CN114786672A - 西达本胺(Chidamide)及塞来昔布(Celecoxib)的抗癌组合 - Google Patents

西达本胺(Chidamide)及塞来昔布(Celecoxib)的抗癌组合 Download PDF

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Abstract

本发明涉及组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂，呈酸性盐形式的西达本胺(chidamide)，及非类固醇抗炎药物(NSAIDs)，呈碱性盐形式的塞来昔布(celecoxib)的组合。本发明亦关于显著调节肿瘤微环境并因此显著改善抗癌活性的方法。

Description

西达本胺(Chidamide)及塞来昔布(Celecoxib)的抗癌组合
技术领域
本发明涉及癌症疗法领域。特别地，本发明提供包含呈盐形式的西达本胺(Chidamide)及塞来昔布(Celecoxib)的组合及其在调节肿瘤微环境及癌症免疫疗法中的应用。
背景技术
癌症免疫疗法是一个快速发展的领域，已取得令人印象深刻并有希望的突破。肿瘤相关抗原的存在的发现现已提高使用宿主免疫系统干预肿瘤生长的可能性。目前正在探索利用免疫系统的体液及细胞组的各种机制以进行癌症免疫疗法。
已提出破坏免疫耐受的几种策略，包括免疫效应子的过继转移、免疫调节疗法及疫苗接种。但是，这些策略仍然不能阻止免疫逃逸。主要的逃逸途径发生在癌细胞中，包括抗凋亡信号传导、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)及环状腺苷单磷酸(cAMP)相关机制。肿瘤微环境是一个重要的研究领域，因为其在肿瘤进展过程中是动态且复杂的。肿瘤通过称为免疫编辑的过程进化出逃避免疫控制的机制，所述过程在肿瘤微环境中提供选择性压力，可导致恶性进展。在称为“免疫逃逸”的促进肿瘤的阶段，免疫系统可通过选择更能抵抗宿主免疫能力的癌细胞或通过改变肿瘤微环境从而促进肿瘤突外生长来进一步促进肿瘤进展。肿瘤微环境的独特性质涉及不同因素，诸如缺氧、酸性pH、血管构造、代谢状态、许多免疫细胞的免疫抑制功能、及细胞介素或趋化激素。这些因素控制免疫逃逸并降低免疫反应。因此，控制肿瘤微环境是抗癌治疗(尤其是免疫疗法)的重要策略之一。
免疫系统稳态包括同时存在刺激及抑制机制来控制免疫系统反应的平衡。抑制机制包括细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4，CD28同源物)、及程式化细胞死亡蛋白1(PD-1)或其配体(PD-L1)、TIM-3(T细胞免疫球蛋白3)、BTLA(B及T淋巴细胞衰减蛋白)、VISTA(T细胞活化的V域Ig抑制因子)及LAG-3(淋巴细胞活化基因3)。刺激机制包括分化簇28(CD28)、肿瘤坏死因子受体超家族成员4(TNFRSF4)(亦称为CD134或称为OX40)、糖皮质激素诱导TNFR家族相关基因(GITR)、肿瘤坏死因子(TNF)受体家族成员(CD137；4-1BB)、肿瘤坏死因子受体超家族成员(CD27)、疱疹病毒进入介体(HVEM)。目前，许多免疫检查点抑制剂单株抗体(包括抗CTLA-4、抗PD-1及抗PD-L1抗体)已被美国FDA、EMA、PMDA及NMPA批准用于多种肿瘤学适应症的治疗用途。然而，对于这些免疫检查点抑制剂，约20％至30％的癌症患者提供单药疗法的肿瘤反应。效力仍不令人满意。将新药与免疫检查点抑制剂组合的策略是提高这些免疫检查点抑制剂的反应率的最新方法。此将提供机会来评估免疫疗法对患有各种晚期癌症的患者的益处。另一方面，对免疫检查点抑制剂的耐药性导致治疗的益处少于所预期的。临床前研究及临床试验中正在进行许多有希望的组合方法。这些有希望的组合方案的努力通过提高免疫反应率及效力为解决耐药性问题带来希望。
US 20180355042及US 20190211103提供包括HDACi及PD-1抑制剂的组合，其可用于治疗癌症，包括减少及/或预防癌症转移。然而，仍然需要开发治疗溶液从而控制肿瘤微环境并改善免疫疗法的抗癌效力。
发明内容
本发明提供包含西达本胺的盐及塞来昔布的盐的组合及调节肿瘤微环境的方法，所述方法通过投与西达本胺盐与其塞来昔布盐的组合来显著改善免疫反应及抗癌活性。
在一个态样中，本发明提供一种组合，所述组合包含西达本胺的酸性盐及塞来昔布的碱性盐。
在一个实施例中，西达本胺的酸性盐及塞来昔布的碱性盐的量分别在约5％(w/w)至约80％(w/w)及约95％(w/w)至约20％(w/w)的范围内。在一个实施例中，西达本胺的酸性盐及塞来昔布的碱性盐的量在重量比约8:1、约4:1、约3:1、约2:1、约1:1、约1:2、约1:3、约1:4或约1:8内。
在一个实施例中，西达本胺的酸性盐及塞来昔布的碱性盐是包含于相同剂型中或独立包含于分开剂型中。在另一个实施例中，剂型是锭剂或胶囊。
在一个实施例中，西达本胺的酸性盐是盐酸盐或硫酸盐。在另一个实施例中，西达本胺的酸性盐是呈结晶或非晶形式。
在一个实施例中，西达本胺的盐酸盐是呈具有X射线粉末绕射(XRPD)图案的结晶形式(形式A)，其峰包含在约16.12°、约19.02°、约21.62°、约23.38°及约30.16°的2-θ值。在另一个实施例中，形式A的XRPD图案进一步具有包含2-θ值在约21.08°、约23.76°、约25.58°、约27.82°及约28.18°的峰。
在又另一个实施例中，西达本胺的盐酸盐是呈具有傅立叶(Fourier)变换红外光谱(FTIR)图案的峰在约3162cm-1、约3059cm-1、约3036cm-1、约2751cm-1、约2588cm-1、约2359cm-1、约2341cm-1、约1667cm-1、约1658cm-1、约1639cm-1、约1620cm-1、约1610cm-1、约1562cm-1、约1517cm-1、约1508cm-1、约1485cm-1、约1468cm-1、约1444cm-1、约1431cm-1、约1307cm-1、约1282cm-1、约1265cm-1、约1243cm-1、约1220cm-1、约1182cm-1、约1145cm-1、约1074cm-1、约1046cm-1的结晶形式(形式A)。
在另一个实施例中，形式A进一步特征为展示与图3(B)所示实质上相同的XRPD图案或与图4(B)所示实质上相同的FTIR图案。
在一个实施例中，西达本胺的硫酸盐是呈具有X射线粉末绕射(XRPD)图案的结晶形式(形式B)，其峰包含在约21.15°、约24.65°、约17.00°、约18.49°及约26.69°的2-θ值。在另一个实施例中，形式B的XRPD图案进一步具有包含2-θ值在约14.74°、约19.45°、约22.00°、约23.55°及约27.94°的峰。
在一个实施例中，西达本胺的硫酸盐是呈具有FTIR图案的峰在约3249cm-1、约3067cm-1、约2578cm-1、约2360cm-1、约1689cm-1、约1664cm-1、约1647cm-1、约1614cm-1、约1568cm-1、约1521cm-1、约1510cm-1、约1486cm-1、约1467cm-1、约1434cm-1、约1412cm-1、约1388cm-1、约1354cm-1、约1328cm-1、约1283cm-1、约1266cm-1、约1252cm-1、约1226cm-1、约1184cm-1、约1099cm-1、约1059cm-1、约1034cm-1及约1022cm-1的结晶形式(形式B)。
在另一个实施例中，形式B进一步特征为展示与图3(C)所示实质上相同的XRPD图案或与图4(C)所示实质上相同的FTIR图案。
在一个实施例中，塞来昔布的碱性盐是塞来昔布的钠盐。在另一个实施例中，塞来昔布的钠盐是呈非晶形式或结晶形式。在另一个实施例中，塞来昔布的钠盐的非晶形式具有与图7(B)所示实质上相同的XRPD图案。
在一个实施例中，塞来昔布的钠盐是呈具有X射线粉末绕射(XRPD)图案的结晶形式(形式I)，其峰包含在约19.85°、约20.51°、约21.51°、约22.55°及约18.25°的2-θ值。在另一个实施例中，形式I的XRPD图案进一步具有包含2-θ值在约10.95°、约14.05°、约14.60°、约17.2°、约25.80°及约27.30°的峰。在另一个实施例中，形式I进一步特征为展示与图7(C)所示实质上相同的XRPD图案。
在一个实施例中，所述组合进一步包含免疫检查点抑制剂及/或化疗剂。在一些实施例中，免疫检查点抑制剂是抗CTLA-4抗体、抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体。免疫检查点抑制剂的某些实施例包括帕姆单抗(pembrolizumab)、彼地利株单抗(pidilizumab)、纳武单抗(nivolumab)、度伐鲁单抗(durvalumab)、阿维单抗(avelumab)、阿特珠单抗(atezolizumab)、特瑞普利单抗(toripalimab)、信迪利单抗(sintilimab)、卡瑞利珠单抗(camrelizumab)及MIHI。
在一个态样中，本发明提供一种通过调节微环境并改善免疫反应来治疗癌症的方法，所述方法包括投与有效量的西达本胺与有效量的塞来昔布的组合。在另一个实施例中，西达本胺及塞来昔布是同时、分开或连续投与。
在一个态样中，本发明提供一种在癌症免疫疗法中调节肿瘤微环境的方法，所述方法包括对个体投与有效量的本文所述的组合。在一个实施例中，西达本胺的酸性盐及塞来昔布的碱性盐是同时、分开或连续投与。
在另一个态样中，本发明提供一种治疗癌症的方法，所述方法包括对个体投与有效量的本文所述的组合。在一个实施例中，癌症是通过调节微环境并改善免疫反应来治疗。在一个实施例中，所述方法进一步包括投与免疫检查点抑制剂。在另一个实施例中，本发明及免疫检查点抑制剂的组合是同时、分开或连续投与。免疫检查点抑制剂的实例是彼等描述于本文中者。
在一个实施例中，与投与西达本胺游离碱及塞来昔布游离酸相比，投与西达本胺的酸性盐及塞来昔布的碱性盐改善药物动力学形态。
癌症的某些实施例包括神经胶质母细胞瘤、肝癌、结肠直肠上皮癌(colorectalcarcinoma)、神经胶质母细胞瘤、胃癌、结肠直肠癌(colorectal cancer)、食道癌、肺癌、胰脏癌、肾细胞癌、良性前列腺增生、前列腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、乳癌、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、梅克尔细胞癌(Merkel cell carcinoma)、非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkinlymphoma)、急性骨髓性白血病(AML)、胆囊癌、胆管癌、膀胱癌及子宫癌。
图式简单说明
图1A至1G表示西达本胺-API、西达本胺-HCl盐及西达本胺-H2SO4盐的1H-NMR及13C-NMR光谱。显示西达本胺-API(活性医药成分)(A)的1H-NMR光谱、西达本胺-HCl盐(B)的1H-NMR光谱及西达本胺-H2SO4盐(C)的光谱1H-NMR。显示西达本胺-API(D)的13C-NMR光谱、西达本胺-HCl盐(E)的13C-NMR光谱及西达本胺-H2SO4盐(F)的13C-NMR光谱。比较西达本胺的不同形式的13C-NMR光谱数据(G)。
图2A至2D表示西达本胺-HCl盐及西达本胺-H2SO4盐的阳性及阴性离子ESI-MS光谱。显示阳性离子模式(A)及阴性离子模式(B)的西达本胺-HCl盐的ESI-MS光谱。显示阳性离子模式(C)及阴性离子模式(D)的西达本胺-H2SO4盐的ESI-MS光谱。
图3A至3D表示西达本胺-API、西达本胺-HCl盐及西达本胺-H2SO4盐的X射线粉末绕射(XRD)光谱。比较西达本胺-API(A)的XRD光谱、西达本胺-HCl盐(B)的XRD光谱、西达本胺-H2SO4盐(C)的XRD光谱并显示西达本胺-API、西达本胺-HCl盐及西达本胺-H2SO4盐的2-θ值(D)是不同的(D)。
图4A至4D显示西达本胺-API、西达本胺-HCl盐及西达本胺-H2SO4盐的傅立叶变换红外光谱(FTIR)光谱。分析西达本胺-API(A)、西达本胺-HCl盐(B)及西达本胺-H2SO4盐(C)的FTIR光谱，以表征西达本胺-API、西达本胺-HCl盐及西达本胺-H2SO4盐(D)。
图5A至5E显示塞来昔布-API及塞来昔布-Na盐的1H-NMR及13C-NMR光谱。塞来昔布-API(活性医药成分)及塞来昔布-Na盐的1H-NMR光谱(400MHz，CDCl3)分别显示于图5A及5B中。塞来昔布-API及塞来昔布-Na盐的13C-NMR光谱分别显示于图5C及5D中。在图5E中比较塞来昔布-API及塞来昔布-Na盐的13C-NMR光谱数据(100MHz，DMSO-d6)。塞来昔布-Na盐可通过不同制程制备为非晶或结晶形式。非晶塞来昔布-Na盐的1H-NMR及13C-NMR光谱具有与结晶盐形式的1H-NMR及13C-NMR光谱相同的图案。
图6显示塞来昔布-Na盐的快速原子轰击质谱(FAB-MS)光谱。非晶塞来昔布-Na盐的FAB-MS光谱具有与结晶盐形式的FAB-MS光谱相同的图案。
图7A至7D显示塞来昔布-API及塞来昔布-Na盐的非晶及结晶形式的X射线粉末绕射(XRD)光谱。塞来昔布-API、塞来昔布-Na盐的非晶及结晶形式的XRD光谱分别显示于图7A、7B及7C中。非晶形式及结晶形式之间的绕射峰明显不同。
图8A至8D显示塞来昔布-API及塞来昔布-Na盐的非晶及结晶形式的傅立叶变换红外光谱(FTIR)光谱。呈晶体及非晶形式的塞来昔布-API及塞来昔布-Na盐的FTIR光谱分别显示于图8A、8B及8C中。在塞来昔布-API与塞来昔布-Na盐间分析FTIR图案的表征(图8D)。
图9A至9D显示西达本胺-HCl盐加塞来昔布-cap与抗PD-1抗体的组合在带有CT26肿瘤的小鼠中的治疗反应。如所示，用各种治疗方法处理带有CT26结肠肿瘤的BALB/c小鼠。IgG，抗IgG对照(媒剂，2.5mg/kg)；PD-1，抗PD-1单株抗体(2.5mg/kg)；CD-HCl，西达本胺-HCl盐12.5、25、50mg/kg；CD-K30，西达本胺-K30(涂布在聚乙烯吡咯啶酮K30上的西达本胺，50mg/kg)；C-cap 50，自胶囊的塞来昔布产物(50mg/kg，
Figure GDA0003700933200000081
)。记录总肿瘤体积及肿瘤尺寸的倍数变化(A)、个体肿瘤体积(B)、带有CT26肿瘤的小鼠体重(C)及动物存活率(D)。在肿瘤植入后，如所示处理带有CT26肿瘤的小鼠并在肿瘤体积达成3000mm3时实施安乐死。显示平均值及标准偏差。亦指示用于每个实验组中的动物的数量及P值。*P<0.05(相对IgG)；#P<0.05(相对PD-1)。使用学生t检验计算P值，学生t检验将适应症组的肿瘤尺寸与IgG组进行比较。通过单向ANOVA，然后通过Tukey多重比较检验(Tukey’s multiplecomparisons test)，分析不同治疗组间的存活率差异。
图10A至10E显示西达本胺-HCl盐加塞来昔布-Na盐与抗PD-1抗体的组合在带有CT26肿瘤的小鼠中的治疗反应。如所示，用各种治疗方法处理带有CT26结肠肿瘤的BALB/c小鼠。IgG，抗IgG对照(媒剂，2.5mg/kg)；PD-1，抗PD-1单株抗体(2.5mg/kg)；CD-HCl，西达本胺-HCl盐(50mg/kg)；C-Na，非晶塞来昔布-Na盐(12.5、25及50mg/kg)；CD-K30，西达本胺-K30(涂布在聚乙烯吡咯啶酮K30上的西达本胺，50mg/kg)；C-胶囊50，自胶囊的塞来昔布产物(50mg/kg，
Figure GDA0003700933200000082
)。记录总肿瘤体积及肿瘤尺寸的倍数变化(A)、个体肿瘤体积(B)、无肿瘤小鼠百分比(C)、带有CT26肿瘤的小鼠体重(D)及动物存活率(E)。在肿瘤植入后，如所示处理带有CT26肿瘤的小鼠并在肿瘤体积达成3000mm3时实施安乐死。显示平均值及标准偏差。亦指示用于每个实验组中的动物的数量及P值。*P<0.05(相对IgG)；#P<0.05(相对PD-1)。使用学生t检验计算P值，学生t检验将适应症组的肿瘤尺寸与IgG组进行比较。通过单向ANOVA，然后通过Tukey多重比较检验，分析不同治疗组间的存活率差异。
图11A至11D证实西达本胺-HCl盐加塞来昔布-Na盐与抗PD-1抗体的组合的最佳治疗反应剂量并评估带有CT26肿瘤的小鼠中西达本胺-H2SO4盐加塞来昔布-Na盐与抗PD-1抗体的组合的治疗反应。如所示，用各种治疗方法处理带有CT26结肠肿瘤(肿瘤尺寸约300mm3)的BALB/c小鼠。IgG，抗IgG对照(媒剂，2.5mg/kg)；PD-1，抗PD-1单株抗体(2.5mg/kg)；CD-HCl，西达本胺-HCl盐(12.5、25及50mg/kg)；C-Na，非晶塞来昔布-Na盐(12.5、25及50mg/kg)；C-Na结晶，结晶塞来昔布-Na盐(50mg/kg)；CD-H2SO4，西达本胺-H2SO4盐(50mg/kg)；CD-K30，西达本胺-K30(涂布于聚乙烯吡咯啶酮K30上的西达本胺，50mg/kg)；C-cap，来自胶囊的塞来昔布产物(50mg/kg，
Figure GDA0003700933200000091
)。记录总肿瘤体积及肿瘤尺寸的倍数变化(A)、个体肿瘤体积(B)、带有CT26肿瘤的小鼠体重(C)及动物存活率(D)。在肿瘤植入后，如所示处理带有CT26肿瘤的小鼠并在肿瘤体积达成3000mm3时实施安乐死。显示平均值及标准偏差。亦指示用于每个实验组中的动物的数量及P值。*P<0.05(相对IgG)；#P<0.05(相对PD-1)。使用学生t检验计算P值，学生t检验将适应症组的肿瘤尺寸与IgG组进行比较。通过单向ANOVA，然后通过Tukey多重比较检验，分析不同治疗组间的存活率差异。
图12A至12D显示通过在带有CT26肿瘤的小鼠中使用抗PD-1或抗CTLA-4 Ab与西达本胺-HCl盐加塞来昔布-Na盐的组合克服对PD-1检查点阻断疗法的抗性。通过投与抗PD-1抗体(2.5mg/kg)的第一线疗法两次(每周两次)来治疗带有CT-26的小鼠(平均肿瘤尺寸约120mm3)。当肿瘤符合第一线疗法的失败标准(其定义为当肿瘤尺寸增加三倍至平均约360mm3且肿瘤体积＜600mm3)时，将小鼠重新纳入第二线疗法研究。如所示，用七种不同方案(n＝9至11只小鼠/组)治疗这些抗PD-1抗性小鼠：IgG，抗-IgG对照(媒剂，2.5mg/kg)；PD-1，抗-PD-1单株抗体(2.5mg/kg)；CTLA-4，抗-CTLA-4单株抗体(2.5mg/kg)；CD-HCl，西达本胺-HCl盐(50mg/kg)；C-Na，非晶塞来昔布-Na盐(50mg/kg)；MS275，恩替司他(entinostat)(20mg/kg)。记录总肿瘤体积及肿瘤尺寸的倍数变化(A)、个体肿瘤体积(B)、带有CT26肿瘤的小鼠体重(C)及动物存活率(D)。在肿瘤植入后，如所示处理带有CT26肿瘤的小鼠并在肿瘤体积达成3000mm3时实施安乐死。显示平均值及标准偏差。亦指示用于每个实验组中的动物的数量及P值。*P<0.05(相对IgG)；#P<0.05(相对PD-1)。使用学生t检验计算P值，学生t检验将适应症组的肿瘤尺寸与IgG组进行比较。通过单向ANOVA，然后通过Tukey多重比较检验，分析不同治疗组间的存活率差异。
图13A至13D显示通过在带有CT26肿瘤的小鼠中使用抗PD-1或抗CTLA-4 Ab与西达本胺-HCl盐加塞来昔布-Na盐的组合克服对PD-L1检查点阻断疗法的抗性。通过投与抗PD-L1抗体(2.5mg/kg)的第一线疗法两次(每周两次)来治疗带有CT-26的小鼠(平均肿瘤尺寸约160mm3)。当肿瘤符合第一线疗法的失败标准(其定义为当肿瘤尺寸增加三倍至平均约320mm3且肿瘤体积＜600mm3)时，将小鼠重新纳入第二线疗法研究。如所示，用七种不同方案(n＝9至11只小鼠/组)治疗这些抗PD-L1抗性小鼠。IgG，抗-IgG对照(媒剂，2.5mg/kg)；PD-1，抗-PD-1单株抗体(2.5mg/kg)；CTLA-4，抗-CTLA-4单株抗体(2.5mg/kg)；CD-HCl，西达本胺-HCl盐(50mg/kg)；C-Na，非晶塞来昔布-Na盐(50mg/kg)；MS275，恩替司他(20mg/kg)。记录总肿瘤体积及肿瘤尺寸的倍数变化(A)、个体肿瘤体积(B)、带有CT26肿瘤的小鼠体重(C)及动物存活率(D)。在肿瘤植入后，如所示处理带有CT26肿瘤的小鼠并在肿瘤体积达成3000mm3时实施安乐死。显示平均值及标准偏差。亦指示用于每个实验组中的动物的数量及P值。*P<0.05(相对IgG)；#P<0.05(相对PD-1)。使用学生t检验计算P值，学生t检验将适应症组的肿瘤尺寸与IgG组进行比较。通过单向ANOVA，然后通过Tukey多重比较检验，分析不同治疗组间的存活率差异。
图14A至14F显示Wistar雄性大鼠中仅西达本胺-HCl盐及塞来昔布-Na盐或组合的PK分布。该大鼠以50mg/kg的剂量经口投与西达本胺-K30、西达本胺-HCl盐、塞来昔布-胶囊(
Figure GDA0003700933200000111
塞来昔布/cap)、或非晶塞来昔布-Na盐。分析西达本胺-K30与西达本胺-HCl盐之间的PK分布的比较(A)。分析塞来昔布/cap与非晶塞来昔布-Na盐之间的PK分布的比较(B)。西达本胺-K30加塞来昔布/cap相对西达本胺-HCl盐加非晶塞来昔布-Na盐的西达本胺PK分布的比较显示于(C)中。西达本胺-K30加塞来昔布/cap相对西达本胺-HCl盐加塞来昔布-Na盐的塞来昔布PK分布的比较显示于(D)中。西达本胺-K30相对西达本胺-HCl盐相对西达本胺-K30加塞来昔布/cap相对西达本胺-HCl盐加塞来昔布-Na盐的西达本胺PK分布的比较显示于(E)中。塞来昔布/cap相对塞来昔布-Na盐相对西达本胺-K30加塞来昔布/cap相对西达本胺-HCl盐加塞来昔布-Na盐的塞来昔布PK分布的比较显示于(F)中。
实施方式
除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语具有与本发明所属技术的一般技术者通常所了解的相同含义。尽管可在实践或测试本发明中使用类似或等效于彼等本文所述者的任何方法及材料，但现描述优选的方法及材料。本文提及的所有公开案均以引用的方式并入本文中。
本文中提及“约”值或参数时包括(并描述)针对该值或参数本身的实施例。例如，提及“约X”的描述包括“X”的描述。例如，术语XRPD图案中2-θ值的“约X°”是指2-θ值的+/-0.2度。
术语“一”及“一个”是指冠词的语法标的中的一者或至多于一者(亦即，至少一者)。举例来说，“一个元素”意指一个元素或多于一个元素。除非另有明确说明，否则使用“或”意指“及/或”。
术语“多晶型物”是指特定结晶堆积配置中化合物(例如，化合物1)或其水合物或溶剂合物的结晶形式。特定化合物的所有多晶型物具有相同的元素组成。如本文所用，术语“结晶”是指由结构单元的有序配置组成的固体状态形式。相同化合物或其水合物或溶剂合物的不同结晶形式是由于固体状态中分子的不同堆积而产生的，此导致不同结晶对称性及/或单位晶胞参数。不同结晶形式通常具有不同X射线绕射图案、红外光谱、熔点、密度、硬度、晶体形状、光学及电学性质、稳定性及/或溶解度。
当(例如)提及XRPD图案时术语“实质上如……中所示”是指不一定与彼等本文所描绘者相同的图，但当由熟习此项技术者考虑时该图落在实验误差或偏差的限制内。
如本文所用，“个体(subject)”、“个体(individual)”及“患者”可互换使用以指代脊椎动物，优选是哺乳动物，更佳是人类。哺乳动物包括(但不限于)鼠类、猿猴、人类、农场动物、运动动物及宠物。亦包括体外获得或体外培养的生物实体的组织、细胞及其子代。
如本文所用，“治疗有效量”意指足以治疗罹患疾病(例如，神经退化性疾病)的个体或缓解与该疾病有关的症状或并发症的量。
如本文所用，术语“治疗(treat/treating/treatment)”及类似语是指减轻或改善病症、及/或与其有关的症状。应明了，尽管没有排除，但治疗某种病症或病情并不要求完全消除该病症、病情或与其有关的症状。
如本文所用，术语“免疫疗法”是指通过包括诱导、增强、抑制或以其他方式改变免疫反应的方法来治疗罹患疾病或处在感染疾病或发生疾病复发的风险中的个体。
如本文所用，术语“程式化细胞死亡蛋白1(PD-1)”是指属于CD28家族的免疫抑制受体。PD-1主要表达于体内先前活化的T细胞上，并结合至两种配体PD-L1及PD-L2。如本文所用术语“PD-1”包括人类PD-1(hPD-1)、hPD-1的变体、同功异型物及物种同源物、及具有至少一个与hPD-1共同的抗原决定基的类似物。完整hPD-1序列可以GenBank寄存编号U64863查找。
如本文所用，术语“程式化死亡配体1(PD-L1)”是PD-1的两个细胞表面糖蛋白配体之一(另一者是PD-L2)，其在结合至PD-1后下调T细胞活化及细胞介素分泌。如本文所用术语“PD-L1”包括人类PD-L1(hPD-L1)、hPD-L1的变体、同功异型物及物种同源物、及具有至少一个与hPD-L1共同的抗原决定基的类似物。完整hPD-L1序列可以GenBank寄存编号Q9NZQ7查找。
如本文所用，“抗体”及“其抗原结合片段”包括天然生成的免疫球蛋白(例如，IgM、IgG、IgD、IgA、IgE等)以及非天然生成的免疫球蛋白，包括(例如)单链抗体、嵌合抗体(例如，人类化鼠类抗体)、异质共轭抗体(例如，双特异性抗体)、Fab'、F(ab').sub.2、Fab、Fv及rIgG。如本文所用，“抗原结合片段”是全长抗体的保留特异性识别抗原的能力的部分、以及这些部分的各种组合。
如本文所用，术语“癌症”是指一宽泛组的各种疾病，其特征在于体内异常细胞的不受控制的生长。不受调节的细胞分裂及生长导致形成恶性肿瘤，其侵袭邻近组织并亦可通过淋巴系统或血流转移至身体的远端部分。如本文所用“癌症”是指原发性、转移性及复发性癌症。
肿瘤微环境是癌症生物学的重要态样，其有助于肿瘤发生、肿瘤进展及对疗法的反应。肿瘤微环境由异质细胞群组成，所述异质细胞群包括恶性细胞及通过广泛串扰(crosstalk)来支持肿瘤增殖、侵袭及转移潜力的细胞。肿瘤细胞通常会诱导免疫抑制微环境，此有利于免疫细胞(诸如骨髓衍生的抑制细胞(MDSC)、肿瘤相关巨噬细胞(TAM)及调节T细胞(Tregs))的免疫抑制群体的发展。因此，已发现在肿瘤微环境中的靶标，其可帮助导引并改善各种癌症疗法的作用，特别是通过增强宿主抗肿瘤免疫反应而起作用的免疫疗法。
本发明惊人地发现组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂(诸如西达本胺或其酸性盐)及非类固醇抗炎药物(NSAID)(诸如塞来昔布或其碱性盐)的组合显著改善免疫反应，调节肿瘤微环境，并因此显著改善抗癌活性。两种活性医药成分优选是呈盐形式或结晶形式或非晶形式。
西达本胺
Figure GDA0003700933200000141
被称为组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂并抑制I类HDAC1、HDAC2、HDAC3、以及IIb类HDAC10。西达本胺的化学名称为具有以下结构的4-(((E)-3-(吡啶-3-基)丙烯酰胺基)甲基)-N-(2-胺基-4-氟苯基)苯甲酰胺。
Figure GDA0003700933200000151
塞来昔布(尤其以商标名称
Figure GDA0003700933200000153
出售)是一种COX-2选择性非类固醇抗炎药物(NSAID)。塞来昔布的化学名称为具有以下结构的4-[5-(4-甲基苯基)-3-(三氟甲基)吡唑-1-基]苯磺酰胺。
Figure GDA0003700933200000152
在本发明中，使用西达本胺的酸性盐(诸如西达本胺-HCl或西达本胺-H2SO4盐)及塞来昔布的碱性形式(诸如塞来昔布-Na盐)。优选地，西达本胺的盐形式是呈结晶形式及塞来昔布的盐形式是呈非晶形式。
特定言之，本文描述西达本胺-HCl盐的结晶形式(结晶形式A)及西达本胺-H2SO4盐(表B)的结晶形式。
本文针对形式A及形式B描绘并描述XRPD图案及FTIR图案。如本文所用，“最大峰”是指绕射图案中强度最高的峰。如本文所用，术语“主要强度峰”包括具有特定X射线粉末绕射图案中峰的前20％中的强度的任何峰。
结晶形式A具有XRPD图案，所述XRPD图案具有包括如本文所述的2-θ值的峰。替代地，西达本胺的盐酸盐是呈结晶形式(形式A)，其具有具有如本文所述的峰的傅立叶变换红外光谱(FTIR)图案。此外，形式A进一步特征为展示与图3(B)所示实质上相同的XRPD图案或与图4(B)所示实质上相同的FTIR图案。
结晶形式B具有XRPD图案，所述XRPD图案具有包括如本文所述的2-θ值的峰。替代地，西达本胺的硫酸盐是呈结晶形式(形式B)，其具有具有如本文所述的峰的FTIR图案。此外，形式B进一步特征为展示与图3(C)所示实质上相同的XRPD图案或与图4(C)所示实质上相同的FTIR图案。
塞来昔布的碱性盐为塞来昔布的钠盐，其是呈非晶形式或结晶形式。在一个实施例中，塞来昔布的钠盐的非晶形式具有与图7(B)所示实质上相同的XRPD图案。
呈结晶形式(形式I)的塞来昔布的钠盐具有具有如本文所述的峰的X射线粉末绕射(XRPD)图案。在另一个实施例中，形式I进一步特征为展示与图7(C)所示实质上相同的XRPD图案。
西达本胺酸性盐是在制造制程中通过强酸性条件(阿瑞尼斯酸(Arrheniusacid)，pKa<3)并通过特定制程生成西达本胺-HCl及西达本胺-H2SO4盐的新颖晶体形式来制备的。这些盐在与塞来昔布-Na盐及免疫检查点抑制剂组合时显著改善水溶解度及药物动力学性质，大大地增强在免疫疗法中的效力。本文实例中说明西达本胺-HCl及西达本胺-H2SO4盐的结晶形式的生成制程。
塞来昔布碱性盐是在制造制程中通过金属氢化物(诸如NaH)并通过特定制程生成塞来昔布-Na盐的“无水”非晶及晶体形式来制备的。非晶塞来昔布-Na盐具有显著水溶解度及新颖药物动力学性质，及当与西达本胺酸性盐及免疫检查点抑制剂组合时于增强在免疫疗法中的效力上产生影响。塞来昔布-Na盐的晶体形式亦观察到相似结果。本文实例说明塞来昔布-Na盐的非晶形式及结晶形式的生成制程。
在一些实施例中，西达本胺-HCl或西达本胺-H2SO4盐组合的量在约5％(w/w)至约80％(w/w)、约30％至约80％(w/w)、约40％至约80％(w/w)、约20％至约60％(w/w)、约30％至约60％(w/w)、约40％至约60％(w/w)或约35％至约60％(w/w)的范围内。
在一些实施例中，塞来昔布-Na盐组合的量在约5％至约80％(w/w)、约30％至约80％(w/w)、约40％至约80％(w/w)、约20％至约60％(w/w)、约30％至约60％(w/w)、约40％至约60％(w/w)或约35％至约60％(w/w)的范围内。
在一个实施例中，本发明的组合是用不同比例的西达本胺-HCl盐或西达本胺-H2SO4盐(可称为西达本胺盐)及塞来昔布-Na盐(可称为塞来昔布盐)产生。与西达本胺-K30(西达本胺产物的初始调配物
Figure GDA0003700933200000171
)及塞来昔布/胶囊(塞来昔布产物的初始调配物
Figure GDA0003700933200000172
)相比，西达本胺盐及塞来昔布盐的药物动力学性质改善。
此外，与西达本胺-K30加塞来昔布/胶囊相比，与免疫检查点抑制剂组合，所述组合(西达本胺盐加塞来昔布盐)显著改善抗癌活性。与单独免疫检查点抑制剂、西达本胺-K30加塞来昔布/胶囊、及甚至两者进一步组合相比，用本发明组合与免疫检查点抑制剂组合治疗显著增强抑制肿瘤生长的效力。此外，所述组合(combo)及免疫检查点抑制剂的组合显著根除肿瘤并将存活率提高至约80至100％。
免疫检查点抑制剂可与本文所述的本发明组合组合使用以刺激抵抗癌细胞的免疫系统并治疗癌症。适用于本发明的免疫检查点抑制剂包括抑制PD-1、PD-L1、CTLA-4、T细胞免疫球蛋白-3(TIM3)、B及T淋巴细胞衰减因子(BTLA)、T细胞活化的V域Ig抑制因子(VISTA)或淋巴细胞活化基因3(LAG3)途径的抑制受体的拮抗剂，诸如抗-PD-1抗体、抗-PD-L1抗体、抗-CTLA-4抗体、抗-TIM-3抗体、抗-BTLA抗体、抗-VISTA抗体及抗-LAG-3抗体。PD-1或PD-L1抑制剂的实例包括(但不限于)阻断人类PD-1的人类化抗体，诸如帕姆单抗(抗-PD-1 Ab，商标名称
Figure GDA0003700933200000181
)、纳武单抗(抗-PD-1 Ab，
Figure GDA0003700933200000182
)或彼地利株单抗(抗-PD-1 Ab，CT-011)、特瑞普利单抗(抗-PD-1 Ab，商标名称Tuo
Figure GDA0003700933200000183
)、信迪利单抗(抗-PD-1Ab，商标名称
Figure GDA0003700933200000184
)、卡瑞利珠单抗(抗-PD-1 Ab)、
Figure GDA0003700933200000185
(抗-PD-L1 Ab，阿维单抗)、
Figure GDA0003700933200000186
(抗-PD-L1 Ab，度伐鲁单抗)、及
Figure GDA0003700933200000187
(抗-PD-L1 Ab，阿特珠单抗)、以及完全人类抗体，诸如纳武单抗(抗-PD-1 Ab，商标名称
Figure GDA0003700933200000188
)及塞米利单抗(cemiplimab)-rwlc(抗-PD-1 Ab，商标名称
Figure GDA0003700933200000189
)。其他PD-1抑制剂可包括可溶性PD-1配体的表达形式，包括(但不限于)PD-L2 Fc融合蛋白(亦称为B7-DC-Ig或AMP-244)及目前正在研究及/或开发用于疗法中的其他PD-1抑制剂。另外，免疫检查点抑制剂可包括(但不限于)阻断PD-L1的人类化或完全人类抗体，诸如度伐鲁单抗及MIH1及目前正在研究的其他PD-L1抑制剂。在一些实施例中，免疫检查点抑制剂的量在约0.5％(w/w)至约15％(w/w)、0.5％(w/w)至约10％(w/w)、0.5％(w/w)至约5％(w/w)、1.0％(w/w)至约20％(w/w)、1.0％(w/w)至约15％(w/w)、1.0％(w/w)至约10％(w/w)或1.0％(w/w)至约5％(w/w)的范围内。
在本发明的一些实施例中，西达本胺-HCl或西达本胺-H2SO4盐、塞来昔布-Na盐及免疫检查点抑制剂是同时投与。在一些实施例中，西达本胺-HCl或西达本胺-H2SO4盐、塞来昔布-Na盐及免疫检查点抑制剂是以任一种顺序或交替地连续投与。
本发明的医药组合可用“载剂”调配。如本文所用，“载剂”包括任何溶剂、分散介质、媒剂、涂料、稀释剂、抗菌剂及/或抗真菌剂、等渗剂、吸收延迟剂、缓冲剂、载剂溶液、悬浮液、胶体及类似物。这些介质及/或试剂于医药活性物质的用途是此项技术中熟知的。例如，医药组合可经特别调配以固体或液体形式投与，包括彼等适于以下者：(1)经口投与，例如，浸液(水性或非水性溶液或悬浮液)、含片、糖衣丸、胶囊、丸剂、锭剂(例如，彼等靶向口颊、舌下及全身吸收者)、大丸剂(boluse)、粉剂、颗粒、施用至舌的糊剂；(2)非经肠投与，例如，通过皮下、肌肉内、静脉内或硬膜外注射，诸如(例如)无菌溶液或悬浮液、或缓释调配物；(3)局部施用，诸如(例如)霜剂、乳剂(lotion)、凝胶、软膏或控释贴剂或施用至皮肤的喷雾；(4)阴道内或直肠内，诸如(例如)子宫托、霜剂、栓剂或泡沫；(5)舌下；(6)经眼；(7)经皮；(8)透黏膜；或(9)经鼻。
本发明的组合可用于调节肿瘤微环境及癌症免疫疗法。癌症的实例包括(但不限于)神经胶质母细胞瘤、肝癌(诸如肝细胞癌)、结肠直肠上皮癌(colorectal carcinoma)、神经胶质母细胞瘤、胃癌、结肠直肠癌(colorectal cancer)、食道癌、肺癌(诸如非小细胞肺癌(NSCLC)及小细胞肺癌)、胰脏癌、肾细胞癌、良性前列腺增生、前列腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、乳癌、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、梅克尔细胞癌、非霍奇金淋巴瘤、急性骨髓性白血病(AML)、胆囊癌、胆管癌、膀胱癌及子宫癌。
本发明的医药组合可以单一调配物提供。在其他实施例中，本发明的医药组合可以单独调配物提供。医药组合可以适于一或多种优选投药途径的多种及/或复数种形式调配。因此，医药组合可通过一或多种已知途径投与，包括(例如)口服、非经肠(例如，皮内、经皮、皮下、肌肉内、静脉内、腹膜内等)、或局部(例如，鼻内、肺内、乳房内、阴道内、子宫内、皮内、经皮、经直肠等)。可将药物组合或其部分投与至黏膜表面，诸如通过投与至(例如)鼻或呼吸道黏膜(例如，通过喷雾或气雾剂)。药物组合或其一部分亦可通过持续释放或延迟释放来投与。
本发明的医药组合可方便地以单位剂型存在并可通过药学技术中熟知的方法来制备。制备与医药上可接受的载剂的组合的方法包括使本发明的医药组合与构成一或多种辅助成分的载剂结合的步骤。一般而言，本发明的医药组合可通过将活性化合物与液体载剂、细分的固体载剂或两者均匀及/或紧密地结合，并然后，若需要，将产品成型为所需调配物来制备。
在一些实施例中，所述方法可包括投与足够量的本发明的医药组合以提供(例如)约10mg/kg至约1,000mg/kg的剂量至个体。
通过以下实例说明本发明。应明了根据如本文所述的本发明范围及精神广义上解释特定实例、材料、量及程式。
实例
材料及方法
材料及设备。西达本胺-API、西达本胺-K30、西达本胺-HCl盐、西达本胺-H2SO4盐及塞来昔布-Na盐由GNT Biotech&Medicals Co.Ltd(Taiwan,China)提供。塞来昔布-API购自Aarti Drugs Ltd(India)。塞来昔布胶囊产品(
Figure GDA0003700933200000201
200mg)购自(Pfizer，Taiwan,China)。以下抗体及试剂用于动物实验：小鼠抗PD-L1(B7-H1)单株抗体(10F.9G2；Bio X Cell)、小鼠抗PD-1(CD279)单株抗体(RMP1-14；Bio X Cell)、小鼠抗CTLA4(CD152)单株抗体(BE0164；Bio X Cell)及大鼠抗IgG2a同型对照单株抗体(2A3；Bio X Cell)。LC/MS级甲醇、HPLC级乙腈、1-庚磺酸钠盐、滑石及乙二胺四乙酸均购自J.T.
Figure GDA0003700933200000202
(USA)。甲酸、氯化钠、乳糖、硬脂酸镁、聚乙烯吡咯啶酮及磷酸三钠十二水合物购自Sigma-Aldrich(USA)。月桂基硫酸钠购自Showa Chemical Co.,Ltd(Japan)。蒸馏水是使用Milli-Q蒸馏系统(Merck
Figure GDA0003700933200000203
France)纯化。盐酸S.G.(HCl)购自Fisher chemical，USA。氢化钠(NaH)，THF 99.5％分子筛购自Acros，Belgium。无水乙醚购自ECHO chemical co.,LTD，Taiwan,China。滤纸购自Toyo Roshi Kaisha,LTD，Japan。1H NMR及13C NMR记录于BrukerAVANCE 400MHz PLUS仪器上。FTIR光谱记录于具有AutoATR系统(Perkin Elmer IR分光光度计)的Perkin Elmer Spotlight 200i Sp2上。粉末X射线绕射测量是在PANalyticalEMPYREAN X绕射仪上进行。电喷雾电离质量记录于Bruker microTOF上。快速原子轰击质量记录于JEOL JMS-700上。Gibco RPMI 1640及具有L-麸酰胺酸的DMEM购自Invitrogen LifeTechnologies。HyClone FBS购自Thermo Scientific。
西达本胺-HCl盐的制备。将一公克的西达本胺-API(活性医药成分)置于烧瓶中且添加3～5ml 6～8N HCl(aq)并通过目测检查搅拌直至完全溶解。然后在没有搅拌条件下产生固体沉淀。通过抽滤制程分离固体沉淀，并通过形成浆液四次以用乙醚除去杂质来进一步纯化。浓缩纯固体并浓缩至干燥。然后在50至60℃下在烤箱中干燥固体产物16小时并研磨成粉末以通过100网目之筛。制备西达本胺-HCl盐并通过HPLC、1H-NMR、13C-NMR、XRD、饱和溶解度、MS及FTIR等的分析进一步特征。亦通过以下制程制备西达本胺-HCl盐。
将65mg西达本胺-API悬浮在50～150ml EtOH、MeOH、DCM、THF或H2O中，然后在搅拌下添加2～6滴37％HCl直至完全溶解。浓缩混合物以除去溶剂直至剩余1ml液体，然后将其滴入至50ml醚中并沉淀出固体盐。
将500mg西达本胺-API添加至4～10ml 4～8N HCl(aq)中并搅拌直至完全溶解。然后添加10～20ml EtOH并然后添加10～20ml醚直至形成起雾外观。结晶制程在4℃下持续12h。通过过滤收集盐并用醚洗涤，并然后在烤箱中在60℃下干燥5h。
西达本胺-H2SO4盐的制备。将一公克的西达本胺-API置于烧瓶中且添加3～5ml 3～5M H2SO4(aq)并通过目测检查搅拌直至完全溶解。将所述溶液慢慢滴入至150～200ml乙醇中并沉淀出固体。通过抽滤制程分离固体，并用乙醇冲洗三次。固体通过浆液制程用乙醇纯化三次，并该固体进一步用乙醚除去过量的水分。浓缩纯固体并浓缩至干燥。然后在50～60℃下在烤箱中干燥固体产物16小时并研磨成粉末以通过100网目之筛。制备西达本胺-H2SO4盐并通过HPLC、1H-NMR、13C-NMR、XRD、饱和溶解度、MS及FTIR等的分析进一步表征。
塞来昔布-Na盐的制备。将五公克塞来昔布-API置于圆底烧瓶中并在无空气条件下在氮气存在下添加150-200ml THF。通过目测检查，所述化合物完全溶解。将450-500mgNaH(氢化钠)添加至所述溶液中并强力搅拌。固体沉淀在约70-90min内形成。通过抽滤制程除去THF并将固体用20ml THF冲洗三次。然后将固体溶解在300ml二氯甲烷(DCM)中，并通过吸滤制程过滤该溶液以除去任何未溶解的。收集滤液并然后通过旋转蒸发器利用压力30-50mbar及旋转速度140rpm浓缩并浓缩至干燥以产生固体。在60℃下干燥纯固体16小时并研磨粉末以通过100网目之筛。制备无水非晶塞来昔布-Na盐并通过1H-NMR、13C-NMR、XRD、MS、FTIR等的光谱进一步分析。
及生成无水非晶塞来昔布-Na盐的其他制程如下所述。将一公克塞来昔布-API置于圆底烧瓶中并在无空气条件下在氮气存在下添加6ml THF。通过目测检查，所述化合物完全溶解。将75～100mg NaH(氢化钠)添加至所述溶液中并强力搅拌。固体沉淀在约40～80min内形成。通过抽滤制程除去THF并将固体用乙醚冲洗三次。通过浆液制程用乙醚纯化固体三次。然后将固体溶解在150～200ml二氯甲烷(DCM)中，并通过吸滤制程过滤该溶液以除去任何未溶解的。收集滤液并然后浓缩并浓缩至干燥。在缩合制程期间，将初始压力设定在400～430mbar，直到没有馏出物。然后将压力设定在10～30mbar直到沉淀出固体盐。在60℃下干燥纯固体16小时并研磨成粉末以通过100网目之筛。制备非晶塞来昔布-Na盐并通过HPLC、1H-NMR、13C-NMR、XRD、饱和溶解度、MS及FTIR等的分析进一步表征。
亦在如以上所述制程下制备无水结晶塞来昔布-Na盐，不同之处在于在缩合制程中将压力设定在10～30mbar直至沉淀出固体盐。
测定西达本胺-HCl、西达本胺-H2SO4及塞来昔布-Na盐的饱和溶解度。将5mg西达本胺-HCl、西达本胺-H2SO4或塞来昔布-Na盐的样品添加至含有ddH2O的5ml容量烧瓶并在培养箱中在25℃下以100rpm振荡90分钟。使所得悬浮液滤过0.22μm过滤器。分别在256nm、256nm及253nm下分光光度法测定西达本胺-HCl、西达本胺-H2SO4及塞来昔布-Na盐的浓度。一式三份测定每个样品的饱和溶解度并报告平均值及标准偏差。标准曲线的制备如以下所述。在99.99％MeOH中制备西达本胺及塞来昔布的储液。发现λmax分别在256nm及253nm。校准曲线显示良好线性，其特征是在0-20μg/ml的Beer浓度范围内相关系数(R2)等于0.9998。
细胞系。CT26(CRL-2638；鼠类结肠直肠腺癌)购自ATCC。CT26肿瘤细胞系在补充10％(vol/vol)FBS的McCoy 5A中于37℃、5％CO2下生长。
动物模型中的抗癌活性。动物研究是由中国台北医学大学机构动物照护及使用委员会(The Taipei Medical University Institutional Animal Care and UseCommittee)批准并监督的(TMU IACUC，编号：LAC-2018-0340)。所有动物实验均使用六-至八周大的雄性BALB/C小鼠(BioLASCO Taiwan,China)。通过皮下注射至每只小鼠的右胁来接种CT26(5×106)癌细胞。在随机化及治疗之前，允许肿瘤生长10至11d(肿瘤尺寸约200-300mm3)。带有CT26的小鼠通过在植入肿瘤后第11天、第14天、第17天、第20天、第23天及第26天腹腔内投药给予2.5mg/kg抗IgG(Lot#65481701)、抗PD-1(Lot#640517M1及Lot#717918D1)、抗PD-L1(Lot#720619F1)或抗CTLA-4(Lot#702418A2B)抗体，并将所有抗体在100μL无菌PBS(pH 7.4)(Invitrogen Life Technologies)中稀释至适宜浓度。在植入肿瘤后第11天经口投与西达本胺-K30、西达本胺-HCl盐、西达本胺-H2SO4盐、塞来昔布(胶囊/
Figure GDA0003700933200000241
200mg)及塞来昔布-Na盐(非晶或结晶形式)。从第11天至第26天，以每天12.5、25及50mg/kg的各种剂量经口投与西达本胺-K30、西达本胺-HCl盐及西达本胺-H2SO4盐来治疗带有肿瘤的小鼠。从第11天至第26天，每天用塞来昔布(胶囊/
Figure GDA0003700933200000242
200mg)或塞来昔布-Na盐以12.5、25.0及50mg/kg的各种剂量进行治疗。从治疗开始直至肿瘤体积达成3,000mm3，测量抗癌活性。肿瘤体积计算为长度×宽度2×0.5。
动物模型中的存活率。从第11天至第25天或第26天进行抗体或药物的投药。在带有肿瘤的小鼠中肿瘤继续生长。每三天或每四天一次(两次/周)测量小鼠的肿瘤体积。当肿瘤体积达成3,000mm3时，带有肿瘤的小鼠被视为死亡。记录并分析所有治疗组。
克服对第一线PD-1检查点阻断疗法的抗性。动物研究是由中国台北医学大学机构动物照护及使用委员会批准并监督的(TMU IACUC，编号：LAC-2018-0340)。所有动物实验均使用六-至八周大的雄性BALB/C小鼠(BioLASCO Taiwan,China)。通过皮下注射至每只小鼠的右胁来接种CT26(5×106)癌细胞。在投与抗PD-1抗体(2.5mg/kg)的第一线治疗两次(两次投药间隔3天)之前，允许肿瘤生长8d(平均肿瘤尺寸约120mm3)。当肿瘤满足在第一线疗法中第二剂量的抗PD-1抗体后的3天内连续增加三倍(平均肿瘤尺寸360mm3)及肿瘤体积＜600mm3的失败标准时，重新入选小鼠。将对抗PD-1 Ab具有抗性的这些小鼠进一步随机分组。通过七种不同方案处理对抗PD-1 Ab具有抗性的小鼠，包括抗IgG(2.5mg/kg；Lot#65481701)、抗PD-1 Ab(2.5mg/kg；Lot#640517M1)、抗PD-1 Ab(2.5mg/kg)与恩替司他(20mg/kg)的组合、抗PD-1 Ab(2.5mg/kg)与西达本胺-HCl盐(50mg/kg)的组合加塞来昔布-Na盐(50mg/kg)、西达本胺-HCl盐(50mg/kg)加塞来昔布-Na盐(50mg/kg)、单独抗CTLA-4 Ab(2.5mg/kg；Lot#702418A2B)或与西达本胺-HCl盐(50mg/kg)的组合加塞来昔布-Na盐(50mg/kg)。在第14天、第17天、第20天、第23天、第26天及第29天(六种治疗，每次治疗间隔3天)经腹膜内(i.p.)投与抗体并将所有抗体在100μL无菌PBS(pH 7.4)(Invitrogen LifeTechnologies)中稀释至适宜浓度。从第14天至第29天经口投与塞来昔布-Na盐、西达本胺-HCl盐及恩替司他。每天给予塞来昔布-Na盐(50mg/kg)、西达本胺-HCl盐(50mg/kg)，然而，每两天给予恩替司他(20mg/kg)。从治疗开始直至肿瘤体积达成3,000mm3，测量抗癌活性。肿瘤体积计算为长度×宽度2×0.5。设计动物研究并显示针对抗PD-1抗体的第一线疗法在发展出对抗PD-1抗体疗法的原发性/继发性抗性的人类癌症患者中失败的潜在治疗选项。
克服对第一线PD-L1检查点阻断疗法的抗性。体内动物研究是由中国台北医学大学机构动物照护及使用委员会批准并监督的(TMU IACUC，编号：LAC-2018-0340)。所有动物实验均使用六-至八周大的雄性BALB/C小鼠(BioLASCO Taiwan,China)。通过皮下注射至每只小鼠的右胁来接种CT26(5×106)癌细胞。在投与抗PD-L1抗体(2.5mg/kg)的第一线治疗两次(两次投药间隔3天)之前，允许肿瘤生长8d(平均肿瘤尺寸约160mm3)。当肿瘤满足在最后一次投与抗PD-L1(Lot#720619F1)抗体后的3天内连续增加两倍(平均肿瘤尺寸320mm3)且肿瘤体积为＜600mm3的失败标准时，重新入选小鼠。将对抗PD-L1 Ab具有抗性的这些小鼠进一步随机分组。通过七种不同方案处理对抗PD-L1 Ab具有抗性的小鼠，包括抗IgG(2.5mg/kg；Lot#65481701)、抗PD-1 Ab(2.5mg/kg；Lot#717918D1)、抗PD-1 Ab(2.5mg/kg)与恩替司他(20mg/kg)的组合、抗PD-1 Ab(2.5mg/kg)与西达本胺-HCl盐(50mg/kg)的组合加塞来昔布-Na盐(50mg/kg)、西达本胺-HCl盐(50mg/kg)加塞来昔布-Na盐(50mg/kg)、单独抗CTLA-4 Ab(2.5mg/kg；Lot#702418A2B)或与西达本胺-HCl盐(50mg/kg)的组合加塞来昔布-Na盐(50mg/kg)。在第14天、第17天、第20天、第23天、第26天及第29天(六种治疗，每次治疗间隔3天)经腹膜内(i.p.)投与抗体并将所有抗体在100μL无菌PBS(pH 7.4)(InvitrogenLife Technologies)中稀释至适宜浓度。从第14天至第29天经口投与塞来昔布-Na盐、西达本胺-HCl盐及恩替司他。每天给予塞来昔布-Na盐(50mg/kg)、西达本胺-HCl盐(50mg/kg)，然而，每两天给予恩替司他(20mg/kg)。从治疗开始直至肿瘤体积达成3,000mm3，测量抗癌活性。肿瘤体积计算为长度×宽度2×0.5。设计动物研究并显示针对抗PD-L1抗体的第一线疗法在发展出对抗PD-L1抗体疗法的原发性/继发性抗性的人类癌症患者中失败的潜在治疗选项。
西达本胺-HCl盐及塞来昔布-Na盐在Wistar大鼠中的PK分布(药物动力学)的分析。在7周大的Wistar雄性大鼠中进行西达本胺、塞来昔布及其盐形式(西达本胺-HCl盐及塞来昔布-Na盐)的药物动力学研究，通过以50mg/kg含在水中的剂量经口投与化合物。Wistar雄性大鼠购自BioLasco(Taiwan,China)。在药物动力学研究之前，将动物禁食12h并自由取得水。在投药后0.08、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、4、6、8、10、12、24、48及72h收集血液样品(n>5/时间点)。在每个时间点，从颈静脉收集约250μL血液于具有EDTA的标记MicrotainerTM管中。在30min的预定采样时间内处理该等血液样品以获得血浆样品。所有血浆样品均储藏在-80℃以下，直至分析。通过使用液相层析-质谱(LC-MS/MS，6470 AgilentTech.，USA)方法，定量极限为14.2ng/mL(西达本胺)及45.5ng/mL(塞来昔布)，用西达本胺-k30、西达本胺-HCl盐、塞来昔布(胶囊/
Figure GDA0003700933200000271
200mg)及非晶形式塞来昔布-Na盐处理，分析血浆样品。使用梯形法则及经过验证的Phoenix WinNonlin软体(版本6.3)的非分隔分析工具计算西达本胺-k30、西达本胺-HCl盐、塞来昔布/
Figure GDA0003700933200000272
及塞来昔布-Na盐的PK参数。药物动力学研究在中国台北医学大学进行并获得机构动物照护及使用委员会批准(IACUC批准号：LAC-2017-0331)。如下所述制备并分析样品。将150μL乙腈(含有10％甲醇)添加至50μL校准标准品或血浆样品并涡旋样品1min以沉淀蛋白质。在4℃、21,130×g下离心15min后，将5μL上清液直接注射至LC-MS/MS中以用于分析。用配备四元泵(1260Infinity II四元泵LC系统)、脱气器、自动进样器、恒温管柱区室及LC-MS/MS-6470质谱仪(Agilent Tech，USA)的6470系列液相层析(Agilent Tech.，USA)进行分析。如下表所述，在40℃及流动相梯度下，在
Figure GDA0003700933200000273
60RP-选择性B管柱(5μm，125×4.6mm，Merck，Germany)上实现层析分离。流速为0.5mL/min。总运行时间为10min。干燥气流及雾化气流设定在6L/min及1.5L/min。系统的干燥气体温度及毛细管电压分别调节至250℃及3000V。以多重反应监测模式，对于西达本胺在正离子电喷雾电离界面中使用在m/z 391.1及265.1的靶离子，及对于塞来昔布在负离子电喷雾电离界面中使用在m/z 380及m/z 316的靶离子，进行LC-MS/MS。
LC/MS的梯度表
Figure GDA0003700933200000281
统计。自至少四个独立实验计算所有数据点的平均值及标准误差。每个实验条件与IgG对照组之间的肿瘤尺寸的成对比较是使用学生两样品t检验(Systat Software，SanJose，CA，USA)进行的。进行学生检验或ANOVA，以分析动物效力数据。Kaplan–Meier曲线及对数等级检验是使用sigma stat 3.5软体生成的。所有P值<0.05在统计学上视为显著的。
实例1 西达本胺-HCl盐的新颖晶体形式的表征
西达本胺已于2014年获得中国CFDA(NMPA)批准用于复发型或难治性周边T细胞淋巴瘤(PTCL)。西达本胺(商标名称，
Figure GDA0003700933200000282
)可作为包含5mg西达本胺的口服用锭剂，及推荐剂量为30mg，每周两次，间隔时间超过3天。该锭剂含有涂布在聚乙烯吡咯啶酮k30(PVP-K30)上的西达本胺-API以改善其水溶解度及口服生物可利用性。在本发明中，吾人开发西达本胺API的调配物以产生呈新颖晶体形式的西达本胺-HCl及西达本胺-H2SO4盐。西达本胺-HCl及西达本胺-H2SO4盐的性质可显著改善水溶解度及口服生物可利用性。如图1所示，通过1H-NMR及13C-NMR识别西达本胺盐的结构。通过使用溶剂二甲基亚砜(DMSO-d6)，使用Bruker AVANCE 400MHz PLUS仪器记录1H NMR。在100MHz下记录13C NMR光谱。1H-NMR数据证实与西达本胺-API相比，在西达本胺-HCl盐中苯胺中NH2基的化学位移信号δH 5.20消失，如图1A及B所示。该结果证实盐形式是在C21-NH2的位置生成的。其可描述为C21-NH3 +Cl-或西达本胺-HCl盐。西达本胺-API及西达本胺-HCl盐的13C-NMR数据显示于图1D及E中。描述西达本胺-API及西达本胺-HCl盐的化学位移数据的详细信息，如表1及图1G所示。此外，使用ESI-MS以确定分子量。使用具有ESI源及离子极性：正/负模式的Bruker microTOF记录西达本胺-HCl盐的质谱。确定西达本胺-HCl盐的正离子模式ESI-MS光谱并显示于图2A中。具最大丰度的峰具有m/z 391.158[M+H]+。然而，确定西达本胺-HCl盐的负离子模式ESI-MS光谱并显示于图2B中。具最大丰度的峰具有m/z 425.118[M+Cl]-。接下来，通过XRD表征西达本胺-HCl盐的晶体形式。分析西达本胺-API与西达本胺-HCl盐之间的XRD分布的比较。在PANalytical EMPYREAN X射线衍射仪上进行XRD测量。对于X射线辐射源，使用Cu(λ＝45kV，40mA)阳极，2θ范围在3°与40°之间，扫描速率为1/min。XRD数据证实西达本胺-API及西达本胺-HCl盐具有不同XRD分布，如图3A(西达本胺-API)及3B(西达本胺-HCl盐)所示。如图3D所示，西达本胺-API与西达本胺-HCl盐之间的2-θ值不同。所述数据指示西达本胺-HCl盐具有不同于西达本胺-API的晶体形式的新颖晶体形式。在饱和溶解度研究中分析西达本胺-API及西达本胺-HCl盐的两种不同晶体形式。如表2所示，西达本胺-HCl盐的水溶性比西达本胺-API及西达本胺-K30高得多。西达本胺-API不溶于水，及西达本胺-K30(西达本胺锭剂的调配物
Figure GDA0003700933200000301
)显示低水溶解度(约26.03μg/mL)。测试三个独立批次的西达本胺-HCl盐并显示分别约554.83、566.90及536.06μg/mL的饱和溶解度。这些结果证实与西达本胺-K30相比，西达本胺-HCl盐显著改善水溶解度20倍以上，如表2所示。西达本胺-HCl盐的水溶解度的改善可增加口服生物可利用性，此然后将改善PK分布及抗癌效力。通过FTIR分析进一步证实西达本胺-HCl盐的结构，如图4所示。在具有AutoATR系统的Perkin ElmerSpotlight 200i Sp2(Perkin Elmer IR分光光度计)上记录FTIR光谱。FTIR光谱是在4000-700cm-1范围内的扫描。如图4B所示，西达本胺-HCl盐的分布丢失苯胺的在3275及3309波数(单位为cm-1)的N-H拉伸信号。图4D表示西达本胺-API(图4A)及西达本胺-HCl盐的FTIR数据的比较。
Figure GDA0003700933200000302
表1.西达本胺-API、西达本胺-HCl盐及西达本胺-H2SO4盐的1H-NMR光谱数据(400MHz，d6-DMSO)。
Figure GDA0003700933200000311
表2.西达本胺-API、西达本胺-HCl盐及西达本胺-H2SO4盐的饱和溶解度研究
Figure GDA0003700933200000312
Figure GDA0003700933200000321
*BDL：低于侦测极限
实例2 西达本胺-H2SO4盐的新颖晶体形式的表征
用H2SO4制备西达本胺的第二盐形式。通过1H-NMR及13C-NMR识别西达本胺-H2SO4盐的结构，如图1C及1F所示。通过使用溶剂二甲基亚砜(DMSO-d6)，使用Bruker AVANCE400MHz PLUS仪器记录1H NMR。在100MHz下记录13C NMR光谱。1H-NMR数据证实与西达本胺-API相比，在西达本胺-H2SO4盐中苯胺中NH2基的化学位移信号δH 5.20消失，如图1C及1A所示。该结果证实盐形式是在C21-NH2的位置生成的。其可描述为C21-NH3 +HSO4 -或西达本胺-H2SO4盐。表1及图1G显示西达本胺-API及西达本胺-H2SO4盐的详细化学位移数据。此外，使用ESI-MS以确定分子量。使用具有ESI源及离子极性：正/负模式的Bruker microTOF记录西达本胺-H2SO4盐的质谱。确定西达本胺-H2SO4盐的正离子模式ESI-MS光谱并显示于图2C中。具最大丰度的峰具有m/z 391.16[M+H]+。然而，确定西达本胺-H2SO4盐的负离子模式ESI-MS光谱并显示于图2D中。具最大丰度的峰具有m/z 487.12[M+HSO4]-。接下来，通过XRD表征西达本胺-H2SO4盐的晶体形式。分析西达本胺-API与西达本胺-H2SO4盐之间的XRD分布的比较。在PANalytical EMPYREAN X射线衍射仪上进行XRD测量。对于X射线辐射源，使用Cu(λ＝45kV，40mA)阳极，2θ范围在3°与40°之间，扫描速率为1/min。XRD数据证实西达本胺-API及西达本胺-H2SO4盐具有不同XRD分布，如图3A(西达本胺-API)及3C(西达本胺-H2SO4盐)所示。如图3D所示，西达本胺-API与西达本胺-H2SO4盐之间的2-θ值不同。该数据指示西达本胺-H2SO4盐具有不同于西达本胺-API的晶体形式的新颖晶体形式。在饱和溶解度研究中分析西达本胺-API及西达本胺-H2SO4盐的两种不同晶体形式。如表2所示，西达本胺-H2SO4盐的水溶性比西达本胺-API及西达本胺-K30高得多。西达本胺-API不溶于水，及西达本胺-K30(西达本胺锭剂的调配物
Figure GDA0003700933200000331
)显示低水溶解度(约26.03μg/mL)。测试三个独立批次的西达本胺-H2SO4盐并显示分别约597.39、652.90及561.5μg/mL的饱和溶解度。这些结果证实与西达本胺-K30相比，西达本胺-H2SO4盐显著改善水溶解度20倍以上，如表2所示。西达本胺-H2SO4盐的水溶解度的改善可增加口服生物可利用性，此然后将改善PK分布及抗癌效力。通过FTIR分析进一步证实西达本胺-H2SO4盐的结构，如图4C所示。在具有AutoATR系统的Perkin Elmer Spotlight200i Sp2(Perkin Elmer IR分光光度计)上记录FTIR光谱。FTIR光谱是在4000-700cm-1范围内的扫描。如图4C所示，西达本胺-H2SO4盐的分布丢失苯胺的在3412及3309波数(单位为cm-1)的N-H拉伸信号。图4D表示西达本胺-API(图4A)及西达本胺-H2SO4盐的FTIR数据的比较。
实例3 塞来昔布-Na盐的新颖非晶形式的表征
非晶形式的特征在于具有短程分子序，而不同于具有分子堆积的长程序列的晶体形式。塞来昔布已被分类为BCS(生物医药分类系统(biopharmaceutical classificationsystem))的类别II。其具有低溶解度及高渗透性性质。大多数商业化药物具有适宜渗透性；溶解是针对于这些药物的吸收的速率限制步骤。另一方面，溶解度是药物开发中的另一个重要问题；非晶形式的制备为低溶解度问题提供有效解决方案。吾人已设计并测试一种独特方法来生成塞来昔布-Na盐的非晶形式。在NaH强碱条件下，发生以Na取代塞来昔布-API的磺酰胺基中的氢并通过多个步骤(包括纯化及凝结)生产新颖非晶塞来昔布-Na盐。首先，比较塞来昔布-API及塞来昔布-Na盐的1H-NMR光谱并显示于图5A及5B中。其清楚地显示，如图5B所示，磺酰胺中的两个氢信号消失。其表明两个Na原子取代磺酰胺基中的两个氢原子产生新颖塞来昔布-Na盐。塞来昔布-API的1H NMR数据(400MHz，CDCl3)描述为：δ2.36(3H,s),4.86(2H,s),6.72(1H,s),7.09(2H,dd),7.16(2H,d),7.46(2H,m),7.89(2H,m)。塞来昔布-Na盐的1H NMR数据(400MHz，CDCl3)描述为：δ2.09(3H,s),6.59(1H,s),6.87(4H,s),6.94(2H,d),7.61(2H,d)。1H-NMR数据证实，与塞来昔布-API相比，在塞来昔布-Na盐中磺酰胺的NH2基中的化学位移信号δH 4.86消失，如图5B及5A所示。此外，在图5C、5D及5E中证实13C-NMR数据。接下来，吾人使用FAB-MS以证实塞来昔布-Na盐的分子量，如图6所示。通过使用具有FAB源及离子极性的JEOL JMS-700：正模式记录塞来昔布-Na盐的质谱。数据证实实测m/z为426.1[M+H+]。其建议塞来昔布-Na盐为C17H12F3N3Na2O2S，分子量为425.04。在FAB-MS中C17H12F3N3Na2O2S的计算m/z为425.04，及实测为426.1(M+H)+。数据再证实塞来昔布-Na盐包含两个钠取代两个氢。接下来，评估非晶塞来昔布-Na盐的水溶解度。如表3所示，塞来昔布-API不溶于水，但塞来昔布-胶囊
Figure GDA0003700933200000341
略不溶于水(约1.19μg/mL)。测试塞来昔布-Na盐的非晶形式的独立三批，分别具有约54.72、54.45及56.72μg/mL的饱和溶解度。与塞来昔布-API及塞来昔布-胶囊相比，塞来昔布-Na盐的水溶解度显著改善。该结果表明塞来昔布-Na的非晶盐形式的改善水溶解度性质可增加口服生物可利用性，并因此提高治疗效力。此外，如图7所示，XRD数据指示塞来昔布-API具有特定晶体图案(图7A)，但非晶塞来昔布-Na盐具有非晶绕射图案，如图7B所示。该结果指示非晶塞来昔布-Na盐具有饱和水溶解度显著改善的特定形式。许多研究致力于通过使用不同聚合物作为载剂来制备塞来昔布的非晶形式。通过FTIR的分析再证实非晶塞来昔布-Na盐的结构，如图8所示。如图8A&8B所示，非晶塞来昔布-Na盐丢失磺酰胺的在3234及3341波数(单位为cm-1)的N-H拉伸。塞来昔布-API与非晶塞来昔布-Na盐之间的FTIR数据比较如图8D所示。
表3.塞来昔布-API、塞来昔布-胶囊及塞来昔布-Na盐(非晶形式或结晶形式)的饱和溶解度研究。
Figure GDA0003700933200000351
*BDL：低于侦测极限
amo：非晶；cry：结晶
实例4 塞来昔布-Na盐的结晶形式的表征
制备结晶塞来昔布-Na盐并通过1H-NMR、13C-NMR、XRD、MS、FTIR分析。如表3所示，来自三个不同批次的塞来昔布-Na盐的结晶形式的水溶解度显示为约111.5、133.63及95.34μg/mL。如图7C及7D所示，结晶塞来昔布-Na盐的晶体绕射图案不同于塞来昔布-API的晶体绕射图案。该结果指示结晶塞来昔布-Na盐具有特定结晶形式，此导致水溶解度显著改善。通过FTIR的分析再证实结晶塞来昔布-Na盐的结构，如图8C所示。如图8C及8D所示，与塞来昔布-API相比，塞来昔布-Na盐丢失磺酰胺的在3234及3341波数(单位为cm-1)的N-H拉伸。
实例5 在带有CT26的小鼠中在与塞来昔布-胶囊及抗PD-1 Ab组合时，西达本胺-K30与西达本胺-HCl盐之间的抗癌活性比较
为研究西达本胺盐形式是否会增强对于肿瘤抑制的效力，吾人评估西达本胺-K30加塞来昔布-胶囊与西达本胺-HCl盐加塞来昔布-胶囊与抗PD-1抗体(2.5mg/kg；Lot#640517M1)的组合在带有CT26的小鼠中的治疗效应。如图9所示，在第11天，带有CT26肿瘤的小鼠中肿瘤尺寸生长至约200-250mm3。然后如所示用6种不同方案治疗小鼠。如图9A所示，与抗PD-1 Ab组相比，西达本胺-K30 50mg/kg加塞来昔布-胶囊50mg/kg与抗PD-1 Ab的组合在带有CT26的小鼠中显著抑制肿瘤生长。12.5、25或50mg/kg剂量的西达本胺-HCl盐加塞来昔布-胶囊50mg/kg与抗PD-1 Ab的组合的结果亦显示与抗PD-1 Ab组相比在带有CT26肿瘤的小鼠中肿瘤生长受到显著抑制。为比较西达本胺盐形式与西达本胺-K30之间的抗癌活性，由以下等级评估效力。在该研究中，吾人定义完全反应(CR，在带有肿瘤的小鼠中，在治疗结束时，肿瘤生长≦0.5倍)；部分反应(PR，肿瘤生长肿瘤尺寸>0.5倍，但在治疗结束时，在带有肿瘤的小鼠中肿瘤生长≦2倍)；疾病稳定(SD，在治疗结束时，在带有肿瘤的小鼠中肿瘤生长在2倍与5倍之间)；进行性疾病(PD，在治疗结束时，在带有肿瘤的小鼠中肿瘤生长等于或大于5倍)。
如图9B所示，与西达本胺-K30 50mg/kg加塞来昔布-胶囊50mg/kg与抗PD-1 Ab组的组合相比，西达本胺-HCl盐50mg/kg加塞来昔布-胶囊50mg/kg与抗PD-1 Ab 2.5mg/kg的组合甚至更有效地抑制带有CT26肿瘤的小鼠中的肿瘤生长。用西达本胺-K30 50mg/kg加塞来昔布-胶囊50mg/kg与抗PD-1 Ab的组合治疗达成6只小鼠(60％)具有CR及4只小鼠PD及中度肿瘤生长，及用西达本胺-HCl盐50mg/kg加塞来昔布-HCl盐50mg/kg与抗PD-1 Ab的组合治疗达成89％的反应率，其中5只小鼠具有PR及3只小鼠具有CR，并没有小鼠具有PD。这些结果表明，由于水溶解度及口服生物可利用性更高，西达本胺-HCl盐形式比西达本胺-K30更有效，此因此改善治疗效力。在图9A及9B中，亦显示与抗PD-1 Ab、西达本胺-HCl盐12.5mg/kg加塞来昔布-胶囊50mg/kg的组合足以影响肿瘤微环境及反应性细胞毒性T淋巴细胞来杀死肿瘤。如图9C所示，治疗组中无一小鼠损失任何体重。在第26天停止治疗后，在IgG对照组中，在带有CT26肿瘤的小鼠中治疗生长更快。然而，西达本胺-HCl盐加塞来昔布-Na盐与免疫检查点抑制剂方案的组合极有效地抑制肿瘤生长并因此显著增加存活率(图9D)。如图9D所示，西达本胺-HCl盐50mg/kg加塞来昔布-胶囊50mg/kg与抗PD-1 Ab的组合显著增加存活率至约77.7％，然而，在带有CT26的肿瘤小鼠模型中，西达本胺-K30 50mg/kg加塞来昔布-胶囊50mg/kg与抗PD-1 Ab的组合仅达成60％存活率。值得注意的是，西达本胺-HCl盐25mg/kg加塞来昔布-胶囊50mg/kg与抗PD-1 Ab的组合显著增加存活率至约66.6％。该结果表明西达本胺-HCl盐加塞来昔布-胶囊比西达本胺-K30加塞来昔布-胶囊更有效地控制并调节肿瘤微环境并增强免疫疗法至某种程度。
该研究亦证明，西达本胺-HCl盐加塞来昔布-胶囊与免疫检查点抑制剂的组合比西达本胺-K30加塞来昔布-胶囊更有效地增强抗癌免疫反应。另一方面，当与抗PD-1 Ab比较时，西达本胺-HCl盐加塞来昔布-胶囊与西达本胺-K30加塞来昔布-胶囊之间的面对面的直接比较已证实与西达本胺-HCl盐加塞来昔布-Na盐的组合方案的抗癌活性优于与西达本胺-K30加塞来昔布-胶囊的组合方案的抗癌活性。
实例6 在带有CT26的小鼠中西达本胺-K30加塞来昔布-胶囊与西达本胺-HCl盐加塞来昔布-Na盐与抗PD-1 Ab的组合之间的抗癌效应的比较
为证实肿瘤抑制活性的改善，吾人评估西达本胺-K30加塞来昔布-胶囊相对西达本胺-HCl盐加塞来昔布-Na盐与抗PD-1抗体(2.5mg/kg；Lot#640517M1)的组合在带有CT26的小鼠中的治疗效应。如图10所示，当在第10天在带有CT26的小鼠中肿瘤尺寸生长至约200至250mm3时，对每个研究组进行治疗。首先，与抗PD-1 Ab组比较，在带有CT26的小鼠中，西达本胺-K30 50mg/kg加塞来昔布-胶囊50mg/kg与抗PD-1 Ab的组合显著抑制肿瘤生长(图10A)。与抗PD-1 Ab组相比，在12.5、25及50mg/kg各种剂量的西达本胺-HCl盐50mg/kg加非晶塞来昔布-Na盐与抗PD-1 Ab的组合的结果显示显著抑制带有CT26的小鼠中的肿瘤生长(图10A)。在图10B中，证实与西达本胺-K30 50mg/kg加塞来昔布-胶囊50mg/kg与抗PD-1 Ab2.5mg/kg的组合相比，西达本胺-HCl盐50mg/kg加不同剂量的塞来昔布-Na盐与抗PD-1 Ab2.5mg/kg的组合甚至更有效地抑制带有CT26的小鼠中的肿瘤生长。这些结果表明西达本胺-HCl盐及塞来昔布-Na盐比西达本胺-K30及塞来昔布-胶囊更有效，因为这些盐形式具有更高的水溶解度及口服生物可利用性并因此改善治疗效力。
在图10A及10B中，显示西达本胺-HCl盐50mg/kg与塞来昔布-Na盐12.5mg/kg的组合足以影响肿瘤微环境及反应性细胞毒性T淋巴细胞来杀死肿瘤。相同剂量(50mg/kg)的西达本胺-K30加塞来昔布-胶囊(达成4只小鼠具有CR，50％)与西达本胺-HCl盐加塞来昔布-Na盐与抗PD-1 Ab 2.5mg/kg的组合之间的抗癌效应的面对面的直接比较显示与盐形式方案之后者组合在带有CT26的小鼠中具有更好的肿瘤生长抑制潜能并达成7只具有小鼠CR(100％)，如图10B所示。此外，如图10C所示，在不同治疗组中评估无肿瘤动物(CR)的百分比。当与西达本胺-K30加塞来昔布-胶囊比较时，与抗PD-1 Ab组合的所有盐形式方案更有效地抑制肿瘤生长(具有更高比例的无肿瘤例)。这些结果表明与塞来昔布-胶囊与免疫检查点抑制剂的组合相比，塞来昔布-Na盐更有效地抑制带有CT26的小鼠模型中的肿瘤生长。与西达本胺-K30相比，西达本胺-HCl亦证实相似结果。该发现亦证实可与免疫检查点抑制剂组合降低西达本胺-HCl盐加塞来昔布-Na盐的剂量，以有效地再活化肿瘤微环境中的细胞毒性T淋巴细胞，来抑制肿瘤生长，如图10A及10B所示。如图10D所示，治疗组中无一小鼠损失任何体重。
在第25天停止治疗后，在IgG(2.5mg/kg；Lot#65481701)对照组中，在带有CT26肿瘤的小鼠中肿瘤生长更快。如图10E所示，在带有CT26的肿瘤小鼠模型中，与西达本胺-K30加塞来昔布-胶囊(约75％)相比，与抗PD-1 Ab组合，西达本胺-HCl盐50mg/kg加塞来昔布-Na盐50mg/kg组显著增加存活率至约100％。抗PD-1组的存活率仅为37.5％。该结果表明西达本胺-HCl盐加塞来昔布-Na盐比西达本胺-K30加塞来昔布-胶囊更有效地控制并调节肿瘤微环境并增强免疫反应至某种程度。总言之，西达本胺-HCl盐加塞来昔布-Na盐与免疫检查点抑制剂方案的组合极有效地抑制肿瘤生长并因此显著增加存活率(图10E)。该研究证明，西达本胺-HCl盐加塞来昔布-Na盐与免疫检查点抑制剂的组合比西达本胺-K30加塞来昔布-胶囊更有效地增强抗癌免疫反应。另一方面，当与抗PD-1 Ab比较时，西达本胺-HCl盐加塞来昔布-Na盐与西达本胺-K30加塞来昔布-胶囊之间的面对面的直接比较已证实与西达本胺-HCl盐加塞来昔布-Na盐的组合方案的抗癌活性优于与西达本胺-K30加塞来昔布-胶囊的组合方案的抗癌活性。
实例7证实西达本胺-HCl盐加塞来昔布-Na盐与抗PD-1抗体的组合的最佳治疗反应剂量并在带有CT26肿瘤的小鼠中评估西达本胺-H2SO4盐加塞来昔布-Na盐与抗PD-1抗体的组合
为测试西达本胺-HCl盐加塞来昔布-Na盐与抗PD-1抗体的组合在带有CT26肿瘤的小鼠中的最佳治疗反应剂量，用不同剂量的西达本胺-HCl盐加塞来昔布-Na盐与抗PD-1抗体的组合治疗肿瘤尺寸约300mm3的小鼠。如图11A所示，西达本胺-HCl盐加非晶塞来昔布-Na盐以50mg/kg的剂量与抗PD-1抗体(2.5mg/kg；Lot#717918D1)组合比以25mg/kg及12.5mg/kg的剂量更佳。该结果亦显示当与西达本胺-K30加塞来昔布-胶囊以50mg/kg的剂量与抗PD-1抗体(2.5mg/kg)组合相比时，西达本胺-HCl盐加塞来昔布-Na盐以25mg/kg的剂量与抗PD-1抗体(2.5mg/kg)组合具有相似治疗反应。已显示，在带有CT26肿瘤的小鼠中，在相同剂量下，当与抗PD-1抗体组合时，西达本胺-HCl盐加塞来昔布-Na盐比西达本胺-K30加塞来昔布-胶囊具有更有效的抗癌活性。此外，在带有CT26肿瘤的小鼠中，在相同剂量下，当与西达本胺-HCl盐加非晶塞来昔布-Na盐相比时，与抗PD-1抗体组合，西达本胺-HCl盐加结晶塞来昔布-Na盐具有降低的抗癌活性效价，如图11B所示。另一方面，西达本胺-H2SO4盐加塞来昔布-Na盐与抗PD-1抗体组合具有类似于西达本胺-HCl盐加塞来昔布-Na盐与抗-PD-1抗体组合的强效抗癌活性的强效抗癌活性，如图11B所示。在该实验中，由于肿瘤在不同治疗之前已达成约300mm3的平均体积且抗PD-1抗体蛋白活性相比以往的研究更低，因此在该研究中抗PD-1抗体治疗的抗癌治疗效应显示极差。如图11B所示，在该研究中，最佳剂量的西达本胺-HCl盐50mg/kg或西达本胺-H2SO4盐50mg/kg加塞来昔布-Na盐以50mg/kg的剂量与抗PD-1抗体(2.5mg/kg)组合具有最佳治疗反应。此外，在组合方案中，非晶塞来昔布-Na盐比结晶塞来昔布-Na盐获得更佳反应率。当治疗前肿瘤尺寸平均约300mm3时，西达本胺-K30加塞来昔布-胶囊与抗PD-1抗体组合仅达成反应率约33％。然而，西达本胺-HCl盐或西达本胺-H2SO4盐加塞来昔布-Na盐与抗PD-1抗体的组合分别显著改善反应率高至62.5％及55.5％。这些结果证实在带有CT26肿瘤的小鼠中西达本胺及塞来昔布的盐形式比西达本胺-K30及塞来昔布-胶囊更有效地增强免疫反应率。如图11C所示，治疗组中无一小鼠损失任何体重。
在第26天停止治疗后，在IgG对照组中，带有CT26肿瘤的小鼠中的肿瘤生长更快。然而，西达本胺-HCl盐或西达本胺-H2SO4盐加塞来昔布-Na盐与免疫检查点抑制剂方案的组合极有效地抑制肿瘤生长并因此显著增加存活率(图11D)。如图11D所示，在该研究中西达本胺-K30 50mg/kg加塞来昔布-胶囊50mg/kg与抗PD-1抗体组组合仅增加存活率至约22％，因为抗PD-1抗体抗癌活性相比以往的结果更低。另一方面，在带有CT26肿瘤的小鼠模型中，西达本胺-HCl盐或西达本胺-H2SO4盐50mg/kg加塞来昔布-Na盐50mg/kg与抗PD-1抗体组的组合分别显著增加存活率至约37.5％或44.4％。该结果表明西达本胺-HCl盐或西达本胺-H2SO4盐加塞来昔布-Na盐与抗PD-1抗体的组合比西达本胺-K30加塞来昔布-胶囊与抗PD-1抗体的组合更有效地控制并调节肿瘤微环境并增强免疫反应至某种程度。该研究亦证明，西达本胺-HCl盐或西达本胺-H2SO4盐加塞来昔布-Na盐与免疫检查点抑制剂的组合比西达本胺-K30加塞来昔布-胶囊与免疫检查点抑制剂的组合更有效地增强抗癌免疫反应。另一方面，当与抗PD-1 Ab比较时，西达本胺-HCl盐加塞来昔布-Na盐与西达本胺-K30加塞来昔布-胶囊之间的面对面的直接比较已证实与西达本胺-HCl盐加塞来昔布-Na盐的组合方案的抗癌活性优于与西达本胺-K30加塞来昔布-胶囊的组合方案的抗癌活性。
实例8 通过在带有CT26的小鼠中用抗PD-1/抗CTLA-4 Ab与西达本胺-HCl盐加塞来昔布-Na盐的组合进行第二线治疗克服对第一线抗PD-1 Ab治疗的抗性
在该研究中，以第二线疗法治疗小鼠以模仿在人类第一线癌症疗法中发生的第一线耐药性的治疗，其中接受第一线抗PD-1抗体疗法的很大一部分人类癌症患者将发展出抗性，以评估当第一线抗PD-1抗体疗法失败时西达本胺-HCl盐加塞来昔布-Na盐与抗PD-1/抗CTLA-4抗体的组合的第二线疗法的抗癌效价。评价西达本胺-HCl盐加塞来昔布-Na盐是否可通过调节肿瘤微环境来改善免疫检查点抑制剂敏感性。在投与抗PD-1抗体(2.5mg/kg；Lot#717918D1)的第一线治疗两次(两次投药间隔3天)之前，允许肿瘤生长8d(平均肿瘤尺寸约120mm3)。当肿瘤满足在第一线疗法中第二剂量的第一线抗PD-1抗体疗法后的3天内连续增加三倍(平均肿瘤尺寸360mm3)及肿瘤体积＜600mm3的治疗失败标准时，重新入选小鼠。将对抗PD-1 Ab具有抗性的这些小鼠进一步随机分组。如所示，有十种不同治疗方案(n＝9至11只小鼠/组)。将这些小鼠随机分为不同第二线治疗组，包括抗IgG Ab(2.5mg/kg；Lot#65481701)、抗PD-1 Ab(2.5mg/kg；Lot#717918D1)、作为阳性对照的恩替司他(20mg/kg)与抗PD-1 Ab(2.5mg/kg)的组合、西达本胺-K30加塞来昔布-胶囊、西达本胺-HCl盐(50mg/kg)加塞来昔布-Na盐(50mg/kg)、塞来昔布-K30加塞来昔布-胶囊与抗PD-1 Ab的组合、西达本胺-HCl盐(50mg/kg)加塞来昔布-Na盐(50mg/kg)与抗PD-1 Ab(2.5mg/kg)的组合、抗CTLA-4Ab(2.5mg/kg；Lot#702418A2B)、西达本胺-K30加塞来昔布-胶囊与抗CTLA-4 Ab(2.5mg/kg)的组合、西达本胺-HCl盐(50mg/kg)加塞来昔布-Na盐(50mg/kg)与抗CTLA-4 Ab(2.5mg/kg)组的组合。抗体经腹膜内(i.p)处理六次(两次注射间隔3天)。经口投与恩替司他八次(每2天给予)。西达本胺-K30或西达本胺-HCl盐及塞来昔布-胶囊或塞来昔布-Na盐以口服16次(每天)治疗。如图12A及12B所示，在抗PD-1 Ab组中没有小鼠达成PR(反应率0％)及8只小鼠具有PD及快速肿瘤生长。与西达本胺-K30加塞来昔布-胶囊相比，用西达本胺-HCl盐加塞来昔布-Na盐治疗更有效地抑制肿瘤生长。用西达本胺-HCl盐加塞来昔布-Na盐治疗显示3只小鼠达成CR及4只小鼠达成PD及肿瘤快速生长(反应率33.3％)。然而，用西达本胺-K30加塞来昔布-胶囊治疗显示仅1只小鼠达成PR及8只小鼠达成PD及肿瘤快速生长(反应率10％)。当西达本胺-HCl盐加塞来昔布-Na盐与抗PD-1 Ab组合时，结果证实4只小鼠达成CR(反应率36.3％)及6只小鼠达成PD且肿瘤生长慢得多。然而，用西达本胺-K30加塞来昔布-胶囊与抗PD-1 Ab组合治疗显示仅1只小鼠达成PR及9只小鼠达成PD及肿瘤中度生长(反应率10％)。该结果表明抗PD-1 Ab在对抗PD-1 Ab具有抗性的小鼠中没有抗癌活性。此外，在对抗PD-1Ab具有抗性的小鼠中，西达本胺-HCl盐加塞来昔布-Na盐方案极有效地控制肿瘤微环境并增加抗PD-1 Ab敏感性。且与西达本胺-HCl盐加塞来昔布-Na盐的盐形式组合相比，用西达本胺-K30加塞来昔布-胶囊治疗显示抗癌活性少得多。如图12B所示，与抗PD-1 Ab组相比，抗CTLA-4 Ab组适度地抑制肿瘤生长，但没有小鼠曾经达成CR或PR及有7只小鼠达成PD及中度肿瘤生长。然而，在西达本胺-HCl盐加塞来昔布-Na盐与抗CTLA-4 Ab组的组合中，结果证实4只小鼠达成CR，2只小鼠达成PR(反应率60％)并没有PD小鼠。及在西达本胺-K30加塞来昔布-胶囊与抗CTLA-4 Ab组的组合中，结果证实2只小鼠达成CR，1只小鼠达成PR(反应率25％)及5只小鼠实现PD及中度肿瘤生长。最后，在阳性对照组中，恩替司他与抗PD-1 Ab组合，1只小鼠达成PR(反应率9％)及8只小鼠达成PD及快速肿瘤生长。总之，西达本胺-HCl盐加塞来昔布-Na盐方案有效地增强对抗PD-1 Ab具有抗性的小鼠的反应率。此外，在对抗PD-1 Ab具有抗性的小鼠中，西达本胺-HCl盐加塞来昔布-Na盐当与抗CTLA-4 Ab组合时比与抗PD-1 Ab组合时可更有效地增强反应率。
在第31天停止治疗后，带有CT26肿瘤的小鼠中的肿瘤在抗PD-1及抗CTLA-4组中生长更快(图12D)。在第60天评估存活率。用未组合抗PD-1 Ab的西达本胺-K30加塞来昔布-胶囊治疗比组合PD-1 Ab显示更佳存活率，分别达成11.1％及0％。及用未组合抗PD-1 Ab的西达本胺-HCl盐加塞来昔布-Na盐治疗比组合抗PD-1 Ab显示更佳存活率，分别达成44％及40％。结果指示在治疗后停用西达本胺-K30加塞来昔布-胶囊或西达本胺-HCl盐加塞来昔布-Na盐与抗PD-1 Ab组合比西达本胺-K30加塞来昔布-胶囊或西达本胺-HCl盐加塞来昔布-Na盐意外地显示更快肿瘤生长。该研究亦证明，西达本胺-HCl盐加塞来昔布-Na盐与抗CTLA-4 Ab组合比西达本胺-HCl加塞来昔布-Na与抗PD-1 Ab组合更有效地增强抗癌免疫反应。然而，西达本胺-HCl盐加塞来昔布-Na盐与抗CTLA-4 Ab组合比西达本胺-K30加塞来昔布-胶囊与抗CTLA-4 Ab组合更有效地抑制肿瘤生长，分别达成存活率77.8％及41.6％(图12D)。另一方面，当与抗PD-1 Ab组合时，西达本胺-HCl盐加塞来昔布-Na盐与MS-275之间的面对面的直接比较已证实在抗PD-1抗性条件下，与西达本胺-HCl盐加塞来昔布-Na盐的组合方案的抗癌活性优于与MS-275的组合方案的抗癌活性。
实例9 在带有CT26的小鼠中通过用抗PD-1/抗CTLA-4 Ab与西达本胺-HCl盐加塞来昔布-Na盐组合进行第二线治疗克服对第一线抗PD-L1 Ab治疗的抗性
在该研究中，吾人进一步测试在用抗PD-L1 Ab第一线疗法治疗后针对于耐药性的发生进行第二线组合治疗，并评估当第一线抗PD-L1抗体疗法失败时用西达本胺-HCl盐加塞来昔布-Na盐与抗PD-1/抗CTLA-4抗体组合进行第二线疗法的抗癌效价。测试在对第一线抗PD-L1抗体治疗的耐药性后西达本胺-HCl盐加塞来昔布-Na盐是否可通过调节肿瘤微环境来改善免疫检查点抑制剂的敏感性。用抗PD-L1抗体(2.5mg/kg；Lot#720619F1)的第一线疗法治疗带有CT-26肿瘤的小鼠(平均肿瘤尺寸约160mm3)两次(两次注射间隔3天)。当肿瘤满足在第一线疗法中第二剂量的第一线抗PD-L1抗体疗法后的3天内连续增加三倍(平均肿瘤尺寸320mm3)及肿瘤体积＜600mm3的治疗失败标准时，重新入选小鼠。将对抗PD-L1 Ab具有抗性的这些小鼠进一步随机分组。如所示，有十种不同治疗方案(n＝9至11只小鼠/组)。将这些小鼠随机分为不同第二线治疗组，包括抗IgG Ab(2.5mg/kg；Lot#65481701)、抗PD-1Ab(2.5mg/kg；Lot#717918D1)、作为阳性对照的恩替司他(20mg/kg)加塞来昔布-胶囊与抗PD-1 Ab(2.5mg/kg)的组合、西达本胺-K30加塞来昔布-胶囊、西达本胺-HCl盐(50mg/kg)加塞来昔布-Na盐(50mg/kg)、塞来昔布-K30加塞来昔布-胶囊与抗PD-1 Ab的组合、西达本胺-HCl盐(50mg/kg)加塞来昔布-Na盐(50mg/kg)与抗PD-1 Ab(2.5mg/kg)的组合、抗CTLA-4 Ab(2.5mg/kg；Lot#702418A2B)、西达本胺-K30加塞来昔布-胶囊与抗CTLA-4 Ab(2.5mg/kg)的组合、西达本胺-HCl盐(50mg/kg)加塞来昔布-Na盐(50mg/kg)与抗CTLA-4 Ab(2.5mg/kg)组的组合。腹膜内(i.p)六次(每3天投与)对抗体进行治疗。经口投与恩替司他八次(每2天投与)。西达本胺-K30或西达本胺-HCl盐及塞来昔布-胶囊或塞来昔布-Na盐以口服16次(每天)治疗。如图13A及13B所示，在对照组抗IgG组中，2只小鼠达成PR及3只小鼠达成PD及快速肿瘤生长(反应率28.6％)，此是因为对第一线抗PD-L1疗法具有反应性的小鼠由于对第一线治疗之反应延迟被误认为对抗PD-L1 Ab治疗具有抗性。然而，在抗PD-1 Ab组中，1只小鼠达成PR，2只小鼠达成CR及3只小鼠达成PD及快速肿瘤生长(反应率33.3％)。与西达本胺-K30加塞来昔布-胶囊相比，用西达本胺-HCl盐加塞来昔布-Na盐治疗更有效地抑制肿瘤生长。用西达本胺-HCl盐加塞来昔布-Na盐治疗显示6只小鼠达成CR，1只小鼠达成PR及无PD小鼠(反应率70％)。然而，用西达本胺-K30加塞来昔布-胶囊治疗显示2只小鼠达成CR，4只小鼠达成PR及3只小鼠达成PD及快速肿瘤生长(反应率54.5％)。当西达本胺-HCl盐加塞来昔布-Na盐与抗PD-1 Ab组合时，结果证实6只小鼠达成CR(反应率66.6％)及1只小鼠达成PD及缓慢肿瘤生长。然而，用西达本胺-K30加塞来昔布-胶囊与抗PD-1 Ab组合治疗显示4只小鼠达成CR，1只小鼠达成PR(反应率62.5％)及1只小鼠达成PD及快速肿瘤生长。数据表明与西达本胺-K30加塞来昔布-胶囊方案相比，西达本胺-HCl盐加塞来昔布-Na盐方案更有效地控制肿瘤微环境并增加抗PD-L1抗性小鼠中的抗PD-1 Ab敏感性。
在图13B中，数据显示抗CTLA-4 Ab第二线治疗显著抑制肿瘤生长，及2只小鼠达成CR，3只小鼠达成PR及3只小鼠达成PD及快速肿瘤生长(反应率55.5％)。然而，在用西达本胺-HCl盐加塞来昔布-Na盐与抗CTLA-4 Ab的组合治疗的组中，结果证实4只小鼠达成CR，3只小鼠达成PR及没有PD小鼠(反应率77.7％)。及在西达本胺-K30加塞来昔布-胶囊与抗CTLA-4 Ab组组合中，结果证实2只小鼠达成CR，3只小鼠达成PR及1只小鼠达成PD及快速肿瘤生长(反应率55.5％)。最后，在用恩替司他加塞来昔布-胶囊与抗PD-1 Ab组合作为阳性对照治疗的组中，结果显示2只小鼠达成CR，1只小鼠达成PR及3只小鼠达成PD及快速肿瘤生长(反应率50％)。总之，西达本胺-HCl盐加塞来昔布-Na盐方案有效地增强PD-L1抗性小鼠的反应率。此外，在PD-L1抗性小鼠中，西达本胺-HCl盐加塞来昔布-Na盐与免疫检查点抑制剂的组合比西达本胺-K30加塞来昔布-胶囊与免疫检查点抑制剂的组合更有效地增强反应率。
在第31天停止治疗后，带有CT26肿瘤的小鼠中的肿瘤在抗PD-1及抗CTLA-4组中生长更快(图13D)。在第62天评估存活率。用西达本胺-K30加塞来昔布-胶囊与抗PD-1 Ab组合治疗比无PD-1 Ab显示更佳存活率，分别达成62.5％及27.2％。及用西达本胺-HCl盐加塞来昔布-Na盐与抗PD-1 Ab组合治疗比无抗PD-1 Ab显示更佳存活率，分别达成77％及44％。结果指示在治疗后停用西达本胺-K30加塞来昔布-胶囊或西达本胺-HCl盐加塞来昔布-Na盐比西达本胺-K30加塞来昔布-胶囊或西达本胺-HCl盐加塞来昔布-Na盐与抗PD-1 Ab组合意外地显示更快肿瘤生长。该研究亦证明西达本胺-HCl盐加塞来昔布-Na盐与抗CTLA-4 Ab组合有效地增强抗癌免疫反应。然而，西达本胺-HCl盐加塞来昔布-Na盐与抗CTLA-4 Ab组合比西达本胺-K30加塞来昔布-胶囊与抗CTLA-4 Ab组合更有效地抑制肿瘤生长，分别达成存活率66.6％及44.4％(图13D)。另一方面，当与抗PD-1 Ab组合时，西达本胺-HCl盐加塞来昔布-Na盐与MS-275加塞来昔布-胶囊之间的面对面的直接比较已证实在抗PD-L1抗性条件下，与西达本胺-HCl盐加塞来昔布-Na盐的组合方案的抗癌活性优于与MS-275加塞来昔布-胶囊的组合方案的抗癌活性。
实例10在Wistar雄性大鼠中研究西达本胺-HCl盐与塞来昔布-Na盐组合的PK(药物动力学)概况。
单独西达本胺-HCl盐加非晶形式塞来昔布-Na盐或与抗PD-1抗体的组合具有极有效的抗癌免疫活性。因此，吾人研究Wistar大鼠中西达本胺-HCl盐与塞来昔布-Na盐组合相对于西达本胺-K30与塞来昔布-胶囊组合的PK特性。如图14A所示，分析Wistar大鼠中通过口服西达本胺-HCl盐(50mg/kg)及西达本胺-K30(50mg/kg)的西达本胺血液浓度-时间分布。在表4中，结果证实西达本胺的Cmax及Tmax对于盐形式是显著改变。在西达本胺-HCl盐组中，Cmax为2065.2(ng/mL)及Tmax为0.14h。然而，在西达本胺-K30组中，Cmax为786.3ng/mL及Tmax为0.39h。与西达本胺-K30的吸收率相比，西达本胺-HCl盐的吸收率极显著增加。然而，如表4所示，AUC、MRT及T1/2的值未显著改变。这些结果表明在Wistar大鼠中与西达本胺-K30相比，西达本胺-HCl盐具有更快的吸收性质并达成更高的Cmax，但并未增加循环系统中西达本胺的总量。如图14B所示，分析Wistar大鼠中口服50mg/kg塞来昔布-Na盐及50mg/kg塞来昔布-胶囊的塞来昔布血液浓度-时间分布。该结果证实在Wistar大鼠中于口服后Tmax、Cmax、AUC、AUMC、MRT及T1/2的值在塞来昔布-Na盐与塞来昔布-胶囊之间无显著差异，如表5所示。
接下来，分析在Wistar大鼠中通过口服西达本胺-HCl盐加塞来昔布-Na盐与西达本胺-K30加塞来昔布-胶囊(剂量为50mg/kg)之间的西达本胺PK分布的比较。如图14C及表4所示，与西达本胺-K30加塞来昔布-胶囊组相比，西达本胺的Cmax值在西达本胺-HCl盐加塞来昔布-Na盐组中显著增加，且该等值分别为约2244.5ng/mL及862.3ng/mL。如表4所示，与西达本胺-K30加塞来昔布-胶囊组相比，西达本胺的Tmax值在西达本胺-HCl盐加塞来昔布-Na盐组中显著减小，且该等值分别为约0.14h及0.25h。与西达本胺-K30加塞来昔布-胶囊组相比，西达本胺的AUC值在西达本胺-HCl盐加塞来昔布-Na盐组中略增加，且该等值分别为约5977ng*h/mL及4201ng*h/mL。两种组合之间AUMC值的相似比较结果显示于表4中。如表4所示，显示两组之间的MRT及T1/2的值没有差异。如图14E及表4所示，西达本胺-HCl盐与西达本胺-HCl盐加塞来昔布-Na盐之间的PK分布比较显示略有变化。提出在就ADME(吸收、分布、代谢及排泄)方面，在用西达本胺-HCl盐加塞来昔布-Na盐治疗中，西达本胺PK分布未因存在塞来昔布-Na盐而受到显著影响。然而，如表4所示，对西达本胺的AUC值影响轻微，及西达本胺-HCl及西达本胺-HCl盐加塞来昔布-Na盐组的AUC值分别为约4113ng/mL及5977ng/mL。
另一方面，如图14D及表5所示，在Wistar大鼠中，通过口服，当将西达本胺-K30加塞来昔布-胶囊与西达本胺-HCl盐加塞来昔布-Na盐(50mg/kg)比较时，塞来昔布PK分布没有显著改变。然而，如图14F及表5所示，单独塞来昔布-Na盐或塞来昔布-胶囊比西达本胺-K30加塞来昔布-胶囊或西达本胺-HCl盐加塞来昔布-Na盐具有显著更低的Cmax及AUC。这些结果表明西达本胺-K30或西达本胺-HCl盐的存在显著改变塞来昔布ADME分布，并因此显著增加塞来昔布的Cmax及AUC值。然而，由于存在塞来昔布-Na盐或塞来昔布-胶囊，西达本胺PK分布未受到显著影响。总言之，证实西达本胺-HCl盐加塞来昔布-Na盐具有显著改变的ADME分布，此因此当与免疫检查点抑制剂组合时实现有效肿瘤抑制并增加存活，表明在面对耐药性的第二线疗法的挑战中盐形式比西达本胺-K30加塞来昔布-胶囊具有更佳抗癌效价。
表4.在Wistar雄性大鼠中用西达本胺-K30、西达本胺-HCl盐、西达本胺-k30加塞来昔布-胶囊、及西达本胺-HCl盐加塞来昔布-Na盐治疗的西达本胺药物动力学参数。
Figure GDA0003700933200000501
值为平均值±标准偏差(SD)。aP<0.05，相对于西达本胺-k30，bP<0.05，相对于西达本胺-HCl盐；cP<0.05，相对于西达本胺-k30加塞来昔布-cap。用西达本胺-k30、西达本胺-HCl盐、西达本胺-k30加塞来昔布-cap、及西达本胺-HCl盐加塞来昔布-Na盐治疗的大鼠之间的差异表示为平均值±SD并通过单向ANOVA然后Tukey多重比较检验分析。
Tmax：达到Cmax的时间。
Cmax：投药后药物的峰值血浆浓度。
AUC0→t：曲线下面积。
MRT：平均滞留时间
T1/2：药物浓度达到其原始值的一半所需的时间。
表5.在Wistar雄性大鼠中用塞来昔布-胶囊、塞来昔布-Na盐、塞来昔布-胶囊加西达本胺-k30、及塞来昔布-Na盐加西达本胺-HCl盐治疗的塞来昔布药物动力学参数。
Figure GDA0003700933200000511
值为平均值±标准偏差(SD)。aP<0.05，相对于塞来昔布/cap，bP<0.05，相对于塞来昔布-Na盐；cP<0.05，相对于西达本胺-k30加塞来昔布-cap。用西达本胺-k30、西达本胺-HCl盐、西达本胺-k30加塞来昔布-cap、及西达本胺-HCl盐加塞来昔布-Na盐治疗的大鼠之间的差异表示为平均值±SD并通过单向ANOVA然后Tukey多重比较检验分析。
Tmax：达到Cmax的时间。
Cmax：投药后药物的峰值血浆浓度。
AUC0→t：曲线下面积。
MRT：平均滞留时间
T1/2：药物浓度达到其原始值的一半所需的时间。

Claims (32)

1.一种组合，其包含西达本胺(chidamide)的酸性盐及塞来昔布(celecoxib)的碱性盐。
2.如权利要求1的组合，其中所述西达本胺的酸性盐及所述塞来昔布的碱性盐的量分别在约5％(w/w)至约80％(w/w)及约95％(w/w)至约20％(w/w)的范围内。
3.如权利要求1的组合，其中所述西达本胺的酸性盐及所述塞来昔布的碱性盐的量在重量比约8:1、约4:1、约2:1、约1:1、约1:2、约1:4或约1:8内。
4.如权利要求1的组合，其中所述西达本胺的酸性盐及所述塞来昔布的碱性盐是包含于相同剂型中或独立包含于分开剂型中。
5.如权利要求4的组合，其中所述剂型是锭剂或胶囊。
6.如权利要求1的组合，其中所述西达本胺的酸性盐是西达本胺的盐酸盐或硫酸盐。
7.如权利要求6的组合，其中所述西达本胺的盐形式是呈结晶形式。
8.如权利要求6的组合，其中所述西达本胺的盐酸盐是呈具有X射线粉末绕射(XRPD)图案包含2-θ值在约16.12°、约19.02°、约21.62°、约23.38°及约30.16°的峰的结晶形式(形式A)。
9.如权利要求8的组合，其中所述形式A的XRPD图案进一步具有包含2-θ值在约21.08°、约23.76°、约25.58°、约27.82°及约28.18°的峰。
10.如权利要求6的组合，其中所述西达本胺的盐酸盐是呈具有傅立叶(Fourier)变换红外光谱(FTIR)图案的峰在约3162cm-1、约3059cm-1、约3036cm-1、约2751cm-1、约2588cm-1、约2359cm-1、约2341cm-1、约1667cm-1、约1658cm-1、约1639cm-1、约1620cm-1、约1610cm-1、约1562cm-1、约1517cm-1、约1508cm-1、约1485cm-1、约1468cm-1、约1444cm-1、约1431cm-1、约1307cm-1、约1282cm-1、约1265cm-1、约1243cm-1、约1220cm-1、约1182cm-1、约1145cm-1、约1074cm-1、约1046cm-1的结晶形式(形式A)。
11.如权利要求8或10的组合，其中形式A进一步特征为展示与图3(B)所示实质上相同的XRPD图案或与图4(B)所示实质上相同的FTIR图案。
12.如权利要求6的组合，其中所述西达本胺的硫酸盐是呈具有X射线粉末绕射(XRPD)图案包含2-θ值在约21.15°、约24.65°、约17.00°、约18.49°及约26.69°的峰的结晶形式(形式B)。
13.如权利要求12的组合，其中所述形式B的XRPD图案进一步具有包含2-θ值在约14.74°、约19.45°、约22.00°、约23.55°及约27.94°的峰。
14.如权利要求6的组合，其中所述西达本胺的硫酸盐是呈具有FTIR图案的峰在约3249cm-1、约3067cm-1、约2578cm-1、约2360cm-1、约1689cm-1、约1664cm-1、约1647cm-1、约1614cm-1、约1568cm-1、约1521cm-1、约1510cm-1、约1486cm-1、约1467cm-1、约1434cm-1、约1412cm-1、约1388cm-1、约1354cm-1、约1328cm-1、约1283cm-1、约1266cm-1、约1252cm-1、约1226cm-1、约1184cm-1、约1099cm-1、约1059cm-1、约1034cm-1及约1022cm-1的结晶形式(形式B)。
15.如权利要求12或14的组合，其中形式B进一步特征为展示与图3(C)所示实质上相同的XRPD图案或与图4(C)所示实质上相同的FTIR图案。
16.如权利要求1的组合，其中所述塞来昔布的碱性盐是塞来昔布的钠盐。
17.如权利要求16的组合，其中所述塞来昔布的钠盐是呈非晶形式或结晶形式。
18.如权利要求17的组合，其中所述非晶形式具有与图7(B)所示实质上相同的XRPD图案。
19.如权利要求16的组合，其中所述结晶形式(形式I)具有X射线粉末绕射(XRPD)图案包含2-θ值在约19.85°、约20.51°、约21.51°、约22.55°及约18.25°的峰。
20.如权利要求19的组合，其中形式I的所述XRPD图案进一步具有包含2-θ值在约10.95°、约14.05°、约14.601°、约17.2°、约25.80°及约27.30°的峰。
21.如权利要求19的组合，其中形式I进一步特征为展示与图7(C)所示实质上相同的XRPD图案。
22.如权利要求1的组合，其中所述组合进一步包含免疫检查点抑制剂及/或化疗剂，在一些实施例中，所述免疫检查点抑制剂是抗CTLA-4抗体、抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体。
23.如权利要求22的组合，其中所述免疫检查点抑制剂是帕姆单抗(pembrolizumab)、彼地利株单抗(pidilizumab)、纳武单抗(nivolumab)、度伐鲁单抗(durvalumab)、阿维单抗(avelumab)、阿特珠单抗(atezolizumab)、特瑞普利单抗(toripalimab)、信迪利单抗(sintilimab)、卡瑞利珠单抗(camrelizumab)或MIHI。
24.一种在癌症免疫疗法中调节肿瘤微环境的方法，所述方法包括投与有效量的如权利要求1至22中任一项的组合。
25.如权利要求24的方法，其中所述西达本胺的酸性盐及所述塞来昔布的碱性盐是同时、分开或连续投与。
26.一种治疗癌症的方法，其包括对个体投与有效量的如权利要求1至22中任一项的组合。
27.如权利要求24或26的方法，其中所述方法进一步包括投与免疫检查点抑制剂。
28.如权利要求24或26的方法，其中，与西达本胺游离碱及塞来昔布游离碱的药物动力学概况(profile)相比，投与所述西达本胺的酸性盐及所述塞来昔布的碱性盐改善药物动力学概况。
29.如权利要求27的方法，其中如权利要求1至22中任一项的组合及所述免疫检查点抑制剂是同时、分开或连续投与。
30.如权利要求24或26的方法，其中所述癌症是神经胶质母细胞瘤、肝癌、结肠直肠上皮癌(colorectal carcinoma)、神经胶质母细胞瘤、胃癌、结肠直肠癌(colorectalcancer)、食道癌、肺癌、胰脏癌、肾细胞癌、良性前列腺增生、前列腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、乳癌、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、梅克尔细胞癌(Merkel cell carcinoma)、非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin lymphoma)、急性骨髓性白血病(AML)、胆囊癌、胆管癌、膀胱癌或子宫癌。
31.一种经由调节肿瘤微环境并改善免疫反应来治疗癌症的方法，所述方法包括投与有效量的西达本胺与有效量的塞来昔布组合。
32.如权利要求31的方法，其中所述西达本胺及塞来昔布是同时、分开或连续投与。
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