KR20220061179A

KR20220061179A - 치다마이드 및 셀레콕시브의 항암 조합물

Info

Publication number: KR20220061179A
Application number: KR1020227011577A
Authority: KR
Inventors: 지아-시옹 첸; 무-수안 양; 청-한 초우; 이-홍 우; 즈-하오 추; 예-수 차오; 치아-난 첸
Original assignee: 지엔티 바이오테크 & 메디컬즈 코포레이션
Priority date: 2019-09-11
Filing date: 2019-09-11
Publication date: 2022-05-12
Also published as: CA3153597A1; EP4028002A1; AU2019465985B2; EP4028002A4; MX2022002856A; BR112022004471A2; CN114786672A; WO2021046765A1; AU2019465985A1; JP2022547555A

Abstract

본 발명은 히스톤 데아세틸라제(HDAC) 억제제인 산성 염 형태의 치다마이드, 및 비스테로이드성 항-염증 약물(NSAID)인 염기성 염 형태의 셀레콕시브의 조합물을 제공한다. 본 발명은 또한, 종양 미세환경을 유의미하게 조절하고, 이에 따라, 항암 활성을 크게 개선시키는 방법을 제공한다.

Description

치다마이드 및 셀레콕시브의 항암 조합물

본 개시내용은 암 치료법 분야에 관한 것이다. 구체적으로, 본 개시내용은 염 형태의 치다마이드 및 셀레콕시브를 포함하는 조합물, 및 종양 미세환경의 조절 및 암 면역요법에서의 이의 적용을 제공한다.

암 면역 요법은 인상적이고 유망한 돌파구를 만드는 빠르게 발전하는 분야이다. 최근에는 종양-관련 항원 존재의 발견으로 인해 종양 성장에서 개입하는 숙주의 면역 체계의 사용 가능성이 높아졌다. 면역 체계의 체액 및 세포 아암 둘 모두를 활용하는 다양한 메커니즘은 현재 암 면역요법에 대해 탐구되고 있다.

면역 이펙터, 면역조절 요법, 및 백신접종의 입양 전달을 포함하는 면역 관용을 파괴하기 위한 여러 전략이 제안되어 있다. 그러나, 이러한 전략들은 면역 회피를 여전히 방지하지 못한다. 주요 회피 경로는 항-아폽토시스 신호전달, 미토겐-활성화 단백질 키나제(MAPK), 및 시클릭 아데노신 모노포스페이트(cAMP) 관련 메커니즘을 포함하는 암 세포에서 발생한다. 종양 미세환경은 종양 진행의 과정에서 역동적이고 복잡하기 때문에 중요한 연구 분야이다. 종양은 면역 편집이라고 하는 과정에 의해 면역 조절을 회피하기 위한 메커니즘을 발달시키며, 이는 악성 진행을 초래할 수 있는 종양 미세환경에서 선택적 압력을 제공한다. '면역 회피(immune escape)'로서 지칭되는 종양-촉진 단계에서, 면역 체계는 숙주의 면역적격(immunocompetence)에서 더 잘 생존할 수 있는 암 세포를 선택하거나 종양 성장이 촉진되는 방식으로 종양 미세환경을 변형시킴으로써 추가로 종양 진행시킬 수 있다. 종양 미세환경의 독특한 특성은 여러 면역 세포의 저산소증, 산성 pH, 혈관 설계자, 대사 상태, 면역억제 기능 및 시토카인 또는 케모카인과 같은 상이한 인자와 관련이 있다. 이러한 인자들은 면역 회피를 제어하고, 면역 반응을 감소시킨다. 이에 따라, 종양 미세환경을 제어하는 것은 항암 치료, 특히, 면역요법을 위한 중요한 전략들 중 하나이다.

면역 체계 항상성은 면역 체계 반응에서의 균형을 제어하기 위해 자극 메커니즘 및 억제 메커니즘 둘 모두의 존재를 포함한다. 억제 메커니즘은 세포독성 T 림프구 관련 항원-4 (CTLA-4, CD28 동족체), 및 프로그래밍된 세포 사멸 단백질-1(PD-1) 또는 이의 리간드(PD-L1), TIM-3(T 세포 면역글로불린-3), BTLA(B 및 T 림프구 감쇠자), VISTA(T 세포 활성화의 V-도메인 Ig 억제인자) 및 LAG-3(림프구-활성화 유전자 3)을 포함한다. 자극 메커니즘은 분화 클러스트 28(CD28), CD134 또는 OX40으로도 알려진 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리, 구성원 4(TNFRSF4), 글루코코르티코이드-유도 TNFR 패밀리 관련 유전자(GITR), 종양 괴사 인자(TNF) 수용체 패밀리의 구성원(CD137; 4-1BB), 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리의 구성원(CD27), 헤르페스바이러스 진입 매개체(HVEM)를 포함한다. 현재, 여러 면역 관문 억제제 모노클로날 항체-포함 항-CTLA-4, 항-PD-1, 및 항-PD-L1 항체는 US FDA, EMA, PMDA, 및 NMPA에 의해 여러 종양학적 적응증에서 치료 용도로 승인되었다. 그러나, 이러한 면역 관문 억제제에 대하여, 암 환자의 약 20% 내지 30%는 단일 요법에 대한 종양 반응을 제공하였다. 효능은 여전히 만족스럽지 못하다. 면역 관문 억제제를 갖는 신규한 약물 조합물의 전략은 이러한 면역 관문 억제제의 반응률을 상승시키기 위한 최근 접근법이다. 이러한 것은 다양한 진행성 암을 가진 환자들에게 면역요법의 혜택을 평가할 기회를 제공할 것이다. 한편, 면역 관문 억제제에 대한 약물 저항은 치료 혜택이 기대 이하로 야기되었다. 여러 유망한 병용 방법은 전임상 연구 및 임상 시험에서 진행되었다. 이러한 유망한 병용 요법의 노력은 면역 반응률 및 효능을 개선시킴으로써 약물 저항의 문제를 해결할 수 있는 희망을 가져온다.

US 20180355042호 및 US 20190211103호에는 암 전이를 감소 및/또는 예방하는 것을 포함하는, 암을 치료하는 데 유용한 HDACi 및 PD-1 억제제를 포함하는 조합물이 제공된다. 그러나, 종양 미세환경을 제어하고 면역요법의 항암 효능을 개선하기 위한 치료 솔루션을 개발하는 것이 여전히 요구되고 있다.

본 개시내용은 치다마이드(chidamide)의 염 및 셀레콕시브(celecoxib)의 염을 포함하는 조합물, 및 이의 셀레콕시브 염과 조합하여 치다마이드 염을 투여함으로써 면역 반응 및 항암 활성을 크게 개선시키는, 종양 미세환경을 조절하는 방법을 제공한다.

일 양태에서, 본 개시내용은 치다마이드의 산성 염 및 셀레콕시브의 염기성 염을 포함하는 조합물을 제공한다.

일 구현예에서, 치다마이드의 산성 염 및 셀레콕시브의 염기성 염의 양은 각각 약 5%(w/w) 내지 약 80%(w/w) 및 약 95%(w/w) 내지 약 20%(w/w)의 범위이다. 일 구현예에서, 치다마이드의 산성 염 및 셀레콕시브의 염기성 염의 양은 약 8:1, 약 4:1, 약 3:1, 약 2:1, 약 1:1, 약 1:2, 약 1:3, 약 1:4 또는 약 1:8의 중량비이다.

일 구현예에서, 치다마이드의 산성 염 및 셀레콕시브의 염기성 염은 동일한 투약 형태에 함유되어 있거나, 별개의 투약 형태에 독립적으로 함유되어 있다. 추가 구현예에서, 투약 형태는 정제 또는 캡슐이다.

일 구현예에서, 치다마이드의 산성 염은 하이드로클로라이드 염 또는 설페이트 염이다. 다른 구현예에서, 치다마이드의 산성 염은 결정질 또는 비정질 형태이다.

일 구현예에서, 치다마이드의 하이드로클로라이드 염은 약 16.12도, 약 19.02도, 약 21.62도, 약 23.38도 및 약 30.16도에서 2-세타 값을 포함하는 피크를 갖는 X선 분말 회절(XRPD) 패턴을 갖는 결정질 형태(형태 A)이다. 다른 구현예에서, 형태 A의 XRPD 패턴은 약 21.08도, 약 23.76도, 약 25.58도, 약 27.82도 및 약 28.18도에서 2-세타 값을 포함하는 피크를 추가로 갖는다.

또 다른 구현예에서, 치다마이드의 하이드로클로라이드 염은 약 3162 cm^-1, 약 3059 cm^-1, 약 3036 cm^-1, 약 2751 cm^-1, 약 2588 cm^-1, 약 2359 cm^-1, 약 2341 cm^-1, 약 1667 cm^-1, 약 1658 cm^-1, 약 1639 cm^-1, 약 1620 cm^-1, 약 1610 cm^-1, 약 1562 cm^-1, 약 1517 cm^-1, 약 1508 cm^-1, 약 1485 cm^-1, 약 1468 cm^-1, 약 1444 cm^-1, 약 1431 cm^-1, 약 1307 cm^-1, 약 1282 cm^-1, 약 1265 cm^-1, 약 1243 cm^-1, 약 1220 cm^-1, 약 1182 cm^-1, 약 1145 cm^-1, 약 1074 cm^-1, 약 1046 cm^-1에서 피크를 갖는 푸리에 변환 적외선 분광(FTIR) 패턴을 갖는 결정질 형태(형태 A)이다.

추가 구현예에서, 형태 A는 도 3b에 도시된 것과 실질적으로 동일한 XRPD 패턴 또는 도 4b에 도시된 것과 실질적으로 동일한 FTIR 패턴을 나타내는 것으로서 추가로 특징된다.

일 구현예에서, 치다마이드의 설페이트 염은 약 21.15도, 약 24.65도, 약 17.00도, 약 18.49도 및 약 26.69도에서 2-세타 값을 포함하는 피크를 갖는 X선 분말 회절(XRPD) 패턴을 갖는 결정질 형태(형태 B)이다. 다른 구현예에서, 형태 B의 XRPD 패턴은 약 14.74도, 약 19.45도, 약 22.00도, 약 23.55도 및 약 27.94도에서 2-세타 값을 포함하는 피크를 추가로 갖는다.

일 구현예에서, 치다마이드의 설페이트 염은 약 3249 cm^-1, 약 3067 cm^-1, 약 2578 cm^-1, 약 2360 cm^-1, 약 1689 cm^-1, 약 1664 cm^-1, 약 1647 cm^-1, 약 1614 cm^-1, 약 1568 cm^-1, 약 1521 cm^-1, 약 1510 cm^-1, 약 1486 cm^-1, 약 1467 cm^-1, 약 1434 cm^-1, 약 1412 cm^-1, 약 1388 cm^-1, 약 1354 cm^-1, 약 1328 cm^-1, 약 1283 cm^-1, 약 1266 cm^-1, 약 1252 cm^-1, 약 1226 cm^-1, 약 1184 cm^-1, 약 1099 cm^-1, 약 1059 cm^-1, 약 1034 cm^-1 및 약 1022 cm^-1에서 피크를 갖는 FTIR 패턴을 갖는 결정질 형태(형태 B)이다.

추가 구현예에서, 형태 B는 도 3c에 도시된 것과 실질적으로 동일한 XRPD 패턴 또는 도 4c에 도시된 것과 실질적으로 동일한 FTIR 패턴을 나타내는 것으로서 추가로 특징된다.

일 구현예에서, 셀레콕시브의 염기성 염은 셀레콕시브의 나트륨 염이다. 다른 구현예에서, 셀레콕시브의 나트륨 염은 비정질 형태 또는 결정질 형태이다. 다른 구현예에서, 셀레콕시브의 나트륨 염의 비정질 형태는 도 7b에 도시된 것과 실질적으로 동일한 XRPD 패턴을 갖는다.

일 구현예에서, 셀레콕시브의 나트륨 염은 약 19.85도, 약 20.51도, 약 21.51도, 약 22.55도 및 약 18.25도에서 2-세타 값을 포함하는 피크를 갖는 X선 분말 회절(XRPD) 패턴을 갖는 결정질 형태(형태 I)이다. 다른 구현예에서, 형태 I의 XRPD 패턴은 약 10.95도, 약 14.05도, 약 14.60도, 약 17.2도, 약 25.80도 및 약 27.30도에서 2-세타 값을 포함하는 피크를 추가로 갖는다. 추가 구현예에서, 형태 I은 도 7c에 도시된 것과 실질적으로 동일한 XRPD 패턴을 나타내는 것으로서 추가로 특징된다.

일 구현예에서, 조합물은 면역 관문 억제제 및/또는 화학 치료제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 면역 관문 억제제는 항-CTLA-4 항체, 항-PD-1 항체 또는 항-PD-L1 항체이다. 면역 관문 억제제의 특정 구현예는 펨브롤리주맙, 피딜리주맙, 니볼루맙, 두르발루맙, 아벨루맙, 아테졸리주맙, 토리팔리맙, 신틸리맙, 캄렐리주맙, 및 MIHI를 포함한다.

일 양태에서, 본 개시내용은 유효량의 셀레콕시브와 함께 유효량의 치다마이드를 투여하는 것을 포함하여, 미세환경의 조절 및 면역 반응의 개선을 통해 암을 치료하는 방법을 제공한다. 추가 구현예에서, 치다마이드 및 셀레콕시브는 동시에, 별도로 또는 순차적으로 투여된다.

일 양태에서, 본 개시내용은 대상체에 유효량의 본원에 기술된 조합물을 투여하는 것을 포함하여, 암 면역요법에서 종양 미세환경을 조절하는 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 치다마이드의 산성 염 및 셀레콕시브의 염기성 염은 동시에, 별도로 또는 순차적으로 투여된다.

다른 양태에서, 본 개시내용은 대상체에 유효량의 본원에 기술된 조합물을 투여하는 것을 포함하여, 암을 치료하는 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 암은 미세환경의 조절 및 면역 반응의 개선을 통해 치료된다. 일 구현예에서, 방법은 면역 관문 억제제를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 다른 구현예에서, 본 개시내용의 조합물 및 면역 관문 억제제는 동시에, 별도로 또는 순차적으로 투여된다. 면역 관문 억제제의 예는 본원에 기술된 것이다.

일 구현예에서, 치다마이드의 산성 염 및 셀레콕시브의 염기성 염의 투여는 치다마이드 자유 염기 및 셀레콕시브 자유 산의 약동학 프로파일과 비교하여 약동학 프로파일을 개선시킨다.

암의 특정 구현예는 교모세포종, 간암, 대장 암종, 교모세포종, 위암, 대장암, 식도암, 폐암, 췌장암, 신세포 암종, 양성 전립선 비대증, 전립선암, 난소암, 흑색종, 유방암, 만성 림프구성 백혈병(CLL), 메르켈 세포 암종, 비-호지킨 림프종, 급성 골수성 백혈병(AML), 담낭암, 담관암종, 비뇨기 방광암, 및 자궁암을 포함한다.

도 1a 내지 도 1g는 치다마이드-API, 치다마이드-HCl 염, 및 치다마이드-H ₂ SO ₄ 염에 대한 ¹ H-NMR 및 ¹³ C-NMR 스펙트럼을 나타낸다. 치다마이드-API(활성 약제학적 성분)의 ¹H-NMR 스펙트럼(a), 치다마이드-HCl 염의 ¹H-NMR 스펙트럼(b), 및 치다마이드-H₂SO₄ 염의 ¹H-NMR 스펙트럼(c)이 도시되어 있다. 치다마이드-API의 ¹³C-NMR 스펙트럼(d), 치다마이드-HCl 염의 ¹³C-NMR 스펙트럼(e), 및 치다마이드-H₂SO₄ 염의 ¹³C-NMR 스펙트럼(f)이 도시되어 있다. 상이한 형태들의 치다마이드의 ¹³C-NMR 스펙트럼의 데이터는 비교되어 있다(g).
도 2a 내지 도 2d는 치다마이드-HCl 염 및 치다마이드-H ₂ SO ₄ 염에 대한 양이온 및 음이온 ESI-MS 스펙트럼 둘 모두를 나타낸다. 양이온 모드(a) 및 음이온 모드(b)에서 치다마이드-HCl 염의 ESI-MS 스펙트럼이 도시되어 있다. 양이온 모드(c) 및 음이온 모드(d)에서 치다마이드-H₂SO₄ 염의 ESI-MS 스펙트럼이 도시되어 있다.
도 3a 내지 도 3d는 치다마이드-API, 치다마이드-HCl 염, 및 치다마이드-H ₂ SO ₄ 염에 대한 X선 분말 회절(XRD) 스펙트럼을 나타낸다. 치다마이드-API의 XRD 스펙트럼(a), 치다마이드-HCl 염의 XRD 스펙트럼(b), 치다마이드-H₂SO₄ 염의 XRD 스펙트럼(c)은 비교되었고, 치다마이드-API, 치다마이드-HCl 염, 및 치다마이드-H₂SO₄ 염의 2-세타 값이 상이함을 나타내었다(d).
도 4a 내지 도 4d는 치다마이드-API, 치다마이드-HCl 염, 및 치다마이드-H ₂ SO ₄ 염에 대한 푸리에 변환 적외선 분광(FTIR) 스펙트럼을 도시한 것이다. 치다마이드-API(a), 치다마이드-HCl 염(b), 및 치다마이드-H₂SO₄ 염(c)의 FTIR 스펙트럼은 치다마이드-API, 치다마이드-HCl 염, 및 치다마이드-H₂SO₄ 염의 특징분석(d)을 위해 분석되었다.
도 5a 내지 도 5e는 셀레콕시브-API 및 셀레콕시브-Na 염에 대한 ¹ H-NMR 및 ¹³ C-NMR 스펙트럼을 도시한 것이다. 셀레콕시브-API(활성 약제학적 성분) 및 셀레콕시브-Na 염의 ¹H-NMR 스펙트럼(400MHz, CDCl₃)은 각각 도 5a 및 도 5b에 도시되어 있다. 셀레콕시브-API 및 셀레콕시브-Na 염의 ¹³C-NMR 스펙트럼은 각각 도 5c 및 도 5d에 도시되어 있다. 셀레콕시브-API 및 셀레콕시브-Na 염의 ¹³C-NMR 스펙트럼(100MHz, DMSO-d₆)의 데이터는 도 5e에서 비교되었다. 셀레콕시브-Na 염은 상이한 공정에 의해 비정질 또는 결정질 형태로서 제조될 수 있다. 비정질 셀레콕시브-Na 염의 ¹H-NMR 및 ¹³C-NMR 스펙트럼은 결정질 염 형태의 패턴과 동일한 패턴을 갖는다.
도 6은 셀레콕시브-Na 염의 고속 원자 폭격 질량 분석(FAB-MS) 스펙트럼을 도시한 것이다. 비정질 셀레콕시브-Na 염의 FAB-MS 스펙트럼은 결정질 염 형태의 패턴과 동일한 패턴을 갖는다.
도 7a 내지 도 7d는 셀레콕시브-API 및 비정질 및 결정질 형태의 셀레콕시브-Na 염에 대한 X선 분말 회절(XRD) 스펙트럼을 도시한 것이다. 셀레콕시브-API, 비정질 및 결정질 형태의 셀레콕시브-Na 염의 XRD 스펙트럼은 각각 도 7a, 도 7b 및 도 7c에 제시되어 있다. 이는 비정질 형태와 결정질 형태 간에 회절 피크의 측면에서 확연히 상이하였다.
도 8a 내지 도 8d는 셀레콕시브-API 및 비정질 및 결정질 형태의 셀레콕시브-Na 염에 대한 푸리에 변환 적외선 분광(FTIR) 스펙트럼을 도시한 것이다. 셀레콕시브-API 및 결정질 및 비정질 형태의 셀레콕시브-Na 염의 FTIR 스펙트럼은 각각 도 8a, 도 8b, 및 도 8c에 제시된다. FTIR 패턴의 특징분석은 셀레콕시브-API와 셀레콕시브-Na 염 간에 분석되었다(도 8d).
도 9a 내지 도 9d는 CT26 종양-보유 마우스에서 항-PD-1 항체와 조합된 치다마이드-HCl 염 플러스 셀레콕시브-cap의 치료 반응을 도시한 것이다. CT26 결장 종양을 보유한 BALB/c 마우스는 명시된 바와 같은 다양한 치료 양상으로 치료받았다. IgG, 항-IgG 대조군(비히클, 2.5 mg/kg); PD-1, 항-PD-1 단일클론 항체(2.5 mg/kg); CD-HCl, 치다마이드-HCl 염 12.5, 25, 50 mg/kg; CD-K30, 치다마이드-K30(폴리비닐피롤리돈 K30 상에 코팅된 치다마이드, 50 mg/kg); C-cap 50, 캡슐로부터의 셀레콕시브 제품(50 mg/kg, Celebrex^®). 총 종양 체적 및 종양 크기의 배수 변화(a), 개개 종양 체적(b), CT26 종양-보유 마우스 체중(c), 및 동물 생존률(d)이 기록되었다. CT26 종양-보유 마우스는 명시된 바와 같이 치료받고, 종양 이식 후 종양 체적이 3000 ㎣에 도달하였을 때 마취되었다. 평균 및 SD는 나타나 있다. 각 실험 아암에서 사용되는 동물의 수 및 P 값이 또한 명시되어 있다. ^*P < 0.05(대 IgG); ^#P < 0.05(대 PD-1). P-값은 적응증 그룹에서의 종양 크기를 IgG 그룹과 비교한 스튜던트 t-테스트(student's t-test)를 이용하여 계산되었다. 상이한 치료 그룹 간의 생존률의 차이는 일원 ANOVA, 이후 터키 다중 비교 테스트(Tukey's multiple comparisons test)에 의해 분석되었다.
도 10a 내지 도 10e는 CT26 종양-보유 마우스에서 항-PD-1 항체와 조합된 치다마이드-HCl 염 플러스 셀레콕시브-Na 염의 치료 반응을 도시한 것이다. CT26 결장 종양을 보유한 BALB/c 마우스는 명시된 바와 같이 다양한 치료 양상으로 치료받았다. IgG, 항-IgG 대조군(비히클, 2.5 mg/kg); PD-1, 항-PD-1 단일클론 항체(2.5 mg/kg); CD-HCl, 치다마이드-HCl 염(50 mg/kg); C-Na, 비정질 셀레콕시브-Na 염(12.5, 25, 및 50 mg/kg); CD-K30, 치다마이드-K30(폴리비닐피롤리돈 K30 상에 코팅된 치다마이드, 50 mg/kg); C-캡슐 50, 캡슐로부터의 셀레콕시브 제품(50 mg/kg, Celebrex^®). 총 종양 체적 및 종양 크기의 배수 변화(a), 개개 종양 체적(b), 종양-부재 마우스의 백분율(c), CT26 종양 보유-마우스 체중(d), 및 동물 생존률(e)이 기록되었다. CT26 종양 보유 마우스는 명시된 바와 같이 치료받고, 종양 이식 후 종양 체적이 3000 ㎣에 도달하였을 때 마취되었다. 평균 및 SD는 나타나 있다. 각 실험 아암에서 사용되는 동물의 수 및 P 값이 또한 명시되어 있다. ^*P < 0.05(대 IgG); ^#P < 0.05(대 PD-1). P-값은 적응증 그룹에서의 종양 크기를 IgG 그룹과 비교한 스튜던트 t-테스트를 이용하여 계산되었다. 상이한 치료 그룹 간의 생존률의 차이는 일원 ANOVA, 이후 터키 다중 비교 테스트에 의해 분석되었다.
도 11a 내지 도 11d는 항-PD-1 항체와 조합된 최적의 치료 반응 용량의 치다마이드-HCl 염 플러스 셀레콕시브-Na 염을 확인하고, CT26 종양-보유 마우스에서 항-PD-1 항체와 조합된 치다마이드-H ₂ SO ₄ 염 플러스 셀레콕시브-Na 염의 치료 반응을 평가한 것이다. 종양 크기가 약 300 ㎣인 CT26 결장 종양을 보유한 BALB/c 마우스는 명시된 바와 같이 다양한 치료 양상으로 치료받았다. IgG, 항-IgG 대조군(비히클, 2.5 mg/kg); PD-1, 항-PD-1 단일클론 항체(2.5 mg/kg); CD-HCl, 치다마이드-HCl 염(12.5, 25, 및 50 mg/kg); C-Na, 비정질 셀레콕시브-Na 염(12.5, 25, 및 50 mg/kg); C-Na cry, 결정질 셀레콕시브-Na 염(50 mg/kg); CD-H₂SO₄, 치다마이드-H₂SO₄ 염(50 mg/kg); CD-K30, 치다마이드-K30(폴리비닐피롤리돈 K30 상에 코팅된 치다마이드, 50 mg/kg); C-cap, 캡슐로부터의 셀레콕시브 제품(50 mg/kg, Celebrex^®). 총 종양 체적 및 종양 크기의 배수 변화(a), 개개 종양 체적(b), CT26 종양-보유 마우스 체중(c), 및 동물 생존률(d)이 기록되었다. CT26 종양 보유 마우스는 명시된 바와 같이 치료받고, 종양 이식 후 종양 체적이 3000 ㎣에 도달하였을 때 마취되었다. 평균 및 SD는 나타나 있다. 각 실험 아암에서 사용되는 동물의 수 및 P 값이 또한 명시되어 있다. ^*P < 0.05(대 IgG); ^#P < 0.05(대 PD-1). P-값은 적응증 그룹에서의 종양 크기를 IgG 그룹과 비교한 스튜던트 t-테스트를 이용하여 계산되었다. 상이한 치료 그룹 간의 생존률의 차이는 일원 ANOVA, 이후 터키 다중 비교 테스트에 의해 분석되었다.
도 12a 내지 도 12d는 PD-1 관문 차단 요법에 대한 내성이 CT26 종양-보유 마우스에서 치다마이드-HCl 염 플러스 셀레콕시브-Na 염과 조합된 항-PD-1 또는 항-CTLA-4 Ab를 사용함으로써 극복됨을 도시한 것이다. CT-26-보유 마우스(평균 종양 크기 약 120 ㎣)는 2회 투여된(주당 2회) 항-PD-1 항체(2.5 mg/kg)의 제1선 요법(first line therapy)으로 치료받았다. 종양이 평균 약 360 ㎣까지 종양 크기가 3배 증가되고 종양 체적이 ＜600 ㎣일 때로서 규정된, 제1선 요법의 실패 기준을 충족하였을 때, 마우스는 제2선 요법 연구에 재등록되었다. 이러한 항-PD-1 내성 마우스는 명시된 바와 같이 7가지 상이한 요법(n=9 내지 11마리의 마우스/그룹)으로 치료받았다: IgG, 항-IgG 대조군(비히클, 2.5 mg/kg); PD-1, 항-PD-1 단일클론 항체(2.5 mg/kg); CTLA-4, 항-CTLA-4 단일클론 항체(2.5 mg/kg); CD-HCl, 치다마이드-HCl 염(50 mg/kg); C-Na, 비정질 셀레콕시브-Na 염(50 mg/kg); MS275, 엔티노스타트(entinostat)(20 mg/kg). 총 종양 체적 및 종양 크기의 배수 변화(a), 개개 종양 체적(b), CT26 종양-보유 마우스 체중(c), 및 동물 생존률(d)이 기록되었다. CT26 종양 보유 마우스는 명시된 바와 같이 치료받고, 종양 이식 후 종양 체적이 3000 ㎣에 도달하였을 때 마취되었다. 평균 및 SD는 나타나 있다. 각 실험 아암에서 사용되는 동물의 수 및 P 값이 또한 명시되어 있다. ^*P < 0.05(대 IgG); ^#P < 0.05(대 PD-1). P-값은 적응증 그룹에서의 종양 크기를 IgG 그룹과 비교한 스튜던트 t-테스트를 이용하여 계산되었다. 상이한 치료 그룹 간의 생존률의 차이는 일원 ANOVA, 이후 터키 다중 비교 테스트에 의해 분석되었다.
도 13a 내지 도 13d는 PD-L1 관문 차단 요법에 대한 내성이 CT26 종양-보유 마우스에서 치다마이드-HCl 염 플러스 셀레콕시브-Na 염과 조합된 항-PD-1 또는 항-CTLA-4 Ab를 사용함으로써 극복됨을 도시한 것이다. CT-26-보유 마우스(평균 종양 크기 약 120 ㎣)는 2회 투여된(주당 2회) 항-PD-1 항체(2.5 mg/kg)의 제1선 요법으로 치료받았다. 종양이 평균 약 360 ㎣까지 종양 크기가 3배 증가되고 종양 체적이 ＜600 ㎣일 때로서 규정된, 제1선 요법의 실패 기준을 충족하였을 때, 마우스는 제2선 요법 연구에 재등록되었다. 이러한 항-PD-L1 내성 마우스는 명시된 바와 같은 7가지의 상이한 요법(n= 9 내지 11 마우스/그룹)으로 치료받았다. IgG, 항-IgG 대조군(비히클, 2.5 mg/kg); PD-1, 항-PD-1 단일클론 항체(2.5 mg/kg); CTLA-4, 항-CTLA-4 단일클론 항체(2.5 mg/kg); CD-HCl, 치다마이드-HCl 염(50 mg/kg); C-Na, 비정질 셀레콕시브-Na 염(50 mg/kg); MS275, 엔티노스타트(20 mg/kg). 총 종양 체적 및 종양 크기의 배수 변화(a), 개개 종양 체적(b), CT26 종양 보유-마우스 체중(c), 및 동물 생존률(d)이 기록되었다. CT26 종양 보유 마우스는 명시된 바와 같이 치료받고, 종양 이식 후 종양 체적이 3000 ㎣에 도달하였을 때 마취되었다. 평균 및 SD는 나타나 있다. 각 실험 아암에서 사용되는 동물의 수 및 P 값이 또한 명시되어 있다. ^*P < 0.05(대 IgG); ^#P < 0.05(대 PD-1). P-값은 적응증 그룹에서의 종양 크기를 IgG 그룹과 비교한 스튜던트 t-테스트를 이용하여 계산되었다. 상이한 치료 그룹 간의 생존률의 차이는 일원 ANOVA, 이후 터키 다중 비교 테스트에 의해 분석되었다.
도 14a 내지 도 14f는 위스타 수컷 래트(Wistar male rat)에서 치다마이드-HCl 염 및 셀레콕시브-Na 염 단독 또는 이의 조합의 PK 프로파일을 도시한 것이다. 래트에는 50 mg/kg의 용량으로 치다마이드-K30, 치다마이드-HCl 염, 셀레콕시브-캡슐(celebrex^®, 셀레콕시브/cap), 또는 비정질 셀레콕시브-Na 염이 경구 투여되었다. 치다마이드-K30과 치다마이드-HCl 염 간의 PK 프로파일의 비교는 분석되었다(a). 셀레콕시브/cap과 비정질 셀레콕시브-Na 염 간의 PK 프로파일의 비교는 분석되었다(b). 치다마이드-K30 플러스 셀레콕시브/cap 대 치다마이드-HCl 염 플러스 비정질 셀레콕시브-Na 염의 치다마이드 PK 프로파일의 비교는 (c)에 도시되어 있다. 치다마이드-K30 플러스 셀레콕시브/cap 대 치다마이드-HCl 염 플러스 셀레콕시브-Na 염의 셀레콕시브 PK 프로파일의 비교는 (d)에 도시되어 있다. 치다마이드-K30 대 치다마이드-HCl 염 대 치다마이드-K30 플러스 셀레콕시브/cap 대 치다마이드-HCl 염 플러스 셀레콕시브-Na 염의 치다마이드 PK 프로파일의 비교는 (e)에 도시되어 있다. 셀레콕시브/cap 대 셀레콕시브-Na 염 대 치다마이드-K30 플러스 셀레콕시브/cap 대 치다마이드-HCl 염 플러스 셀레콕시브-Na 염의 셀레콕시브 PK 프로파일의 비교는 (f)에 도시되어 있다.

달리 규정하지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질이 여기에 기술된다. 본원에 언급된 모든 간행물은 본원에 참고로 포함된다.

본원에서 "약" 값 또는 파라미터에 대한 언급은 그러한 값 또는 파라미터 자체에 대한 구현예를 포함(및 설명)한다. 예를 들어, "약 X"를 언급하는 설명은 "X"의 설명을 포함한다. 예를 들어, XRPD 패턴에서 2-세타 값의 용어 "약 X^o"는 2-세타 값의 +/-0.2도를 지칭한다.

단수 용어는 하나 또는 하나 초과의(즉, 적어도 하나의) 문법적 대상을 지칭한다. 일 예로서, "엘리먼트(an element)"는 하나의 엘리먼트 또는 하나 초과의 엘리먼트를 의미한다. "또는"의 사용은 달리 구체적으로 기술하지 않는 한, "및/또는"을 의미한다.

용어 "다형체"는 결정질 형태의 화합물(예를 들어, 화합물 1), 또는 이의 수화물 또는 용매화물, 특히, 결정 패킹 배열(crystal packing arrangement)의 화합물을 지칭한다. 특정 화합물의 모든 다형체는 동일한 원소 위치를 갖는다. 본원에서 사용되는 용어 "결정질"은 구조적 단위의 정렬된 배열로 이루어진 고체 상태 형태를 지칭한다. 상이한 결정질 형태의 동일한 화합물, 또는 이의 수화물 또는 용매화물은 상이한 결정 대칭 및/또는 단위 셀 파라미터를 초래하는, 고체 상태의 분자의 상이한 패킹으로 인해 발생한다. 상이한 결정질 형태는 대개 상이한 X선 회절 패턴, 적외선 스펙트럼, 융점, 밀도, 경도, 결정 형상, 광학적 및 전기적 특성, 안정성, 및/또는 용해도를 갖는다.

예를 들어, XRPD 패턴을 지칭할 때 용어 "...에 도시된 것과 실질질적으로"는 본원에 도시된 것과 본질적으로 동일하지 않고 당업자에 의해 고려될 때 실험 오차 또는 편차의 한계 내에 속하는 그래프를 지칭한다.

본원에서 사용되는 "대상체", "개체" 및 "환자"는 척추동물, 바람직하게는, 포유동물, 더욱 바람직하게는, 인간을 지칭하기 위해 상호 교환 가능하게 사용된다. 포유동물은 뮤린, 유인원, 인간, 농장 동물, 스포츠 동물, 및 애완 동물을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 시험관내에서 수득되거나 시험관내에서 배양된 생물학적 실체의 조직, 세포 및 이의 자손이 또한 포함된다.

본원에서 사용되는 "치료학적 유효량"은 질환(예를 들어, 신경퇴행성 질환)을 앓고 있는 대상체를 치료하거나 질환과 관련된 증상 또는 합병증을 완화시키는 데 충분한 양을 의미한다.

본원에서 사용되는 용어 "치료하다", "치료하는", 및 "치료", 등은 장애, 및/또는 이와 관련된 증상을 감소 또는 개선시키는 것을 의미한다. 배제되지 않지만, 장애 또는 병태를 치료하는 것이 장애, 병태 또는 이와 관련된 증상이 완전히 제거되는 것을 필요로 하지 않는다는 것이 인식될 것이다.

본원에서 사용되는 용어 "면역요법"은 면역 반응을 유도, 향상, 억제, 또는 달리 변형시키는 것을 포함하는 방법에 의해 질병을 앓고 있거나, 질환을 축소시키거나 재발을 걸릴 위험이 있는 대상체의 치료를 지칭한다.

본원에서 사용되는 용어 "프로그래밍된 세포 사멸 단백질 1(PD-1)"은 CD28 패밀리에 속하는 면역억제 수용체를 지칭한다. PD-1은 생체내에서 이전에 활성화된 T 세포에서 우세하게 발현되고, 2개의 리간드, 즉, PD-L1 및 PD-L2에 결합한다. 본원에서 사용되는 용어 "PD-1"은 인간 PD-1(hPD-1), hPD-1의 변이체, 아이소형 및 종 동족체, 및 hPD-1과 적어도 하나의 공통 에피토프를 갖는 유사체를 포함한다. 완전한 hPD-1 서열은 GenBank 기탁번호 U64863에서 확인될 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "프로그래밍된 사멸-리간드1(PD-L1)"은 PD-1에 결합 시에 T 세포 활성화 및 시토카인 분비를 하향조절하는 PD-1에 대한 2개의 세포 표면 당단백질 리간드 중 하나(다른 하나는 PD-L2임)이다. 본원에서 사용되는 용어 "PD-L1"은 인간 PD-L1(hPD-L1), hPD-L1의 변이체, 아이소형, 및 종 동족체, 및 hPD-L1과 적어도 하나의 공통 에피토프를 갖는 유사체를 포함한다. 완전한 hPD-L1 서열은 GenBank 기탁번호 Q9NZQ7에서 확인될 수 있다.

본원에서 사용되는 "항체" 및 "이의 항원-결합 단편"은 자연 발생 면역글로불린(예를 들어, IgM, IgG, IgD, IgA, IgE 등)뿐만 아니라 예를 들어, 단쇄 항체, 키메라 항체(예를 들어, 인간화된 뮤린 항체), 헤테로컨쥬게이트 항체(예를 들어, 이중특이적 항체), Fab', F(ab')₂, Fab, Fv, 및 rIgG를 포함하는 비천연 발생 면역글로불린을 포함한다. 본원에서 사용되는 "항원-결합 단편"은 항원을 특이적으로 인식하는 능력을 보유하는 전장 항체의 부분뿐만 아니라 이러한 부분들의 다양한 조합이다.

본원에서 사용되는 용어 "암"은 신체에서 비정상 세포의 제어되지 않은 성장에 의해 특징되는 다양한 질환의 광범위한 그룹을 지칭한다. 제어되지 않은 세포 분열 및 성장은 이웃하는 조직을 침범하고 또한 림프계 또는 혈류를 통해 신체의 먼 부분으로 전이될 수 있는 악성 종양의 형성을 초래한다. 본원에서 사용되는 "암"은 원발성, 전이성 및 재발 암을 지칭한다.

종양 미세환경은 종양 개시, 종양 진행 및 요법에 대한 반응에 기여하는 암 생물학의 중요한 양태이다. 종양 미세환경은 악성 세포, 및 광범위한 누화(crosstalk)를 통해 종양 증식, 침습, 및 전이 가능성을 지지하는 세포를 포함하는 이종 세포 집단으로 구성된다. 종양 세포는 종종 면역억제 미세환경을 유도하며, 이는 골수-유래 억제인자 세포(MDSC), 종양-관련 대식세포(TAM), 및 조절 T 세포(Treg)와 같은 면역 세포의 면역억제 집단의 발달을 선호한다. 이에 따라, 다양한 암 치료법, 특히, 숙주 항종양 면역 반응을 강화시킴으로써 작용하는 면역요법의 작용을 유도하고 개선시키는 데 도움을 줄 수 있는 종양 미세환경 내의 표적이 포함되지 않는다.

본 발명은 놀랍게도, 히스톤 데아세틸라제(HDAC) 억제제(예를 들어, 치다마이드 또는 이의 산성 염) 및 비스테로이드성 항-염증 약물(NSAID)(예를 들어, 셀레콕시브 또는 이의 염기성 염)의 조합물이 면역 반응을 유의미하게 개선하고, 종양 미세환경을 조절하고, 이에 따라, 항암 활성을 크게 개선시킨다는 것을 발견하였다. 2개의 활성 약제학적 성분은 바람직하게는, 염 형태 또는 결정질 형태 또는 비정질 형태이다.

치다마이드(Epidaza^®)는 히스톤 데아세틸라제(HDAC) 억제제로서 알려져 있고, 클래스 I HDAC1, HDAC2, HDAC3뿐만 아니라 클래스 IIb HDAC10을 억제한다. 치다마이드의 화학명은 하기 구조를 갖는 4-(((E)-3-(피리딘-3-일)아크릴아미도)메틸)-N-(2-아미노-4-플루오로페닐)벤즈아미드이다:

특히 상표명 Celebrex^®로 시판되는 셀레콕시브는 COX-2 선택적 비스테로이드성 항-염증 약물(NSAID)이다. 셀레콕시브의 화학명은 하기 구조를 갖는 4-[5-(4-메틸페닐)-3-(트리플루오로메틸)피라졸-1-일]벤젠설폰아미드이다:

본 개시내용에서, 치다마이드의 산성 염(예를 들어, 치다마이드-HCl 또는 치다마이드-H₂SO₄ 염) 및 셀레콕시브의 염기성 형태(예를 들어, 셀레콕시브-Na 염)가 사용된다. 바람직하게는, 치다마이드의 염 형태는 결정질 형태이며, 셀레콕시브의 염 형태는 비정질 형태이다.

특히, 치다마이드-HCl 염의 결정질 형태(결정질 형태 A) 및 치다마이드-H₂SO₄ 염의 결정질 형태(형태 B)는 본원에 기술된다.

XRPD 패턴 및 FTIR 패턴은 본원에서 형태 A 및 형태 B에 대해 도시되고 기술된다. 본원에서 사용되는 "가장 큰 피크"는 가장 높은 세기를 갖는 회절 패턴에서의 피크를 지칭한다. 본원에서 사용되는 용어 "주요 세기 피크"는 특정 X선 분말 회절 패턴에서 피크의 상부 20%인 세기를 갖는 임의의 피크를 포함한다.

결정질 형태 A는 본원에 기술된 바와 같은 2-세타 값을 포함하는 피크를 갖는 XRPD 패턴을 갖는다. 대안적으로, 치다마이드의 하이드로클로라이드 염은 본원에 기술된 바와 같은 피크를 갖는 푸리에 변환 적외선 분광(FTIR) 패턴을 갖는 결정질 형태(형태 A)이다. 또한, 형태 A는 도 3b에 도시된 것과 실질적으로 동일한 XRPD 패턴 또는 도 4b에 도시된 것과 실질적으로 동일한 FTIR 패턴을 나타내는 것으로서 추가로 특징된다.

결정질 형태 B는 본원에 기술된 바와 같은 2-세타 값을 포함하는 피크를 갖는 XRPD 패턴을 갖는다. 대안적으로, 치다마이드의 설페이트 염은 본원에 기술된 바와 같은 피크를 갖는 FTIR 패턴을 갖는 결정질 형태(형태 B)이다. 또한, 형태 B는 도 3c에 도시된 것과 실질적으로 동일한 XRPD 패턴 또는 도 4c에 도시된 것과 실질적으로 동일한 FTIR 패턴으로서 추가로 특징된다.

셀레콕시브의 염기성 염은 비정질 형태 또는 결정질 형태인 셀레콕시브의 나트륨 염이다. 일 구현예에서, 셀레콕시브의 나트륨 염의 비정질 형태는 도 7b에 도시된 것과 실질적으로 동일한 XRPD 패턴을 갖는다.

결정질 형태(형태 I)의 셀레콕시브의 나트륨 염은 본원에 기술된 바와 같은 피크를 갖는 X선 분말 회절(XRPD) 패턴을 갖는다. 추가 구현예에서, 형태 I은 도 7c에 도시된 것과 실질적으로 동일한 XRPD 패턴을 나타내는 것으로서 추가로 특징된다.

치다마이드 산성 염은 제조 공정 동안 강산성 조건(pKa < 3을 갖는 아레니우스산)에 의해 및 새로운 결정 형태의 치다마이드-HCl 및 치다마이드-H₂SO₄ 염을 생성하기 위한 특정 공정을 통해 제조된다. 이러한 염은 셀레콕시브-Na 염 및 면역 관문 억제제와 조합할 때 수용해도 및 약동학적 프로파일을 상당히 개선시켜, 면역요법의 효능을 크기 향상시킨다. 결정질 형태의 치다마이드-HCl 및 치다마이드-H₂SO₄ 염의 제조 공정은 본원의 실시예에 예시되어 있다.

셀레콕시브 염기성 염은 제조 공정 동안 NaH와 같은 금속 하이드라이드에 의해 및 "무수" 비정질 및 결정 형태의 셀레콕시브-Na 염을 생성하기 위한 특정 공정을 통해 제조된다. 비정질 셀레콕시브-Na 염은 치다마이드 산성 염 및 면역 관문 억제제와 조합할 때 상당한 수용해도 및 신규한 약동학적 프로파일을 지니고, 면역요법에서 효능 향상에 영향을 미친다. 유사한 결과는 또한, 결정 형태의 셀레콕시브-Na 염에서 관찰되었다. 비정질 형태 및 결정질 형태의 셀레콕시브-Na 염의 제조 공정은 본원의 실시예에 예시되어 있다.

일부 구현예에서, 조합물에서 치다마이드-HCl 또는 치다마이드-H₂SO₄ 염의 양은 약 5%(w/w) 내지 약 80%(w/w), 약 30% 내지 약 80%(w/w), 약 40% 내지 약 80%(w/w), 약 20% 내지 약 60%(w/w), 약 30% 내지 약 60%(w/w), 약 40% 내지 약 60%(w/w) 또는 약 35% 내지 약 60%(w/w)의 범위이다.

일부 구현예에서, 조합물에서 셀레콕시브-Na 염의 양은 약 5% 내지 약 80%(w/w), 약 30% 내지 약 80%(w/w), 약 40% 내지 약 80%(w/w), 약 20% 내지 약 60%(w/w), 약 30% 내지 약 60%(w/w), 약 40% 내지 약 60%(w/w) 또는 약 35% 내지 약 60%(w/w)의 범위이다.

일 구현예에서, 본 개시내용의 조합물은 상이한 비의 치다마이드-HCl 염 또는 치다마이드-H₂SO₄ 염(치다마이드 염으로 불리워질 수 있음) 및 셀레콕시브-Na 염(셀레콕시브 염으로 불리워질 수 있음)으로 제조된다. 치다마이드 염 및 셀레콕시브 염의 약동학적 특성은 치다마이드-K30(치다마이드 제품 Epidaza^®의 본래 포뮬레이션) 및 셀레콕시브/캡슐(셀레콕시브 제품 Celebrex^®의 본래 포뮬레이션)과 비교할 때 개선되었다.

또한, 면역 관문 억제제와 조합 시에, 조합물(치다마이드 염 플러스 셀레콕시브 염)은 치다마이드-K30 플러스 셀레콕시브/캡슐과 비교하여 항암 활성을 크게 개선하였다. 면역 관문 억제제와 조합한 본 개시내용의 조합물로의 치료는 면역 관문 억제제 단독, 치다마이드-K30 플러스 셀레콕시브/캡슐, 및 심지어 둘 모두를 추가로 조합하였때와 비교하여 종양 성장을 억제하는 효능을 상당히 증가시킨다. 또한, 콤보와 면역 관문 억제제의 조합물은 종양을 상당히 박멸하고, 생존률을 약 80 내지 100%까지 증가시킨다.

면역 관문 억제제는 암 세포에 대한 면역 체계를 자극시키고 암을 치료하기 위해 본원에 기술된 본 개시내용의 조합물과 조합하여 사용될 수 있다. 본 개시내용에서 사용하기에 적합한 면역 관문 억제제는 PD-1, PD-L1, CTLA-4, T 세포 면역글로불린-3 (TIM3), B 및 T 림프구 감쇠자(BTLA), T 세포 활성화 (VISTA) 또는 림프구-활성화 유전자 3(LAG3) 경로의 V-도메인 Ig 억제인자를 억제하는 억제 수용체의 길항제, 예를 들어, 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-TIM-3 항체, 항-BTLA 항체, 항-VISTA 항체 및 항-LAG-3 항체를 포함한다. PD-1 또는 PD-L1 억제제의 예는 인간 PD-1을 차단하는 인간화된 항체, 예를 들어, 펨브롤리주맙(항-PD-1 Ab, 상표명 Keytruda^®), 니볼루맙(항-PD-1 Ab, Opdivo^®) 또는 피딜리주맙(항-PD-1 Ab, CT-011), 토리팔리맙(항-PD-1 Ab, 상표명 Tuo Yi^®), 신틸리맙(항-PD-1 Ab, 상표명 Tyvyt^®), 캄렐리주맙(항-PD-1 Ab), Bavencio^®(항-PD-L1 Ab, 아벨루맙), Imfinzi^®(항-PD-L1 Ab, 두르발루맙), 및 Tecentriq^®(항-PD-L1 Ab, 아테졸리주맙)뿐만 아니라 완전 인간 항체, 예를 들어, 니볼루맙(항-PD-1 Ab, 상표명 Opdivo^®) 및 세미플리맙-rwlc(항-PD-1 Ab, 상표명 Libtayo^®)를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 다른 PD-1 억제제는 비제한적으로 B7-DC-Ig 또는 AMP-244로도 알려진 PD-L2 Fc 융합 단백질을 포함하는 가용성 PD-1 리간드, 및 치료에서 사용하기 위해 현재 연구 및/또는 개발 중에 있는 다른 PD-1 억제제의 제시를 포함할 수 있다. 또한, 면역 관문 억제제는 비제한적으로, 두르발루맙 및 MIH1과 같은 PD-L1을 차단하는 인간화된 또는 완전 인간 항체 및 현재 연구 중인 다른 PD-L1 억제제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 면역 관문 억제제의 양은 약 0.5%(w/w) 내지 약 15%(w/w), 0.5%(w/w) 내지 약 10%(w/w), 0.5%(w/w) 내지 약 5%(w/w), 1.0%(w/w) 내지 약 20%(w/w), 1.0%(w/w) 내지 약 15%(w/w), 1.0%(w/w) 내지 약 10%(w/w) 또는 1.0%(w/w) 내지 약 5%(w/w)의 범위이다.

본 개시내용의 일부 구현예에서, 치다마이드-HCl 또는 치다마이드-H₂SO₄ 염, 셀레콕시브-Na 염, 및 면역 관문 억제제는 동시에 투여된다. 일부 구현예에서, 치다마이드-HCl 또는 치다마이드-H₂SO₄ 염, 셀레콕시브-Na 염, 및 면역 관문 억제제는 순서대로 또는 교대로 순차적으로 투여된다.

본 발명의 약제학적 조합물은 "담체"와 함께 제형화될 수 있다. 본원에서 사용되는 "담체"는 임의의 용매, 분산 매질, 비히클, 코팅, 희석제, 항박테리아제 및/또는 항진균제, 등장제, 흡수 지연제, 완충제, 담체 용액, 현탁액, 및 콜로이드 등을 포함한다. 약제학적 활성 물질에 대한 이러한 매질 및/또는 제제의 사용은 당 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 약제학적 조합물은 하기를 위해 개조된 것을 포함하는 고체 또는 액체 형태로 투여하기 위해 특별히 제형화될 수 있다: (1) 경구 투여, 예를 들어, 드랜치(수성 또는 비수성 용액 또는 현탁액), 로젠지, 당의정, 캡슐, 환제, 정제(예를 들어, 협측, 설하 및 전신 흡수를 위해 표적화된 것), 볼루스, 분말, 과립, 혀에 적용하기 위한 페이스트; (2) 비경구 투여, 예를 들어, 피하, 근육내, 정맥내 또는 경막외 주사에 의한 비경구 투여, 예를 들어, 멸균 용액 또는 현탁액 또는 서방출 제형으로서의 비경구 투여; (3) 국소 적용, 예를 들어, 크림, 로션, 겔, 연고, 또는 제어된 방출 패치 또는 피부에 적용된 스프레이; (4) 질내 또는 직장내, 예를 들어, 페서리(pessary), 크림, 좌제 또는 포움으로서; (5) 설하로; (6) 안구로; (7) 경피로; (8) 경점막으로; 또는 (9) 비강내.

본 개시내용의 조합물은 종양 미세환경을 조절하기 위해 및 암 면역요법에서 사용될 수 있다. 암의 예는 교모세포종, 간암(예를 들어, 간세포 암종), 대장 암종, 교모세포종, 위암, 대장암, 식도암, 폐암(예를 들어, 비소세포 폐암(NSCLC) 및 소세포 폐암), 췌장암, 신세포 암종, 양성 전립선 비대증, 전립선암, 난소암, 흑색종, 유방암, 만성 림프구성 백혈병(CLL), 메르켈 세포 암종, 비-호지킨 림프종, 급성 골수성 백혈병(AML), 담낭암, 담관암종, 비뇨기 방광암, 및 자궁암을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.

본 개시내용의 약제학적 조합물은 단일 제형에 제공될 수 있다. 다른 구현예에서, 본 개시내용의 약제학적 조합물은 별개의 제형에 제공될 수 있다. 약제학적 조합ㅂㅂ물은 하나 이상의 바람직한 투여 경로에 적합한 다양한 및/또는 복수의 형태로 제형화될 수 있다. 이에 따라, 약제학적 조합물은 예를 들어, 경구, 비경구(예를 들어, 피내, 경피, 피하, 근육내, 정맥내, 복강내 등) 또는 국소(예를 들어, 비강내, 폐내, 유방내, 질내, 자궁내, 피내, 경피, 직장 등)를 포함하는 하나 이상의 공지된 경로를 통해 투여될 수 있다. 약제학적 조합물, 또는 이의 일부분은 점막 표면에, 예를 들어, (예를 들어, 스프레이 또는 에어로졸에 의한) 비강 또는 호흡기 점막에 투여에 의해 투여될 수 있다. 약제학적 조합물, 또는 이의 일부분은 또한, 서방출 또는 지연방출을 통해 투여될 수 있다.

본 개시내용의 약제학적 조합물은 단위 투약 형태로 보편적으로 제시될 수 있고, 제약 분야에서 널리 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체를 갖는 조합물을 제조하는 방법은 본 개시내용의 약제학적 조합물을 하나 이상의 보조 구성성분을 구성하는 담체와 회합하는 단계를 포함한다. 일반적으로, 본 개시내용의 약제학적 조합물은 활성 화합물을 액체 담체, 미분된 고체 담체, 또는 둘 모두와 균일하게 및/또는 밀접하게 회합시키고, 이후에, 필요한 경우, 생성물을 원하는 제형으로 형상화함으로써 제조될 수 있다.

일부 구현예에서, 본 방법은 대상체에 예를 들어, 약 10 mg/kg 내지 약 1,000 mg/kg의 용량을 제공하기에 충분한 양의 본 개시내용의 약제학적 조합물을 투여하는 것을 포함할 수 있다.

본 발명은 하기 실시예에 의해 예시된다. 특정 예, 물질, 양 및 절차가 본원에 기술된 본 발명의 범위 및 사상에 따라 광범위하게 해석되어야 하는 것으로 이해되어야 한다.

실시예

물질 및 방법

물질 및 장치. 치다마이드-API, 치다마이드-K30, 치다마이드-HCl 염, 치다마이드-H₂SO₄ 염 및 셀레콕시브-Na 염을 GNT Biotech & Medicals Co. Ltd(Taiwan)에 의해 제공하였다. 셀레콕시브-API를 Aarti Drugs Ltd(India)로부터 구매하였다. 셀레콕시브 캡슐 제품(Celebrex^®, 200 mg)을 (Pfizer, Taiwan)으로부터 구매하였다. 하기 항체 및 시약을 동물 실험을 위해 사용하였다: 마우스 항-PD-L1(B7-H1) 단일클론 항체(10F.9G2; Bio X Cell), 마우스 항-PD-1(CD279) 단일클론 항체(RMP1-14; Bio X Cell), 마우스 항-CTLA4(CD152) 단일클론 항체(BE0164; Bio X Cell), 및 래트 항-IgG2a 아이소타입 대조군 단일클론 항체(2A3; Bio X Cell). LC/MS-등급 메탄올, HPLC-등급의 아세토니트릴, 1-헵탄설폰산 나트륨 염, 탈크, 및 에틸렌디아민테트라아세트산 모두를 J.T.Baker®(USA)로부터 구매하였다. 포름산, 나트륨 클로라이드, 락토스, 마그네슘 스테아레이트, 폴리비닐피롤리돈, 및 나트륨 포스페이트 트리염기성 12수화물을 Sigma-Aldrich(USA)로부터 구매하였다. 나트륨 라우릴 설페이트를 Showa Chemical Co., Ltd(Japan)로부터 구매하였다. 증류수를 Milli-Q 증류 시스템(Merck Millipore®, France)을 이용하여 정제하였다. 염산 S.G.(HCl)를 Fisher chemical(USA)로부터 구매하였다. 나트륨 하이드라이드(NaH), THF 99.5% 분자 시브를 Acros(Belgium)로부터 구매하였다. 무수 에틸 에테르를 ECHO chemical co., LTD(Taiwan)로부터 구매하였다. 필터지를 Toyo Roshi Kaisha, LTD(Japan)로부터 구매하였다. ¹H NMR 및 ¹³C NMR을 Bruker AVANCE 400MHz PLUS 기기 상에서 기록하였다. FTIR 스펙트럼을 AutoATR System이 부착된 Perkin Elmer Spotlight 200i Sp2(Perkin Elmer IR 분광광도계) 상에서 기록하였다. 분말 X선 회절 측정을 PANalytical EMPYREAN X선 회절기 상에서 수행하였다. 전기분무 이온화 질량을 Bruker microTOF 상에서 기록하였다. 고속 원자 충격 질량을 JEOL JMS-700 상에서 기록하였다. Gibco RPMI 1640 및 L-글루타민을 갖는 DMEM을 Invitrogen Life Technologies로부터 구매하였다. HyClone FBS를 Thermo Scientific으로부터 구매하였다.

치다마이드-HCl 염의 제조. 1 그램의 치다마이드-API(활성 약제학적 성분)를 플라스크에 배치시키고, 3 내지 5 ml의 6 내지 8N HCl(aq)을 첨가하고, 육안 검사에 의해 완전히 용해될 때까지 교반하였다. 이후에, 교반 조건이 없는 경우 고체 침전이 발생되었다. 고체 침전물을 흡입 여과 공정에 의해 분리하고, 디에틸 에테르로 불순물을 제거하기 위해 4회 슬러리를 형성시킴으로써 추가로 정제하였다. 순수한 고형물을 건조상태까지 응축 및 건조시켰다. 이후에, 고체 생성물을 오븐에서 50 내지 60℃에서 16시간 동안 건조시키고, 100 메시의 시브를 통과하기 위해 분말로 그라인딩하였다. 치다마이드-HCl 염을 제조하여, HPLC, ¹H-NMR, ¹³C-NMR, XRD, 포화 용해도, MS 및 FTIR 등의 분석에 의해 추가로 특징분석하였다. 치다마이드-HCl 염을 또한, 하기 공정에 의해 제조하였다.

65 mg의 치다마이드-API를 50 내지 150 ml의 EtOH, MeOH, DCM, THF, 또는 H₂O 중에 현탁시키고, 이후에 2 내지 6 방울의 37% HCl을 완전히 용해될 때까지 교반하면서 첨가하였다. 혼합물을 농축하여 1 ml의 액체가 남을 때까지 용매를 제거하였고, 이후에, 이를 50 ml 에테르에 적가하고, 고체 염이 침전되었다.

500 mg 치다마이드-API를 4 내지 10 ml의 4 내지 8N HCl(aq)에 첨가하고, 완전히 용해될 때까지 교반하였다. 이후에, 10 내지 20 ml EtOH를 첨가하고, 이후에, 안개와 같은 외관이 형성될 때까지 10 내지 20 ml 에테르를 첨가하였다. 결정화 공정을 4℃에서 12시간 동안 지속하였다. 염을 여과에 의해 수집하고, 에테르로 세척하고, 이후에, 오븐에서 60℃에서 5시간 동안 건조시켰다.

치다마이드-H ₂ SO ₄ 염의 제조. 1 그램의 치다마이드-API를 플라스크에 배치시킥, 3 내지 5 ml의 3 내지 5M H₂SO₄(aq)를 첨가하고, 육안 검사에 의해 완전히 용해될 때까지 교반하였다. 용액을 150 내지 200 ml의 에탄올에 서서히 적가하였으며, 고형물이 침전되었다. 고형물을 흡입 여과 공정에 의해 분리하고, 에탄올로 3회 세정하였다. 고형물을 3회의 에탄올로의 슬러리 공정을 통해 정제하고, 고형물에서 디에틸 에테르로 과량을 수분을 추가로 제거하였다. 순수한 고형물을 건조상태까지 응축 및 농축하였다. 이후에, 고체 생성물을 오븐에서 50 내지 60℃에서 16시간 동안 건조시키고, 100 메시의 시브를 통과시키기 위해 분말로 그라인딩하였다. 치다마이드-H₂SO₄ 염을 제조하고, HPLC, ¹H-NMR, ¹³C-NMR, XRD, 포화 용해도, MS 및 FTIR 등의 분석에 의해 추가로 특징분석하였다.

셀레콕시브-Na 염의 제조. 5 그램의 셀레콕시브-API를 둥근 바닥 플라스크에 배치시키고, 150 내지 200 ml의 THF를 공기-부재 조건 하, 질소 가스의 존재 하에서 첨가하였다. 화합물을 육안 검사에 의해 완전히 용해하였다. 450 내지 500 mg의 NaH(나트륨 하이드라이드)를 용액에 첨가하고, 격렬하게 교반하였다. 고체 침전물이 약 70 내지 90분에 형성되었다. THF를 흡입 여과 공정에 의해 제거하고, 고형물을 20 ml THF로 3회 세정하였다. 이후에, 고형물을 300 ml 디클로라이드 메탄(DCM) 중에 용해하고, 용액을 흡입 공정에 의해 여과하여 임의의 용해되지 않을 것을 제거하였다. 여액을 모으고, 이후에, 고형물 생성을 위해 압력 30 내지 50 mbar 및 회전 속도 140 rpm으로 회전식 증발기에 의해 건조상태까지 응축 및 농축하였다. 순수한 고형물을 60℃에서 16시간 동안 건조시키고, 100 메시의 시브를 통과시키기 위해 분말을 그라인딩하였다. 무수 비정질 셀레콕시브-Na 염을 제조하고, ¹H-NMR, ¹³C-NMR, XRD, MS, FTIR 등의 스펙트럼에 의해 추가로 분석하였다.

그리고, 무수 비정질 셀레콕시브-Na 염을 생성하기 위한 다른 공정은 하기에 기술되어 있다. 1 그램의 셀레콕시브-API를 둥근 바닥 플라스크에 배치시키고, 6 ml의 THF를 공기-부재 조건 하, 질소 가스의 존재 하에서 첨가하였다. 화합물을 육안 검사에 의해 완전히 용해하였다. 75 내지 100 mg의 NaH(나트륨 하이드라이드)를 용액에 첨가하고, 격렬하게 교반하였다. 고체 침전물은 약 40 내지 80분에 형성되었다. THF를 흡입 여과 공정에 의해 제거하고, 고형물을 디에틸 에테르로 3회 세정하였다. 고형물을 3회의 디에틸 에테르로의 슬러리 공정을 통해 정제하였다. 이후에, 고형물을 150 내지 200 ml 디클로라이드 메탄(DCM) 중에 용해하고, 임의의 용해되지 않은 것을 제거하기 위해 용액을 흡입 공정에 의해 여과하였다. 여액을 모으고, 이후에, 건조상태까지 응축 및 농축하였다. 응축 공정 동안, 초기 압력을 증류액에 존재하지 않을 때까지 400 내지 430 mbar로 설정하였다. 이후에, 압력을 고체 염이 침전될 때까지 10 내지 30 mbar로 설정하였다. 순수한 고형물을 60℃에서 16시간 동안 건조시키고, 100 메시의 시브를 통과시키기 위해 분말로 그라인딩하였다. 비정질 셀레콕시브-Na 염을 제조하고, HPLC, ¹H-NMR, ¹³C-NMR, XRD, 포화 용해도, MS, 및 FTIR 등의 분석에 의해 추가로 특징분석하였다.

또한, 응축 공정 동안 고체 염이 침전될 때까지 압력을 10 내지 30 mbar로 설정되는 것을 제외하고 상술된 공정으로 무수 결정질 셀레콕시브-Na 염을 제조하였다.

치다마이드-HCl, 치다마이드-H ₂ SO ₄ , 및 셀레콕시브-Na 염의 포화 용해도의 결정. 5 mg의 치다마이드-HCl, 치다마이드-H₂SO₄, 또는 셀레콕시브-Na 염의 샘플을 ddH2O를 함유한 5 ml 부피 플라스크에 첨가하고, 25℃에서 90분 동안 인큐베이터에서 100 rpm으로 흔들어 주었다. 얻어진 현탁액을 0.22 ㎛ 필터를 통해 여과하였다. 치다마이드-HCl, 치다마이드-H₂SO₄, 및 셀레콕시브-Na 염의 농도를 각각 256 nm, 256 nm, 및 253 nm에서 분광광도법으로 결정하였다. 각 샘플의 포화 용해도를 3회 결정하고, 평균 값 및 표준 편차를 보고하였다. 표준 곡선의 제조는 하기에 기술되어 있다. 치다마이드 및 셀레콕시브의 스톡(stock)을 99.99% MeOH 중에서 제조하였다. λ_max는 256 nm 및 253 nm 각각인 것으로 확인되었다. 교정 곡선은 0 내지 20 ㎍/ml의 비어(Beer) 농도 범위에 대해 0.9998과 동일한 상관 계수(R²)로 특징되는 양호한 선형성을 나타내었다.

세포주. CT26(CRL-2638; 뮤린 대장 선암)을 ATCC로부터 구매하였다. CT26 종양 세포주를 37℃, 5% CO₂에서 10%(vol/vol) FBS가 보충된 McCoy's 5A에서 성장시켰다.

동물 모델에서의 항암 활성. 동물 연구를 태국 의과 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회(Taipei Medical University Institutional Animal Care and Use Committee)(TMU IACUC, NO: LAC-2018-0340)에 의해 승인 및 감독받았다. 6주령 내지 8주령의 수컷 BALB/C 마우스(BioLASCO Taiwan)를 모든 동물 실험에 대해 사용하였다. CT26(5 × 10⁶) 암 세포를 각 마우스의 우측 옆구리에 s.c.에 의해 접종하였다. 종양을 랜덤화 및 치료 전 10 내지 11일 동안 성장시켰다(종양 크기 약 200 내지 300 ㎣). CT26-보유 마우스에 종양 이식후 11, 14, 17, 20, 23 및 26일에 i.p.에 의해 2.5 mg/kg의 항-IgG(Lot#65481701), 항-PD-1(Lot#640517M1 및 Lot#717918D1), 항-PD-L1(Lot#720619F1) 또는 항-CTLA-4(Lot#702418A2B) 항체를 제공하고, 모든 항체를 100 ㎕의 멸균 PBS(pH 7.4)(Invitrogen Life Technologies) 중에 적절한 농도까지 희석하였다. 치다마이드-K30, 치다마이드-HCl 염, 치다마이드-H₂SO₄ 염, 셀레콕시브(캡슐/Celebrex^®, 200 mg), 및 셀레콕시브-Na 염(비정질 또는 결정질 형태)을 종양 이식후 11일에 경구 투여하였다. 11일에서 26일까지 매일 12.5, 25, 및 50 mg/kg의 다양한 용량으로 종양 보유 마우스를 치료하기 위해 치다마이드-K30, 치다마이드-HCl 염, 및 치다마이드-H₂SO₄ 염을 경구 투여하였다. 12.5, 25.0, 및 50 mg/kg의 다양한 용량의 셀레콕시브(캡슐/Celebrex^®, 200 mg) 또는 셀레콕시브-Na 염으로의 매일 치료를 11일에서 26일까지 수행하였다. 항암 활성을 치료 시작으로부터 종양 체적이 3,000 ㎣에 도달할 때까지 측정하였다. 종양 체적을 길이 × 폭² × 0.5로서 계산하였다.

동물 모델에서의 생존률. 항체 또는 약물의 투여를 11일에서 25일 또는 26일까지 수행하였다. 종양은 종양 보유 마우스에서 계속 성장하였다. 마우스의 종양 체적을 3일 또는 4일마다 1회 측정하였다(2회/주). 종양 체적이 3,000 ㎣에 도달하였을 때 종양 보유 마우스는 사망한 것으로서 간주되었다. 모든 치료 그룹을 기록 및 분석하였다.

제1선 PD-1 관문 차단 요법에 대한 내성을 극복하기 위함. 대만 의과 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회(TMU IACUC, NO: LAC-2018-0340)에 의해 동물 연구를 승인 및 감독받았다. 6주령 내지 8주령 수컷 BALB/C 마우스(BioLASCO Taiwan)를 모든 동물 실험에 대해 사용하였다. CT26(5 × 10⁶) 암 세포를 각 마우스의 우측 옆구리에 s.c.에 의해 접종하였다. 항-PD-1 항체(2.5 mg/kg)가 2회 투여된 제1선 치료(2회 투여 사이에 3일) 전에 종양은 8일 동안 성장되었다(종양 크기 평균 약 120 ㎣). 제1선 요법 동안 항-PD-1 항체의 2차 투여 후 및 종양 체적이 ＜600 ㎣인 후에 종양이 3일에 연속 3배 증가(종양 크기 평균 360 ㎣)의 실패 기준을 충족하였을 때, 마우스를 재등록하였다. 항-PD-1 Ab에 대한 내성을 갖는 이러한 마우스를 추가로 랜덤화하였다. 항-PD-1 Ab에 대한 내성을 갖는 마우스를 항-IgG(2.5 mg/kg; Lot#65481701), 항-PD-1 Ab(2.5 mg/kg; Lot#640517M1), 엔티노스타트(20 mg/kg)와 조합된 항-PD-1 Ab(2.5 mg/kg), 치다마이드-HCl 염(50 mg/kg) 플러스 셀레콕시브-Na 염(50 mg/kg)과 조합된 항-PD-1 Ab(2.5 mg/kg), 치다마이드-HCl 염(50 mg/kg) 플러스 셀레콕시브-Na 염(50 mg/kg), 항-CTLA-4 Ab(2.5 mg/kg; Lot#702418A2B) 단독 또는 치다마이드-HCl 염(50 mg/kg) 플러스 셀레콕시브-Na 염(50 mg/kg)과 조합된 항-CTLA-4 Ab(2.5 mg/kg; Lot#702418A2B)를 포함하는 7가지 상이한 요법에 의해 치료하였다. 항체를 14, 17, 20, 23, 26 및 29일에 복강내로(i.p.) 투여하고(6회 치료, 치료 사이에 3일), 모든 항체를 100 ㎕의 멸균 PBS(pH 7.4)(Invitrogen Life Technologies) 중에 적절한 농도로 희석하였다. 셀레콕시브-Na 염, 치다마이드-HCl 염, 및 엔티노스타트를 14일에서 29일까지 경구 투여하였다. 셀레콕시브-Na 염(50 mg/kg), 치다마이드-HCl 염(50 mg/kg)을 매일 제공한 반면, 엔티노스타트(20 mg/kg)를 2일마다 제공하였다. 항암 활성을 치료 시작으로부터 종양 체적이 3,000 ㎣에 도달할 때까지 측정하였다. 종양 체적으로 길이 × 폭² × 0.5로서 계산하였다. 동물 연구를 설계하였고, 항-PD-1 항체 요법에 대한 1차/2차 내성을 나타내는 인간 암 환자에서 항-PD-1 항체로의 제1선 요법의 실패에 대한 가능성 치료 옵션을 나타내었다.

제1선 PD-L1 관문 차단 요법에 대한 내성을 극복하기 위함. 대만 의과 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 생체내 동물 연구를 승인 및 관리하였다(TMU IACUC, NO: LAC-2018-0340). 6주령 내지 8주령 수컷 BALB/C 마우스(BioLASCO Taiwan)를 모든 동물 실험에 대해 사용하였다. CT26(5 × 10⁶) 암 세포를 각 마우스의 우측 옆구리에 s.c.에 의해 접종하였다. 항-PD-1 항체(2.5 mg/kg)가 2회 투여된 제1선 치료(2회 투여 사이에 3일) 전에 종양은 8일 동안 성장되었다(종양 크기 평균 약 160 ㎣). 마지막 항-PD-L1(Lot#720619F1) 항체 투여 후 및 종양 체적이 ＜600 ㎣인 후에 종양이 3일에 연속 2배 증가(종양 크기 평균 320 ㎣)의 실패 기준을 충족하였을 때, 마우스를 재등록하였다. 항-PD-1 Ab에 대한 내성을 갖는 이러한 마우스를 추가로 랜덤화하였다. 항-PD-1 Ab에 대한 내성을 갖는 마우스를 항-IgG(2.5 mg/kg; Lot#65481701), 항-PD-1 Ab(2.5 mg/kg; Lot#640517M1), 엔티노스타트(20 mg/kg)와 조합된 항-PD-1 Ab(2.5 mg/kg), 치다마이드-HCl 염(50 mg/kg) 플러스 셀레콕시브-Na 염(50 mg/kg)과 조합된 항-PD-1 Ab(2.5 mg/kg), 치다마이드-HCl 염(50 mg/kg) 플러스 셀레콕시브-Na 염(50 mg/kg), 항-CTLA-4 Ab(2.5 mg/kg; Lot#702418A2B) 단독 또는 치다마이드-HCl 염(50 mg/kg) 플러스 셀레콕시브-Na 염(50 mg/kg)과 조합된 항-CTLA-4 Ab(2.5 mg/kg; Lot#702418A2B)를 포함하는 7가지 상이한 요법에 의해 치료하였다. 항체를 14, 17, 20, 23, 26 및 29일에 복강내로(i.p.) 투여하고(6회 치료, 치료 사이에 3일), 모든 항체를 100 ㎕의 멸균 PBS(pH 7.4)(Invitrogen Life Technologies) 중에 적절한 농도로 희석하였다. 셀레콕시브-Na 염, 치다마이드-HCl 염, 및 엔티노스타트를 14일에서 29일까지 경구 투여하였다. 셀레콕시브-Na 염(50 mg/kg), 치다마이드-HCl 염(50 mg/kg)을 매일 제공한 반면, 엔티노스타트(20 mg/kg)를 2일마다 제공하였다. 항암 활성을 치료 시작으로부터 종양 체적이 3,000 ㎣에 도달할 때까지 측정하였다. 종양 체적으로 길이 × 폭² × 0.5로서 계산하였다. 동물 연구를 설계하였고, 항-PD-1 항체 요법에 대한 1차/2차 내성을 나타내는 인간 암 환자에서 항-PD-1 항체로의 제1선 요법의 실패에 대한 가능성 치료 옵션을 나타내었다.

위스타 래트에서 치다마이드-HCl 염 및 셀레콕시브-Na 염의 PK 프로파일(약동학)의 분석. 치다마이드, 셀레콕시브 및 이의 염 형태(치다마이드-HCl 염 및 셀레콕시브-Na 염)의 약동학 연구를 7주령의 위스타 수컷 래트에서, 수 중 50 mg/kg의 용량으로 화합물을 경구 투여함으로써 수행하였다. 위스타 수컷 래트를 BioLasco(Taiwan)로부터 구매하였다. 약동학 연구 이전에, 물에 자유롭게 접근하게 하면서 동물을 12시간 동안 금식시켰다. 혈액을 샘플을 투여 후 0.08, 0.25, 0.5, 0.75, 1, 1.5, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 48 및 72 h에 수집하였다(n > 5/시점). 각 시점에, 약 250 ㎕의 혈액을 경정맥으로부터 EDTA가 함유된 라벨링된 Microtainer™ 튜브에 수집하였다. 30분의 스케쥴링된 샘플링 시간 내에 혈장 샘플을 획득하기 위해 혈액 샘플을 처리하였다. 모든 혈장 샘플을 분석할 때까지 -80℃ 미만에서 저장하였다. 혈장 샘플을 14.2 ng/mL(치다마이드) 및 45.5 ng/mL(셀레콕시브)의 정량 한계를 갖는 액체 크로마토그래피-질량 분광(LC-MS/MS, 6470 Agilent Tech., USA) 방법을 이용함으로써 치다마이드-k30, 치다마이드-HCl 염, 셀레콕시브(캡슐/Celebrex^®, 200 mg), 및 비정질 형태 셀레콕시브-Na 염으로의 치료에 대해 분석하였다. 치다마이드-k30, 치다마이드-HCl 염, 셀레콕시브/celebrex^®, 및 셀레콕시브-Na 염의 PK 파라미터를 검증된 Phoenix WinNonlin 소프트웨어(버젼 6.3)의 사다리꼴 규칙 및 비구획 분석 툴을 이용하여 계산하였다. 약동학 연구를 대만 의과 대학에서 수행하였고, 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC 승인 번호: LAC-2017-0331)에 의해 승인받았다. 샘플을 하기에 기술된 바와 같이 제조 및 분석하였다. 50 ㎕ 교정 표준물 또는 혈장 샘플에, 150 ㎕ 아세토니트릴(10% 메탄올 함유)을 첨가하고, 샘플을 1분 동안 와류시켜 단백질을 침전시켰다. 4℃, 21,130×g에서 15분 동안 원심분리 후에, 5 ㎕의 상청액을 분석을 위해 LC-MS/MS에 직접적으로 주입하였다. 분석을 4차 펌프(1260 Infinity II Quaternary Pump LC system), 탈기 장치, 오토샘플러, 온도조절 컬럼 구획 및 LC-MS/MS-6470 질량 분석기(Agilent Tech, USA)가 장착된 6470 Series 액체 크로마토그래프(Agilent Tech., USA)로 수행하였다. 크로마토그래피 분리를 40℃ 및 하기 표에 기술된 이동상 구배에서 LiChrospher® 60 RP-select B 컬럼(5 ㎛, 125×4.6 mm, Merck, Germany) 상에서 달성하였다. 유량은 0.5 mL/분이었다. 전체 실행 시간은 10분이었다. 건조 가스 흐름 및 네뷸라이징 가스 흐름을 6 및 1.5 L/분으로 설정하였다. 시스템의 건조 가스 온도 및 모세관 전압을 각각 250℃ 및 3000 V로 조정하였다. LC-MS/MS를 양이온 전기분무 이온화 계면에서 치다마이드에 대해 m/z 391.1 및 265.1에서 및 음이온 전기분무 이온화 계면에서 셀레콕시브에 대해 m/z 380 및 m/z 316에서 표적 이온을 사용한 다중 반응 모니터링 모드로 수행하였다.

LC/MS의 구배표

통계학. 평균 및 표준 오차를 적어도 4회의 독립 실험으로부터의 모든 데이터점에 대해 계산하였다. 각 실험 조건과 IgG 대조군 간의 종양 크기의 쌍별 비교를 스튜던트 2-샘플 t-테스트(Systat Software, San Jose, CA, USA)를 이용하여 수행하였다. 스튜던트 테스트 또는 ANOVA를 동물 효능 데이터의 분석을 위해 수행하였다. 카플란-마이어 곡선 및 로그 순위 시험을 sigma stat 3.5 소프트웨어를 이용하여 생성하였다. 모든 P 값 < 0.05은 통계학적으로 유의미한 것으로 간주되었다.

실시예 1 치다마이드-HCl 염의 신규한 결정 형태의 특징분석

치다마이드를 2014년에 중국 CFDA(NMPA)에 의해 재발성 또는 불응성 말초 T-세포 림프종(PTCL)용으로 승인받았다. 치다마이드(상표명, eipdaza^®)는 5 mg의 치다마이드를 함유한 경구 용도를 위한 정제로서 입수 가능하였으며, 권장 용량은 3일 이상의 간격으로 매주 2회 30 mg이다. 정제는 이의 수용해도 및 경구 생체이용률을 개선하기 위해 폴리비닐피롤리돈 k30(PVP-K30) 상에 코팅된 치다마이드-API를 함유한다. 본 발명에서, 본 발명자는 신규한 결정 형태의 치다마이드-HCl 및 치다마이드-H₂SO₄ 염을 생성하기 위한 치다마이드 API에 대한 제형을 개발하였다. 치다마이드-HCl 및 치다마이드-H₂SO₄ 염의 특성은 수용해도 및 경구 생체이용률을 유의미하게 개선시킬 수 있다. 치다마이드 염의 구조를 도 1에 도시된 바와 같이 ¹H-NMR 및 ¹³C-NMR에 의해 식별하였다. ¹H NMR을 용매 디메틸 설폭사이드(DMSO-d6)를 사용하는 Bruker AVANCE 400 MHz PLUS 기기를 이용함으로써 기록하였다. ¹³C NMR 스펙트럼을 100 MHz에서 기록하였다. ¹H-NMR 데이터는 아닐린에서의 NH₂ 기의 화학직 이동 신호 δ_H 5.20이 도 1a 및 도 1b에 도시된 바와 같이 치다마이드-API와 비교하여 치다마이드-HCl 염에서 사라짐을 나타내었다. 이러한 결과는, 염 형태가 C21-NH₂의 위치에서 생성되었음을 나타내었다. 이는 C21-NH₃ ⁺ Cl^- 또는 치다마이드-HCl 염으로서 기술될 수 있다. 치다마이드-API 및 치다마이드-HCl 염의 ¹³C-NMR 데이터는 도 1d 및 도 1e에 도시되어 있다. 치다마이드-API 및 치다마이드-HCl 염의 화학적 이동 데이터의 세부사항은 표 1 및 도 1g에 나타낸 바와 같이 기술되어 있다. 또한, ESI-MS를 이용하여 분자량을 결정하였다. 치다마이드-HCl 염의 질량 스펙트럼을 ESI 소스 및 이온 극성: 양성/음성 모드를 갖는 Bruker microTOF를 이용하여 기록하였다. 치다마이드-HCl 염의 양이온 모드 ESI-MS 스펙트럼을 결정하였고, 도 2a에 도시하였다. 가장 풍부한 피크는 m/z 391.158 [M+H]⁺를 갖는다. 그러나, 치다마이드-HCl 염에 대한 음이온 모드 ESI-MS 스펙트럼을 결정하고, 도 2b에 도시하였다. 가장 풍부한 피크는 m/z 425.118 [M+Cl]^-를 갖는다. 다음으로, 결정 형태의 치다마이드-HCl 염은 XRD에 의해 특징되었다. 치다마이드-API와 치다마이드-HCl 염의 XRD 프로파일의 비교를 PANalytical EMPYREAN X선 회절계 상에서 수행하였다. X선 방사선 소스를 위하여, Cu(λ=45 kV, 40 mA) 애노드를 사용하였으며, 스캔 속도 1/분으로 3 내지 40°의 2θ 범위로 수행하였다. XRD 데이터는 치다마이드-API 및 치다마이드-HCl 염이 도 3a(치다마이드-API) 및 도 3b(치다마이드-HCl 염)에 도시된 바와 같은 상이한 XRD 프로파일을 가짐을 나타내었다. 2-세타 값은 도 3d에 도시된 바와 같이 치다마이드-API와 치다마이드-HCl 염 간에 상이하였다. 이러하 데이터는 치다마이드-HCl 염이 치다마이드-API의 결정 형태와는 상이한 신규한 결정 형태를 가짐을 나타내었다. 2개의 상이한 결정 형태의 치다마이드-API 및 치다마이드-HCl 염을 포화 용해도 연구에서 분석하였다. 치다마이드-HCl 염은 표 2에 나타낸 바와 같이 치다마이드-API 및 치다마이드-K30보다 훨씬 더 수용성이었다. 치다마이드-API는 수불용성이었으며, 치다마이드 정제(epidaza^®)의 제형인 치다마이드-K30은 낮은 수용해도(약 26.03 ㎍/mL)를 나타내었다. 치다마이드-HCl 염의 3개의 독립 배치는 시험되었고, 각각 약 554.83, 566.90, 및 536.06 ㎍/mL의 포화 용해도를 나타내었다. 이러한 결과는, 치다마이드-HCl 염이 표 2에 나타낸 바와 같이 치다마이드-K30과 비교하여 수용해도를 20배 이상 크게 개선하였음을 나타내었다. 치다마이드-HCl 염의 수용해도의 개선은 경구 생체이용률을 증가시킬 수 있으며, 이는 이후에, PK 프로파일 및 항암 효능을 개선시킬 것이다. 치다마이드-HCl 염의 구조는 도 4에 도시된 바와 같이 FTIR 분석에 의해 추가로 확인되었다. FTIR 스펙트럼을 AutoATR System(Perkin Elmer IR 분광광도계)을 구비한 Perkin Elmer Spotlight 200i Sp2 상에서 기록하였다. FTIR 스펙트럼을 4000 내지 700 cm^-1 범위에 걸쳐 스캔하였다. 치다마이드-HCl 염의 프로파일은 도 4b에 도시된 바와 같이 cm^-1 단위의 3275 및 3309 파수에서 아닐린의 N-H 스트레칭의 신호를 상실하였다. 치다마이드-API(도 4a) 및 치다마이드-HCl 염의 FTIR 데이터의 비교는 도 4d에 재시되어 있다.

표 1. 치다마이드-API, 치다마이드-HCl 염 및 치다마이드-H₂SO₄ 염에 대한 ¹H-NMR 분광 데이터(400 MHz, d₆-DMSO)

표 2. 치다마이드-API, 치다마이드-HCl 염, 및 치다마이드-H₂SO₄ 염의 포화 용해도 연구

실시예 2 신규한 결정 형태의 치다마이드-H ₂ SO ₄ 염의 특징분석

치다마이드의 제2 염 형태를 H₂SO₄로 제조하였다. 치다마이드-H₂SO₄ 염의 구조는 도 1c 및 도 1f에 도시된 바와 같이 ¹H-NMR 및 ¹³C-NMR에 의해 식별되었다. 용매 디메틸 설폭사이드(DMSO-d₆)를 사용한 Bruker AVANCE 400MHz PLUS 기기를 이용하여 ¹H NMR을 기록하였다. ¹³C NMR 스펙트럼을 100 MHz으로 기록하였다. ¹H-NMR 데이터는 아닐린에서 NH₂ 기의 화학적 이동 신호 δ_H 5.20이 도 1c 및 도 1a에 도시된 바와 같이 치다마이드-API와 비교하여 치다마이드-H₂SO₄ 염에서 소멸되었음을 나타내었다. 이러한 결과는, 염 형태가 C21-NH₂의 위치에서 생성되었음을 나타내었다. 이는 C21-NH₃ ⁺ HSO₄ ^- 또는 치다마이드-H₂SO₄ 염을 기술할 수 있다. 치다마이드-API 및 치다마이드-H₂SO₄ 염의 상세한 화학적 이동 데이터는 표 1 및 도 1g에 나타나 있다. 또한, ESI-MS를 이용하여 분자량을 결정하였다. 치다마이드-H₂SO₄ 염의 질량 스펙트럼을 ESI 소스 및 이온 극성: 양성/음성 모드를 구비한 Bruker microTOF를 이용하여 기록하였다. 치다마이드-H₂SO₄ 염의 양이온 모드 ESI-MS 스펙트럼이 결정되었고, 도 2c에 도시되어 있다. 가장 풍부한 피크는 m/z 391.16 [M+H]⁺를 갖는다. 그러나, 치다마이드-H₂SO₄ 염에 대한 음이온 모드 ESI-MS 스펙트럼이 결정되었고, 도 2d에 도시되어 있다. 가장 풍부한 피크는 m/z 487.12 [M⁺ HSO₄]^-를 갖는다. 다음으로, 결정 형태의 치다마이드-H₂SO₄ 염을 XRD에 의해 특징분석하였다. 치다마이드-API와 치다마이드-H₂SO₄ 염 간의 XRD 프로파일의 비교를 분석하였다. XRD 측정을 PANalytical EMPYREAN X선 회절계 상에서 수행하였다. X선 방사선 소스를 위해, Cu(λ=45 kV, 40mA) 애노드를 사용하였고, 이는 스캔 속도 1/분에서 3 내지 40°의 2θ 범위이었다. XRD 데이터는 치다마이드-API 및 치다마이드-H₂SO₄ 염이 도 3a(치다마이드-API) 및 도 3c(치다마이드-H₂SO₄ 염)에 도시된 바와 같이 상이한 XRD 프로파일을 가짐을 나타내었다. 2-세타 값은 도 3d에 도시된 바와 같이 치다마이드-API와 치다마이드-H₂SO₄ 염 간에 상이하였다. 이러한 데이터는 치다마이드-H₂SO₄ 염이 치다마이드-API의 결정 형태와는 상이한 신규한 결정 형태를 가짐을 나타내었다. 2개의 상이한 결정 형태의 치다마이드-API 및 치다마이드-H₂SO₄ 염을 포화 용해도 연구에서 분석하였다. 치다마이드-H₂SO₄ 염은 표 2에 나타낸 바와 같이 치다마이드-API 및 치다마이드-K30보다 훨씬 더 수용성이었다. 치다마이드-API는 수불용성이었으며, 치다마이드 정제(epidaza^®)의 제형인 치다마이드-K30은 낮은 수용해도(약 26.03 ㎍/mL)를 나타내었다. 치다마이드-H₂SO₄ 염의 3개의 독립 배치를 시험하였고, 이는 각각 약 597.39, 652.90, 및 561.5 ㎍/mL의 포화 용해도를 나타내었다. 이러한 결과는, 치다마이드-H₂SO₄ 염이 표 2에 나타낸 바와 같이 치다마이드-K30과 비교하여 수용해도를 20배 이상 크게 개선시킴을 나타내었다. 치다마이드-H₂SO₄ 염의 수용해도의 개선은 경구 생체이용률을 증가시킬 수 있으며, 이는 이후에, PK 프로파일 및 항암 효능을 개선시킬 것이다. 치다마이드-H₂SO₄ 염의 구조를 도 4c에 도시된 바와 같이 FTIR 분석에 의해 추가로 확인하였다. FTIR 스펙트럼을 AutoATR System(Perkin Elmer IR 분광광도계)을 구비한 Perkin Elmer Spotlight 200i Sp2 상에서 기록하였다. FTIR 스펙트럼을 4000 내지 700 cm^-1 범위에 걸쳐 스캔하였다. 치다마이드-H₂SO₄ 염의 프로파일은 도 4c에 도시된 바와 같이 cm^-1 단위의 3412 및 3309 파수에서 아닐린의 N-H 스트레칭의 신호를 상실하였다. 치다마이드-API(도 4a) 및 치다마이드-H₂SO₄ 염의 FTIR 데이터의 비교는 도 4d에 제시되어 있다.

실시예 3 신규한 비정질 형태의 셀레콕시브-Na 염의 특징분석

비정질 형태는 분자 패킹의 장거리 규칙도(long-range order)를 갖는 결정 형태와 달리 단거리 분자 규칙도를 가짐으로써 특징분석된다. 셀레콕시브는 BCS(생물의약품 분류 시스템)의 클래스 II로서 분류되었다. 이는 낮은 용해도 및 높은 투과율 특성을 나타내었다. 대부분의 상용화된 약물은 적절한 투과율을 가지며, 용해는 이러한 약물의 흡수를 위한 속도 제한 단계이다. 한편, 용해도는 약물 개발에서 다른 중요한 문제였으며, 비정질 형태의 제조는 낮은 용해도 문제에 대한 효율적인 해법을 제공한다. 본 발명자는 비정질 형태의 셀레콕시브-Na 염을 생성하는 독특한 방ㅂ버을 설계하고, 시험하였다. NaH 강염기 조건에서, Na에 의한 셀레콕시브-API의 설폰아미드 기에서 수소의 대체가 일어났고, 정제 및 응축을 포함한 다단계를 통해, 신규한 비정질 셀레콕시브-Na 염을 생성하였다. 첫째로, 셀레콕시브-API 및 셀레콕시브-Na 염의 ¹H-NMR 스펙트럼을 비교하였고, 이는 도 5a 및 도 5b에 도시되어 있다. 설폰아미드에서 2개의 수소 신호가 도 5b에 도시된 바와 같이 소멸되는 것이 명확하게 나타났다. 2개의 Na 원자가 설폰아미드 기로부터 2개의 수소 원자를 대체하여 신규한 셀레콕시브-Na 염을 생성한다는 것이 제안되었다. 셀레콕시브-API의 ¹H NMR 데이터(400 MHz, CDCl₃)는 하기와 같이 기술되었다: δ 2.36(3H, s), 4.86(2H, s), 6.72(1H, s), 7.09(2H, dd), 7.16(2H, d), 7.46(2H, m), 7.89(2H, m). 셀레콕시브-Na 염의 ¹H NMR 데이터(400 MHz, CDCl₃)는 하기와 같이 기술되었다: δ 2.09(3H, s), 6.59(1H, s), 6.87(4H, s), 6.94(2H, d), 7.61(2H, d). ¹H-NMR 데이터는 설폰아미드에서 NH₂ 기의 화학적 이동 신호 δ_H 4.86이 도 5b 및 도 5a에 도시된 바와 같이 셀레콕시브-API와 비교하여 셀레콕시브-Na 염에서 소멸됨을 나타내었다. 또한, ¹³C-NMR 데이터는 도 5c, 도 5d 및 도 5e에 나타나 있다. 다음으로, 본 발명자는 FAB-MS를 이용하여, 도 6에 도시된 바와 같이 셀레콕시브-Na 염의 분자량을 확인하였다. FAB Source 및 이온 극성: 양 모드를 구비한 JEOL JMS-700을 이용하여 셀레콕시브-Na 염의 질량 스펙트럼을 기록하였다. 데이터는 실험치 m/z가 426.1 [M+H⁺]임을 나타내었다. 셀레콕시브-Na 염이 425.04의 분자량을 갖는 C₁₇H₁₂F₃N₃Na₂O₂S임을 시사하였다. C₁₇H₁₂F₃N₃Na₂O₂S에 대한 계산된 m/z는 425.04이었으며, 이는 FAB-MS에서 426.1 (M+H)⁺임을 확인하였다. 데이터는 셀레콕시브-Na 염이 2개의 수소를 대체하기 위해 2개의 나트륨을 함유함을 다시 확인하였다. 다음으로, 비정질 셀레콕시브-Na 염의 수용해도를 평가하였다. 표 3에 나타낸 바와 같이, 셀레콕시브-API는 수불용성이었지만, 셀레콕시브-캡슐(Celebrex^®)은 약간 수불용성이었다(약 1.19 ㎍/mL). 비정질 형태의 셀레콕시브-Na 염의 3개의 독립 배치는 각각 약 54.72, 54.45, 및 56.72 ㎍/mL의 포화 용해도를 갖는 것으로 시험되었다. 셀레콕시브-Na 염의 수용해도는 셀레콕시브-API 및 셀레콕시브-캡슐과 비교하여 유의미하게 개선되었다. 이러한 결과는, 비정질 염 형태의 셀레콕시브-Na의 개선된 수용해도 특성이 경구 생체이용률을 증가시킬 수 있고, 이에 따라, 치료 효능을 증가시킴을 시사하였다. 또한, 도 7에 도시된 바와 같이, XRD 데이터는 셀레콕시브-API가 특정 결정 패턴(도 7a)을 갖지만, 비정질 셀레콕시브-Na 염이 도 7b에 도시된 바와 같이 비정질 회절 패턴을 가짐을 나타내었다. 이러한 결과는, 비정질 셀레콕시브-Na 염이 포화 수용해도의 상당한 개선을 갖는 특정 형태를 지님을 나타내었다. 담체로서 상이한 폴리머를 사용함으로써 비정질 형태의 셀레콕시브를 제조하기 위해 여러 연구를 수행하였다. 비정질 셀레콕시브-Na 염의 구조를 도 8에 도시된 바와 같이 FTIR의 분석에 의해 재확인하였다. 비정질 셀레콕시브-Na 염은 도 8a 및 도 8b에 도시된 바와 같이 cm^-1 단위의 3234 및 3341 파수에서 설폰아미드의 N-H 스트레칭을 상실하였다. 셀레콕시브-API와 비정질 셀레콕시브-Na 염 간의 FTIR 데이터의 비교는 도 8d에 제시되어 있다.

표 3. 셀레콕시브-API, 셀레콕시브-캡슐, 및 셀레콕시브-Na 염(비정질 형태 또는 결정질 형태)의 포화 용해도 연구

실시예 4 결정질 형태의 셀레콕시브-Na 염의 특징분석

결정질 셀레콕시브-Na 염을 제조하고 ¹H-NMR, ¹³C-NMR, XRD, MS, FTIR에 분석하였다. 표 3에 나타낸 바와 같이, 3가지의 상이한 배치로부터의 결정질 형태의 셀레콕시브-Na 염의 수용해도는 약 111.5, 133.63, 및 95.34 ㎍/mL인 것으로 나타났다. 도 7c 및 도 7d에 도시된 바와 같이, 결정질 셀레콕시브-Na 염의 결정 회절 패턴은 셀레콕시브-API의 결정 회절 패턴과는 상이하다. 이러한 결과는 결정질 셀레콕시브-Na 염이 수용해도의 뚜렷한 개선을 유발시키는 특정 결정질 형태를 지님을 나타내었다. 결정질 셀레콕시브-Na 염의 구조를 도 8c에 도시된 바와 같이 FTIR의 분석에 의해 재확인하였다. 셀레콕시브-Na 염은 셀레콕시브-API와 비교하여, 도 8c 및 도 8d에 도시된 바와 같이, cm^-1 단위의 3234 및 3341 파수에서 설폰아미드의 N-H 스트레칭을 상실하였다.

실시예 5 CT26-보유 마우스에서 셀레콕시브-캡슐 및 항-PD-1 Ab와 조합할 때 치다마이드-K30과 치다마이드-HCl 염 간의 항암 활성의 비교

치다마이드 염 형태가 종양 억제에 대한 효능을 증가시키는 지의 여부를 조사하기 위해, 본 발명자는 CT26-보유 마우스에서 항-PD-1 항체(2.5 mg/kg; Lot#640517M1)와 조합한 치다마이드-K30 플러스 셀레콕시브-캡슐 대 치다마이드-HCl 염 플러스 셀레콕시브-캡슐의 치료 효과를 평가하였다. 도 9에 도시된 바와 같이, CT26 종양-보유 마우스에서 종양 크기를 11일째에 약 200 내지 250 ㎣까지 성장시켰다. 이후에, 마우스를 나타낸 바와 같이 6가지 상이한 요법으로 치료하였다. 도 9a에 도시된 바와 같이, 항-PD-1 Ab와 조합한 치다마이드-K30 50 mg/kg 플러스 셀레콕시브-캡슐 50 mg/kg은 항-PD-1 Ab 그룹과 비교하여 CT26-보유 마우스에서 종양 성장을 유의미하게 억제하였다. 항-PD-1 Ab와 조합한 12.5, 25, 또는 50 mg/kg 플러스 셀레콕시브-캡슐 50 mg/kg의 용량에서 치다마이드-HCl 염의 결과는 또한, 항-PD-1 Ab 그룹과 비교하여 CT26 종양-보유 마우스에서 종양 성장의 유의미한 억제를 나타내었다. 치다마이드 염 형태와 치다마이드-K30 사이에 항암 활성을 비교하기 위해, 효능을 하기 등급화(grading)에 의해 평가하였다. 이러한 연구에서, 본 발명자는 완전 반응(CR, 치료 종료 시에 종양 보유 마우스에서 ≤ 0.5배 종양 성장); 부분 반응(PR, 치료 종료 시에 종양 보유 마우스에서 종양 크기 >0.5배 종양 성장 그러나 ≤2배 종양 성장); 안정한 질환(SD, 치료 종료 시에 종양 보유 마우스에서 2 내지 5배 종양 성장); 진행성 질환(PD, 치료 종료 시에 종양 보유 마우스에서 5배 이상의 종양 성장)을 규정하였다.

도 9b에 도시된 바와 같이, 항-PD-1 Ab 2.5 mg/kg과 조합한 치다마이드-HCl 염 50 mg/kg 플러스 셀레콕시브-캡슐 50 mg/kg은 항-PD-1 Ab와 조합한 치다마이드-K30 50 mg/kg 플러스 셀레콕시브-캡슐 50 mg/kg 그룹과 비교하여 CT26 종양-보유 마우스에서 종양 성장을 억제하는 데 훨씬 더 효과적이다. 항-PD-1 Ab와 조합한 치다마이드-K30 50 mg/kg 플러스 셀레콕시브-캡슐 50 mg/kg으로 치료는 6마리의 마우스에서 CR(60%) 및 4마리의 마우스에서 중간 정도의 종양 성장을 갖는 PD를 달성하였으며, 항-PD-1 Ab와 조합한 치다마이드-HCl 염 50 mg/kg 플러스 셀레콕시브-HCl 염 50 mg/kg로의 치료는 마우스에서 PD 없이 5마리의 마우스에서 PR 및 3마리의 마우스에서 CR을 갖는 89%의 반응률을 달성하였다. 이러한 결과는, 치다마이드-HCl 염 형태가 더 높은 수용해도 및 경구 생체이용률로 인해 치다마이드-K30보다 더욱 효율적이고, 이에 따라, 치료 효능을 개선시킴을 제시하였다. 도 9a 및 도 9b에서, 또한, 항-PD-1 Ab와 조합하여, 치다마이드-HCl 염 12.5 mg/kg 플러스 셀레콕시브-캡슐 50 mg/kg이 종양 미세환경에 영향을 미치고 종양을 사멸시키기 위해 세포독성 T-림프구를 재활성화시키는 데 충분함을 나타내었다. 도 9c에 도시된 바와 같이, 치료 그룹에서 어떠한 마우스도 체중이 상실되지 않았다. 26일에 치료를 중지한 후에, CT26 종양-보유 마우스에서 종양은 IgG 대조군에서 더 빠르게 성장하였다. 그러나, 면역 관문 억제제 요법과 조합한 치다마이드-HCl 염 플러스 셀레콕시브-Na 염은 종양 성장을 억제하는 데 매우 강력하였고, 이에 따라 생존률을 유의미하게 증가시켰다(도 9d). 도 9d에 도시된 바와 같이, 항-PD-1 Ab와 조합한 치다마이드-HCl 염 50 mg/kg 플러스 셀레콕시브-캡슐 50 mg/kg은 생존률을 약 77.7%까지 유의미하게 상승하였지만, 항-PD-1 Ab와 조합한 치다마이드-K30 50 mg/kg 플러스 셀레콕시브-캡슐 50 mg/kg은 CT26-보유 종양 마우스 모델에서 단지 60% 생존률을 달성하였다. 항-PD-1 Ab와 조합한 치다마이드-HCl 염 25 mg/kg 플러스 셀레콕시브-캡슐 50 mg/kg이 생존률을 66.6%까지 유의미하게 증가했다는 것이 주목할 만하다. 이러한 결과는 치다마이드-HCl 염 플러스 셀레콕시브-캡슐이 종양 미세환경을 제어 및 조절하고 면역요법을 어느 정도까지 상승시키는 데, 치다마이드-K30 플러스 셀레콕시브-캡슐보다 더욱 강력함을 시사하였다.

이러한 연구는 또한, 면역 관문 억제제와 조합한 치다마이드-HCl 염 플러스 셀레콕시브-캡슐이 치다마이드-K30 플러스 셀레콕시브-캡슐에 비해 항암 면역 반응을 상승시키는 데 더욱 강력함을 입증하였다. 한편, 항-PD-1 Ab와 조합할 때 치다마이드-HCl 염 플러스 셀레콕시브-캡슐과 치다마이드-K30 플러스 셀레콕시브-캡슐 간의 일대일 비교는 치다마이드-HCl 염 플러스 셀레콕시브-Na 염과의 병용 요법의 항암 활성이 치다마이드-K30 플러스 셀레콕시브-캡슐과의 병용 요법의 항암 활성보다 더욱 양호함을 나타내었다.

실시예 6 CT26-보유 마우스에서 항-PD-1 Ab와 조합한 치다마이드-K30 플러스 셀레콕시브-캡슐과 치다마이드-HCl 염 플러스 셀레콕시브-Na 염 간에 항암 효과의 비교

종양 억제 활성의 개선을 나타내기 위해, 본 발명자는 CT26-보유 마우스에서 항-PD-1 항체(2.5 mg/kg; Lot#640517M1)와 조합한 치다마이드-K30 플러스 셀레콕시브-캡슐 대 치다마이드-HCl 염 플러스 셀레콕시브-Na 염의 치료 효과를 평가하였다. 도 10에 도시된 바와 같이, CT26-보유 마우스에서 종양 크기가 10일째에 약 200 내지 250 ㎣까지 성장하였을 때 각 연구 그룹을 치료하였다. 먼저, 항-PD-1 Ab와 조합한 치다마이드-K30 50 mg/kg 플러스 셀레콕시브-캡슐 50 mg/kg은 항-PD-1 Ab 그룹과 비교하여 CT26-보유 마우스에서 종양 성장을 유의미하게 억제하였다(도 10a). 항-PD-1 Ab와 조합한 12.5, 25, 및 50 mg/kg의 다양한 용량에서 치다마이드-HCl 염 50 mg/kg 플러스 비정질 셀레콕시브-Na 염의 결과는 항-PD-1 Ab 그룹과 조합한 CT26-보유 마우스에서 종양 성장의 유의미한 억제를 나타내었다(도 10a). 도 10b에서, 항-PD-1 Ab 2.5 mg/kg과 조합한 치다마이드-HCl 염 50 mg/kg 플러스 상이한 용량의 셀레콕시브-Na 염이 항-PD-1 Ab 2.5 mg/kg과 조합한 치다마이드-K30 50 mg/kg 플러스 셀레콕시브-캡슐 50 mg/kg과 비교하여 CT26-보유 마우스에서 종양 성장을 억제하는 데 훨씬 더욱 효과적임을 나타내었다. 이러한 결과는 치다마이드-HCl 염 및 셀레콕시브-Na 염이 치다마이드-K30 및 셀레콕시브-캡슐보다 더욱 효율적임을 시사하였는데, 왜냐하면, 이러한 염 형태는 더 높은 수용해도 및 경구 생체이용률을 지니고, 이에 따라, 치료 효능을 개선시키기 때문이다.

도 10a 및 도 10b에서, 셀레콕시브-Na 염 12.5 mg/kg과 조합한 치다마이드-HCl 염 50 mg/kg이 종양 미세환경에 영향을 미치고 종양을 사멸시키기 위해 세포독성 T-림프구를 재활성화시키기에 충분함을 나타내었다. 항-PD-1 Ab 2.5 mg/kg과 조합한 동일한 용량(50 mg/kg)의 치다마이드-K30 플러스 셀레콕시브-캡슐(4마리의 마우스에서 CR, 50%를 달성함) 및 치다마이드-HCl 염 플러스 셀레콕시브-Na 염 간의 항암 효과의 일대일 비교는 염 형태 요법과의 후자의 조합이 CT26-보유 마우스에서 종양 성장 억제의 더 양호한 효능을 가지고 도 10b에 도시된 바와 같이 7마리의 마우스가 CR을 달성함(100%)을 나타내었다. 또한, 도 10c에 도시된 바와 같이, 상이한 치료 그룹에서 종양 부재 동물의 백분율(CR)을 평가하였다. 항-PD-1 Ab와 조합하여, 모든 염 형태 요법은 치다마이드-K30 플러스 셀레콕시브-캡슐과 비교할 때 종양 성장을 억제하는 데(더 높은 종양-부재의 백분율을 갖는 데) 더욱 강력하였다. 이러한 결과는, 셀레콕시브-Na 염이 CT26-보유 마우스 모델에서 면역 관문 억제제와 조합한 셀레콕시브-캡슐보다 종양 성장을 억제하는 데 더욱 강력하였다. 유사한 결과는 또한, 치다마이드-K30과 비교하여 치다마이드-HCl에서 나타났다. 이러한 발견은 또한, 치다마이드-HCl 염 플러스 셀레콕시브-Na 염의 용량이 도 10a 및 도 10b에 도시된 바와 같이 종양 성장을 억제하기 위한 종양 미세환경에서 세포독성 T-림프구의 강력한 재활성화를 위해 면역 관문 억제제와 조합하여 감소될 수 있음을 나타내었다. 도 10d에 도시된 바와 같이, 치료 그룹에서 어떠한 마우스도 체중을 상실하지 않았다.

25일째에 치료를 중지한 후에, CT26-보유 종양 마우스에서 종양은 IgG(2.5 mg/kg; Lot#65481701) 대조군에서 더 빠르게 성장하였다. 도 10e에 도시된 바와 같이, 항-PD-1 Ab와 조합하여, 치다마이드-HCl 염 50 mg/kg 플러스 셀레콕시브-Na 염 50 mg/kg 그룹은 CT25-보유 종양 마우스 모델에서 치다마이드-K30 플러스 셀레콕시브-캡슐(약 75%)과 비교하여 생존률을 약 100%까지 유의미하게 증가시켰다. 생존률은 항-PD-1 그룹의 경우에 단지 37.5%이었다. 이러한 결과는 치다마이드-HCl 염 플러스 셀레콕시브-Na 염이 종양 미세환경을 제어 및 조절하고 면역 반응을 어느 정도까지 상승시키는 데 치다마이드-K30 플러스 셀레콕시브-캡슐보다 더욱 강력하였다. 결론적으로, 면역 관문 억제제 요법과 조합한 치다마이드-HCl 염 플러스 셀레콕시브-Na 염은 종양 성장을 억제하는 데 매우 강력하였고, 이에 따라, 생존률을 유의미하게 증가시켰다(도 10e). 이러한 연구는, 면역 관문 억제제와 조합한 치다마이드-HCl 염 플러스 셀레콕시브-Na 염이 치다마이드-K30 플러스 셀레콕시브-캡슐보다 항암 면역 반응을 상승시키는 데 더욱 강력함을 입증하였다. 한편, 항-PD-1 Ab와 조합할 때 치다마이드-HCl 염 플러스 셀레콕시브-Na 염과 치다마이드-K30 플러스 셀레콕시브-캡슐 간의 일대일 비교는 치다마이드-HCl 염 플러스 셀레콕시브-Na 염과의 병용 요법의 항암 활성이 치다마이드-K30 플러스 셀레콕시브-캡슐과의 병용 요법의 항암 활성보다 더욱 양호함을 나타내었다.

실시예 7 항-PD-1 항체와 조합한 치다마이드-HCl 염 플러스 셀레콕시브-Na 염의 최적의 치료 반응 용량을 확인하고 CT26 종양-보유 마우스에서 항-PD-1 항체와 조합한 치다마이드-H ₂ SO ₄ 염 플러스 셀레콕시브-Na 염을 평가함

CT26 종양-보유 마우스에서 항-PD-1 항체와 조합한 치다마이드-HCl 염 플러스 셀레콕시브-Na 염의 최적의 치료 반응 용량을 시험하기 위해, 약 300 ㎣의 종양 크기를 갖는 마우스를 항-PD-1 항체와 조합한 상이한 용량의 치다마이드-HCl 염 플러스 셀레콕시브-Na 염으로 치료하였다. 도 11a에 도시된 바와 같이, 항-PD-1 항체(2.5 mg/kg; Lot#717918D1)와 조합한 50 mg/kg의 용량의 치다마이드-HCl 염 플러스 비정질 셀레콕시브-Na 염은 25 mg/kg 및 12.5 mg/kg의 용량에서보다 더욱 양호하였다. 이러한 결과는 또한, 항-PD-1 항체(2.5 mg/kg)와 조합한 25 mg/kg 용량의 치다마이드-HCl 염 플러스 셀레콕시브-Na 염이 항-PD-1 항체(2.5 mg/kg)와 조합한 50 mg/kg의 용량의 치다마이드-K30 플러스 셀레콕시브-캡슐과 비교할 때와 유사한 치료 반응을 지님을 나타내었다. 치다마이드-HCl 염 플러스 셀레콕시브-Na 염이 CT26 종양-보유 마우스에서 항-PD-1 항체와 조합할 때 동일한 양에서 치다마이드-K30 플러스 셀레콕시브-캡슐보다 더욱 강력한 항암 활성을 지님을 제시하였다. 또한, 항-PD-1 항체와 조합하여, 치다마이드-HCl 염 플러스 결정질 셀레콕시브-Na 염은 도 11b에 도시된 바와 같이 CT26 종양-보유 마우스에서 동일한 용량에서 치다마이드-HCl 염 플러스 비정질 셀레콕시브-Na 염과 비교할 때 감소된 항암 활성 효능을 지녔다. 한편, 항-PD-1 항체와 조합한 치다마이드-H₂SO₄ 염 플러스 셀레콕시브-Na 염은 도 11b에 도시된 바와 같이 항-PD-1 항체와 조합한 치다마이드-HCl 염 플러스 셀레콕시브-Na 염의 항암 활성과 유사한 강력한 항암 활성을 지녔다. 이러한 실험에서, 상이한 치료 전에 종양이 약 300 ㎣의 평균 부피에 도달하고, 항-PD-1 항체 단백질 활성이 이전 연구와 비교하여 더 낮기 때문에, 항-PD-1 항체 치료의 항암 치료 효과는 이러한 연구에서 매우 불량한 것으로 나타났다. 도 11b에 도시된 바와 같이, 항-PD-1 항체(2.5 mg/kg)와 조합한 최적의 용량의 치다마이드-HCl 염 50 mg/kg 또는 치다마이드-H₂SO₄ 염 50 mg/kg 플러스 50 mg/kg 용량의 셀레콕시브-Na 염은 이러한 연구에서 최상의 치료 반응을 지녔다. 또한, 비정질 셀레콕시브-Na 염은 병용 요법에서 결정질 셀레콕시브-Na 염보다 더 양호한 반응률을 달성하였다. 종양 크기가 치료 전에 평균 약 300 ㎣일 때, 항-PD-1 항체와 조합한 치다마이드-K30 플러스 셀레콕시브-캡슐은 단지 약 33%의 반응률을 달성하였다. 그러나, 항-PD-1 항체와 조합한 치다마이드-HCl 염 또는 치다마이드-H₂SO₄ 염 플러스 셀레콕시브-Na 염은 반응률을 각각 62.5% 및 55.5%까지 유의미하게 개선시켰다. 이러한 결과는 염 형태의 치다마이드 및 셀레콕시브가 CT26 종양-보유 마우스에서 치다마이드-K30 및 셀레콕시브-캡슐보다 면역 반응률을 상승시키는 데 더욱 강력함을 나타내었다. 도 11c에 도시된 바와 같이, 치료 그룹에서 어떠한 마우스도 체중이 상실되지 않았다.

26일째에 치료를 중지시킨 후에, CT26-보유 종양 마우스에서 종양은 IgG 대조군에서 더욱 빠르게 성장하였다. 그러나, 면역 관문 억제제 요법과 조합한 치다마이드-HCl 염 또는 치다마이드-H₂SO₄ 염 플러스 셀레콕시브-Na 염은 종양 성장을 억제하는 데 매우 강력하였고, 이에 따라, 생존률을 유의미하게 증가시켰다(도 11d). 도 11d에 도시된 바와 같이, 항-PD-1 항체와 조합한 치다마이드-K30 50 mg/kg 플러스 셀레콕시브-캡슐 50 mg/kg 그룹은 이러한 연구에서 생존률을 단지 약 22%까지 증가하였는데, 왜냐하면, 항-PD-1 항체 항암 활성이 이전 결과와 비교하여 더 낮았기 때문이다. 한편, 항-PD-1 항체와 조합한 치다마이드-HCl 염 또는 치다마이드-H₂SO₄ 염 50 mg/kg 플러스 셀레콕시브-Na 염 50 mg/kg 그룹은 CT26-보유 종양 마우스 모델에서 생존률을 각각 약 37.5% 또는 44.4%까지 유의미하게 증가시켰다. 이러한 결과는 항-PD-1 항체와 조합한 치다마이드-HCl 염 또는 치다마이드-H₂SO₄ 염 플러스 셀레콕시브-Na 염이 종양 미세환경을 제어 및 조절하고 면역 반응을 어느 정도까지 상승시키는 데 항-PD-1 항체와 조합한 치다마이드-K30 플러스 셀레콕시브-캡슐보다 더욱 강력함을 시사하였다. 이러한 연구는 또한, 면역 관문 억제제와 조합한 치다마이드-HCl 염 또는 치다마이드-H₂SO₄ 염 플러스 셀레콕시브-Na 염이 면역 관문 억제제와 조합한 치다마이드-K30 플러스 셀레콕시브-캡슐보다 항암 면역 반응을 상승시키는 데 더욱 강력함을 입증하였다. 한편, 항-PD-1 Ab와 조합할 때 치다마이드-HCl 염 플러스 셀레콕시브-Na 염과 치다마이드-K30 플러스 셀레콕시브-캡슐 간의 일대일 대응은 치다마이드-HCl 염 플러스 셀레콕시브-Na 염과의 병용 요법의 항암 활성이 치다마이드-K30 플러스 셀레콕시브-캡슐과의 병용 요법의 항암 활성보다 더 양호함을 나타내었다.

실시예 8 제1선 항-PD-1 Ab 치료에 대한 내성은 CT26-보유 마우스에서 치다마이드-HCl 염 플러스 셀레콕시브-Na 염과 조합한 항-PD-1/항-CTLA-4 Ab로의 제2선 치료에 의해 극복됨

이러한 연구에서, 제1선 항-PD-1 항체 치료법이 실패하였을 때 항-PD-1/항-CTLA-4 항체와 조합한 치다마이드-HCl 염 플러스 셀레콕시브-Na 염으로의 제2선 치료법의 항암 효능의 평가를 위해 마우스를 인간 제1선 암 치료법에서 발생하는 제1선 약물 내성에 대한 치료를 모방하기 위해 제2선 치료법으로 치료하였으며, 여기서, 제1선 항-PD-1 항체 요법을 받은 인간 암 환자의 대부분은 내성을 나타낼 것이다. 치다마이드-HCl 염 플러스 셀레콕시브-Na 염이 종양 미세환경의 조절을 통한 면역 관문 억제제 민감성을 개선할 수 있는 지의 여부를 평가하였다. 종양을 항-PD-1 항체(2.5 mg/kg; Lot#717918D1)의 2회(2회 투여 간에 3일) 투여의 제1선 치료 전에 8일 동안 성장시켰다(종양 크기 평균 약 120 ㎣). 종양이 제 용량의 제1선 항-PD-1 항체 요법 후에 3일에 3배의 연속 증가의 치료 실패 기준(종양 크기 평균 360 ㎣)을 충족하거나 종양 체적이 ＜600 ㎣일 때, 마우스를 재등록하였다. 항-PD-1 Ab에 대한 내성을 갖는 이러한 마우스를 추가로 랜덤화하였다. 명시된 바와 같은 10가지 상이한 치료 요법이 존재한다(n= 9 내지 11마리의 마우스/그룹). 이러한 마우스를 항-IgG Ab(2.5 mg/kg; Lot#65481701), 항-PD-1 Ab(2.5 mg/kg; Lot#717918D1), 양성 대조군으로서 항-PD-1 Ab(2.5 mg/kg)와 조합한 엔티노스타트(20 mg/kg), 치다마이드-K30 플러스 셀레콕시브-캡슐, 치다마이드-HCl 염(50 mg/kg) 플러스 셀레콕시브-Na 염(50 mg/kg), 항-PD-1 Ab와 조합한 치다마이드-K30 플러스 셀레콕시브-캡슐, 항-PD-1 Ab(2.5 mg/kg)와 조합한 치다마이드-HCl 염(50 mg/kg) 플러스 셀레콕시브-Na 염(50 mg/kg), 항-CTLA-4 Ab(2.5 mg/kg; Lot#702418A2B), 항-CTLA-4 Ab(2.5 mg/kg)와 조합한 치다마이드-K30 플러스 셀레콕시브-캡슐, 항-CTLA-4 Ab(2.5 mg/kg)와 조합한 치다마이드-HCl 염(50 mg/kg) 플러스 셀레콕시브-Na 염(50 mg/kg) 그룹을 포함하는, 상이한 제2선 치료 그룹으로 랜덤화하였다. 항체를 복강내(i.p)로 6회(2회 주사 간에 3일) 치료하였다. 엔티노스타트를 8회(2일마다 제공됨) 경구 투여하였다. 치다마이드-K30 또는 치다마이드-HCl 염 및 셀레콕시브-캡슐 또는 셀레콕시브-Na 염을 경구 투여에 의해 16회(매일) 치료하였다. 도 12a 및 도 12b에 도시된 바와 같이, 항-PD-1 Ab 그룹에서의 마우스는 PR(반응률 0%)이 달성되지 않았으며, 8마리의 마우스는 빠른 종양 성장을 갖는 PD이었다. 치다마이드-HCl 염 플러스 셀레콕시브-Na 염으로의 치료는 치다마이드-K30 플러스 셀레콕시브-캡슐과 비교하여 종양 성장을 억제하는 데 더욱 강력하였다. 치다마이드-HCl 염 플러스 셀레콕시브-Na 염으로의 치료는 3마리의 마우스가 CR을 달성하였으며, 4마리의 마우스가 빠른 종양 성장을 갖는 PD(반응률 33.3%)를 달성함을 나타내었다. 그러나, 치다마이드-K30 플러스 셀레콕시브-캡슐로의 치료는 단지 1마리의 마우스가 PR을 달성하였고, 8마리의 마우스가 빠른 종양 성장을 갖는 PD(반응률 10%)를 달성함을 나타내었다. 치다마이드-HCl 염 플러스 셀레콕시브-Na 염이 항-PD-1 Ab와 조합될 때, 결과는 4마리의 마우스가 CR(반응률 36.3%)을 달성하였으며, 6마리의 마우스가 훨씬 더 느린 종양 성장을 갖는 PD를 달성함을 나타내었다. 그러나, 항-PD-1 Ab와 조합한 치다마이드-K30 플러스 셀레콕시브-캡슐로의 치료는 단지 1마리의 마우스가 PR을 달성하였고, 9마리의 마우스가 중간 정도의 종양 성장(반응률 10%)과 함께 PD를 달성함을 나타내었다. 이러한 결과는 항-PD-1 Ab가 항-PD-1 Ab에 대한 내성을 갖는 마우스에서 항암 활성을 가지지 않음을 시사하였다. 또한, 치다마이드-HCl 염 플러스 셀레콕시브-Na 염 요법은 종양 미세환경을 제어하고 항-PD-1 Ab에 대한 내성을 갖는 마우스에서 항-PD-1 Ab 민감성을 증가시키는 데 매우 강력하였다. 그리고, 치다마이드-K30 플러스 셀레콕시브-캡슐로의 치료는 치다마이드-HCl 염 플러스 셀레콕시브-Na 염의 염 형태 조합물과 비교하여 훨씬 더 적은 항암 활성을 나타내었다. 도 12b에 도시된 바와 같이, 항-CTLA-4 Ab 그룹은 항-PD-1 Ab 그룹과 비교하여 종양 성장을 중간 정도로 억제하였지만, CR 또는 PR이 달성된 마우스가 존재하지 않았으며, 7마리의 마우스는 중간 정도의 종양 성장을 갖는 PD를 달성하였다. 그러나, 항-CTLA-4 Ab 그룹과 비교하여 치다마이드-HCl 염 플러스 셀레콕시브-Na 염에서, 결과는 4마리의 마우스가 CR을 달성하였으며, 2마리의 마우스가 PR(반응률 60%)을 달성하였으며, PD 마우스가 존재하지 않음을 나타내었다. 그리고, 항-CTLA-4 Ab 그룹과 조합한 치다마이드-K30 플러스 셀레콕시브-캡슐에서, 결과는, 2마리의 마우스가 CR을 달성하였고, 1마리의 마우스가 PR(반응률 25%)을 달성하였고, 5마리의 마우스가 중간 정도의 종양 성장을 갖는 PD를 달성함을 나타내었다. 마지막으로, 항-PD-1 Ab와 조합한 양성 대조군 엔티노스타트에서, 1마리의 마우스가 PR(반응률 9%)을 달성하였고, 8마리의 마우스가 빠른 종양 성장을 갖는 PD를 달성하였다. 종합하면, 치다마이드-HCl 염 플러스 셀레콕시브-Na 염 요법은 항-PD-1 Ab에 대한 내성을 갖는 마우스에서 반응률을 상승시키는 데 강력하였다. 또한, 치다마이드-HCl 염 플러스 셀레콕시브-Na 염은 항-PD-1 Ab에 대한 내성을 갖는 마우스에서 항-PD-1 Ab와 조합한 것보다 항-CTLA-4 Ab와 조합할 때 반응률을 상승시키는 데 더욱 강력하였다.

31일째에 치료를 중지한 후에, CT26 종양-보유 마우스에서 종양은 항-PD-1 및 항-CTLA-4 그룹에서 더욱 빠르게 성장하였다(도 12d). 생존률을 60일에 평가하였다. 항-PD-1 Ab와 조합하지 않은 치다마이드-K30 플러스 셀레콕시브-캡슐로의 치료는 항-PD-1 Ab와의 조합물보다 더 양호한 생존률을 나타내었으며, 이는 각각 11.1% 및 0%를 달성하였다. 그리고, 항-PD-1 Ab와 조합하지 않은 치다마이드-HCl 염 플러스 셀레콕시브-Na 염으로의 치료는 항-PD-1 Ab와의 조합물보다 더 양호한 생존률을 나타내었으며, 이는 각각 44% 및 40% 달성하였다. 결과는 치료 중지 후에, 항-PD-1 Ab와 조합한 치다마이드-K30 플러스 셀레콕시브-캡슐 또는 치다마이드-HCl 염 플러스 셀레콕시브-Na 염이 예상치 못하게 치다마이드-K30 플러스 셀레콕시브-캡슐 또는 치다마이드-HCl 염 플러스 셀레콕시브-Na 염보다 더 빠른 종양 성장을 나타냄을 명시하였다. 이러한 연구는 또한, 항-CTLA-4 Ab와 조합한 치다마이드-HCl 염 플러스 셀레콕시브-Na 염이 항-PD-1 Ab와 조합한 치다마이드-HCl 플러스 셀레콕시브-Na보다 항암 면역 반응을 상승시키는 데 더욱 강력함을 입증하였다. 그러나, 항-CTLA-4 Ab와 조합한 치다마이드-HCl 염 플러스 셀레콕시브-Na 염은 항-CTLA-4 Ab와 조합한 치다마이드-K30 플러스 셀레콕시브-캡슐보다 종양 성장을 억제하는 데 더욱 강력하였으며, 각각 77.8% 및 41.6%의 생존률을 달성하였다(도 12d). 한편, 항-PD-1 Ab와 조합할 때 치다마이드-HCl 염 플러스 셀레콕시브-Na 염과 MS-275 간의 일대일 비교는 치다마이드-HCl 염 플러스 셀레콕시브-Na 염과의 병용 요법의 항암 활성이 항-PD-1 내성 조건에서 MS-275와의 병용 요법의 항암 활성보다 더 양호함을 나타내었다.

실시예 9 제1선 항-PD-L1 Ab 치료에 대한 내성은 CT26-보유 마우스에서 치다마이드-HCl 염 플러스 셀레콕시브-Na 염과 조합한 항-PD-1/항-CTLA-4 Ab으로의 제2선 치료에 의해 극복됨

이러한 연구에서, 본 발명자는 항-PD-L1 Ab 제1선 요법으로의 치료 후 약물 내성의 발생률 에 대한 제2선 병용 치료를 추가로 시험하였고, 제1선 항-PD-L1 항체 요법이 실패하였을 때 항-PD-1/항-CTLA-4 항체와 조합한 치다마이드-HCl 염 플러스 셀레콕시브-Na 염으로의 제2선 치료법의 항암 효능을 평가하였다. 치다마이드-HCl 염 플러스 셀레콕시브-Na 염이 제1선 항-PD-L1 항체 치료에 대한 약물 내성 후 종양 미세환경의 조절을 통한 면역 관문 억제제의 민감성을 개선시킬 수 있는 지의 여부를 시험하였다. CT-26 종양-보유 마우스(평균 종양 크기 약 160 ㎣)를 2회(2회의 주사 사이에 3일) 항-PD-L1 항체(2.5 mg/kg; Lot#720619F1)의 제1선 요법으로 치료하였다. 종양이 제2 용량의 제1선 항-PD-L1 항체 요법 후 3일에 3배 연속 증가의 치료 실패 기준(종양 크기 평균 320 ㎣)을 충족하고 종양 체적이 ＜600 ㎣일 때, 마우스를 재등록하였다. 항-PD-L1 Ab에 대한 내성을 갖는 이러한 마우스를 추가로 랜덤화하였다. 명시된 바와 같이 10가지 상이한 치료 요법이 존재하였다(n= 9 내지 11마리의 마우스/그룹). 이러한 마우스를 항-IgG Ab(2.5 mg/kg; Lot#65481701), 항-PD-1 Ab(2.5 mg/kg; Lot#717918D1), 양성 대조군으로서 항-PD-1 Ab(2.5 mg/kg)와 조합한 엔티노스타트(20 mg/kg) 플러스 셀레콕시브-캡슐, 치다마이드-K30 플러스 셀레콕시브-캡슐, 치다마이드-HCl 염(50 mg/kg) 플러스 셀레콕시브-Na 염(50 mg/kg), 항-PD-1 Ab와 조합한 치다마이드-K30 플러스 셀레콕시브-캡슐, 항-PD-1 Ab(2.5 mg/kg)와 조합한 치다마이드-HCl 염(50 mg/kg) 플러스 셀레콕시브-Na 염(50 mg/kg), 항-CTLA-4 Ab(2.5 mg/kg; Lot#702418A2B), 항-CTLA-4 Ab(2.5 mg/kg)와 조합한 치다마이드-K30 플러스 셀레콕시브-캡슐, 항-CTLA-4 Ab (2.5 mg/kg)와 조합한 치다마이드-HCl 염(50 mg/kg) 플러스 셀레콕시브-Na 염(50 mg/kg) 그룹을 포함하는 상이한 제2선 치료 그룹으로 랜덤화하였다. 항체를 복강내(i.p)로 6회(3일마다 투여함) 치료하였다. 엔티노스타트를 8회(2일마다 투여됨) 경구 투여하였다. 치다마이드-K30 또는 치다마이드-HCl 염 및 셀레콕시브-캡슐 또는 셀레콕시브-Na 염을 16회(매일) 경구 투여에 의해 치료하였다. 도 13a 및 도 13b에 도시된 바와 같이, 대조군 항-IgG 그룹에서, 2마리의 마우스는 PR을 달성하였으며, 3마리의 마우스는 빠른 종양 성장을 갖는 PD를 달성하였으며(반응률 28.6%), 이는 제1선 항-PD-L1 용법에 대해 반응성인 마우스가 제1선 치료에 대한 반응 지연으로 인한 항-PD-L1 Ab 치료에 대해 내성적인 것으로 오인되었기 때문이다. 그러나, 항-PD-1 Ab 그룹에서, 1마리의 마우스는 PR을 달성하였으며, 2마리의 마우스는 CR을 달성하였으며, 3마리의 마우스는 빠른 종양 성장을 갖는 PD를 달성하였다(반응률 33.3%). 치다마이드-HCl 염 플러스 셀레콕시브-Na 염으로의 치료는 치다마이드-K30 플러스 셀레콕시브-캡슐과 비교하여 종양 성장을 억제하는 데 더욱 강력하였다. 치다마이드-HCl 염 플러스 셀레콕시브-Na 염으로의 치료는, 6마리의 마우스가 CR을 달성하였으며, 1마리의 마우스가 PR을 달성하였으며, PD를 갖는 마우스(반응률 70%)가 존재하지 않음을 나타내었다. 그러나, 치다마이드-K30 플러스 셀레콕시브-캡슐로의 치료는 2마리의 마우스가 CR을 달성하였으며, 4마리의 마우스가 PR을 달성하였으며, 3마리의 마우스가 빠른 종양 성장을 갖는 PD를 달성함(반응률 54.5%)을 나타내었다. 치다마이드-HCl 염 플러스 셀레콕시브-Na 염이 항-PD-1 Ab와 조합할 때, 결과는 6마리의 마우스가 CR(반응률 66.6%)을 달성하였으며, 1마리의 마우스가 느린 종양 성장을 갖는 PD를 달성함을 나타내었다. 그러나, 항-PD-1 Ab와 조합한 치다마이드-K30 플러스 셀레콕시브-캡슐로의 치료는 4마리의 마우스가 CR을 달성하였으며, 1마리의 마우스가 PR(반응률 62.5%)을 달성하였으며, 1마리의 마우스가 빠른 종양 성장을 갖는 PD를 달성함을 나타내었다. 데이터는 치다마이드-HCl 염 플러스 셀레콕시브-Na 염 요법이 치다마이드-K30 플러스 셀레콕시브-캡슐 요법과 비교하여 종양 미세환경을 제어하고 항-PD-L1-내성 마우스에서 항-PD-1 Ab 민감성을 증가시키는 데 더욱 강력함을 시사하였다.

도 13b에서, 데이터는 항-CTLA-4 Ab 제2선 치료가 종양 성장을 크게 억제하였으며, 2마리의 마우스가 CR을 달성하였으며, 3마리의 마우스가 PR을 달성하였으며, 3마리의 마우스가 빠른 종양 성장을 갖는 PD(반응률 55.5%)를 달성함을 나타내었다. 그러나, 항-CTLA-4 Ab와 조합한 치다마이드-HCl 염 플러스 셀레콕시브-Na 염으로 치료된 그룹에서, 결과는 4마리의 마우스가 CR을 달성하였으며, 3마리의 마우스가 PR을 달성하였으며, 어떠한 마우스도 PD를 달성하지 않음(반응률 77.7%)을 나타내었다. 그리고, 항-CTLA-4 Ab와 조합한 치다마이드-K30 플러스 셀레콕시브-캡슐 그룹에서, 결과는 2마리의 마우스가 CR을 달성하였으며, 3마리의 마우스가 PR을 달성하였으며, 1마리의 마우스가 빠른 종양 성장을 갖는 PD를 달성함(반응률 55.5%)을 나타내었다. 마지막으로, 양성 대조군으로서 항-PD-1 Ab와 조합한 엔티노스타트 플러스 셀레콕시브-캡슐로 치료된 그룹에서, 결과는 2마리의 마우스가 CR을 달성하였으며, 1마리의 마우스가 PR을 달성하였으며, 3마리의 마우스가 빠른 종양 성장을 갖는 PD를 달성함(반응률 50%)을 나타내었다. 종합하면, 치다마이드-HCl 염 플러스 셀레콕시브-Na 염 요법은 PD-L1-내성 마우스에서 반응률을 상승하는 데 강력하였다. 또한, 면역 관문 억제제와 조합한 치다마이드-HCl 염 플러스 셀레콕시브-Na 염은 PD-L1-내성 마우스에서 면역 관문 억제제와 조합한 치다마이드-K30 플러스 셀레콕시브-캡슐보다 반응률을 상승시키는 데 더욱 강력하였다.

31일에 치료를 중지한 후에, CT26 종양-보유 마우스에서 종양은 항-PD-1 및 항-CTLA-4 그룹에서 더욱 빠르게 성장하였다(도 13d). 생존률을 62일에 평가하였다. 항-PD-1 Ab와 조합한 치다마이드-K30 플러스 셀레콕시브-캡슐로의 치료는 항-PD-1 Ab의 부재 하에서의 생존률보다 더 양호한 생존률을 나타내었으며, 이는 각각 62.5% 및 27.2%를 달성하였다. 그리고, 항-PD-1 Ab와 조합한 치다마이드-HCl 염 플러스 셀레콕시브-Na 염으로의 치료는 항-PD-1 Ab의 부재 하에서의 생존률보다 더 양호한 생존률을 나타내었으며, 이는 각각 77% 및 44%를 달성하였다. 결과는 치료를 중지한 후에 치다마이드-K30 플러스 셀레콕시브-캡슐 또는 치다마이드-HCl 염 플러스 셀레콕시브-Na 염이 예상치 못하게 항-PD-1 Ab와 조합한 치다마이드-K30 플러스 셀레콕시브-캡슐 또는 치다마이드-HCl 염 플러스 셀레콕시브-Na 염보다 더 빠른 종양 성장을 나타냄을 명시하였다. 이러한 연구는 또한, 항-CTLA-4 Ab와 조합한 치다마이드-HCl 염 플러스 셀레콕시브-Na 염이 항암 면역 반응을 상승시키는 데 강력함을 입증하였다. 그러나, 항-CTLA-4 Ab와 조합한 치다마이드-HCl 염 플러스 셀레콕시브-Na 염은 항-CTLA-4 Ab와 조합한 치다마이드-K30 플러스 셀레콕시브-캡슐보다 종양 성장을 억제하는 데 더욱 강력하였으며, 각각은 66.6%% 및 44.4%의 생존률을 달성하였다(도 13d). 한편, 항-PD-1 Ab와 조합할 때 치다마이드-HCl 염 플러스 셀레콕시브-Na 염과 MS-275 플러스 셀레콕시브-캡슐 간의 일대일 비교는 치다마이드-HCl 염 플러스 셀레콕시브-Na 염과의 병용 요법의 항암 활성이 항-PD-L1 내성 조건에서 MS-275 플러스 셀레콕시브-캡슐과의 병용 요법의 항암 활성보다 더 양호함을 나타내었다.

실시예 10 위스타 수컷 래트에서 셀레콕시브-Na 염과 조합한 치다마이드-HCl 염의 PK(동력학) 프로파일을 연구하기 위함

치다마이드-HCl 염 플러스 비정질 형태 셀레콕시브-Na 염 단독 또는 항-PD-1 항체와 조합한 치다마이드-HCl 염 플러스 비정질 형태 셀레콕시브-Na 염은 매우 강력한 항암 면역 활성르 지녔다. 이에 따라, 본 발명자는 위스타 래트에서 셀레콕시브-Na 염과 조합된 치다마이드-HCl 염 대 셀레콕시브-캡슐과 조합된 치다마이드-K30의 PK 프로파일을 연구하였다. 도 14a에 도시된 바와 같이, 위스타 래트에서 경구 투여에 의한 치다마이드-HCl 염(50 mg/kg) 및 치다마이드-K30(50 mg/kg)의 치다마이드 혈액 농도-시간 프로파일을 분석하였다. 표 4에서, 결과는 치다마이드의 Cmax 및 Tmax가 염 형태에 대해 유의미하게 변경됨을 나타내었다. 치다마이드-HCl 염 그룹에서, Cmax는 2065.2(ng/mL)이며, Tmax는 0.14 h이었다. 그러나, 치다마이드-K30 그룹에서, Cmax는 786.3 ng/mL이며, Tmax는 0.39 h이었다. 치다마이드-K30의 흡수율과 비교하여 치다마이드-HCl 염의 흡수율이 매우 크게 증가되었다. 그러나, AUC, MRT, 및 T1/2의 값은 표 4에 나타낸 바와 같이 유의미하게 변경되지 않았다. 이러한 결과는 치다마이드-HCl 염이 위스타 래트에서 치다마이드-K30과 비교하여 더 빠른 흡수 특성을 지니고, 더 높은 Cmax를 달성하였지만, 순환 체계에서 치다마이드의 전체 양을 증가시키지 않음을 시사하였다. 도 14b에 도시된 바와 같이, 위스타 래트에서 경구 투여에 의한 50 mg/kg의 셀레콕시브-Na 염 및 50 mg/kg의 셀레콕시브-캡슐의 셀레콕시브 혈액 농도-시간 프로파일을 분석하였다. 이러한 결과는 Tmax, Cmax, AUC, AUMC, MRT, 및 T1/2의 값이 표 5에 나타낸 바와 같이 위스타 래트에서 셀레콕시브-Na 염과 셀레콕시브-캡슐 간에 경구 투여 후 유의미하게 상이하지 않음을 나타내었다.

다음으로, 위스타 래트에서 경구 투여에 의한 50 mg/kg 용량에서 치다마이드-HCl 염 플러스 셀레콕시브-Na 염과 치다마이드-K30 플러스 셀레콕시브-캡슐 간의 치다마이드 PK 프로파일의 비교를 분석하였다. 도 14c 및 표 4에 나타낸 바와 같이, 치다마이드의 Cmax 값은 치다마이드-K30 플러스 셀레콕시브-캡슐 그룹과 비교하여 치다마이드-HCl 염 플러스 셀레콕시브-Na 염 그룹에서 유의미하게 증가되었으며, 값은 각각 약 2244.5 및 862.3 ng/mL이었다. 표 4에 나타낸 바와 같이, 치다마이드의 Tmax 값은 치다마이드-K30 플러스 셀레콕시브-캡슐 그룹과 비교하여 치다마이드-HCl 염 플러스 셀레콕시브-Na 염 그룹에서 유의미하게 감소되었으며, 값은 각각 약 0.14 및 0.25h이었다. 치다마이드의 AUC 값을 치다마이드-K30 플러스 셀레콕시브-캡슐 그룹과 비교하여 치다마이드-HCl 염 플러스 셀레콕시브-Na 염 그룹은 약간 증가되었으며, 값은 각각 약 5977 및 4201 ng*h/mL이었다. 2개의 조합물들 간의 AUMC 값의 유사한 비교 결과는 표 4에 나타나 있었다. MRT 및 T1/2의 값은 표 4에 나타낸 바와 같이 2개의 그룹 간에 차이를 나타내지 않았다. 치다마이드-HCl 염과 치다마이드-HCl 염 플러스 셀레콕시브-Na 염 간의 PK 프로파일 비교는 도 14e 및 표 4에 나타낸 바와 같이 약간의 변화를 나타내었다. 치다마이드-HCl 염 플러스 셀레콕시브-Na 염으로의 치료에서, 치다마이드 PK 프로파일이 ADME(흡수, 분포, 대사, 및 분비)의 측면에서 셀레콕시브-Na 염의 존재에 의해 유의미하게 영향을 받지 않음을 시사하였다. 그러나, 치다마이드의 AUC 값은 약간 영향을 받았으며, 치다마이드-HCl 및 치다마이드-HCl 염 플러스 셀레콕시브-Na 염 그룹에 대한 AUC 값은 표 4에 나타낸 바와 같이 각각 약 4113 및 5977 ng/mL이었다.

한편, 셀레콕시브 PK 프로파일은 도 14d 및 표 5에 나타낸 바와 같이 위스타 래트에서 경구 투여에 의해 50 mg/kg에서 치다마이드-HCl 염 플러스 셀레콕시브-Na 염과 치다마이드-K30 플러스 셀레콕시브-캡슐을 비교할 때 유의미하게 변하지 않았다. 그러나, 셀레콕시브-Na 염 또는 셀레콕시브-캡슐 단독은 도 14f 및 표 5에 도시된 바와 같이 치다마이드-K30 플러스 셀레콕시브-캡슐 또는 치다마이드-HCl 염 플러스 셀레콕시브-Na 염보다 유의미하게 더 낮은 Cmax 및 AUC를 지녔다. 이러한 결과는, 치다마이드-K30 또는 치다마이드-HCl 염의 존재가 셀레콕시브 ADME 프로파일을 유의미하게 변경시켰고, 이에 따라, 셀레콕시브의 Cmax 및 AUC의 값을 크게 증가시킴을 시사하였다. 그러나, 치다마이드 PK 프로파일은 셀레콕시브-Na 염 또는 셀레콕시브-캡슐의 존재에 의해 유의미하게 영향을 받지 않았다. 결론적으로, 치다마이드-HCl 염 플러스 셀레콕시브-Na 염이 유의미하게 변경된 ADME 프로파일을 지니고, 이에 따라, 효과적인 종양 억제를 달성하였고, 면역 관문 억제제와 조합할 때 생존을 증가시킴을 나타내었으며, 이는 염 형태가 약물 내성에 대한 제2선 요법의 직면하는 과제에서 치다마이드-K30 플러스 셀레콕시브-캡슐보다 더욱 양호한 항암 효능을 지님을 시사한다.

표 4. 위스타 수컷 래트에서 치다마이드-K30, 치다마이드-HCl 염, 치다마이드-k30 플러스 셀레콕시브-캡슐, 및 치다마이드-HCl 염 플러스 셀레콕시브-Na 염으로의 치료로부터 치다마이드의 약동학 파라미터

표 5. 위스타 수컷 래트에서 셀레콕시브-캡슐, 셀레콕시브-Na 염, 셀레콕시브-캡슐 플러스 치다마이드-k30, 및 셀레콕시브-Na 염 플러스 치다마이드-HCl 염으로의 치료로부터 셀레콕시브의 약동학 파라미터

Claims

치다마이드(chidamide)의 산성 염 및 셀레콕시브(celecoxib)의 염기성 염을 포함하는 조합물(combination).
제1항에 있어서, 치다마이드의 산성 염 및 셀레콕시브의 염기성 염의 양이 각각 약 5%(w/w) 내지 약 80%(w/w) 및 약 95%(w/w) 내지 약 20%(w/w)의 범위인 조합물.
제1항에 있어서, 치다마이드의 산성 염 및 셀레콕시브의 염기성 염의 양이 약 8:1, 약 4:1, 약 2:1, 약 1:1, 약 1:2, 약 1:4 또는 약 1:8의 중량비인 조합물.
제1항에 있어서, 치다마이드의 산성 염 및 셀레콕시브의 염기성 염이 동일한 투약 형태에 함유되어 있거나, 별개의 투약 형태에 독립적으로 함유되어 있는 조합물.
제4항에 있어서, 투약 형태가 정제 또는 캡슐인 조합물.
제1항에 있어서, 치다마이드의 산성 염이 치다마이드의 하이드로클로라이드 염 또는 설페이트 염인 조합물.
제6항에 있어서, 치다마이드의 염 형태가 결정질 형태인 조합물.
제6항에 있어서, 치다마이드의 하이드로클로라이드 염이 약 16.12도, 약 19.02도, 약 21.62도, 약 23.38도 및 약 30.16도에서 2-세타 값을 포함하는 피크를 갖는 X선 분말 회절(XRPD) 패턴을 갖는 결정질 형태(형태 A)인 조합물.
제8항에 있어서, 형태 A의 XRPD 패턴이 약 21.08도, 약 23.76도, 약 25.58도, 약 27.82도 및 약 28.18도에서 2-세타 값을 포함하는 피크를 추가로 갖는 조합물.
제6항에 있어서, 치다마이드의 하이드로클로라이드 염이 약 3162 cm^-1, 약 3059 cm^-1, 약 3036 cm^-1, 약 2751 cm^-1, 약 2588 cm^-1, 약 2359 cm^-1, 약 2341 cm^-1, 약 1667 cm^-1, 약 1658 cm^-1, 약 1639 cm^-1, 약 1620 cm^-1, 약 1610 cm^-1, 약 1562 cm^-1, 약 1517 cm^-1, 약 1508 cm^-1, 약 1485 cm^-1, 약 1468 cm^-1, 약 1444 cm^-1, 약 1431 cm^-1, 약 1307 cm^-1, 약 1282 cm^-1, 약 1265 cm^-1, 약 1243 cm^-1, 약 1220 cm^-1, 약 1182 cm^-1, 약 1145 cm^-1, 약 1074 cm^-1, 약 1046 cm^-1에서 피크를 갖는 푸리에 변환 적외선 분광(FTIR) 패턴을 갖는 결정질 형태(형태 A)인 조합물.
제8항 또는 제10항에 있어서, 형태 A가 도 3b에 도시된 것과 실질적으로 동일한 XRPD 패턴 또는 도 4b에 도시된 바와 실질적으로 동일한 FTIR 패턴을 나타냄으로써 추가로 특징되는 조합물.
제6항에 있어서, 치다마이드의 설페이트 염이 약 21.15도, 약 24.65도, 약 17.00도, 약 18.49도 및 약 26.69도에서 2-세타 값을 포함하는 피크를 갖는 X선 분말 회절(XRPD) 패턴을 갖는 결정질 형태(형태 B)인 조합물.
제12항에 있어서, 형태 B의 XRPD 패턴이 약 14.74도, 약 19.45도, 약 22.00도, 약 23.55도 및 약 27.94도에서 2-세타 값을 포함하는 피크를 추가로 갖는 조합물.
제6항에 있어서, 치다마이드의 설페이트 염이 약 3249 cm^-1, 약 3067 cm^-1, 약 2578 cm^-1, 약 2360 cm^-1, 약 1689 cm^-1, 약 1664 cm^-1, 약 1647 cm^-1, 약 1614 cm^-1, 약 1568 cm^-1, 약 1521 cm^-1, 약 1510 cm^-1, 약 1486 cm^-1, 약 1467 cm^-1, 약 1434 cm^-1, 약 1412 cm^-1, 약 1388 cm^-1, 약 1354 cm^-1, 약 1328 cm^-1, 약 1283 cm^-1, 약 1266 cm^-1, 약 1252 cm^-1, 약 1226 cm^-1, 약 1184 cm^-1, 약 1099 cm^-1, 약 1059 cm^-1, 약 1034 cm^-1 및 약 1022 cm^-1에서 피크를 갖는 FTIR 패턴을 갖는 결정질 형태(형태 B)인 조합물.
제12항 또는 제14항에 있어서, 형태 B가 도 3c에 도시된 것과 실질적으로 동일한 XRPD 패턴 또는 도 4c에 도시된 것과 실질적으로 동일한 FTIR 패턴을 나타내는 것으로서 추가로 특징되는 조합물.
제1항에 있어서, 셀레콕시브의 염기성 염이 셀레콕시브의 나트륨 염인 조합물.
제16항에 있어서, 셀레콕시브의 나트륨 염이 비정질 형태 또는 결정질 형태인 조합물.
제17항에 있어서, 비정질 형태가 도 7b에 도시된 것과 실질적으로 동일한 XRPD 패턴을 갖는 조합물.
제16항에 있어서, 결정질 형태(형태 I)가 약 19.85도, 약 20.51도, 약 21.51도, 약 22.55도 및 약 18.25도에서 2-세타 값을 포함하는 피크를 갖는 X선 분말 회절(XRPD) 패턴을 갖는 조합물.
제19항에 있어서, 형태 I의 XRPD 패턴이 약 10.95도, 약 14.05도, 약 14.601도, 약 17.2도, 약 25.80도 및 약 27.30도에서 2-세타 값을 포함하는 피크를 추가로 갖는 조합물.
제19항에 있어서, 형태 I이 도 7c에 도시된 것과 실질적으로 동일한 XRPD 패턴을 나타내는 것으로서 추가로 특징되는 조합물.
제1항에 있어서, 조합물이 면역 관문 억제제 및/또는 화학 치료제를 추가로 포함하며, 일부 구현예에서, 면역 관문 억제제는 항-CTLA-4 항체, 항-PD-1 항체 또는 항-PD-L1 항체인 조합물.
제22항에 있어서, 면역 관문 억제제가 펨브롤리주맙, 피딜리주맙, 니볼루맙, 두르발루맙, 아벨루맙, 아테졸리주맙, 토리팔리맙, 신틸리맙, 캄렐리주맙, 또는 MIHI인 조합물.
암 면역요법에서 종양 미세환경을 조절하는 방법으로서, 유효량의 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 조합물을 투여하는 것을 포함하는 방법.
제24항에 있어서, 치다마이드의 산성 염 및 셀레콕시브의 염기성 염이 동시에, 별도로 또는 순차적으로 투여되는 방법.
암을 치료하는 방법으로서, 유효량의 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 조합물을 대상체에 투여하는 것을 포함하는 방법.
제24항 또는 제26항에 있어서, 방법이 면역 관문 억제제를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
제24항 또는 제26항에 있어서, 치다마이드의 산성 염 및 셀레콕시브의 염기성 염의 투여가 치다마이드 자유 염기 및 셀레콕시브 자유 염기의 약동학 프로파일과 비교하여 약동학 프로파일을 개선시키는 방법.
제27항에 있어서, 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 조합물 및 면역 관문 억제제가 동시에, 별도로 또는 순차적으로 투여되는 방법.
제24항 또는 제26항에 있어서, 암이 교모세포종, 간암, 대장 암종, 교모세포종, 위암, 대장암, 식도암, 폐암, 췌장암, 신세포 암종, 양성 전립선 비대증, 전립선암, 난소암, 흑색종, 유방암, 만성 림프구성 백혈병(CLL), 메르켈 세포 암종, 비-호지킨 림프종, 급성 골수성 백혈병(AML), 담낭암, 담관암종, 비뇨기 방광암, 또는 자궁암인 방법.
종양 미세환경의 조절 및 면역 반응의 개선을 통해 암을 치료하는 방법으로서, 유효량의 셀레콕시브와 함께 유효량의 치다마이드를 투여하는 것을 포함하는 방법.
제31항에 있어서, 치다마이드 및 셀레콕시브가 동시에, 별도로 또는 순차적으로 투여되는 방법.