CN114766352A - 一种花生优良性状的培育方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种花生优良性状的培育方法，属于花生育种技术领域。本发明所述方法中采用子叶截除法截除花生早期杂交分离世代个体的部分子叶，用于优良性状的测定，根据测定结果对早期杂交分离世代群体筛选，从而最终培育出优良性状稳定遗传的花生。此外，利用子叶截除法对杂交早期分离世代群体单粒的优良性状进行筛选，突破了花生单粒性状检测后无法传代的问题，缩减育种规模，大大降低育种的人工和时间成本，提高选择效率。同时，本发明截除子叶的花生，其发芽率不受影响。
Description
技术领域
本发明属于花生育种技术领域，具体涉及一种花生优良性状的培育方法。
背景技术
花生是我国重要的油料作物和经济作物，其总产、单位面积产油量、种植业产值，在国内大宗油料作物中均居首位。花生营养丰富，种子含油量46％-57％，蛋白质含量20％-32％，而且还含有多种维生素，富含类黄酮及白藜芦醇等功能活性物质。我国已鉴定的6300份花生种质资源的百仁重幅度大约为40.00～137.50g，平均为59.16g。一般，大花生的百仁重≥80g，小花生的百仁重<80g。随着人民生活水平的提高和加工技术的进步，我国花生食用及食品加工量将越来越大，对原料的需求也会越来越多样化。
花生早期杂交会获得大量的、基因型高度复杂的性状分离世代群体(F2-F4代)；目前对早期分离世代群体(F2-F4代)进行种植筛选需要耗费大量的人力、物力和时间成本，检测效率低，这不利于优良性状的筛选和培育，而对早期分离世代群体中目标性状个体进行初步筛选，有利于加快育种进程，缩短育种年限，降低育种成本，增加育种目标可控性。因此，建立一种快速、高效、准确的花生优良性状的筛选和培育方法，例如高油酸含量、高油含量以及高糖花生的筛选等，可以满足人们对花生不同性状的需求。
发明内容
本发明提供了一种花生优良性状的筛选方法，步骤如下：对花生的部分子叶进行截除，将截取的子叶用于性状测定，筛选出具有优良性状的花生。
子叶的截除指的是，在远离花生胚芽一端，截除一定长度的花生子叶。在截除花生子叶时，选取一片或者两片子叶进行截除。
截除的花生子叶长度为花生种子总长度的1/4，或者小于花生种子总长度的1/4。
截除的花生子叶部分，以90～230mg为宜。
在对子叶进行截除时，保持与子叶呈90°垂直下切，减少创面。可采用刀片进行截除。
截除花生子叶时，以不损伤花生胚芽为基本原则。
子叶截除时，需对刀片进行灭菌处理，避免种子发芽过程中长菌腐烂；可优选地采用酒精灯灼烧手术刀片进行灭菌。
上述筛选方法可用于花生任一子代的性状筛选。优选地，在花生早期杂交分离世代进行性状筛选。花生早期杂交分离世代可进一步优选为F2代和F3代。所筛选的花生性状包括但不限于高油酸含量、高油含量以及高糖含量。
上述筛选方法能够保证被截除子叶的花生具有较高的成活率。
上述筛选方法可用于花生优良性状的培育，所述优良性状包括但不限于高油酸含量、高油含量以及高甜度性状。
本发明提供了一种具有优良性状的花生的培育方法，步骤如下：
(1)将母本花生与父本花生进行杂交，收获F1代种子；
(2)将F1代种植，剔除杂株，混收获得F2代种子；
(3)截除F2代单粒种子的部分子叶，用于优良性状的测定。根据测定结果筛选出具有优良性状的花生种子种植，结合农艺性状和抗性收获F3代单株；
(4)F3代单株种子按照步骤(3)，筛选出具有优良性状的花生种子种植，结合农艺性状和抗性收获F4代单株；
(5)按常规育种进程完成F4-F6代选育。
上述培育方法中，所述优良性状包括但不限于高油酸含量、高油含量以及高糖含量。其中，F2和F3代单粒种子高油、高油酸、高糖含量筛选标准分别为油脂含量≥50％，高油酸含量≥65％，总糖含量≥5％，F4-F6代株系高油、高油酸、高糖含量筛选标准分别为油脂含量≥55％，高油酸含量≥75％，总糖含量≥6％。
上述优良性状花生的培育方法中，子叶的截除是在远离花生胚芽一端，小于等于种子长度的1/4处，同时截除两片子叶。
上述优良性状花生的培育方法中，截除子叶后的花生种子，对其切口进行消毒处理，于无菌环境中放置8h以上，待切口自然干燥后，再进行种植。
消毒处理可用300mg/L的头孢霉素溶液对其切口处理3s。
上述优良性状花生的培育方法中，截除子叶后的花生种子，于种植前7天，在室内进行种子萌发，待种子露白，根伸长约1.5cm移栽至大田，保证成活率。
本发明的有益效果为：
本发明利用子叶截除法对杂交早期分离世代群体F2-F3代单粒的优良性状进行筛选，突破了花生单粒性状检测后无法传代的问题，缩减育种规模，大大降低育种的人工和时间成本，提高选择效率。同时，花生子叶截除法的采用并未影响截除子叶的花生发芽率。
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
(一)子叶截除法
子叶截除分为2种方式：(1)只切一片子叶，在远离胚芽一端，刀片与子叶呈90°垂直下切，分别切除种子长度的1/8，1/4，1/2，3/4，共4个梯度，各长度梯度下，均不要切到胚小叶，每个梯度20粒种子，6次重复。(2)两片子叶同时切，在远离胚芽一端，刀片与子叶呈90°垂直下切，分别切除种子长度的1/8，1/4，1/2，共3个梯度，每个梯度20粒种子，6次重复。
(二)子叶油脂含量测定
截除的花生子叶部分，其重量以90～230mg为宜。将截除的子叶部分采用液氮反复研磨，烘干，利用万用天平对干粉末进行称量(m)。将干粉末放入15mL玻璃管中，加入7mL甲醇-氯仿(2:1，V:V)提取液，超声(300w，28kHz)10min混匀。6000r/min转速离心15min，采用胶头滴管吸取上层有机相到新的15mL玻璃管中，残渣先后加3mL、2mL、1mL甲醇-氯仿(2:1，V:V)，超声5min混匀，6000r/min转速离心15min，保留上层有机相。合并有机相提取液转移到25mL分液漏斗中，加入2.5mL氯仿和3mL 1％氯化钠溶液，混匀，静置分层，分为三层，回收下层。加2.5mL氯仿于上层和中层溶液中再萃取两次，合并所有下层液，置于提脂瓶中。提脂瓶使用前已在105℃烘箱中干燥2h，放入干燥器冷却至恒重，于万用天平称量得到提脂瓶的重量(m1)。采用氮吹仪，50℃水浴加热，氮气挥干溶剂至恒重。把提脂瓶置入105℃烘箱中干燥2h，放入干燥器冷却至恒重，于万用天平称量得到总脂和提脂瓶的总重量(m2)。采用重量法计算总脂的含量，公式如下：ω＝(m2－m1)/m×100％。
(三)子叶脂肪酸成分含量测定
截除的花生子叶部分，其重量以10mg为宜。将截除的子叶部分采用液氮反复研磨，烘干，利用万用天平对干粉末进行称量。将干粉末放入已经被酒精清洗并烘干的5mL钳口顶空瓶中，加入850μL的甲醇和100μL的盐酸，超声(300w，28kHz)10min混匀。然后向瓶中加入50μL 2,2-二甲氧丙烷。用压盖器将顶空瓶用带聚四氟乙烯垫的铝盖封好，85℃水浴反应1h。甲酯化过程中每隔10min振荡一次。反应结束后，取出冷却至室温。用启盖器启盖后，向瓶中加入1mL 1％的NaCl溶液和0.5mL正己烷，混匀，将上层溶液吸出转入10mL烘干的离心管中，静置10分钟。25℃，4000r/min转速离心5分钟，吸取上清液，用0.22μm滤膜过滤后转入进样瓶中。如果得到的样品浓度过低，采用氮吹仪吹干上清液，然后用200μL正己烷溶解定容，涡旋2～3s，用0.22um滤膜过滤后转入进样瓶中，用于GC-MS上机测定。采用归一化法计算脂肪酸组分的相对含量，即对各组分色谱峰面积积分，以各组分的峰面积总和为100％，脂肪酸组分的百分含量以占峰面积总和的百分比表示。
(四)子叶总糖含量测定
(1)进行样品水解
截除的花生子叶部分，其重量以90～230mg为宜。将截除的子叶部分采用液氮反复研磨，烘干，利用万用天平对干粉末进行称量(m2)。将干粉末小心倒入100mL的圆底烧瓶中，加入50mL水和15mL浓盐酸，在瓶口放上棉花塞，置100℃水浴中水解20min。水解完后取出立即水浴冷却至室温，用漏斗过滤，收集滤液于250mL容量瓶中。再用蒸馏水洗涤滤渣，将洗液也倒入容量瓶中，最后用水定容，摇匀。此溶液为试样测试液。
(2)制定标准曲线
分别准确吸取0、200μL、400μL、600μL、800μL、1000μL的100mg/L葡萄糖标准溶液至15mL具塞试管，不足1.0mL的用蒸馏水补足。向试液中加入1.0mL 5％的苯酚溶液，然后快速加入5.0mL浓硫酸，静置10min。涡旋振荡器振荡30s，使反应液充分混合。然后将6个试管同时放于30℃恒温水浴锅中反应20min。取3mL橙黄色反应液于比色皿中，在490nm波长处测其吸光度，记录数据。以葡萄糖质量浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，制作葡萄糖标准曲线。(3)测定样品。准确吸取花生样品测试液200μL于15mL具塞试管，用蒸馏水补至1.0mL，按步骤2操作，用空白溶液调零，在490nm处测吸光度，以标准曲线计算总糖含量。空白试验需与测定平行进行，用同样的方法和试剂，但不加样品。总糖含量以质量分数ω计，数值以百分率(％)表示。因样品烘至干燥，故含水率可忽略不计，按下式计算：
式中：
V1——样品定容体积，单位为毫升(mL)；
V2——比色测定时加入到比色皿中的样品测定液的体积，单位为毫升(mL)；
m1——从标准曲线上查得样品测定液中的含糖量，单位为毫克(mg)；
m2——样品质量，单位为克(mg)；
计算结果以葡萄糖计，表示到小数点后两位。
实施例1
选用两个小花生品种花育20号和花育23号，挑选种皮颜色稍微发白，颗粒饱满的一级米，按照上述“子叶截除法”进行子叶截除。其中，当两片子叶切除长度为1/4时，切除的花育20号和花育23号的子叶平均重量分别为99.76mg和118.41mg，能满足检测油脂、脂肪酸或总糖含量所需干物质重量。对切除部分子叶后的种子与完整种子进行发芽试验。把种子放入直径15cm的培养皿中进行室内萌发试验。培养皿底部铺滤纸，每皿放20粒种子，在常温下用灭菌的超纯水浸种8h，之后置于25℃培养箱中培养，7d后统计发芽率，发芽标准为胚芽长度大于或等于种子长度。试验结果如表1所示：
表1切除子叶种子发芽率统计
由上述内容可知，当切除两片子叶，且切除长度为1/4时，切除的花育20号和花育23号子叶的重量均能够满足检测油脂、脂肪酸或总糖含量所需干物质重量，而且，发芽率均≥90％。
实施例2
选用两个大花生品种花育33号和花育917号，挑选种皮颜色稍微发白，颗粒饱满的一级米，按照上述“子叶截除法”进行子叶截除。其中，当两片子叶切除长度为1/4时，切除的花育33号和花育917号的子叶平均重量分别为227.11mg和201.80mg，能满足检测油脂、脂肪酸或总糖含量所需干物质重量。对切除部分子叶后的种子与完整种子进行发芽试验。把种子放入直径15cm的培养皿中进行室内萌发试验。培养皿底部铺滤纸，每皿放20粒种子，在常温下用灭菌的超纯水浸种8h，之后置于25℃培养箱中培养，7d后统计发芽率，发芽标准为胚芽长度大于或等于种子长度。试验结果如表2所示：
表2切除子叶种子发芽率统计
由上述内容可知，当切除两片子叶，且切除长度为1/4时，切除的花育33号和花育917号子叶的重量均能够满足检测油脂、脂肪酸或总糖含量所需干物质重量，而且，发芽率均≥95％。
实施例3
2010年春季，以高产品系P10-2(027×SIP009)为母本，高油花生品种徐花8号(8034-5×鲁花6号)为父本，搭配杂交组合，并收获F1。2010年冬季，将F1代种植于三亚，并收获F2。2011年春季，在远离胚芽一端，种子长度1/4处，同时截除两片子叶。按照上述子叶油脂含量测定方法，测定两片子叶截除部分的油脂含量。选择油脂含量≥50％的F2种子，于种植前7天，在室内进行种子萌发，待种子露白，根伸长约1.5cm移栽至莱西大田，成活率达到100％。收获F3代。2012年春季，检测单粒F3种子中油脂含量，选择含油量在50％以上的种子，于种植前7天，在室内进行种子萌发，待种子露白，根伸长约1.5cm移栽至莱西大田，成活率达到100％。收获F4代。2013年春季，选择每个F4株系中部分种子检测油脂含量，从中选择油脂含量≥55％的F4株系，选择的F4株系种子按株系种植于莱西，观察结果数、抗逆性、果仁外观品质，在丰产性状好的株行选择单株，按株行对中选单株进行混收，获得F5代。2014年春季，选择每个F5株系中部分种子检测油脂含量，从中选择油脂含量≥55％的F5株系，选择的F5株系种子按株系种植于莱西，观察结果数、抗逆性、果仁外观品质，在丰产性状好的株行选择单株，按株行对中选单株进行混收，获得F6代优异株系，编号P19-13。经检测P19-13株系花生油脂含量为55.30％。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
Claims (10)
1.一种花生优良性状的筛选方法，其特征在于，对花生的部分子叶进行截除，将截取的子叶用于性状测定，筛选出具有优良性状的花生。
2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述子叶的截除为，在远离花生胚芽一端，选取一片或者两片子叶进行截除。
3.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，截除的花生子叶长度小于等于花生种子总长度的1/4。
4.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，在对子叶进行截除时，保持与子叶呈90°垂直下切截除。
5.权利要求1～4任一项所述的筛选方法在培育优良性状花生中的应用。
6.一种具有优良性状的花生的培育方法，其特征在于，步骤如下：
(1)将母本花生与父本花生进行杂交，收获F1代种子；
(2)将F1代种植，剔除杂株，混收获得F2代种子；
(3)根据权利要求1所述的方法筛选出具有优良性状的F2代单粒种子，将筛选出来的种子进行种植，结合农艺性状和抗性收获F3代单株；
(4)F3代单株种子按照步骤(3)，筛选出具有优良性状的花生种子种植，结合农艺性状和抗性收获F4代单株；
(5)按常规育种进程完成F4-F6代选育。
7.根据权利要求6所述的培育方法，其特征在于，所述优良性状为高油含量、高油酸含量、以及高糖含量性状中的一种或几种。
8.根据权利要求7所述的培育方法，其特征在于，F2和F3代单粒种子高油、高油酸、高糖含量筛选标准分别为油脂含量≥50％，高油酸含量≥65％，总糖含量≥5％，F4-F6代株系高油、高油酸、高糖含量筛选标准分别为油脂含量≥55％，高油酸含量≥75％，总糖含量≥6％。
9.权利要求6～8任一项所述的培育方法，其特征在于，对截除子叶后的花生种子切口进行消毒处理，于无菌环境中放置8h以上，待切口自然干燥后，再进行种植。
10.权利要求6～8任一项所述的培育方法，其特征在于，截除子叶后的花生种子，于种植前7天，在室内进行种子萌发，待种子露白，根伸长约1.5cm移栽至大田，保证成活率。
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