Ile Ser Glu Asp Ala Tyr

1 5 10 15

Asn Tyr

<210> 10

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 10

Gly Ile Ser Ser Thr Met Ser Gly Ile Ile Phe Ala Glu Ser Lys Ala

1 5 10 15

Gly Gln Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala

20 25

<210> 11

<211> 140

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 11

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Pro Gly Tyr Thr Asp Ser Asn Tyr

20 25 30

Tyr Met Ser Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Trp Val

35 40 45

Ala Gly Val Asn Thr Gly Arg Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Met Phe

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Val Ala Ala Cys His Phe Cys Asp Ser Leu Pro Lys Thr Gln Asp

100 105 110

Glu Tyr Ile Leu Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala

115 120 125

Ala Ala Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Gly Ser

130 135 140

<210> 12

<211> 137

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 12

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Arg Ser Gly Trp Pro Tyr Ser Thr Tyr

20 25 30

Ser Met Asn Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Ala Val

35 40 45

Ala Gly Ile Ser Ser Thr Met Ser Gly Ile Ile Phe Ala Glu Ser Lys

50 55 60

Ala Gly Gln Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Arg Arg Asp Tyr Ser Leu Ser Ser Ser Ser Asp Asp Phe Asp

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Tyr

115 120 125

Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Gly Ser

130 135

<210> 13

<211> 140

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 13

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Thr Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Ala Ser Phe Ser

20 25 30

Trp Ile Gly Tyr Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val

35 40 45

Ala Val Ile Asn Val Gly Val Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Glu Asn Thr Ile Ser

65 70 75 80

Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Gly Ser Leu Arg Trp Ser Arg Pro Pro Asn Pro Ile Ser Glu Asp

100 105 110

Ala Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala

115 120 125

Ala Ala Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Gly Ser

130 135 140

<210> 14

<211> 137

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 14

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Glu Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Arg Ser Gly Trp Pro Tyr Ser Thr Tyr

20 25 30

Ser Met Asn Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Ala Val

35 40 45

Ala Gly Ile Ser Ser Thr Met Ser Gly Ile Ile Phe Ala Glu Ser Lys

50 55 60

Ala Gly Gln Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Arg Arg Asp Tyr Ser Leu Ser Ser Ser Ser Asp Asp Phe Asp

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Tyr

115 120 125

Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Gly Ser

130 135

<210> 15

<211> 140

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (14)..(14)

<223> X是Ala或非天然存在的氨基酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (40)..(40)

<223> X是Ala或非天然存在的氨基酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (42)..(42)

<223> X是Gly或非天然存在的氨基酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (43)..(43)

<223> X是Lys或非天然存在的氨基酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (75)..(75)

<223> X是Ala或非天然存在的氨基酸

<400> 15

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Xaa Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Pro Gly Tyr Thr Asp Ser Asn Tyr

20 25 30

Tyr Met Ser Trp Phe Arg Gln Xaa Pro Xaa Xaa Glu Arg Glu Trp Val

35 40 45

Ala Gly Val Asn Thr Gly Arg Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Xaa Lys Asn Thr Met Phe

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Val Ala Ala Cys His Phe Cys Asp Ser Leu Pro Lys Thr Gln Asp

100 105 110

Glu Tyr Ile Leu Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala

115 120 125

Ala Ala Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Gly Ser

130 135 140

<210> 16

<211> 137

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (14)..(14)

<223> X是Ala或非天然存在的氨基酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (40)..(40)

<223> X是Ala或非天然存在的氨基酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (42)..(42)

<223> X是Gly或非天然存在的氨基酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (43)..(43)

<223> X是Lys或非天然存在的氨基酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (75)..(75)

<223> X是Ala或非天然存在的氨基酸

<400> 16

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Xaa Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Arg Ser Gly Trp Pro Tyr Ser Thr Tyr

20 25 30

Ser Met Asn Trp Phe Arg Gln Xaa Pro Xaa Xaa Glu Arg Glu Ala Val

35 40 45

Ala Gly Ile Ser Ser Thr Met Ser Gly Ile Ile Phe Ala Glu Ser Lys

50 55 60

Ala Gly Gln Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Xaa Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Arg Arg Asp Tyr Ser Leu Ser Ser Ser Ser Asp Asp Phe Asp

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Tyr

115 120 125

Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Gly Ser

130 135

<210> 17

<211> 140

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (40)..(40)

<223> X是Ala或非天然存在的氨基酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (42)..(42)

<223> X是Gly或非天然存在的氨基酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (43)..(43)

<223> X是Lys或非天然存在的氨基酸

<400> 17

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Thr Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Ala Ser Phe Ser

20 25 30

Trp Ile Gly Tyr Phe Arg Gln Xaa Pro Xaa Xaa Glu Arg Glu Gly Val

35 40 45

Ala Val Ile Asn Val Gly Val Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Glu Asn Thr Ile Ser

65 70 75 80

Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Gly Ser Leu Arg Trp Ser Arg Pro Pro Asn Pro Ile Ser Glu Asp

100 105 110

Ala Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala

115 120 125

Ala Ala Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Gly Ser

130 135 140

<210> 18

<211> 137

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (14)..(14)

<223> X是Ala或非天然存在的氨基酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (40)..(40)

<223> X是Ala或非天然存在的氨基酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (42)..(42)

<223> X是Gly或非天然存在的氨基酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (43)..(43)

<223> X是Lys或非天然存在的氨基酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (75)..(75)

<223> X是Ala或非天然存在的氨基酸

<400> 18

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Glu Xaa Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Arg Ser Gly Trp Pro Tyr Ser Thr Tyr

20 25 30

Ser Met Asn Trp Phe Arg Gln Xaa Pro Xaa Xaa Glu Arg Glu Ala Val

35 40 45

Ala Gly Ile Ser Ser Thr Met Ser Gly Ile Ile Phe Ala Glu Ser Lys

50 55 60

Ala Gly Gln Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Xaa Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Arg Arg Asp Tyr Ser Leu Ser Ser Ser Ser Asp Asp Phe Asp

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Tyr

115 120 125

Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Gly Ser

130 135

Claims

1.一种抗原结合多肽，其包括选自下列的三个互补决定区(CDR)：

(i)GYTDSNYYMS(CDR-H1；SEQ ID NO：1)、GVNTGRGSTSYADSVKG(CDR-H2；SEQ ID NO：2)和AACHFCDSLPKTQDEYIL(CDR-H3；SEQ ID NO：3)；

(ii)GWPYSTYSMN(CDR-H1；SEQ ID NO：4)、GISSTMSGIIFAES(CDR-H2；SEQ ID NO：5)和RRDYSLSSSSDDFDY(CDR-H3；SEQ ID NO：6)；和

(iii)GYTASFS(CDR-H1；SEQ ID NO：7)、GVAVINVGVGSTYYADSV(CDR-H2；SEQ ID NO：8)和SLRWSRPPNPISEDAYNY(CDR-H3；SEQ ID NO：9)。

2.根据权利要求1所述的抗原结合多肽，其中CDR-H2包括如SEQ ID NO：10(GISSTMSGIIFAESKAGQFTISQDNA)中所列的氨基酸序列。

3.根据权利要求1或2中任一项所述的抗原结合多肽，其是单域抗体。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的抗原结合多肽，包括以下氨基酸序列：QVQLQESGGGSVQAGGSLRLSCTAPGYTDSNYYMSWFRQAPGKEREWVAGVNTGRGSTSYADSVKGRFTISQDNAKNTMFLQMNSLKPEDTAIYYCAVAACHFCDSLPKTQDEYILWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGS(SEQ ID NO：11)。

5.根据权利要求1至3中任一项所述的抗原结合多肽，包括以下氨基酸序列：QVQLQESGGGSVQAGGSLRLSCARSGWPYSTYSMNWFRQAPGKEREAVAGISSTMSGIIFAESKAGQFTISQDNAKNTVYLQMNNLKPEDTAIYYCAARRDYSLSSSSDDFDYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGS(SEQ ID NO：12)。

6.根据权利要求1至3中任一项所述的抗原结合多肽，包括以下氨基酸序列：QVQLQESGGGSVQTGGSLRLSCAASGYTASFSWIGYFRQAPGKEREGVAVINVGVGSTYYADSVKGRFTISRDNTENTISLEMNSLKPEDTGLYYCAGSLRWSRPPNPISEDAYNYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGS(SEQ ID NO：13)。

7.根据权利要求1至3中任一项所述的抗原结合多肽，包括以下氨基酸序列：QVQLQESGGGSVEAGGSLRLSCARSGWPYSTYSMNWFRQAPGKEREAVAGISSTMSGIIFAESKAGQFTISQDNAKNTVYLQMNNLKPEDTAIYYCAARRDYSLSSSSDDFDYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGS(SEQ ID NO：14)。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的抗原结合多肽，其中所述抗原结合多肽对前列腺特异性膜抗原(PSMA)具有特异性结合亲和力。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的抗原结合多肽，其中所述抗原结合多肽的特征在于与所述PSMA的结合常数(K_a)为至少10⁴Molar^-1sec^-1。

10.根据权利要求4所述的抗原结合多肽，其中所述抗原结合多肽的特征在于与所述PSMA的结合常数(K_a)为7.1×10⁵Molar^-1sec^-1。

11.根据权利要求5所述的抗原结合多肽，其中所述抗原结合多肽的特征在于与所述PSMA的结合常数(K_a)为2×10⁴Molar^-1sec^-1。

12.根据权利要求6所述的抗原结合多肽，其中所述抗原结合多肽的特征在于与所述PSMA的结合常数(K_a)为3.6×10⁴Molar^-1sec^-1。

13.根据权利要求7所述的抗原结合多肽，其中所述抗原结合多肽的特征在于与所述PSMA的结合常数(K_a)为2.2×10⁴Molar^-1sec^-1。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的抗原结合多肽，其中所述抗原结合多肽的特征在于与所述PSMA的解离常数(K_D)小于15nM。

15.根据权利要求4所述的抗原结合多肽，其中所述抗原结合多肽的特征在于与所述PSMA的解离常数(K_D)为55pM。

16.根据权利要求5所述的抗原结合多肽，其中所述抗原结合多肽的特征在于与所述PSMA的解离常数(K_D)为6nM。

17.根据权利要求6所述的抗原结合多肽，其中所述抗原结合多肽的特征在于与所述PSMA的解离常数(K_D)为0.6nM。

18.根据权利要求7所述的抗原结合多肽，其中所述抗原结合多肽的特征在于与所述PSMA的解离常数(K_D)为3.4nM。

19.根据权利要求1至18中任一项所述的抗原结合多肽，其中所述抗原结合多肽的特征在于分子量小于25kDa。

20.根据权利要求1至19中任一项所述的抗原结合多肽，其中所述抗原结合多肽对所述PSMA酶的非催化位点具有特异性结合亲和力。

21.根据权利要求1至20中任一项所述的抗原结合多肽，进一步包括至少一种非天然存在的氨基酸。

22.一种药物组合物，其包括治疗或诊断有效量的根据前述权利要求中任一项所述的抗原结合多肽，以及药学上可接受的载体。

23.根据权利要求22所述的药物组合物，进一步包括治疗或诊断有效量的至少一种选自治疗剂、诊断剂和治疗诊断剂的药剂。

24.一种靶向PSMA的方法，所述方法包括使包括所述PSMA的样品与根据权利要求1至21中任一项所述的抗原结合多肽接触，从而靶向PSMA。

25.根据权利要求24所述的方法，其中所述方法用于对患有或怀疑患有PSMA相关病症的受试者中的所述PSMA进行成像，所述方法包括：

a.向所述受试者施用有效量的根据权利要求1至21中任一项所述的抗原结合多肽和显像剂；和

b.在所述受试者中检测所述PSMA，

从而使包括PSMA的细胞成像。

26.根据权利要求24所述的方法，其中所述方法用于在有需要的受试者中治疗PSMA相关病症，所述方法包括：向所述受试者施用包括有效量的根据权利要求1至21中任一项所述的抗原结合多肽、细胞毒剂或治疗诊断剂以及可接受的载体的药物组合物，从而在有需要的受试者中治疗所述PSMA相关病症。

27.根据权利要求25或26所述的方法，其中所述PSMA相关病症是前列腺癌。

28.根据权利要求25或26所述的方法，其中所述PSMA相关病症是选自下列的神经障碍：帕金森病、阿尔茨海默病、亨廷顿病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)、精神分裂症及其任何组合。