CN114763568A - 一种酶法制备甘油二酯的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种酶法制备甘油二酯的方法，属于油脂加工领域。本发明油脂在有机溶剂体系下，以一定比例在一定温度下加入脂肪酶进行酶促反应，反应一段时间后去除酶和有机试剂，经纯化步骤，得到甘油二酯，其中，所述有机溶剂为乙醇，或乙醇与二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮中的一种或多种混合而成的溶剂。本发明采用非水相体系进行酶法醇解制备甘油二酯，有机溶剂的加入可以有效提高酶的催化效率，从而提高反应效率及产物得率，抑制产物的酰基转移。且有机溶剂均可进行回收利用，所用到的脂肪酶，可以重复再利用多次，显著降低生产成本，具有能耗低、绿色环保、副产物少的优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种酶法制备甘油二酯的方法，属于油脂加工领域。
背景技术
甘油二酯(Diacylglycerol,DAG)是天然油脂中的一种成分，在大多数动植物油脂中含量都较低，即便在含量较高的棕榈油中含量也不超过10％。现代人类能量过剩的问题突出，健康油脂的开发者们一直在寻找一些不同于日常食用油脂的脂质来作为替代品。研究发现DAG具有减脂能力，能降低动物体内脂肪的积累，从而有效阻止动物增加肥胖。此后许多科研工作者开始广泛的关注DAG，并通过一系列的动物实验与人体实验证明了DAG与日常食用油脂相比具有独特的生理功能。研究表明，食用DAG不仅可以抑制内脏脂肪堆积，也能降低餐后血清中甘油三酯和胆固醇的浓度，同时调节血清中葡萄糖水平。而且与其他脂肪替代物不同的是，DAG是油脂的天然成分，其口感、风味与普通膳食脂肪几乎相同。此外，由于DAG的两亲性，其在食品工业中被广泛用作乳化剂如用于沙拉酱、蛋黄酱和饮料等产品。
天然存在的DAG有两种形式，根据空位羟基的位置不同分为1,2-DAG与1,3-DAG两种异构体。1,2-DAG可以调节心肌收缩力，控制心肌肥大，以维持糖尿病人正常的血管功能，且可以作为细胞因子刺激白细胞向感染部位迁移，促进伤口的愈合，消除炎症。此外，纯的1,2-DAG还可用于合成大量兴奋剂和拮抗剂，以及作为合成结构甘油三酯的中间体。
DAG的制备大都以动植物油或甘油与脂肪酸为原料，通过水解、酯化、转酯化、酸解、醇解等反应制备出不同DAG含量的产品。常用的DAG的制备方法主要有三种：水解法、甘油解法与酯化法。水解法是最简便的制备DAG的方法，以精炼动植物油为原料选用sn-1,3位特异性脂肪酶对动植物油脂进行水解反应，通过控制水解程度得到富含DAG的产品，通常此法制得的油脂中DAG得率较低，分子蒸馏纯化后DAG含量通常不超过60％，工业化废水严重。甘油解法对反应条件及酶的要求较高，且产品得率通常较低，不超过50％(Li Y.,ZhongN.,Cheong L.Z.,et al.Immobilization of Candida antarctica Lipase B ontoorganically-modified SBA-15for efficient production of soybean-based mono anddiacylglycerols[J].International journal of biological macromolecules,2018,120:886-895.Zhang Z.,Ma X.,Huang H.,et al.Enzymatic production of highlyunsaturated monoacyglycerols and diacylglycerols and their emulsifyingeffects on the storage stability of a palm oil based shortening system[J].Journal of the American Oil Chemists'Society,2017,94:1175-1188.)；酯化法生产过程中不会生成过多的TAG，故纯化后能够得到高纯度的DAG，但是其工艺较为复杂，需要先制备得到脂肪酸，会一定程度的增加制备成本与反应控制难度。因此，开发一种高效率、高得率、过程简单、产物综合利用度高的制备工艺是DAG工业化未来的发展方向。本发明采用的醇解法DAG得率较高，绿色环保且高效，其中所用溶剂均可回收重复利用，有很大的工业化价值。
发明内容
[技术问题]
现有DAG的制备方法往往存在DAG收率低、工艺复杂、成本高或反应难以控制等问题。
[技术方案]
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种绿色高效的酶催化制备高纯度、高产量的甘油二酯的方法，本发明通过在醇解法中加入有机溶剂的方法，可以有效提高酶的催化效率，从而提高反应效率及产物得率。
为实现上述发明目的，本发明提供了如下技术方案：
一种酶法制备甘油二酯的方法，所述方法包括：油脂在有机溶剂体系下，以一定比例在一定温度下加入脂肪酶进行酶促反应，反应一段时间后去除酶和有机溶剂，经纯化步骤，得到甘油二酯，其中，所述有机溶剂为乙醇，或乙醇与二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮中的一种或多种混合而成的溶剂。
在一个或多个实施方案中，所述反应温度为25℃～45℃，优选25℃～40℃。
在一个或多个实施方案中，所述反应时间为1.5h～10h，优选2h～8h。
在一个或多个实施方案中，所述油脂是指天然油脂，包括植物油、微生物油、动物油脂、藻油及其分提物中的一种或几种。
在一个或多个实施方案中，所述植物油包括但不限于玉米油、大豆油、葵花籽油、亚麻籽油、紫苏籽油等。所述微生物油包括但不限于高山被孢霉油等。
在一个或多个实施方案中，所述酶促反应的体系水分活度为0～0.55，优选0.1～0.6。
在一个或多个实施方案中，所述油脂和乙醇的摩尔比为1:60～1:10，优选1:50～1:30。
在一个或多个实施方案中，所述油脂与有机溶剂(除乙醇外)的比例为1:3～1:0.5(g/mL)。
在一个或多个实施方案中，所述脂肪酶是指以南极假丝酵母(Candidaantarctica)以及疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginose)为来源的脂肪酶。
在一个或多个实施方案中，所述脂肪酶包括Novozym 435、Lipozyme 435、LipaseCL“Amano”IM、Lipozyme TL IM、Lipase TL 100L中的一种或多种。
在一个或多个实施方案中，所述脂肪酶的添加量(相对于油脂的质量分数)为3％～15％。
在一个或多个实施方案中，所述纯化步骤包括分子蒸馏，其中，分子蒸馏的条件为：蒸发器温度100℃～180℃，真空度5Pa～28Pa。
本发明还提供了上述制备方法在油脂加工中的应用。
本发明的有益效果：
本发明采用非水相体系进行酶法醇解制备甘油二酯，有机溶剂的加入可以有效提高酶的催化效率，从而提高反应效率及产物得率，抑制产物的酰基转移。且有机溶剂均可进行回收利用，所用到的脂肪酶，可以重复再利用多次，显著降低生产成本，具有能耗低、绿色环保、副产物少的优点。
附图说明
图1为本发明酶促醇解制备富甘油二酯得到的液相色谱图(示差检测器)，其中，a为对比例1的条件下以正己烷+乙醇为溶剂得到的反应产物的甘油酯组成，b为对比例1中以叔丁醇+乙醇为溶剂得到的反应产物的甘油酯组成，c为对比例2中以丙酮为溶剂得到的反应产物的甘油酯组成，d为实施例1中以丙酮+乙醇为溶剂得到的反应产物的甘油酯组成。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述，但本发明的实施方式不限于此。
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
需要说明的是，若该酶促反应的反应物完全反应，得到的反应产物中甘油二酯的最大摩尔含量为50％，最大质量含量约为66.67％。
酶促反应式如下：
实施例1：(溶剂种类)
将原料(包括乙醇及有机溶剂)与稳定的饱和硝酸镁溶液放入同一密闭容器中放置24h，调节水分活度为0.53。将2.2mmol(1.9g)大豆油与87mmol(4g)无水乙醇混合，加入2mL有机溶剂以及脂肪酶Lipozyme TL IM，酶添加量(相对于油脂的质量分数)为8％，在30℃下进行酶促反应，磁力搅拌400r/min反应8h。反应结束后离心，转速为4000r/min，取上清液，经HPLC-RID检测得到反应粗产物中脂质组成，计算甘油二酯的得率(以下得率均按质量得率计算)，结果如表1所示。可见，当加入丙酮、三氯甲烷或二氯甲烷与乙醇混合作为有机溶剂时，均能提高甘油二酯的得率，尤其当加入丙酮时，甘油二酯的得率可达64.66％，较单独用乙醇提高了22.6％，得到了明显的提高。而当加入正己烷(对比例1)和叔丁醇(对比例2)与乙醇混合作为反应溶剂时，甘油二酯的得率则出现了明显的下降。可见，不同溶剂的加入会明显影响甘油二酯的生成。
表1.醇解反应中不同有机溶剂的种类对甘油二酯得率的影响
实施例2：(溶剂添加量)
将原料(包括乙醇及有机溶剂)与稳定的饱和硝酸镁溶液放入同一密闭容器中放置24h，调节水分活度为0.53。将2.2mmol(1.9g)大豆油与87mmol无水乙醇混合，加入一定量的丙酮以及脂肪酶Lipozyme TL IM，酶添加量(相对于油脂的质量分数)为8％，在30℃下进行酶促反应，磁力搅拌400r/min反应8h。反应结束后离心，转速为4000r/min，取上清液，经HPLC-RID检测得到反应粗产物中脂质组成，计算甘油二酯的得率，结果如表2所示。
表2.醇解反应中不同有机溶剂的添加量对甘油二酯得率的影响
| 溶剂加量 | 1mL | 2mL | 3mL |
| 甘油二酯得率 | 57.69％ | 64.66％ | 60.24％ |
实施例3：(水分活度)
将原料(包括乙醇及有机溶剂)与稳定的饱和无机盐溶液放入同一密闭容器中放置24h，调节水分活度。将2.2mmol(2.0g)高山被孢霉微生物油与87mmol无水乙醇混合，加入2mL丙酮以及脂肪酶Lipozyme TL IM，酶添加量(相对于油脂的质量分数)为8％，在30℃下进行酶促反应，磁力搅拌400r/min反应8h。反应结束后离心，转速为4000r/min，取上清液，经HPLC-RID检测得到反应粗产物中脂质组成，计算甘油二酯的得率，结果如表3所示。可见，不同的水分活度对甘油二酯的得率有较明显的影响，水分活度过高会明显降低甘油二酯的得率。
表3.醇解反应中不同水分活度对甘油二酯得率的影响
| 水分活度 | 0.11 | 0.33 | 0.43 | 0.53 | 0.97(对比例3) |
| 甘油二酯得率 | 49.99％ | 55.94％ | 62.74％ | 66.89％ | 34.43％ |
实施例4：(底物摩尔比)
将原料(包括乙醇及有机溶剂)与稳定的饱和硝酸镁溶液放入同一密闭容器中放置24h，调节水分活度为0.53。将2.2mmol(2.0g)高山被孢霉微生物油与一定量的无水乙醇混合，加入2mL丙酮以及脂肪酶Lipozyme TL IM，酶添加量(相对于油脂的质量分数)为15％，在30℃下进行酶促反应，磁力搅拌400r/min反应2h。反应结束后离心，转速为4000r/min，取上清液，经HPLC-RID检测得到反应粗产物中脂质组成，计算甘油二酯的得率，结果如表4所示。
表4.醇解反应中不同底物摩尔比对甘油二酯得率的影响
实施例5：(酶的种类)
将原料(包括乙醇及有机溶剂)与稳定的饱和硝酸镁溶液放入同一密闭容器中放置24h，调节水分活度为0.53。将2.2mmol(1.9g)亚麻籽油与87mmol无水乙醇混合，加入2mL的丙酮以及脂肪酶，酶添加量(相对于油脂的质量分数)为8％，在30℃下进行酶促反应，磁力搅拌400r/min反应8h。反应结束后离心，转速为4000r/min，取上清液，经HPLC-RID检测得到反应粗产物中脂质组成，计算甘油二酯的得率，结果如表5所示。
表5.醇解反应中不同酶的种类对甘油二酯得率的影响
| 酶的种类 | Lipozyme 435 | Lipozyme TL IM | Lipase TL 100L | Lipase CL“Amano”IM |
| 甘油二酯得率 | 46.57％ | 65.71％ | 63.88％ | 62.50％ |
实施例6：(反应温度)
将原料(包括乙醇及有机溶剂)与稳定的饱和硝酸镁溶液放入同一密闭容器中放置24h，调节水分活度为0.53。将2.2mmol(2.0g)藻油与87mmol无水乙醇混合，加入2mL的丙酮以及脂肪酶Lipozyme TL IM，酶添加量(相对于油脂的质量分数)为8％，在一定温度下进行酶促反应，磁力搅拌400r/min反应8h。反应结束后离心，转速为4000r/min，取上清液，经HPLC-RID检测得到反应粗产物中脂质组成，计算甘油二酯的得率，结果如表6所示。
表6.醇解反应中不同反应温度对甘油二酯得率的影响
| 反应温度 | 25℃ | 30℃ | 35℃ |
| 甘油二酯得率 | 60.18％ | 66.48％ | 63.01％ |
实施例7：(酶的添加量及时间)
将原料(包括乙醇及有机溶剂)与稳定的饱和硝酸镁溶液放入同一密闭容器中放置24h，调节水分活度为0.53。将2.2mmol(2.0g)高山被孢霉微生物油与87mmol无水乙醇混合，加入2mL的丙酮以及脂肪酶Lipozyme TL IM，在30℃下进行酶促反应，磁力搅拌400r/min反应一定时间。反应结束后离心，转速为4000r/min，取上清液，经HPLC-RID检测得到反应粗产物中脂质组成，计算甘油二酯的得率，结果如表7所示。
表7.醇解反应中不同酶添加量及反应时间对甘油二酯得率的影响
*不同的酶添加量需要相应调整反应时间以得到较优效果。
实施例8：
(1)酶促醇解制备甘油二酯
条件与实施例7一致。
(2)分子蒸馏纯化甘油二酯
将反应粗产物进行二级分子蒸馏，具体操作条件为：进料温度60℃，进料速度2g/min，刮膜速度300rpm，蒸发器温度160℃，真空度为10Pa，冷凝温度25℃。收集富含甘油二酯的分子蒸馏重相，经HPLC-RID检测得到反应粗产物中脂质组成，得到甘油二酯的含量为66.48％。
对比例1：(与实施例1对比)
加入2mL正己烷作为有机溶剂，其他条件与实施例1一致。得到的反应产物中甘油二酯得率为27.27％。
加入2mL叔丁醇作为有机溶剂，其他条件与实施例1一致。得到的反应产物中甘油二酯得率为12.78％。
与添加其他溶剂的方案对比见表1，粗产物的脂质组成见图1。
对比例2：(与实施例1对比)
反应体系中不添加乙醇，加入7mL丙酮作为反应溶剂，其他条件与实施例1一致。得到的反应产物中甘油二酯得率为39.40％。
与添加其他溶剂的方案对比见表1，粗产物的脂质组成见图1。
对比例3：(与实施例3对比)
采用饱和硫酸钾溶液控制水分活度为0.97，其他条件与实施例3一致。得到的反应产物中甘油二酯得率为34.43％。与其他水分活度的对比见表3。
对比例4：(与实施例5对比)
加入脂肪酶Lipozyme DF IM，酶添加量(相对于油脂的质量分数)为8％，其他条件与实施例5一致。得到的反应产物中甘油二酯得率为0。
对比例5：(与实施例5对比)
加入脂肪酶Lipozyme RM IM，酶添加量(相对于油脂的质量分数)为8％，其他条件与实施例5一致。得到的反应产物中甘油二酯得率为6.88％。Lipozyme RM IM在醇解反应中催化活性较低，此结果与祝雨筱(祝雨筱.1,2-甘油二酯的酶法合成[D].江南大学.)、操丽丽(操丽丽,姜绍通,寿佳菲,等.两步酶法合成MLM型结构脂质中醇解反应研究[J].食品科学,2012,33(20):65-68)等研究结论一致。
对比例6：(与实施例7对比)
酶添加量(相对于油脂的质量分数)为8％，反应时间为1.5h，其他条件与实施例7一致。得到的反应产物中甘油二酯得率为39.68％。
酶添加量(相对于油脂的质量分数)为15％，反应时间为9h，其他条件与实施例7一致。得到的反应产物中甘油二酯得率为33.60％。
与其他条件的对比见表7。
可以看出添加不同的酶量后，需要相应调整反应时间以得到较优的反应效果，否则会出现反应程度不足或过度的情况，导致甘油二酯的得率大幅降低。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (10)
1.一种酶法制备甘油二酯的方法，其特征在于，所述方法包括：油脂在有机溶剂体系下，以一定比例在一定温度下加入脂肪酶进行酶促反应，反应一段时间后去除酶和有机溶剂，经纯化步骤，得到甘油二酯，其中，所述有机溶剂为乙醇，或乙醇与二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮中的一种或多种混合而成的溶剂。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应温度为25℃～45℃，优选25℃～40℃；所述反应时间为1.5h～10h，优选2h～8h。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述油脂是指天然油脂，包括植物油、微生物油、动物油脂、藻油及其分提物中的一种或几种。
4.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，所述酶促反应的体系水分活度为0～0.55，优选0.1～0.5。
5.根据权利要求1～4任一项所述的方法，其特征在于，所述油脂和乙醇的摩尔比为1:60～1:10；所述油脂与除乙醇外的有机溶剂的比例为1:3～1:0.5(w/v)。
6.根据权利要求1～5任一项所述的方法，其特征在于，所述脂肪酶是指以南极假丝酵母(Candida antarctica)以及疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginose)为来源的脂肪酶。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述脂肪酶包括Novozym 435、Lipozyme435、Lipase CL“Amano”IM、Lipozyme TL IM、Lipase TL 100L中的一种或多种。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述脂肪酶的添加量为油脂的质量的3％～15％。
9.根据权利要求1～8任一项所述的方法，其特征在于，所述纯化步骤包括分子蒸馏，其中，分子蒸馏的条件为：蒸发器温度100℃～180℃，真空度5Pa～28Pa。
10.权利要求1～9任一项所述的方法在油脂加工中的应用。
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