CN114778827A - 一种用于免疫测定的固相萃取装置、集成装置及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于免疫测定的固相萃取装置、集成装置及其应用,根据本发明的所述固相萃取装置为固相探针,其包括包覆有免疫捕获配体涂层的探头部分,所述探头部分能够直接或间接通过特异性的相互作用捕获目标分子或颗粒,以及与探头部分固定连接的手柄部分,并允许通过手柄部分的受控移动来操纵探头部分;所述探头部分和手柄部分可一体成型;配体可以在所述固相探针组装之前或之后涂覆在探头部分的表面上。探头部分能够为球形、椭圆形、圆柱形、立方体或片状结构,也可采用叶轮或混合器的形状,或这些形状的组合;手柄部分能够为圆柱棒、片棒,或环形棒,或这些几何形状在不同截面的组合;并且可采用条形码或RFID的跟踪信息进行标记。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于免疫测定的固相萃取装置、集成装置及其应用,属于过生物医药检验分析领域。
背景技术
在ELISA及其它的免疫测定技术中,需要先用固相捕获分析物,然后再进行清洗,加入标记产生信号,然后检测。标准ELISA板、乳胶颗粒、磁性颗粒等或毛细管也是免疫检测固定相的常用选择。包被有配体的直径在1/8英寸和1/4英寸之间的聚合物微球也曾被用作免疫测定的固定相。这些固相用抗体、抗原或任何其他配体包被,它们能够特异性结合样品中的目标形式,例如抗体、抗原、病毒、外泌体等。
在目前诊断分析中,磁微粒捕获技术,特别是包被有抗原或抗体的磁性微粒,是常见的用于捕获待检物的技术手段。应用顺磁性颗粒做固定相时需要不断搅拌或混合,在免疫分析仪移样和孵育步骤需要保持磁性颗粒均匀悬浮。在许多免疫测定仪器中,例如Abbott Architect,需要使用磁铁等从悬浮液中收集磁性颗粒,并在随后的洗涤步骤中释放这些颗粒。这些使用磁微粒使仪器设计复杂化并增加了仪器和耗材的成本,不易于小型化以适用于POCT测试所需的小型仪器。
在少量目标分子或目标抗体的固相萃取中,常用到类似的磁性粒子的处理方式。而在这些应用中,磁性颗粒可能会在洗涤步骤中遭受损失。此外,如果多个颗粒与共同的目标分子或共同的目标粒子结合,这些颗粒可能会通过共同的目标分子相连,从而引起的微球凝聚或交联。在随后的洗涤、分离步骤的检测过程中,交联可能会导致分析误差升高和结果的不一致性。
此外,目前的磁性微粒技术还有诸多的局限性,例如:不适用于复杂的或高粘度样品的直接操作,比如组织或组织裂解液、全血、或小的样品体积;不能有效混合:磁微粒在清洗过程中可能会流失,特别是快速清洗的时候;包被有抗体的磁性颗粒可能会通过外泌体等抗原形成凝聚,不利于清洗;磁性微粒清洗,需要较长的时间用来利用磁铁固定磁性微粒和清洗液分离;自动化的仪器复杂,需要系统保证磁性微粒的稳定悬浮和精确定量操作等;磁微粒不能直接用于活体组织内直接取样。
发明内容
为了解决目前存在的上述问题,本发明提供了一种新型的固相萃取装置,所述技术方案如下:
本发明首先提供一种用于免疫测定的固相萃取装置,所述装置为固相探针,其包括两部分:包覆有免疫捕获配体的探头部分,所述探头部分能够通过特异性的相互作用捕获目标分子或颗粒,以及与探头部分固定连接的手柄部分,并允许通过手柄部分的受控移动来操纵探头部分。所述探头部分和手柄部分可一体成型,也可以单独制造并组装成一体;配体可以在所述固相探针组装之前或之后涂覆在探头部分的表面上。
根据本发明的技术方案,所述探头部分可以由多种材料制成,例如聚合物、玻璃、二氧化硅、金属、或这些材料的组合。所述手柄部分可以由与所述探头部分相同或不同的固体材料制成,例如聚合物、玻璃、二氧化硅、金属或这些材料的组合。
根据本发明的技术方案,所述探头部分设计可以是球形、椭圆形、圆柱形、立方体,或叶轮、或任何其他形状或这些形状的组合,以改善探头的表面积、机械强度或提高漂洗效率、搅拌特性和信号检测效率;并且进一步提高检测化验的特征。
根据本发明的技术方案,所述手柄部分的设计可以采用不同的形状,例如圆柱形帮或片棒、环形棒等,或者在不同截面处这些几何形状的组合。所述手柄部分可以带或不带条形码,带或不带RFID标签。手柄可以采用任何形状,便于用手或通过机器人设备进行手动或自动操作。多个探针可以通过批处理的部件固定在一起。例如,手柄可以固定在板盖上,以处理微孔板孔内的样品。
根据本发明的技术方案,在某些情况下,在所述手柄部分和所述探头部分之间,设置有一个防护装置,用于在清洗或其他测定步骤期间最大限度地减少液体飞溅(如图3所示)。探头部分和手柄部分之间的连接处可以进行表面处理,使其具有疏水性,以避免液体在表面张力的作用下进入手柄部分。为了减少探头连接处的液体残留,还可以使用单独的吸水垫靠近探头并吸走探头周围的液体。
根据本发明的技术方案,在一种实施方式中,所述固相探针的探头部分可以有多个头部或分支(如图4所示)。每个头部或分支可以包被有不同的配体以捕获不同的分子或颗粒。进一步,并且多个头部能够串联或者并联,不同的头部或分支可以包被不同的配体或不同表面浓度的相同配体。
根据本发明的技术方案,可以在清洗探头时使用无清洗池的方法。无清洗池洗涤允许将洗涤缓冲液直接应用于探头以冲洗掉非特异性结合的分子;并且,漂洗可以是连续的或分步的。进一步,所述探头部分也可以插入清洗池比如孔板的孔中,所述孔中可以有冲洗缓冲液或试剂;所述反应孔可设置在能够连续接收液体的流通池内。
根据本发明的技术方案,在一种实施方式中,所述固相探针可在捕获分析物后,与信号偶联物或标记剂一起温育,并且可使用额外的清洗步骤来去除未结合的偶联物,其中信号偶联物使用不同的信号技术,例如化学发光、荧光、酶化学技术等。信号监测可以在探头未插入液相的情况下进行(如图5和图6所示)。
根据本发明的技术方案,在一种实施方式中,所述固相探针能够固定在具有多个孔的孔板中,例如标准96孔板;并且在板中的每个孔内,所述固相探针可捕获相同或不同的分析物以实现批量捕获和分析操作。
根据本发明的技术方案,在一种实施方式中,在所述手柄部分与所述探头部分之间设置有防护结构,用于防止在洗涤过程中加入液体试剂时液体飞溅,所述防护结构能够设置在探头部分与手柄部分的连接处,所述连接处能够设置为疏水性的,以防止试剂液体在表面张力的作用下进入手柄部分。
所述固相探针在样品温育和冲洗时可以使用无孔方法,能够将样品滴加在探头上形成液膜,在清洗时将洗涤试剂应用于探针并冲洗掉非特异性结合的分子;并且漂洗可以是连续的或逐步的。
所述探头部分也可以插入反应孔中,所述反应孔中具有冲洗缓冲液或试剂;所述反应孔可设置在能够连续接收液体的流通池内。
所述固相探针在捕获分析物后,可与信号偶联物或标记物试剂一起温育,并且可使用额外的清洗步骤来去除未结合的偶联物,其中信号偶联物使用不同的信号技术,包括化学发光、荧光、酶化学技术;并且标记剂或信号偶联物可以在探头表面形成液膜,使用无反应池的操作模式。
根据本发明的技术方案,在一种实施方式中,所述固相探针可置于离心机内,探头上的液体可通过离心力的作用向下旋转并由样品小瓶接收;并且,在所述固相探针和小瓶之间可设置支撑垫片,用于加大探头与收集样品的距离,使收集的样品不再和探头接触,以增加产量和收率。
根据本发明的技术方案,在一种实施方式中,所述固相探针的捕获配体是抗体、双特异性抗体、多肽、适配体、纳米抗体、或可特异性捕获靶标的DNA或RNA分子。
根据本发明的技术方案,在一种实施方式中,所述探头部分能够包覆和另一分子高亲和性结合的分子,如链霉抗生物素、蛋白、或可以和生物素分子结合的配体等;并且所述另一分子通过可裂解基团和所述探头部分的捕获配体结合形成偶联物;所述偶联物可以可先添加到样品中和样品孵育,然后再和探头一起孵育,形成探头、两个配对分子、可裂解基团、配体分子、配体捕获的目标分子的链状分子结构;在孵育后进行清洗及其他步骤;当结合的链状分子结构暴露于酶、光子辐照或化学试剂时,配体分子和配对分子之间的可裂解基团会裂解,从而能够释放配体分子和捕获的目标分子。
根据本发明的技术方案,在一种实施方式中,所述探头部分在探头表面能够包覆有插入肽,所述插入肽能够用于插入细胞外囊泡(EV)的脂质层,以捕获EV颗粒,并且所述探头部分在洗涤后,可通过改变缓冲液pH,使插入肽和EV的脂质层的结合变化,以释放EV颗粒。
根据本发明的技术方案,在一种实施方式中,所述探头部分在探头表面能够连接微纳米颗粒,所述微纳米颗粒能够增加探头的比表面积并影响可捕获的颗粒的粒径。
本发明还提供一种固相萃取装置的集成装置,所述集成装置包括样品容器,用于在孵育期间盛放样品;还包括与所述样品容器匹配的盖子,所述盖子下部与根据本发明所述的固相探针的探头部分相连,在与样品或洗涤缓冲液一同孵育期间,所述探头部分可以浸入所述样品容器内的样品中。这里的的样品容器可以是一个流通池。
本发明进一步提供一种固相萃取装置的集成装置,所述集成装置包括流通池,所述流通池由玻璃或聚苯乙烯或其他聚合物制成,其中包括根据本发明所述的能够捕获分析物的固相探针,所述固相探针的手柄部分可通过超声焊接或粘合剂固定在所述流通池的池壁;所述探头部分位于所述流通池内;所述流通池通过所述探头部分捕获流通池中流过的样品;所述探头部分可以涂有链霉亲和素或亲和素,可与生物素化的捕获配体结合,或直接涂有捕获配体;所述流通池的滞留体积为2ul至100ul;所述流通池可以对紫外线和可见光是透明的,并且所述流通池的池壁还可具有捕获配体。
根据本发明的技术方案,在一种实施方式中,所述流通池的两端连接有导管,并且导管上能够设置泵或移液装置,用于吸入样品、清洗液、洗脱溶液或其他溶液,并将使用后的产品或其它溶液输送到相应的接受容器或废液中;所述流通池能够被置于温控室中;所述流通池可以是一次性使用的,并且所述流通池具有能够容纳1ul-50ul样品的体积。
本发明最后提供一种采用固相萃取装置的免疫测定方法,所述测定方法使用透明流通池中设置固相探针来捕获分析物,并且使用流过缓冲液进行洗涤;所述固相探针可以与信号偶联物或标记剂一起温育,其中信号偶联物使用化学发光、荧光的信号技术,并且所述测定方法能够采用光检测装置进行检测,信号在流通池内产生并能够被直接检测。
本发明的有益效果是:
根据本发明的用于免疫测定的固相萃取装置,能够通过握住手柄部分并操控探头,无需使用磁分离装置,探头与样品溶液孵育后即可轻松与液体样品分离以捕获分析物。进一步,在抓住和操纵手柄部分时,所述固相探针允许以多种方式洗涤和漂洗,例如,可以通过将清洗缓冲液直接涂在探头部分或颈部并让缓冲液向下流动以不需要浸没在液体内的无孔方式带走非特异性结合的分子,从而冲洗探头;探头部分也可以浸入洗涤缓冲液中,在搅拌或不搅拌的情况下冲洗;从而本发明的固相萃取装置,采用无孔洗涤和/或检测可以消除孔污染的可能性。这里的孔除可以是微孔板的孔外,也可以是试管、反应杯或反应池。
根据本发明的用于免疫测定的固相萃取装置,所述固相萃取装置的探头部分可采用叶轮结构,用于在萃取混合样品产生搅拌以增强传质,并有效捕获分析物和有效洗涤以改善测定性能。
根据本发明的用于免疫测定的固相萃取装置,与清洗步骤类似,可采用无反应池检测技术。从而可以避免容器壁对样品的污染。例如,在配体表面和待检物和监测标记剂形成了三明治结构,并有效清洗除掉多余的标记物试剂之后。在探头部分滴加化学发光激发液或荧光激发液,探针在不浸入样品溶液的情况下受到光信号的激发;进一步,发射光可以直接收集,也可以采用积分球收集发射光(如图7所示);从而可以避免容器壁对光信号的影响。
根据本发明的用于免疫测定的固相萃取装置,创新的固相探针可以简化免疫分析分析仪的设计,不需要包括用于悬浮磁微粒的混合和移液装置。此外,配体分子被包覆在探头表面,无需悬浮和磁性颗粒分离装置。基于这种固相探针设计的监测仪器,通过避免清洗液针操作步骤,可以减少测定时间,并通过消除诸如孔和移液器吸头等耗材质量差异的带来的对测量结果的影响,从而可以提高测定性能。
根据本发明的用于免疫测定的固相萃取装置,抗原、抗体或其他捕获配体涂覆在探头的表面上,从而探针可以冻干和密封以提高免疫测定的稳定性,并与运输和保存。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案,下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1所示为根据本发明的一种固相萃取装置的结构示意图;
图2所示为根据本发明的一种固相萃取装置的结构示意图;
图3所示为根据本发明的一种固相萃取装置的结构示意图;
图4所示为根据本发明的一种固相萃取装置的结构示意图;
图5所示为本发明的一种固相萃取装置中,探头部分设置有化学发光物质的示意图;
图6所示为本发明的一种固相萃取装置中,探头部分设置有化学发光物质的示意图;
图7所示为本发明的一种集成装置的结构示意图,其中所述固相探针设置于流通池中;
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将结合附图对本发明的用于免疫测定的固相萃取装置、集成装置及其应用的具体实施方式作进一步地详细描述。
实施例一:
结合图1至图6所示,本实施例提供一种用于免疫测定的固相萃取装置及其几种变形结构;其中所述固相萃取装置为固相探针,所述固相探针包括两部分:包覆有免疫捕获配体涂层的探头部分2,所述探头部分能够通过特异性的相互作用捕获目标分子或颗粒,以及与探头部分固定连接的手柄部分1,并允许通过手柄部分的受控移动来操纵探头部分。所述探头部分和手柄部分可一体成型,也可以单独制造并组装成一体;配体可以在所述固相探针组装之前或之后涂覆在探头部分的表面上。
根据本实施例,所述探头部分2可以由多种材料制成,例如聚合物、玻璃、二氧化硅、金属、或这些材料的组合。所述手柄部分可以由与所述探头部分相同或不同的固体材料制成,例如聚合物、玻璃、二氧化硅、金属或这些材料的组合。
根据本实施例,所述探头部分2设计可以是球形、椭圆形、圆柱形、立方体,或叶轮、或任何其他形状或这些形状的组合,以优化表面积、机械强度、易于传质,并提高传质效率和检测性能的特征。
根据本实施例,所述手柄部分1的设计可以采用不同的形状,例如圆柱形帮或片棒、环形棒等,或者在不同截面处这些几何形状的组合。所述手柄部分可以带或不带条形码,带或不带RFID标签。手柄可以采用任何形状,便于用手或通过机器手等设备进行手动或自动操作。多个探针可以通过批处理的部件固定在一起。例如,手柄可以固定在板盖上,以处理微孔板孔内的样品。
根据本实施例,在某些情况下,在所述手柄部分和所述探头部分之间,设置有一个防护装置(垫片),用于在清洗或其他测定步骤期间最大限度地减少液体飞溅,如图3所示。进一步,所述探头部分和所述手柄部分之间的连接处可以进行表面处理,使其具有疏水性,以避免液体在表面张力的作用下进入手柄部分。为了减少探头连接处的液体残留,还可以使用单独的吸水垫靠近探头并吸走探头周围的液体。
根据本实施例,在一种实施方式中,所述固相探针的探头部分可以有多个头部或分支;如图4所示。每个头部或分支可以包被有不同的配体以捕获不同的分子或颗粒。进一步,并且多个头部能够串联或者并联,不同的头部或分支可以包被不同的配体或不同表面浓度的相同配体。
根据本实施例,可以在清洗探头时使用无需将探头浸入液体的无清洗池的方法。无清洗池洗涤允许将洗涤缓冲液直接应用于探头以冲洗掉非特异性结合的分子;并且,漂洗可以是连续的或逐步的。进一步,所述探头部分也可以插入孔板的孔中,所述孔中可以有冲洗缓冲液或试剂;所述反应孔可设置在能够连续接收液体的流通池内。这里的清洗池可以是试管,反应被,或多孔板的孔等可以盛放液体的容器。
根据本实施例,在一种实施方式中,所述固相探针可在捕获分析物后,与信号偶联物或标记剂一起温育,并且可使用额外的清洗步骤来去除未结合的偶联物,其中信号偶联物使用不同的信号技术,例如化学发光、荧光、酶化学技术等。检测可以利用不实用无标剂的技术。信号监测可以在探头未插入液相的情况下进行,如图5和图6所示。
根据本实施例,在一种实施方式中,所述固相探针能够放到反应容器,比如在具有多个孔的孔板中,例如标准96孔板;并且在板中的每个孔内,所述固相探针可捕获相同或不同的分析物以形成批量捕获和分析操作。
根据本实施例,在一种实施方式中,在所述手柄部分与所述探头部分之间设置有防护结构,用于防止在洗涤过程中加入液体试剂时液体飞溅,所述防护结构能够设置在探头部分与手柄部分的连接处,所述连接处能够设置为疏水性的,以防止试剂液体在表面张力的作用下进入手柄部分。
所述固相探针在样品温育和冲洗时可以使用无孔方法,能够将样品滴加在探头上形成液膜,在清洗时将洗涤试剂应用于探针并冲洗掉非特异性结合的分子;并且漂洗可以是连续的或逐步的;
所述探头部分也可以插入反应孔中,所述反应孔中具有冲洗缓冲液或试剂;所述反应孔可设置在能够连续接收液体的流通池内。
所述固相探针在捕获分析物后,可与信号偶联物或标记物试剂一起温育,并且可使用额外的清洗步骤来去除未结合的偶联物,其中信号偶联物使用不同的信号技术,包括化学发光、荧光、酶化学技术;并且标记剂或信号偶联物可以在探头表面形成液膜,使用无反应池的操作模式。
根据本实施例,在一种实施方式中,所述固相探针可置于离心机内,探头上的液体可通过离心力的作用向下旋转并由样品小瓶接收;并且,在所述固相探针和小瓶之间可设置支撑垫片,用于加大探头与收集样品的分离,使收集的样品不再和探头接触,以增加产量。
根据本实施例,在一种实施方式中,所述固相探针的捕获配体是抗体、双特异性抗体、多肽、适配体、纳米抗体、或可特异性捕获靶标的DNA或RNA分子。
根据本实施例,在一种实施方式中,所述探头部分能够包覆和另一分子高亲和性结合的分子,如链霉抗生物素、蛋白、或可以和生物素分子结合的配体等;并且所述另一分子通过可裂解基团和所述探头部分的捕获配体结合形成偶联物;所述偶联物可以可先添加到样品中和样品孵育,然后再和探头一起孵育,形成探头、两个结合的配对分子、可裂解基团、配体分子、配体捕获的目标分子的链状结构;在孵育后进行清洗及其他步骤;当结合的链状分子结构暴露于酶、光子辐照或化学试剂时,配体分子和配对分子之间的可裂解连接会断裂,从而能够释放配体分子和捕获的目标分子。
根据本实施例,在一种实施方式中,所述探头部分在探头表面能够包覆有插入肽,所述插入肽能够用于插入细胞外囊泡(EV)的脂质层,以捕获EV颗粒,并且所述探头部分在洗涤后,可通过改变缓冲液pH,使插入肽和EV的脂质层的结合变化,以释放EV颗粒。
在一种实施方式中,所述探头部分在探头表面能够连接微纳米颗粒,所述微纳米颗粒能够增加探头的比表面积并影响可捕获的颗粒的粒径。
本实施例还提供一种用于免疫测定的所述固相萃取装置的集成装置,所述集成装置包括样品容器,用于在孵育期间保存样品;还包括与所述样品容器匹配的盖子,所述盖子下部与根据本实施例所述的固相探针的探头部分相连,在与样品或洗涤缓冲液一筒孵育期间,所述探头部分可以浸入所述样品容器内的样品中。
实施例二:
本实施例进一步提供一种用于免疫测定的所述固相萃取装置的集成装置,如图7所示,所述集成装置包括流通池4,所述流通池由玻璃或聚苯乙烯或其他聚合物制成,其中包括根据本发明所述的能够捕获分析物的固相探针,所述固相探针的手柄部分通过超声焊或粘合剂接固定在所述流通池4的池壁;探头部分2位于所述流通池4内,并且通过所述探头部分2捕获所述流通池4中流过的样品;所述探头部分2涂有链霉亲和素或亲和素,可与生物素化的捕获配体结合,或直接涂有捕获配体;所述流通池4的滞留体积为2ul至100ul;所述流通池可以对紫外线和可见光是透明的,并且所述流通池的池壁还具有捕获配体。
根据本实施例,所述流通池的两端连接有导管,并且导管上能够设置泵7或移液装置,用于吸入样品清洗液、清洗缓冲液、触发溶液或其他溶液,并将使用后的溶液输送到相应的容器中;所述流通池能够被置于温控室中;所述流通池可以是一次性使用的,并且所述流通池具有能够容纳1ul-50ul样品的体积。
本实施例还提供一种采用固相萃取装置的免疫测定方法,所述测定方法使用透明流通池中设置固相探针来捕获分析物,并且使用流过缓冲液进行洗涤;所述固相探针可以与信号偶联物或标记剂一起温育,其中信号偶联物使用化学发光、荧光的信号技术,信号在流通池内产生并能够直接检测。
如图7所示,所述流通池4能够为球形结构或其他形状,并且在所述流通池4的外部可以设置有光收集装置或光积分球5,用于收集发出的关光;所述光积分球5能够为球形或者其他适配的形状。
进一步,根据本实施例,所述流通池在采用荧光技术时,在所述光收集装置或光积分球5的外部设置有光源6,并且所述光积分球5在所述光源6的位置设置有入射光开口,使发射光能够进入所述光积分球5,并被所述流通池4中的探头上的信号偶联物接收,并且能够采用光检测装置8进行检测,其中所述光积分球5在所述光检测装置8的位置也设置有开口,其中所述光收集装置也可以有入射光出口。此外,当采用化学发光时,则不需要光源6。
实施例三:
本实施例提供如实施例一所述的一种固相萃取装置的具体应用,根据本实施例的固相萃取装置,其固相探针的结构是使用聚合物树脂(例如聚苯乙烯)的注塑成型的。这种固相探针的形状和尺寸就像火柴一样。所述手柄部分和所述探头部分的总长度在0.5到2英寸之间,探头为球形,直径在2mm到3mm之间;并且,聚苯乙烯的表面有羧基。
在一种以包被抗体为例的实施方式中,也可以分别制造头部和手柄部分,然后将二者组装在一起;其具体测定过程如下:
a)用抗体(或抗原)配体包被探针时,首先将探针头浸入EDAC溶液中以激活羧基与配体分子上的胺基反应;
b)将探针探头从EDAC激活溶液中取出并用值介于PH 4.6~6.5之间使用MES缓冲液冲洗它们以去除额外的EDAC溶液;
c)将探针头浸入溶解在pH4.6至6.5的MES缓冲液中的抗体溶液中温育约15-90分钟;。
d)将探针头从配体溶液中取出并用洗涤PBS溶液冲洗以去除未结合的配体溶液。用洗涤缓冲液冲洗探头,其中可以使用浓度为0.1%~1%的表面活性剂Tween 20来提高洗涤效率。另外,洗涤液中可含有0.1%~2%的BSA溶液;
e)将探头尖端浸入储存缓冲液,用含有BSA或其他封闭剂的溶液覆盖探头表面。将探头尖端浸入冻干缓冲液中,冻干缓冲液可包含0.5-4%的海藻糖以保持包被蛋白的活性。将固相冻干并装入小袋中以保持长期稳定性;
f)如果不需要冻干,可以在缓冲液中添加叠氮钠防腐剂,则将探针尖端密封在一小袋铝袋中。
实施例四:
该实施例提供公开了一种三明治夹心形式的简单方法化学发光免疫测定应用。并且,类似的实施例可以扩展到其他检测技术。具体测定过程如下:
a)取一个如图1所示的涂有抗体配体的固相探针,将头部插入样品孔中,样品孔中装有20ul血清样品和130ul样品稀释剂,孵育16分钟并通过旋转手柄部分以旋转探头,增强混合;
b)将探针头从样品孔中取出并通过将洗涤缓冲液逐滴添加到颈部并让洗涤缓冲液向下流动来连续冲洗。旋转探头以确保充分混合。在0.5~2分钟内用2ml~5ml缓冲液冲洗;
c)使用多孔滤纸通过接近探头周围的液体来吸环绕探头周围的多余液体,而无需接触探头;
d)向探针头中加入150ul标记物试剂,无孔孵育10分钟;
e)使用额外的PBS缓冲液冲洗以去除未结合的结合物,并使用滤纸吸走多余的液体;
f)添加化学发光触发溶液并采用光接收器10收集光信号,如图5所示。
实施例五
固相萃取装置在捕获外泌体和其他颗粒中的应用;其中所述固相探针可以利用光裂解化学捕获和释放外泌体或其他颗粒。本实施例公开了一种捕获和释放外泌体的方法,具体测定过程如下:
a)带有羧基的聚苯乙烯制成探针探头包被有链霉亲和素。
b)通过以下步骤制备可光子裂解的生物素-抗体偶联物:
1)将带有可光裂解基团的生物素链接分子(来自Broad pharm的BP-24517)溶解在无水DMSO中;
2)将有可光裂解基团的生物素分子与抗CD9、抗CD63和抗CD81抗体在PBS
缓冲液中结合,接头与总抗体的摩尔比为4:1到10:1;
3)使用20来自Repligen(20kd float-alyzer G2)的kd透析膜,以去除未反应的链接分子并将缓冲液更换为PBS;
4)标定和生物素偶联的抗体的蛋白浓度;
c)将抗体偶联物与200ul血浆样品在37摄氏度的微孔板孔中孵育15分钟;
d)将涂有链霉亲和素的探针放入孔板孔中,确保探针头不与微孔板壁接触,室温或37℃孵育15分钟;
e)使用带有PBS的喷雾瓶滴加PBS缓冲液冲洗探头周围5次,每次冲洗持续10秒;
步骤f)将探针放入透明玻璃瓶中的200~500ul PBS中,然后将小瓶放入积分球中,用紫外光照射小瓶5分钟,让小瓶放在摇床上轻轻混合1分钟以上。
步骤g)收集上清液中的外泌体并进行定量。可以选择将探头提出液面然后通过温和的离心来将探头上残余液体甩下来,以降低探头头部上剩余的液体量并增加收率。
实施例六
根据本发明所述是固相探针可以在流通池内工作,用于免疫捕获和免疫测定。探针设计和使用该探针的设备的实施例之一在图7中示出,其具体测定过程如下:
a)探头位于流通池内部,聚苯乙烯探头是流通池的一部分,如图7所示;球形聚苯乙烯探头直径约为2mm,探头表面部分覆盖有聚苯乙烯微粒抗体。探头可按前述方案包被有抗体。在包被有抗体后,所述固相探针的手柄部分可以和流通池通过超声波焊接形组装在一起,形成完整的流通池;流通池的球形内径约为3mm,流通池内的液体滞留体积约为10-20ul;
b)该装置包括用于添加样品、洗涤缓冲液、结合溶液和触发溶液等的流路和流通池连接;
c)在操作中可以使用1ml样品,样品可以流过流通池时和探头接触,探头上包袱的抗体可以在样品通过流通池的过程中特异性捕获目标分析物;例如,在检测肝素结合蛋白的免疫分析平台中,37摄氏度的孵育时间可以是15分钟;
d)样品捕获后,洗涤缓冲液可以流过流通池,使用5ml洗涤缓冲液洗去1ml的样品;
e)化学发光偶联物(吖啶-抗HBP)可以加载到流动槽中以结合HBP蛋白并形成三明治形式并孵育8-10分钟;
f)用TRIS缓冲液用于洗去残留的结合物;
g)将触发溶液(碱性H2O2溶液)注入流通池并收集光。
实施例七
本发明所述固相探针可在流通池内工作,用于对毫升级别或更多的样品中的目标分子或颗粒进行免疫捕获。
根据本实施例,探头固定在流通池内,聚苯乙烯探头是流通池的一部分,如图7所示。球形聚苯乙烯探头直径约2mm,探头表面部分可以包被链霉亲和素。在探头表面包被有链霉亲和素,通过超声波焊接,可以将探头可以与流通池组装在一起。流通池的球形内径约为3mm,流通池的滞留量约为10ul~20ul;具体测定过程如下:
a)5ml料液首先与具有将有可光裂解基团的生物素和抗体偶联物混合并在37摄氏度下孵育;然后样品以1ml/min的速率通过流通池5分钟用于捕获;
b)捕获后,用5ml PBS洗涤液以0.5ml/min的流速清洗探针;
c)将紫外光直接照射到流通池10分钟,光裂解基团分解断裂并释放外泌体;
d)使用30ul新鲜缓冲液置换流通池中的样品并冲洗流通池。收集最终体积约50ul。
实施例八
本发明所述固相探针可在流通池内工作,用于对毫升级或更多的样品进行免疫捕获。
根据本实施例,探头固定在流通池内,聚苯乙烯探头是流通池的一部分,如图7所示。球形聚苯乙烯探头直径约2mm,探头表面部分可以包被链霉亲和素。在探头表面偶联有插入肽(比如可以和外泌体膜结合的BP插入序列RPPGFSPFR;或可以和CD63结合的CP05或可以和CD9结合的P238序列),或者低pH插入肽(pHLIP)。通过超声波焊接,可以将探头可以与流通池组装在一起。流通池的球形内径约为3mm,流通池的滞留量约为10~20ul;具体测定过程如下:
a)将含有细胞外囊泡(EV),包括外泌体,在捕获缓冲液中1:3稀释(ph 7.5以下),
b)血浆样品流过流通池,插入肽可以将样品中的EV捕获;
c)使用捕获稀释液缓冲液2ml清洗,
d)使用(微碱性释放液,pH<9.0)置换流通池中的缓冲液,并收集最终体积约50ul。
以上所述仅为本发明的较佳实施例,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (15)
1.一种用于免疫测定的固相萃取装置,其特征在于,所述装置为固相探针,所述固相探针包括:包覆有配体的探头部分及固定连接至所述探头部分的手柄部分,所述探头部分的配体通过特异的相互作用捕获目标分子或颗粒;所述手柄部分能够允许所述探头部分的机械操作,所述装置可用于混合样品的萃取;
所述探头部分和手柄部分可一体成型,也能够分别制造,并组装为一体;所述探头部分和所述手柄部分能够由相同或不同的固体材料制成,所述固体材料能够选用聚合物、玻璃、二氧化硅、金属或这些材料的组合;
所述探头部分能够为球形、椭圆形、圆柱形、立方体或片状结构,也可采用叶轮或混合器的形状,或这些形状的组合;以改善探头的表面积、机械强度或提高漂洗效率、搅拌特性和信号检测效率;
所述手柄部分能够为圆柱棒、片棒,或环形棒,或这些几何形状在不同截面的组合;并且可采用条形码或RFID的跟踪信息进行标记。
2.根据权利要求1所述的装置,其特征在于,所述探头部分能够包括一个或者多个头部,用于包覆一种或多种不同类型的配体,以捕获和检测相同或不同的分子或颗粒;
并且多个头部能够串联或者并联,不同的头部可以涂有不同的配体或不同表面浓度的相同配体。
3.根据权利要求1所述的装置,其特征在于,所述固相探针能够固定在具有多个孔的孔板中;并且在板中的每个孔内,所述固相探针可捕获相同或不同的分析物以形成批量捕获和分析操作。
4.根据权利要求1所述的装置,其特征在于,在所述手柄部分与所述探头部分之间设置有防护结构,用于防止在洗涤过程中加入液体试剂时液体飞溅,所述防护结构能够设置在探头部分与手柄部分的连接处,所述连接处能够设置为疏水性的,以防止试剂液体在表面张力的作用下进入手柄部分。
5.根据权利要求1所述的装置,其特征在于,所述固相探针在样品温育和冲洗时可以使用无孔方法,能够将样品滴加在探头上形成液膜,在清洗时将洗涤试剂应用于探头并冲洗掉非特异性结合的分子;并且漂洗可以是连续的或分步的;
所述探头部分也可以插入反应孔中,所述反应孔中具有冲洗缓冲液或试剂;所述反应孔可设置在能够连续接收液体的流通池内。
6.根据权利要求1所述的装置,其特征在于,所述固相探针在捕获分析物后,可与信号偶联物或标记物试剂一起温育,并且可使用额外的清洗步骤来去除未结合的偶联物,其中信号偶联物使用不同的信号技术,包括化学发光、荧光、酶化学技术;并且标记剂或信号偶联物可以在探头表面形成液膜,使用无反应池的操作模式。
7.根据权利要求1所述的装置,其特征在于,所述固相探针可置于离心机内,探头上的液体可通过离心力的作用向下旋转并由样品小瓶接收;并且,在所述固相探针和小瓶之间可设置支撑垫片,用于加大探头与收集样品的距离,使收集的样品不再和探头接触,以增加收率。
8.根据权利要求1所述的装置,其特征在于,所述固相探针的捕获配体是抗体、双特异性抗体、多肽、适配体、纳米抗体、或可特异性捕获靶标的DNA或RNA分子。
9.根据权利要求1所述的装置,其特征在于,所述探头部分能够包覆和另一分子高亲和性结合的分子;
并且所述另一分子通过可裂解基团和所述探头部分的捕获配体结合形成偶联物;所述偶联物可以可先添加到样品中和样品孵育,然后再和探头一起孵育,形成探头、两个配对分子、可裂解基团、配体分子、配体捕获的目标分子的链状分子结构;在孵育后进行清洗及其他步骤;
当结合的链状分子结构暴露于酶、光子辐照或化学试剂时,配体分子和配对分子之间的可裂解基团会裂解,从而能够释放配体分子和捕获的目标分子。
10.根据权利要求1所述的装置,其特征在于,所述探头部分在探头表面能够包覆有插入肽,所述插入肽能够用于插入EV的脂质层,以捕获EV颗粒,并且所述探头部分在洗涤后,可通过改变缓冲液pH,使插入肽和EV的脂质层的结合变化,以释放EV颗粒。
11.根据权利要求1所述的装置,其特征在于,所述探头部分在探头表面能够连接微纳米颗粒,所述微纳米颗粒能够增加探头的比表面积并影响可捕获的颗粒的粒径。
12.一种用于免疫测定的固相萃取装置的集成装置,其特征在于,所述集成装置包括样品容器,用于在孵育期间盛放样品;还包括与所述样品容器匹配的盖子,所述盖子下部与根据权利要求1-10的任一项所述的固相探针的探头部分相连,在与样品或洗涤缓冲液一同孵育期间,所述探头部分可以浸入所述样品容器内的样品中。
13.一种用于免疫测定的固相萃取装置的集成装置,其特征在于,所述集成装置包括流通池,所述流通池由玻璃或聚苯乙烯或其他聚合物制成,其中包括根据权利要求所述1-10的任一项所述的能够捕获分析物的固相探针,所述固相探针的手柄部分固定在所述流通池上成为流通池的一部分;所述探头部分位于所述流通池内,并通过所述探头部分捕获流通池中流过的样品中的目标分子活颗粒;所述探头部分可包被链霉亲和素,可与生物素化的捕获配体结合,或直接涂有捕获配体;
所述流通池的滞留体积为2ul至100ul;所述流通池可以对紫外线和可见光是透明的,并且所述流通池的池壁还可包被有捕获配体。
14.根据权利要求13所述的集成装置,其特征在于,所述流通池的两端连接有导管,并且导管上能够设置泵或移液装置,用于吸入样品清洗液、清洗缓冲液、发溶液或其他溶液,并将使用后的溶液输送到相应的容器中;
所述流通池能够被置于温控室中;所述流通池可以是一次性使用的,并且所述流通池具有能够容纳1ul-50ul样品的体积。
15.一种采用固相萃取装置的免疫测定方法,其特征在于,所述测定方法使用透明流通池中设置固相探针来捕获分析物,并且使用流过缓冲液进行洗涤;所述固相探针可以与信号偶联物或标记剂一起温育,其中信号偶联物使用化学发光、荧光的信号技术,并且所述测定方法能够采用光检测装置进行检测,信号在流通池内产生并能够直接检测。
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