CN114773478A

CN114773478A - 抗afp抗原vhh结构域及含有其的双特异性抗体

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Publication number: CN114773478A
Application number: CN202210248742.0A
Authority: CN
Inventors: 宋海鹏; 刘原源; 于建立; 曹慧; 古一; 李飞; 张霞; 蒋立仲; 王准; 宋亮
Original assignee: Shenzhen Guochuang Nano Antibody Technology Co ltd
Current assignee: Shenzhen Guochuang Nano Antibody Technology Co ltd
Priority date: 2022-03-14
Filing date: 2022-03-14
Publication date: 2022-07-22
Anticipated expiration: 2042-03-14
Also published as: CN114773478B

Abstract

本发明公开了一种抗AFP抗原的VHH结构域及单域抗体，以及含有两种VHH结构域的双特异性抗体，所述抗体由两条不同的重链序列融合而成，可以分别识别AFP抗原的不同表位。所述单域抗体以及双特异性抗体均具有优异的抗体识别能力，显著的ADCC效应、并具有较长的体内半衰期，在体内外诊断和药物制备领域具有广阔的应用前景。

Description

抗AFP抗原VHH结构域及含有其的双特异性抗体

技术领域

本发明公开了一种多肽，更具体地，公开了一种抗体，属于免疫学领域。

背景技术

肝细胞性癌（Hepatocellular carcinoma，HCC），是世界第五大癌症。甲胎蛋白（甲种胎儿蛋白，α-fetoprotein，AFP）最早是由Bergstrandh和Czar在人胎儿血淸中发现，是目前应用最广泛的HCC肿瘤标志物，被普遍应用于相关疾病的检查。AFP是一种糖蛋白，属于白蛋白家族，分子量为69kDa，一般情况下AFP主要由胚胎肝脏细胞分泌而来。因为其糖链结构的差异，AFP分子存在差异性，目前认为至少有三种异质体（AFP2L1，AFP2L2，AFP2L3）。AFP存在于人血清中，来源于早期胎儿的肝脏和卵黄囊，孕期4周即可在胎儿血清中检测到，最高可达l~3g/L，出生时仍高达60~120mg/L，出生后合成很快受到抑制，含量降至50μg/L，一周岁婴儿的血清AFP浓度水平接近成人。健康成人血清中AFP主要由肝脏产生，生理功能尚不清楚，可能与维持正常妊娠、调节脂肪酸进入胎儿体内及免疫抑制有关。正常成年人血清AFP水平非常低，一般低于10μg/L。肝细胞癌变时，AFP水平随着疾病进展会显著升高。目前，我国建议的临界值上限为20μg/L。AFP是我国目前在临床唯一推荐常规使用的肝细胞癌肿瘤标志物，同时结合超声检查，对无症状的高危人群进行筛查，是临床早期发现肝癌患者的最常用方法。随着医疗水平的不断提高，肝细胞癌的诊断和治疗水平不断进步，但肝细胞癌的临床死亡率仍居高不下。究其原因，与肝细胞癌发病隐匿，自觉症状不明显，造成就医确诊晚有关。提高肝细胞癌患者早期诊断率，同时在治疗过程中通过有效的方法手段进行监测是提高肝细胞癌治疗质量和生存率的关键所在。基于以上原因，目前首要任务是建立简单、快速、有效的检验方法。

不仅如此，自上世纪90年代以来，研究者利用AFP抗体作为载药载体，运输抗癌药物，如阿霉素、柔红霉素、顺铂、甲氨蝶呤等成为热门研究内容，通过胞吞作用将上述药物选择性转运至肿瘤细胞中，起到治疗作用。此外，Meng和Sauzay等研究发现，AFP可以与肝癌细胞膜上的受体结合，进而激活Ca²⁺和PI3/AKT等信号通路，通过上调c-fos、Srs、c-jun、Ras等癌基因的表达，促进肝癌细胞的增殖（Meng WenBo等，The immunosuppression role ofalpha-fetoprotein in human hepatocellular carcinoma，Discovery medicine，2016年21卷118期；Chloé Sauzay等，Alpha-foetoprotein(AFP):A multi-purpose marker inhepatocellular carcinoma，Clinica Chimica Acta，2016年463卷）。因此，可见AFP无论是在疾病的诊断、靶向治疗还是后期的预后监测方面都发挥着巨大的作用。

鉴于癌症生物标志物在癌症的早期诊断和治疗预后中起着重要的作用，其敏感检测在过去几十年里引起了巨大的研究浪潮。免疫分析就是其中一种检测方法。由于其特异性和稳定性的优势，已被广泛应用于癌症生物标志物的敏感检测，并用于基础研究和临床检测。目前，已开发出了多种类型的免疫分析方法：包括电泳免疫分析法、酶联免疫吸附分析法、化学发光免疫分析法、荧光免疫分析法、比色法免疫分析法、质谱免疫分析法、表面拉曼增强光谱免疫分析。化学发光免疫分析法的灵敏度和精确度比酶联免疫吸附法、荧光法高几个数量级，且具有方法稳定快速、检测范围宽、操作简单、自动化程度高等优点，可用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等相关物质的检测分析。目前AFP检测方法大多使用的为传统抗体（鼠源单克隆抗体、兔源多克隆抗体以及山羊抗体），这些抗体分子量大，稳定性差等不足的特点，使得AFP检测灵敏度受到了一定的限制。

基于AFP在临床诊断方面所表现出的突出特性以及在肿瘤治疗领域的巨大应用前景，研发出针对AFP的特异性结合抗体，改善临床诊断和治疗效率成为现有技术的迫切需求。但是基于传统抗体的一些缺点，例如亲和力不高，免疫识别效率低下，对于一些隐蔽程度较高的抗原难以达到理想的结合和中和效果。双特异性抗体是近几年发展起来的一种抗体技术，可以同时识别2种不同的抗原。利用双特异性抗体，可以研发同时针对同一抗原不同表位的双价抗体。

抗体分子是通过其重链和轻链可变区共同组成一个特定的空间结构，识别抗原分子，普通的抗体有四条多肽链组成，2条相同的轻链，2条相同的重链，只能识别同一个抗原分子。双特异性抗体可以利用不同的技术获得，如将2种不同抗体的可变区序列串联在同一个恒定区序列基因上，这样表达出来的抗体分子有2种不同的抗原结合区；或者利用化学的方法，将2个不同轻链、2个不同的重链分子连接成一个抗体样结构的分子。抗体分子的重链和轻链可变区可以形成一定的空间结构，识别特定的抗原分子。有研究发现，不同的抗体分子间，存在轻链序列或者重链序列相同的现象，证明轻链和重链通过空间结构的相互契合，可以识别不同的抗原分子或者识别同一抗原的不同表位，这也是抗体分子交叉反应的理论基础。

1993年，Hamers-Casterman等研究发现，在骆驼科动物（骆驼、单峰骆驼和美洲驼）的体内发现了一类仅有重链二聚体（H₂）的抗体，其主要是IgG2和IgG3类型，此类抗体由于缺乏轻链，于是将这种抗体称为仅有重链的抗体（Heavy chain only like Antibody，HCAbs），而它们的抗原结合部位由一个结构域组成，称为VHH区，因此该类抗体也被称为单结构域抗体或者单域抗体（sdAb）。由于该类抗体为去除恒定区后的可变区序列，分子量只有15kDa，大约10纳米的直径，因此也被称为纳米抗体（Nbs）。这种仅有重链的抗体原来只是作为一种人类B细胞增生性疾病（重链病）的病理形式被人们所认识，其可能是由于基因组水平的突变和缺失而导致重链CH1结构域不能表达，使得表达出的重链缺乏CH1，从而缺乏与轻链的结合能力，因此形成一种重链二聚体。

相对于常规的四链抗体的scFv而言，纳米抗体在亲和力方面与其对应的scFv相当，但在可溶性、稳定性、对聚集的抗性、可重折叠性、表达产率以及DNA操作、文库构建和3-D结构测定的容易性方面超越scFv。

纳米抗体来源于成年骆驼体内HCAbs的最小的功能性抗原结合片段，具有高度稳定性和与抗原结合的高亲合力，能与蛋白裂隙和酶活性位点相互作用，使之作用类似于抑制剂。因此，纳米抗体可以为药物设计小分子酶抑制物提供新的思路。由于仅有重链，纳米抗体的制造较单克隆抗体容易。纳米抗体的独特性质例如处于极端温度和pH环境中的稳定性，使之可以低成本制造大产量，而且可以克服传统抗体实体肿瘤渗透性差，靶向效应低等固有缺陷。因此，纳米抗体在疾病的治疗和诊断中具有很大的价值，在肿瘤的抗体靶向诊断和治疗中也具有很大的发展前景。

鉴于AFP分子糖链结构的差异性，单一位点识别的抗体应用范围受到限制。因此研发抗AFP的双位点识别抗体成为一种新的需求。本发明的目的就是提供一种能够特异性识别AFP抗原的纳米抗体，以及能够同时针对AFP抗原不同表位的双特异性纳米抗体。

发明内容

基于上述发明目的，本发明首先提供了一种抗AFP抗原的VHH结构域，所述VHH结构域的3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3分别为SEQ ID NO.1的第26-33、51-57、96-111位氨基酸序列所示，或者如SEQ ID NO.3的第26-33、51-57、96-111位氨基酸序列所示。

在一个优选的技术方案中，所述VHH结构域的序列由SEQ ID NO.1或者SEQ IDNO.3所述氨基酸序列组成。在本发明中纳米抗体1A6即具有如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的VHH结构域，纳米抗体1E11即具有如SEQ ID NO.3所示氨基酸序列的VHH结构域。

其次，本发明还提供了一种编码上述VHH结构域的核酸，所述核酸的序列由SEQ IDNO.2或者SEQ ID NO.4所示，其中，SEQ ID NO.2编码纳米抗体1A6的VHH结构域，SEQ IDNO.4编码纳米抗体1E11的VHH结构域。

第三，本发明提供了一种含有上述核酸的表达载体，所述表达载体为pMES4。

第四，本发明提供了一种含有上述表达载体的宿主细胞，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21 (DE3)。

第五，本发明还提供了一种含有上述VHH结构域的单域抗体，所述抗体的恒定区序列如SEQ ID NO.5所示；所述单域抗体即带有缺失CH1的恒定区序列的VHH结构域序列。

第六，本发明还提供了一种双特异性抗体，所述抗体含有两条序列不同的重链，所述两条序列不同的重链由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列与SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列串联而成，所述两条序列不同的重链分别识别AFP不同位点。

在一个优选的技术方案中，由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列位于串联的氨基端。

在另一个优选的技术方案中，所述串联的两条序列不同的重链可变区之间设有连接肽，所述连接肽为（G₄S）_n，其中n为1-6之间的整数。

更为优选地，所述n=4。

再为优选地，所述双特异性抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

第七，本发明还提供了一种编码上述双特异性抗体的核酸，所述核酸的序列由SEQID NO.7所示。

尤为优选地，在所述双特异性抗体的羧基端还带有抗体恒定区，其恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

第八，本发明还提供了一种编码上述带有恒定区的双特异性抗体的核酸，所述编码序列由SEQ ID NO.8所示。

第九，本发明提供了一种含有上述核酸的表达载体，所述表达载体为pFUSEhIgG1-Fc2。

第十，本发明提供了一种含有上述表达载体的宿主细胞，所述宿主细胞为HEK293细胞。

最后，本发明还提供了所述抗AFP的VHH结构域或单域抗体以及上述双特异性抗体在制备肿瘤治疗药物中的应用。

本发明提供的抗AFP双特异性抗体对AFP具有优异的抗原识别能力，而与其他非特异性交叉反应性蛋白没有反应。在针对AFP表达阳性的HCC-9204肿瘤细胞的ADCC细胞毒性实验中，本发明提供的双特异性抗体和抗AFP纳米抗体均能显著诱导LAK细胞的ADCC活性，且双特异性抗体诱导能力更为显著，其肿瘤细胞裂解率最高达到85%，高于单独AFP纳米抗体的联合应用，更显著高于两种抗体的单独应用。且本发明提供的双特异性抗体与单独纳米抗体相比具有较长的体内半衰期，这显示出本发明的双特异性抗体在临床治疗AFP抗原阳性的肿瘤以及药物制备领域的应用价值。

附图说明

图1. 提取的总RNA电泳鉴定图；

图2. 第一轮PCR扩增抗体可变区基因电泳鉴定图；

图3. 第二轮PCR扩增抗体可变区基因电泳鉴定图；

图4. pMES4表达载体结构示意图；

图5. pMES4载体双酶切反应产物电泳鉴定图；

图6. 菌落PCR鉴定转化子电泳鉴定图；

图7. 纳米抗体纯化SDS-PAGE图；

图8. Biacore分析纳米抗体亲和力曲线图；

图9. 双特异性抗体纯化SDS-PAGE图；

图10. Biacore分析双特异性抗体亲和力曲线图；

图11. 带恒定区的双特异性抗体纯化SDS-PAGE图；

图12. ADCC细胞毒性试验结果图；

图13. 双特异性抗体与纳米抗体在兔体内的代谢曲线图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的权利要求所限定的保护范围构成任何限制。

实施例1. 纳米抗体噬菌体展示文库的构建及筛选

1.1羊驼的免疫

选取健康成年羊驼一只，将重组AFP抗原（爱必信生物，货号Abt-P-28）与弗氏佐剂按1:1的比例混匀，按6-7μg/kg采用背部皮下多点注射的方式免疫羊驼，共免疫四次，免疫间隔为2周。之后采集羊驼外周血，用于构建噬菌体展示文库。

1.2驼源淋巴细胞的分离

将采集的羊驼外周血利用骆驼外周血淋巴细胞分离液试剂盒（天津灏洋公司，货号LTS1076）说明书操作进行分离淋巴细胞，每2.5×10⁷个活细胞加入1ml RNA分离试剂，取1ml进行RNA提取，其余-80℃保存。

1.3总RNA提取

将含有淋巴细胞的1ml Tipure Isolation Reagent反复吹打，放置5分钟；加入200μl氯仿，涡旋30秒后继续放置5分钟；4℃，12000g离心15分钟，吸取水相转入新的EP管中；加入等量异丙醇，放置10分钟；4℃，12000g离心10分钟，弃上清；用1ml预冷的70%乙醇洗涤，4℃，7500g离心5分钟，弃上清并干燥5分钟；加入30μl RNase-free水溶解沉淀，调整浓度到1μg/μl进行凝胶电泳检测（图1：M为Trans 2K DNA Marker；1-2为提取的RNA）。

1.4反转录合成cDNA

根据逆转录试剂盒说明书（Roche公司的transcripor first stand cDNAsynthesis KIT）以1.3步骤获得的RNA为模板进行逆转录cDNA。

1.5抗体可变区基因扩增

将反转录得到的cDNA作为模版进行PCR反应。扩增共进行两轮，第一轮PCR的引物序列如下：

CALL001：GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG

CALL002：GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC

PCR反应条件及程序为：95℃ 5分钟；95℃ 30秒，57℃ 30秒，72℃ 30秒，30个循环；72℃ 7分钟。使用琼脂糖凝胶回收试剂盒胶回收700bp左右的条带，最终用水调整核酸浓度至5ng/μl（图2：M为Trans 2K DNA Marker；1-3为第一轮PCR产物）。第二轮PCR的引物序列如下：

VHH-Back：GATGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGRGGAGG

VHH-For：CTAGTGCGGCCGCTGGAGACGGTGACCTGGGT

PCR反应条件及程序为：95℃ 5分钟；95℃ 30秒，55℃ 30秒，72℃ 30秒，15个循环；72℃ 7分钟。使用PCR产物回收试剂盒纯化PCR产物（图3：M为Marker；1-3为第二轮PCR产物）。

1.6载体构建

将pMES4（购自Biovector，其结构示意图见图4）与第二次PCR产物分别进行 PstI、BstEII双酶切，取1.5μg酶切后载体和450ng酶切后的第二次PCR产物，加15μl T4 DNA连接酶，补充缓冲液和水至150μl总体积，16℃过夜连接并回收连接产物。使用PCR产物回收试剂盒进行产物回收，20μl水洗脱。1%琼脂糖电泳凝胶检测pMES4载体双酶切结果（图5：M为Trans 5K Plus DNA Marker；1-2为pMES4载体双酶切后产物；3为pMES4载体未酶切质粒）。

1.7电转化及库容测定

取10μl纯化后的连接产物，加入到含有50μl大肠杆菌TG1感受态细胞的预冷电转杯中置入电转仪（美国BTX的ECM630电转仪）进行电转化，取出电转杯，复苏并培养转化子。随机挑选克隆，进行菌落PCR鉴定（图6：M为Marker；N为阴性对照；1-15为随机挑选的单克隆PCR鉴定产物）。根据PCR阳性率推算库容（库容量=克隆数×稀释倍数×PCR鉴定阳性率×10）。引物序列如下：

MP57：TTATGCTTCCGGCTCGTATG

GIII：CCACAGACAGCCCTCATAG

1.8噬菌体扩增

取复苏的菌液接种至YT-AG培养基中，37℃ 200rpm培养到培养物OD₆₀₀=0.5。取出10ml菌液加入4×10¹⁰VCSM13，37℃静止感染30分钟。4000rpm，常温离心10分钟，去净上清。用2×YT-AK（含氨苄青霉素和卡那霉素）培养基重悬菌体，37℃ 200rpm培养过夜。离心取上清40ml管中，加入10ml PEG/NaCl（20%/2.5M）溶液充分混合，离心弃上清，沉淀用1ml冰PBS洗涤离心，取上清250μl预冷的PEG/NaCl，充分混匀并洗涤重悬。

测定噬菌体滴度：将TG1培养至OD₆₀₀=0.4，用LB培养基梯度稀释噬菌体，取倍比稀释的噬菌体TG1培养物混合培养，次日观察培养板中噬菌斑形成情况，对噬菌斑数在30-300的稀释梯度平板进行计数并按照下列公式计算噬菌体滴度（pfu）。

噬菌体滴度（pfu/ml）=稀释倍数×噬菌斑数目×100

1.9纳米抗体筛选

通过ELISA方法以抗原筛选阳性克隆。以抗原包被ELISA板，5% BSA封闭，PBST洗涤。每孔加入100μl噬菌体上清液，37℃放置1小时。弃上清，加入HRP标记的小鼠抗M13的二抗，37℃放置1小时。弃上清，加入TMB溶液，室温孵育5小时，每孔加入2M硫酸终止液，用酶标仪450nm读数。

1.10纳米抗体在大肠杆菌中的表达和纯化

挑选噬菌体ELISA结果阳性的克隆，提取质粒并转化至菌株BL21感受态细胞，以IPTG诱导纳米抗体蛋白表达，收集上清（周质提取物），并将周质提取物透析至PBS，使用Ni-NTA树脂进行纯化，使用不同浓度咪唑进行洗脱和收集，将收集的样品进行还原型蛋白电泳分析，最后将纳米抗体透析到PBS中。

通过羊驼免疫、细胞分离、噬菌体文库的构建、纳米抗体的筛选，筛选出抗AFP的纳米抗体。用Vector NTI软件对测序结果进行抗体轻链和重链基因的分析，以确定可变区的框架区（Framework Regions，FR）和互补决定区（Complementary Determining Regions，CDR）。

本发明筛选到的；两个优选实施方案的纳米抗体被命名为“1A6”和“1E11”。通过DNA测序，所述纳米抗体1A6重链核酸序列为SEQ ID NO. 2所示，可变区氨基酸序列为SEQID NO. 1所示，其中第1-25位氨基酸序列为FR1，第26-33位氨基酸序列为CDR1，第34-50位氨基酸序列为FR2，第51-57位氨基酸序列为CDR2，第58-95位氨基酸序列为FR3，第96-111位氨基酸序列为CDR3，第112-122位氨基酸序列为FR4。所述纳米抗体1E11重链核酸序列为SEQID NO. 4所示，可变区氨基酸序列为SEQ ID NO. 3所示，其中第1-25位氨基酸序列为FR1，第26-33位氨基酸序列为CDR1，第34-50位氨基酸序列为FR2，第51-57位氨基酸序列为CDR2，第58-95位氨基酸序列为FR3，第96-111位氨基酸序列为CDR3，第112-122位氨基酸序列为FR4。

实施例2. 纳米抗体的制备

2.1纳米抗体原始菌株TG1扩增及纳米抗体重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)

将含有纳米抗体核酸的原始菌株TG1甘油菌，按照1:1000比例接种于5ml新鲜的LB-A培养基，37℃ 200rpm过夜培养。次日，使用Plasmid mini kit（OMEGA）按照说明书提取质粒。经验证后将上述质粒1μl转化于100μl感受态细胞中，轻轻混匀，在冰上放置30分钟，42℃水浴热击90秒，冰浴冷却3分钟。向离心管加入600μl LB培养基，37℃振荡培养60分钟。取上清100μl，用三角涂布器涂布在LB-A平板上，37℃倒置培养过夜。

2.2纳米抗体的诱导表达

挑取上述单克隆菌落于LB-A培养基中，37℃振荡培养过夜。次日，取该菌液按照1:100比例加入100ml新鲜LB-A培养基，37℃振荡培养3小时至菌液OD₆₀₀=0.8左右，加入终浓度为1mM IPTG，30℃诱导过夜。第三日，8000rpm，离心10分钟收集菌体，加入1.5ml的预冷TES缓冲液重悬沉淀。冰浴2分钟后，轻柔振荡30秒，重复此循环6次。加3.0ml TES/4（将TES用水稀释4倍），轻柔振荡30秒后，冰浴静置2分钟，同样重复振荡和静置步骤共6次。9000rpm，4℃离心10分钟，收集约4.5ml的上清（周质提取物）。

2.3纳米抗体的纯化和鉴定

将IMAC Sepharose（GE公司）重悬后，取2ml加入到重力柱内，静置30分钟，使sepharose自然沉降于重力柱底部，流出保存缓冲液。加入2倍柱体积的硫酸镍溶液（0.1M），按照约8秒/滴的流速流出硫酸镍溶液；加入10倍柱体积的平衡缓冲液平衡并洗涤sepharose，流速维持不变；将样品使用平衡缓冲液2倍稀释后，加入重力柱中，调节流速为6秒/滴，收集穿透液；加入10倍柱体积洗涤缓冲液洗涤sepharose，维持流速不变，收集洗涤液；加入3倍柱体积的洗脱缓冲液，流速维持在6秒/滴，收集含有目的蛋白的洗脱液；最后依次加入10倍柱体积的平衡缓冲液、10倍柱体积的纯水和10倍柱体积的20%乙醇洗涤sepharose，并最终保留4ml的20%乙醇来保存柱子。上述收集的样品分别进行SDS-PAGE检测（图7: 1为彩虹180广谱蛋白Marker；1为大肠杆菌诱导表达纯化后的纳米抗体1A6；2为大肠杆菌诱导表达纯化后的纳米抗体1E11）。

实施例3. 纳米抗体与抗原的亲和活性测定

3.1芯片抗原偶联

将抗原用不同pH的醋酸钠缓冲液（pH5.5，pH5.0，pH4.5，pH4.0）配制成20μg/ml的工作液，同时准备50mM的NaOH再生溶液，利用Biacore T100 蛋白相互作用分析系统仪器中的模板方法对不同pH条件的抗原与芯片（GE公司）表面之间的静电结合进行分析，以信号增加的量达到5倍RL为标准，选择合适的最偏中性的pH体系并根据需要调整抗原浓度作为偶联时的条件。按照仪器中自带的模板方法对芯片进行偶联：其中1通道选择空白偶联模式，2通道选择Target偶联模式，目标设置为设计好的理论偶联量。偶联过程大概耗时60分钟。

3.2分析物浓度设置条件探索及再生条件优化

采取手动进样模式，选择1，2通道2-1模式进样，流速设置为30 μl/分钟。进样条件均为120秒，30μl/分钟。再生条件均为30秒，30μl/分钟。首先持续空走运行缓冲液直至所有基线均稳定。准备浓度跨度较大的纳米抗体溶液，以运行缓冲液配置，建议设置200μg/ml，150μg/ml，100μg/ml，50μg/ml，20μg/ml，10μg/ml，2μg/ml。准备再生溶液，选择谷氨酸盐酸体系四个pH梯度的再生溶液：1.5，2.0，2.5，3.0。手动进样200μg/ml分析物样品，观察2通道，从最偏中性pH的再生缓冲液进行再生，直至2通道再生后的响应线回到与基线同一高度。再手动进样一次200μg/ml分析物样品，观察2-1通道的信号变化并记录结合量，用上一步中最后使响应线回到基线的再生溶液进行再生后，再次收手动进样200μg/ml分析物样品，观察2-1通道的信号变化并记录结合量与刚才的结合量数值对比，若偏差小于5%，即认为此pH的再生溶液为最佳的再生溶液，若再次进样的结合量偏低，则继续以更低pH的再生缓冲液进行实验。以选择的最佳再生溶液，作为每次进样后的芯片表面再生试剂。分别进样上面设置的分析物浓度样品，并对每个浓度的结合量进行分析，最终确定亲和力测试所需的浓度梯度。

3.3亲和力测试

按优化好的样品浓度梯度，再生溶液，使用仪器自带的模板方法（其中设置进样条件为60秒，30μl/min；解离时间：600秒；再生条件：30秒，30μl/min）对纳米抗体及抗原之间的亲和力进行测试。随时观察2-1通道的信号情况。亲和力测试过程大概耗时200分钟。

3.4结果分析

选择合适的几个浓度梯度的结合解离曲线采用1：1binding的模式对所有曲线进行拟合，最终得到亲和力数值及结合常数和解离常数等重要参数（见表1和图8）。

表1：纳米抗体亲和力数据

。

抗AFP纳米抗体1A6的亲和力数值为9.758E-10，抗AFP纳米抗体1E11的亲和力数值为2.859E-10。表1中，1C5为中国发明专利申请202110548534.8中公开的纳米抗体；1A7为中国发明专利申请202110548529.7中公开的纳米抗体；2F5为中国发明专利申请202110547363.7中公开的纳米抗体；1B9为中国发明专利申请202111046777.8中公开的纳米抗体。

实施例4. 纳米抗体的ELISA叠加数据分析

4.1抗原饱和浓度的确定

以2μg/ml的浓度包被抗原，100μl/孔，4℃包被24小时，洗板5遍。以1%BSA作为封闭剂过夜封闭，洗板5遍。酶标板中加入不同梯度稀释的纳米抗体、阴性对照（阴性血清1:100）、PBS空白对照，37℃孵育30分钟，洗板5遍。加入1:4000比例稀释的HRP标记的羊抗羊驼IgG，37℃孵育30分钟，洗板5遍。加TMB显色液，37℃孵育10分钟，2M硫酸终止反应。读取吸光值450nm读数，绘制抗体饱和曲线，根据结果选择随浓度增加读数不再增加的浓度为饱和浓度。

4.2位点叠加实验

先加入第一种抗体进行反应，洗板后再加第二种抗体，洗板后加酶标二抗，TMB显色读数（方法同4.1）。计算两株抗体叠加率AI， AI>50%说明被测2株抗体抗原位点不同，AI<50%说明被测两株抗体抗原表位相同，AI值越大，位点重叠可能性越低。公式为：AI=[2×A(1+2)-(A1+A2)]/A(1+2)×100%

A1—第一株抗体读数

A2—第二株抗体读数

A（1+2）—叠加2种抗体读数

表2：抗体抗原表位叠加实验

。

实验结果见表2，1A6与1E11纳米抗体相较于已经公开的抗AFP的纳米抗体识别AFP的抗原表位不同，这预示着在纳米抗体的诊断和治疗应用上，1A6和1E11可以作为表位叠加的组合物联合应用，从而可以增大诊断或治疗的效率。

实施例5. 利用Biacore分析纳米抗体结合位点

Biacore系统主要原理就是通过表面分子的浓度改变使SPR（折射率）发生偏移，在监测器上表现为RU值的变化。由于该系统的灵敏度更高，我们设计了相关实验来验证ELISA叠加的实验结果。首先重复进2针第一个纳米抗体A，观察RU值的变化，以确认相应的抗原结合位点的饱和并记录；之后进入第二个纳米抗体B，观察并记录RU值：如该RU值比单一的纳米抗体B的RU值相差不超过20%，即可认为两者识别不同的抗原决定簇；如相差值超过20%但低于60%，认为两者有位阻效应；若相差值超过了60%，判定两者识别了同一抗原。具体操作为首先单纯进样抗体B记录RU增加值R_B1，并对芯片再生；之后重复进两次抗体A，记录RU增加值R_A，并确认饱和后，直接进样抗体B，观察RU值的增加量R_B2；之后使用公式(R_B2-R_A)/R_B1来计算位阻率，以此判定二者是否识别同一抗原决定簇。该实施例结果见表3。

表3：Biacore 检测纳米抗体叠加实验RU值变化表

。

可见纳米抗体1A6、1E11与已经公开的抗AFP的纳米抗体相比均识别不同抗原位点，该结果与ELISA叠加实验推测的结果一致。更加验证了这两株纳米抗体在AFP抗体领域的应用前景。

实施例6. 抗AFP双特异性纳米抗体的制备及亲和力测定

6.1 抗AFP双特异性纳米抗体的制备

将1A6和1E11进行蛋白融合表达，将两个抗体的可变区串联后送往华大基因公司进行基因合成。两个可变区之间用柔性多肽（G₄S）₄进行连接，合成后的基因两端保留HindⅢ和EcoRⅠ两个酶切位点，且连接在pUC57载体上获得pUC57-1A6-1E11。合成的抗体核酸序列如SEQ ID NO.7所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。将pUC57-1A6-1E11与pCDNA3.1(+)同时利用HindⅢ和EcoRⅠ（NEB公司）进行双酶切，利用T4连接酶（NEB公司）将双酶切后的载体与双纳米抗体基因连接过夜，构建pCDNA3.1(+)-1A6-1E11，转化DH5α感受态后利用无内毒素大提试剂盒（天根公司）提取质粒。转染人293细胞，采用离子交换层析的方法从293细胞的培养上清中纯化双特异性抗体，结果见图9（M：彩虹180广谱蛋白Marker；1为双特异性抗体表达原液；2为纯化后的双特异性抗体）。

6.2 双特异性纳米抗体亲和力测定

按照实施例3的方法优化双特异性抗体的浓度梯度，按照优化后的样品浓度梯度和再生溶液，使用仪器自带的模板方法（其中设置进样条件为60s，30μl/min；解离时间：600s；再生条件：30s，30μl/min）对双特异性抗体及抗原之间的亲和力进行测试。随时观察2-1通道的信号情况。选择合适的几个浓度梯度的结合解离曲线采用1:1binding的模式对所有曲线进行拟合，最终得到亲和力数值及结合常数和解离常数。结果见表4和图10。

表4. 双特异性抗体亲和力数据

。

从结果可以看出，本发明获得的双特异性抗体与AFP抗原的亲和活性明显高于单株纳米抗体的亲和活性。

实施例7. 带恒定区的双特异性抗体的制备及其诱导的ADCC活性测定

7.1 带恒定区的双特异性抗体的制备

pFUSE hIgG1-Fc2载体（青岛捷世康生物，货号JR442）上自表达人源IgG1的Fc片段，将双特异性抗体连入pFUSE hIgG1-Fc2，即可获得带有恒定区的双特异性抗体。具体操作为：以pUC57-1A6-1E11为模板，PCR扩增融合纳米抗体。引物序列如下：

Doubleab-F：TTATGAATTCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCT

Doubleab-R：CCACAGATCTTGAGGAGACGGTGACCTGG

利用EcoRⅠ和BglⅡ限制性内切酶（NEB公司）将PCR产物与融合表达载体pFUSEhIgG1-Fc2（恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示）分别进行双酶切，通过T4连接酶（NEB公司）将双酶切后的载体与双特异性抗体连接过夜，构建重组质粒pFUSE hIgG1-Fc2-1A6-(G₄S)₄-1E11，转化DH5α感受态后利用无内毒素大提试剂盒（天根公司）提取质粒。转染人293细胞，采用Protein A层析的方法从293细胞的培养上清中纯化双特异性纳米抗体，核酸序列如SEQ ID NO.8所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。并将纯化后的双特异性纳米抗体进行SDS-PAGE分析（图11：M为彩虹180广谱蛋白Marker；1为表达原液；2为纯化后的带恒定区的双特异性纳米抗体）。

7.2 双特异性抗体诱导的ADCC活性测定

7.2.1 LAK细胞（淋巴因子激活的杀伤细胞，lymphokine activated killercells）制备

取静脉血2ml，放入加有抗凝剂的试管中，轻轻混匀。将试管直立静置于室温或37℃温箱中30-60min，待红细胞自然沉降。此时可见试管中的悬液分3层，上层为淡黄色血浆，底层为红细胞，在紧贴红细胞层上有一呈灰白色的白细胞层（PMBC）。用毛细管吸取位于红细胞层上面的富含白细胞的细胞悬液，移入另一试管中。加入无Ca²⁺、Mg²⁺Hank’s液至离试管口3cm处，混匀，以水平离心机2000r/min离心10min，弃上清，相同方法洗涤两次。沉淀细胞用适量10%-20%灭活小牛血清的Hank’s液重悬，计数，配成所需的细胞浓度的悬液，接种在15ml的细胞培养瓶中（一般常用2×10⁶/ml，RPMI1640培养基含有1000U/ml的白介素-2），置于37℃、5%CO₂培养箱中培养，3天后收集即为LAK细胞。

7.2.2 肿瘤细胞的培养

将高表达AFP的HCC-9204细胞（人肝癌细胞）与不表达AFP的SK-Hep-1细胞（人肝腹水腺癌细胞）在含10%胎牛血清中的RPMI-1640培养基中培养至75-80%的密度，弃培养基，用预热至37℃的PBS洗涤细胞2次，加2ml胰蛋白酶-EDTA溶液，室温放置5min，加2ml含10%胎牛血清的培养基终止反应，采用一次性的无菌吸管反复吹打细胞至单细胞悬液，以水平离心机2000r/min离心10min，弃上清，PBS再洗涤两次，计数后，用培养基重悬细胞至2×10⁶个/ml备用。

7.2.3 细胞毒性试验

在96孔细胞微孔板内接种HCC-9204和SK-Hep-1细胞（3×10⁴个/孔），5%CO₂环境下37℃孵育培养48h后弃培养液，然后根据特定比例加入LAK细胞、带恒定区的抗AFP双特异性抗体或1A6、1E11（抗AFP纳米抗体1A6与1E11的恒定区融合表达抗体制备同7.1，其中1A6-fc的核酸序列如SEQ ID NO.10所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示；1E11-fc的核酸序列如SEQ ID NO.11所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示）或IgG抗体对照（抗体终浓度均为2μg/ml，加入总体积为100μl），LAK细胞与靶细胞的比例为1、5、10、15、20:1。在5%CO₂环境下37℃孵育6h，弃上清（LAK细胞和死亡的肿瘤细胞）。使用MTS方法进行细胞活力测定（abcam公司，货号：ab197010）。

细胞裂解率（%）=【实验靶细胞的OD₄₉₀】/【对照靶细胞的OD₄₉₀】×100

结果如图12所示，纵坐标为肿瘤细胞的裂解率，横坐标为LAK细胞与靶细胞的比例。抗AFP纳米抗体1A6-fc、1E11-fc以及带恒定区的双特异性抗体均能显著诱导LAK细胞的ADCC活性。在LAK与靶细胞比例为20:1的条件下，HCC-9204细胞裂解率在42%-85%之间，在不表达AFP的SK-Hep-1细胞中未观察到这种裂解现象。本发明提供的双特异性抗体显著增强了LAK细胞杀伤HCC-9204细胞的活性，且高于抗AFP纳米抗体1A6-fc和1E11-fc的单独应用。此结果显示出本发明的双特异性抗体在临床治疗AFP抗原阳性肿瘤的应用价值。

实施例8. 双特异性抗体在家兔血浆中的代谢

本实施例以新西兰兔为对象，进行药物代谢动力学的初步研究，每6只新西兰兔为一组，采取背部皮下给药，双特异性纳米抗体和抗AFP纳米抗体1A6和1E11的给药剂量均为1nmol/kg。给药后0.5h、1h、2h、4h、8h、12h、18h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h、120h、144h进行耳缘静脉采血，分离血清进行抗体滴度的测定，绘制药物滴度时间曲线，结果见图13所示。

结果显示纳米抗体在72h后基本已经代谢完毕，纳米抗体处于较低水平，而双特异性抗体在72h后仍然具有一定滴度，可延长治疗效果。使用GraphPad Prism软件分析药物代谢动力学参数，结果见表5。

表5. 纳米抗体和双特异性抗体的家兔体内药物代谢动力学参数

。

表5中，t_max是指抗体滴度达到最大时的时间；t_1/2是指抗体达到最大浓度后代谢掉一半时的时间。从表中可以看到，双特异性抗体在新西兰兔体内的半衰期长达24小时，明显长于纳米抗体单独给药和联合给药。

序列表

<110> 深圳市国创纳米抗体技术有限公司

<120> 抗AFP抗原VHH结构域及含有其的双特异性抗体

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 122

<212> PRT

<213> Lama pacos

<400> 1

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Ala Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Ser Ile Phe Ser Phe Ala

20 25 30

Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Arg Ile Thr Gly Gly Asp Asn Ile Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Ala Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn

85 90 95

Gly Glu Gly Tyr Gly Ser Ser Trp Phe Asp Asp Gly Lys Asn Tyr Trp

100 105 110

Gly Lys Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 2

<211> 366

<212> DNA

<213> Lama pacos

<400> 2

caggtgcagc tgcaggagtc tgggggagcg ctggtgcagc cgggcggcag cctgaaactg 60

agctgcgcgg cgagcgaaag catttttagc tttgcggcga tgggctggta tcgccaggcg 120

ccgggcaaac agcgcgaact ggtggcgcgc attaccggcg gcgataacat taactatgcg 180

gatagcgtga aaggccgctt taccattagc aaagataacg cgaaaaacac cgcgtatctg 240

cagatgaaca gcctgaaacc ggaagatacc gcggtgtatt attgcaacgg cgaaggctat 300

ggcagcagct ggtttgatga tggcaaaaac tattggggca aaggcaccca ggtgaccgtc 360

tcctca 366

<210> 3

<211> 122

<212> PRT

<213> Lama pacos

<400> 3

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Val Ser Cys Ala Ala Ser Glu Ser Ile Phe Ser Phe Ala

20 25 30

Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Arg Ile Thr Gly Gly Asp Asn Ile Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn

85 90 95

Gly Glu Gly Tyr Gly Ser Ser Trp Phe Asp Asp Gly Lys Asn Tyr Trp

100 105 110

Gly Lys Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 4

<211> 366

<212> DNA

<213> Lama pacos

<400> 4

caggtgcagc tgcaggagtc tggaggaggc ctggtgcagc cgggcggcag cctgcgcgtg 60

agctgcgcgg cgagcgaaag catttttagc tttgcggcga tgggctggta tcgccaggcg 120

ccgggcaaac agcgcgaact ggtggcgcgc attaccggcg gcgataacat taactatgcg 180

gatagcgtga aaggccgctt taccattagc aaagataacg cgaaaaacac cgtgtatctg 240

cagatgaaca gcctgaaacc ggaagatacc gcggtgtatt attgcaacgg cgaaggctat 300

ggcagcagct ggtttgatga tggcaaaaac tattggggca aaggcaccca ggtcaccgtc 360

tcctca 366

<210> 5

<211> 227

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 5

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

1 5 10 15

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Lys

225

<210> 6

<211> 264

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 6

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Ala Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Ser Ile Phe Ser Phe Ala

20 25 30

Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Arg Ile Thr Gly Gly Asp Asn Ile Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Ala Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn

85 90 95

Gly Glu Gly Tyr Gly Ser Ser Trp Phe Asp Asp Gly Lys Asn Tyr Trp

100 105 110

Gly Lys Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val

130 135 140

Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu

145 150 155 160

Arg Val Ser Cys Ala Ala Ser Glu Ser Ile Phe Ser Phe Ala Ala Met

165 170 175

Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala Arg

180 185 190

Ile Thr Gly Gly Asp Asn Ile Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg

195 200 205

Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met

210 215 220

Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Gly Glu

225 230 235 240

Gly Tyr Gly Ser Ser Trp Phe Asp Asp Gly Lys Asn Tyr Trp Gly Lys

245 250 255

Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

260

<210> 7

<211> 792

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 7

caggtgcagc tgcaggagtc tgggggagcg ctggtgcagc cgggcggcag cctgaaactg 60

agctgcgcgg cgagcgaaag catttttagc tttgcggcga tgggctggta tcgccaggcg 120

ccgggcaaac agcgcgaact ggtggcgcgc attaccggcg gcgataacat taactatgcg 180

gatagcgtga aaggccgctt taccattagc aaagataacg cgaaaaacac cgcgtatctg 240

cagatgaaca gcctgaaacc ggaagatacc gcggtgtatt attgcaacgg cgaaggctat 300

ggcagcagct ggtttgatga tggcaaaaac tattggggca aaggcaccca ggtgaccgtc 360

tcctcaggag gaggaggatc aggtggaggt ggaagcggag gaggaggttc tggaggtgga 420

ggaagccagg tgcagctgca ggagtctgga ggaggcctgg tgcagccggg cggcagcctg 480

cgcgtgagct gcgcggcgag cgaaagcatt tttagctttg cggcgatggg ctggtatcgc 540

caggcgccgg gcaaacagcg cgaactggtg gcgcgcatta ccggcggcga taacattaac 600

tatgcggata gcgtgaaagg ccgctttacc attagcaaag ataacgcgaa aaacaccgtg 660

tatctgcaga tgaacagcct gaaaccggaa gataccgcgg tgtattattg caacggcgaa 720

ggctatggca gcagctggtt tgatgatggc aaaaactatt ggggcaaagg cacccaggtc 780

accgtctcct ca 792

<210> 8

<211> 1473

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 8

caggtgcagc tgcaggagtc tgggggagcg ctggtgcagc cgggcggcag cctgaaactg 60

agctgcgcgg cgagcgaaag catttttagc tttgcggcga tgggctggta tcgccaggcg 120

ccgggcaaac agcgcgaact ggtggcgcgc attaccggcg gcgataacat taactatgcg 180

gatagcgtga aaggccgctt taccattagc aaagataacg cgaaaaacac cgcgtatctg 240

cagatgaaca gcctgaaacc ggaagatacc gcggtgtatt attgcaacgg cgaaggctat 300

ggcagcagct ggtttgatga tggcaaaaac tattggggca aaggcaccca ggtgaccgtc 360

tcctcaggag gaggaggatc aggtggaggt ggaagcggag gaggaggttc tggaggtgga 420

ggaagccagg tgcagctgca ggagtctgga ggaggcctgg tgcagccggg cggcagcctg 480

cgcgtgagct gcgcggcgag cgaaagcatt tttagctttg cggcgatggg ctggtatcgc 540

caggcgccgg gcaaacagcg cgaactggtg gcgcgcatta ccggcggcga taacattaac 600

tatgcggata gcgtgaaagg ccgctttacc attagcaaag ataacgcgaa aaacaccgtg 660

tatctgcaga tgaacagcct gaaaccggaa gataccgcgg tgtattattg caacggcgaa 720

ggctatggca gcagctggtt tgatgatggc aaaaactatt ggggcaaagg cacccaggtc 780

accgtctcct cagacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 840

ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 900

cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 960

tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 1020

aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 1080

aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1140

tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag 1200

gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1260

atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1320

gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1380

tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcacg aggctctgca caaccactac 1440

acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaa 1473

<210> 9

<211> 491

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 9

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Ala Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Ser Ile Phe Ser Phe Ala

20 25 30

Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Arg Ile Thr Gly Gly Asp Asn Ile Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Ala Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn

85 90 95

Gly Glu Gly Tyr Gly Ser Ser Trp Phe Asp Asp Gly Lys Asn Tyr Trp

100 105 110

Gly Lys Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val

130 135 140

Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu

145 150 155 160

Arg Val Ser Cys Ala Ala Ser Glu Ser Ile Phe Ser Phe Ala Ala Met

165 170 175

Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala Arg

180 185 190

Ile Thr Gly Gly Asp Asn Ile Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg

195 200 205

Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met

210 215 220

Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Gly Glu

225 230 235 240

Gly Tyr Gly Ser Ser Trp Phe Asp Asp Gly Lys Asn Tyr Trp Gly Lys

245 250 255

Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro

260 265 270

Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro

275 280 285

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr

290 295 300

Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn

305 310 315 320

Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg

325 330 335

Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val

340 345 350

Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser

355 360 365

Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

370 375 380

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu

385 390 395 400

Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

405 410 415

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

420 425 430

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

435 440 445

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly

450 455 460

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

465 470 475 480

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

485 490

<210> 10

<211> 1047

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 10

caggtgcagc tgcaggagtc tgggggagcg ctggtgcagc cgggcggcag cctgaaactg 60

agctgcgcgg cgagcgaaag catttttagc tttgcggcga tgggctggta tcgccaggcg 120

ccgggcaaac agcgcgaact ggtggcgcgc attaccggcg gcgataacat taactatgcg 180

gatagcgtga aaggccgctt taccattagc aaagataacg cgaaaaacac cgcgtatctg 240

cagatgaaca gcctgaaacc ggaagatacc gcggtgtatt attgcaacgg cgaaggctat 300

ggcagcagct ggtttgatga tggcaaaaac tattggggca aaggcaccca ggtgaccgtc 360

tcctcagaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg 420

tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 480

gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 540

gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 600

acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 660

tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 720

gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggaggagatg 780

accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 840

gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 900

gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 960

caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg cacgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 1020

aagagcctct ccctgtctcc gggtaaa 1047

<210> 11

<211> 1047

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 11

caggtgcagc tgcaggagtc tggaggaggc ctggtgcagc cgggcggcag cctgcgcgtg 60

agctgcgcgg cgagcgaaag catttttagc tttgcggcga tgggctggta tcgccaggcg 120

ccgggcaaac agcgcgaact ggtggcgcgc attaccggcg gcgataacat taactatgcg 180

gatagcgtga aaggccgctt taccattagc aaagataacg cgaaaaacac cgtgtatctg 240

cagatgaaca gcctgaaacc ggaagatacc gcggtgtatt attgcaacgg cgaaggctat 300

ggcagcagct ggtttgatga tggcaaaaac tattggggca aaggcaccca ggtcaccgtc 360

tcctcagaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg 420

tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 480

gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 540

gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 600

acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 660

tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 720

gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggaggagatg 780

accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 840

gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 900

gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 960

caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg cacgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 1020

aagagcctct ccctgtctcc gggtaaa 1047

<210> 12

<211> 349

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 12

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Ala Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Ser Ile Phe Ser Phe Ala

20 25 30

Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Arg Ile Thr Gly Gly Asp Asn Ile Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Ala Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn

85 90 95

Gly Glu Gly Tyr Gly Ser Ser Trp Phe Asp Asp Gly Lys Asn Tyr Trp

100 105 110

Gly Lys Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys

115 120 125

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu

130 135 140

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu

145 150 155 160

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys

165 170 175

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

180 185 190

Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

195 200 205

Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

210 215 220

Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

225 230 235 240

Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser

245 250 255

Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys

260 265 270

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln

275 280 285

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly

290 295 300

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

305 310 315 320

Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

325 330 335

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

340 345

<210> 13

<211> 349

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 13

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Val Ser Cys Ala Ala Ser Glu Ser Ile Phe Ser Phe Ala

20 25 30

Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Arg Ile Thr Gly Gly Asp Asn Ile Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn

85 90 95

Gly Glu Gly Tyr Gly Ser Ser Trp Phe Asp Asp Gly Lys Asn Tyr Trp

100 105 110

Gly Lys Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys

115 120 125

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu

130 135 140

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu

145 150 155 160

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys

165 170 175

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

180 185 190

Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

195 200 205

Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

210 215 220

Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

225 230 235 240

Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser

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Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys

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Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln

275 280 285

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly

290 295 300

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

305 310 315 320

Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

325 330 335

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

340 345

Claims

1.一种抗AFP抗原的VHH结构域，其特征在于，所述VHH结构域的3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3分别为SEQ ID NO.1的第26-33、51-57、96-111位氨基酸序列所示，或者如SEQ IDNO.3的第26-33、51-57、96-111位氨基酸序列所示。

2.根据权利要求1所述的VHH结构域，其特征在于，所述VHH结构域的序列如SEQ IDNO.1或者SEQ ID NO.3的氨基酸序列所示。

3.一种含有权利要求1或2所述VHH结构域的单域抗体，其特征在于，所述抗体的恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

4.一种编码权利要求2所述VHH结构域序列的核酸，其特征在于，所述核酸的序列由SEQID NO.2或者SEQ ID NO.4所示。

5.一种含有权利要求4所述的核酸的表达载体，其特征在于，所述载体为pMES4。

6.一种含有权利要求5所述表达载体的宿主细胞，其特征在于，所述细胞为大肠杆菌BL21（DE3）。

7.一种双特异性抗体，其特征在于，所述抗体含有两条序列不同的重链，所述两条序列不同的重链由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列与SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列串联而成。

8.根据权利要求7所述的双特异性抗体，其特征在于，所述两条序列不同的重链之间设有连接肽，所述连接肽为（G₄S）n，其中，n为1-6之间的整数。

9.根据权利要求8所述的双特异性抗体，其特征在于，所述n=4，所述双特异性抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

10.根据权利要求9所述的双特异性抗体，其特征在于，在所述双特异性抗体的羧基端还带有抗体恒定区，其恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

11.一种编码权利要求9所述抗体序列的核酸，所述序列由SEQ ID NO.7所示。

12.一种含有权利要求11所述核酸的表达载体，其特征在于，所述载体为pFUSE hIgG1-Fc2。

13.一种含有权利要求12所述表达载体的宿主细胞，其特征在于，所述细胞为HEK293细胞。

14.权利要求1-3任一所述抗体在制备肿瘤治疗药物中的应用。

15.权利要求7-10任一所述抗体在制备肿瘤治疗药物中的应用。