CN114762732A

CN114762732A - 控释微球及其抗衰老的用途

Info

Publication number: CN114762732A
Application number: CN202110043344.0A
Authority: CN
Inventors: 邝纬阳; 林庭匡
Original assignee: Mengqian Technology Intellectual Property Co ltd
Current assignee: Mengqian Technology Intellectual Property Co ltd
Priority date: 2021-01-13
Filing date: 2021-01-13
Publication date: 2022-07-19

Abstract

本发明涉及一种控释微球及其抗衰老的用途。具体而言，本发明提供一种控释微球，其包含海藻酸钙水凝胶、表达和分泌碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和一种或多种抗衰老化合物，其中所述海藻酸钙水凝胶包封所述枯草芽孢杆菌和所述抗衰老化合物。本发明还提供了制备该控释微球的方法以及使用其来预防或治疗衰老或与衰老相关的疾病或病症的方法。通过本发明的控释微球递送的抗衰老活性化合物例如NMN和hbFGF具有更好的体内吸收能力和生物利用率。

Description

控释微球及其抗衰老的用途

技术领域

本发明一般地涉及控释微球，更具体地涉及包封抗衰老活性物质的控释微球以及制备控释微球的方法和将其用于抗衰老的方法。

背景技术

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)是由烟酰胺单核苷酸(NMN)产生的、用于线粒体内细胞呼吸的辅因子。有证据表明，NMN可以提高NAD+和NADH的水平，并改善衰老和与年龄相关的疾病的迹象。另一方面，人碱性成纤维细胞生长因子(hbFGF)是一种经过充分验证的抗衰老细胞因子，其可以促进未分化的人胚胎干细胞和人间充质干细胞的增殖，并参与多种生物学过程，包括血管生成、软骨形成和细胞存活。

口服给药对药物递送具有多种优势，包括消除可能的感染、廉价使用和避免给药过程中的不适感。然而，现有含NMN的口服制剂的人体吸收率较低，而口服给药含肽和蛋白质的活性成分一直是一个长期的挑战，因为它们的尺寸大且易被酶降解。

在本领域中，对于能够有效递送烟酰胺单核苷酸和含肽活性成分的口服制剂存在需求。

发明内容

在一个方面，本公开提供了一种控释微球，其包含海藻酸钙水凝胶、表达和分泌碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和一种或多种抗衰老化合物，其中所述海藻酸钙水凝胶包封所述枯草芽孢杆菌和所述抗衰老化合物。

在一个实施方案中，海藻酸钙水凝胶由海藻酸钠和钙盐例如氯化钙制备。

在一个实施方案中，所述微球通过下列步骤获得：(a)提供钙盐例如氯化钙的水溶液；(b)提供包含所述枯草芽孢杆菌和所述抗衰老化合物的海藻酸钠溶液；和(c)将所述海藻酸钠溶液滴加到所述钙盐例如氯化钙的水溶液中并混合以获得所述微球。

在一个实施方案中，在步骤(b)中，通过将所述枯草芽孢杆菌与海藻酸钠溶液混合，然后向得到的混合物添加所述抗衰老化合物，并任选地进行均质化，以获得所述包含所述枯草芽孢杆菌和所述抗衰老小分子化合物的海藻酸钠溶液。

在一个实施方案中，枯草芽孢杆菌包含表达载体，所述表达载体包含插入物，所述插入物从5’端到3’端包含编码短肽亲和标签、来源于鱼腥藻属(Anabaena sp.)的反式剪接内含肽、以及bFGF的多核甘酸序列，其中所述短肽亲和标签作为所述反式剪接内含肽的N-端外显肽，并且所述bFGF作为所述反式剪接内含肽的C-端外显肽。

在一个实施方案中，内含肽为鱼腥藻属DNA聚合酶III单元的内含肽(Asp DnaE)，优选地，所述内含肽包含与SEQ ID NO:2具有至少75％序列同一性的氨基酸序列或所述内含肽由SEQ ID NO:2所示的序列组成。

在一个实施方案中，所述短肽亲和标签具有约4-15个氨基酸的长度，例如是5-15xHis标签，尤其是6x His标签。

在一个实施方案中，所述bFGF是人bFGF。

在一个实施方案中，所述抗衰老化合物是增加烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)含量的化合物或减少NAD消耗的化合物或其组合。

在一个实施方案中，所述增加烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)含量的化合物选自烟酸核苷、烟酰胺核苷(NR)、烟酸单核苷酸、烟酰胺单核苷酸(NMN)、及其组合。

在一个实施方案中，所述减少NAD消耗的化合物是Sirt1激动剂，优选地，所述Sirt1激动剂选自白藜芦醇、槲皮素、SRT2104、SRT1460、紫铆因、非瑟酮、异烟酰胺(IsoNAM)、白皮杉醇、及其组合。

在一个方面，本公开提供了一种膳食补充剂或药物组合物，其包含本文描述的控释微球，任选地，所述膳食补充剂或药物组合物具有胶囊的形式。

在一个方面，本公开提供了一种制备本文描述的控释微球的方法，所述方法包括：(a)提供钙盐例如氯化钙的水溶液；(b)提供包含表达和分泌碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的枯草芽孢杆菌和一种或多种抗衰老化合物的海藻酸钠溶液；和(c)将所述海藻酸钠溶液滴加到所述钙盐例如氯化钙的水溶液中并混合以获得所述微球，其中任选地，在步骤(b)中，通过将所述枯草芽孢杆菌与海藻酸钠溶液混合，然后向得到的混合物添加所述抗衰老化合物，并任选地进行均质化，以获得所述包含所述枯草芽孢杆菌和所述抗衰老化合物的海藻酸钠溶液。

在一个方面中，本公开提供了一种治疗或预防衰老或与衰老相关的疾病或病况的方法或一种非治疗性的抗衰老方法，所述方法包括向受试者施用本文描述的控释微球、膳食补充剂或药物组合物。

附图说明

图1示出了根据本发明的一个实施方案的表达H6-DnaE-bFGF插入物表达盒的质粒构建载体(10.4kb)的示意图。ori＝枯草芽孢杆菌的复制起点；AmpR＝氨苄青霉素抗性基因；lacI＝lacI基因；T7 RNAP＝T7核糖核酸聚合酶基因；bFGF＝bFGF基因；Asp DnaE＝AspDnaE内含肽；H6＝6x His标签；RBS＝核糖体结合位点。箭头指示基因表达的方向。

图2示出了构建体pECBS1-H6-DnaE-bFGF的酶切鉴定结果。

图3示出了微球控制释放系统(MCRS)的示例性制备过程。将活性成分均质化并与1％的无菌海藻酸钠溶液混合。经由自动微注射器系统逐滴添加该混合物至1％CaCl₂溶液，并在室温下与其进一步混合1小时。收集MCRS产物，并在40℃、35％湿度下干燥。

图4示出了MCRS的机制。海藻酸-钙微球包封的活性成分可以承受低pH值，并且仅在碱性环境下降解。活性成分可以被微球保护而不受胃液的损害，并最终通过胃肠系统到达肠道。在最佳的碱性环境下，海藻酸盐-Ca复合物可以逐渐降解，释放出活性成分并被肠道充分吸收。

图5示出了MCRS在SIF中的表现。

图6示出了服用MCRS后志愿者血液的NAD+水平。在服用NR、NMN和MCRS后，分别监测不同志愿者血液的NAD+水平3小时。在服用市售NR产品后，志愿者的血液NAD+水平略有增加。而服用市售NMN产品后，NAD+水平没有明显变化。相比之下，服用本发明的MCRS后，志愿者的血液NAD+水平呈稳定上升趋势，并在3小时后才下降。

图7示出了服用MCRS后志愿者血液的蛋白质印迹结果。在服用MCRS后，检查志愿者血液循环的bFGF水平。如图7所示，在蛋白质印迹法下检测到循环的bFGF水平显著增加。

具体实施方式

以下提供对可用于有效递送抗衰老小分子化合物例如烟酰胺单核苷酸和抗衰老含肽活性成分例如hbFGF的口服制剂的描述。这些口服制剂满足了本领域中存在的至少一项需求。

本文中所用章节标题仅用于组织目的，不应理解为以任何方式限制所述主题。

除非另有明确定义，否则本文中所用术语应根据其在本领域中的通常含义来理解。除非文中另有规定或指示，否则没有数量词修饰的名词表示一个/种或更多个/种。

标准技术和流程通常根据本领域的常规方法和多种一般参考文献来进行(通常可参见，Sambrook et al.Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd ed.(1989)ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.)。

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施方案及实施方案中的特征可以相互组合。

本公开提供了一种一种新型补充剂的开发，该补充剂包含包封一种或多种抗衰老活性物质，例如烟酰胺单核苷酸(NMN)和分泌人碱性成纤维细胞生长因子(hbFGF)的枯草芽孢杆菌。

在本公开中，发明人设计了一种能够有效递送抗衰老活性物质的缓释系统，称为微球控释系统(MCRS)。该系统包括使用海藻酸盐来形成微球以及使用枯草芽孢杆菌(B.subtilis)作为蛋白质载体。不意图受任何理论的限制，由海藻酸盐包封抗衰老活性化合物例如NMN和表达hbFGF的枯草芽孢杆菌形成的微球限制了活性成分在胃中的释放，并且仅利于它们在肠道中的释放。hbFGF随后从枯草芽孢杆菌中分泌出来并被肠道吸收。发明人已经证明通过本公开的MCRS系统，抗衰老活性化合物例如NMN和hbFGF比其他商业NMN产品具有更好的体内吸收能力和生物利用率。此外，能够同时有效递送不同类型(例如小分子化合物和多肽)的抗衰老物质也是十分有益的，原因至少在于不同类型的抗衰老物质之间存在的互补和/或协同作用以及服用的便利性和依从性；并且同时递送两种性质显著不同的抗衰老物质并不总是容易的，因为不同类型的物质由于性质不同从而对于递送系统的要求不同。而且，可通过包封表达hbFGF的枯草芽孢杆菌而不是包封hbFGF来有效递送hbFGF并显著提高血液循环hbFGF水平是令人惊讶的。此外，不意图受理论的限制，相信本公开的MCRS系统能够显著提高抗衰老活性化合物(尤其是NMN)的生物利用率至少部分可归因于同时包封的表达hbFGF的枯草芽孢杆菌。

微球控释系统MCRS

如本文所使用，术语“微球控释系统”是指一种含有包封活性成分的微球(或微胶囊，在本文中，两者可互换使用)的控制释放或缓释制剂。在一些实施方案中，MCRS呈胶囊的形式，而微球被包封于胶囊内。在口服施用后，胶囊在与胃液接触后降解并释放其中的微球。微球能够抵抗胃液并安全地到达肠道而不受到损害。然后，微球在肠道中被肠液逐渐降解，从而以恒定的速率释放出活性成分，最后被肠绒毛吸收。

在一个实施方案中，本公开的控释微球是海藻酸盐控释微球。在一个实施方案中，本公开的微球可通过滴加法制备。更具体地，本公开提供了一种制备控释微球的方法，所述方法包括：(a)提供二价金属盐包括钙盐例如氯化钙的水溶液；(b)提供包含活性成分的海藻酸钠溶液(例如海藻酸钠水溶液)，任选地，所述活性成分与海藻酸钠溶液被均质化；和(c)将所述海藻酸钠溶液滴加到所述二价金属盐的水溶液中并混合以获得所述微球。

在一个实施方案中，采用标准的直接包埋法进行微球的制备。具体地，通过注射器例如自动微注射器系统将在海藻酸盐(例如海藻酸钠)溶液中的活性成分(优选经均质化)逐滴添加到二价金属盐的水溶液，使其与二价金属离子(例如钙离子)结合形成海藻酸盐-二价金属离子配合物(例如海藻酸盐-钙复合物)，从而形成海藻酸盐(例如海藻酸钙)水凝胶结构，从而形成包封活性成分的微球。在一些实施方案中，逐滴添加在搅拌的同时进行。在一些实施方案中，在适当的温度和湿度(例如30-45℃和30％-40％湿度下，诸如40℃、35％湿度)下干燥所获得的微球，以避免或减少活性成分的变性或降解。在一些实施方案中，将干燥的产物进一步包封入胶囊中，以允许在室温下储存。

在一些实施方案中，与活性成分混合的海藻酸盐溶液(例如水溶液)包含0.1％-10％(w/v)的海藻酸盐，例如0.2％-9％、0.3％-8％、0.4％-7％、0.5％-6％、0.6％-5％、0.7％-4％、0.8％-3％、0.9％-2％、或1％(w/v)。在一些实施方案中，海藻酸盐是海藻酸钠。海藻酸钠是从褐藻类的海带或马尾藻中提取的一种多糖碳水化合物，是由1,4-聚-β-D-甘露糖醛酸(M)和a-L-古罗糖醛酸(G)组成的一种线型共聚物，是海藻酸衍生物中的一种，因此也褐藻酸钠或海藻胶。每个海藻酸钠分子中都含有能与多种金属离子反应形成凝胶的羧基和羟基。将海藻酸钠加入含钙离子的介质中，钙离子将置换海藻酸钠中的钠离子而转化为海藻酸钙分子。钙离子把体系中的分子连在一起，形成三维网状结构，被称为“鸡蛋箱”结构。

在一些实施方案中，二价金属盐溶液(例如水溶液)是钙盐溶液，优选地，氯化钙溶液。在一些实施方案中，二价金属盐溶液(例如水溶液)含有0.1％-10％(w/v)的二价金属盐，例如0.2％-9％、0.3％-8％、0.4％-7％、0.5％-6％、0.6％-5％、0.7％-4％、0.8％-3％、0.9％-2％、或1％(w/v)。

在一些实施方案中，本公开的枯草芽孢杆菌以细胞沉淀的形式先与海藻酸盐溶液混合，然后将抗衰老小分子化合物加入所得的混合物中，并任选地进行均质化，从而获得包含活性成分的海藻酸盐溶液，用于随后的逐滴添加到二价金属盐溶液(例如水溶液)中。

抗衰老化合物

在一些实施方案中，可用于本公开的抗衰老化合物是小分子化合物，其优选地选自增加烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)含量的化合物或减少NAD消耗的化合物或其组合。

NAD含量的增加可通过合成NAD来实现。NAD可通过3种主要途径合成，即其中NAD从色氨酸合成的从头途径、其中NAD通过再循环降解的NAD产物比如烟酰胺产生的NAD补救途径，和其中烟酰胺核苷通过烟酰胺核苷激酶转化为烟酰胺单核苷酸的烟酰胺核苷激酶途径。因此，本领域技术人员将理解，本公开的增加烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)含量的化合物可包括用于合成NAD的从头途径的中间体、NAD补救途径的中间体和烟酰胺核苷激酶途径的中间体中的一种或多种。

在一些实施方案中，增加烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)含量的化合物选自烟酸核苷、烟酰胺核苷(NR)、烟酸单核苷酸、烟酰胺单核苷酸(NMN)、及其组合。

在一些实施方案中，本公开考虑使用减少NAD消耗的化合物。本领域技术人员将理解，施用Sirt1激动剂可减少NAD消耗。因此，在一些实施方案中，减少NAD消耗的化合物是Sirt1激动剂。在进一步的实施方案中，Sirt1激动剂选自白藜芦醇、槲皮素、SRT2104、SRT1460、紫铆因、非瑟酮、异烟酰胺(IsoNAM)、白皮杉醇、及其组合，优选白藜芦醇和槲皮素。

在一些实施方案中，本公开的递送系统对于烟酰胺单核苷酸(NMN)是特别适合的，如图5的结果所示。

表达和分泌碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的枯草芽孢杆菌

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种革兰氏阳性细菌，由于不含内毒素，因此被FDA认为是“公认安全”(GRAS)的。

在一些实施方案中，本公开考虑表达和分泌碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的枯草芽孢杆菌。枯草芽孢杆菌能够稳定表达外源多肽，并且已被工程化以表达分泌的内源蛋白和外源蛋白。可通过包封表达和分泌bFGF的枯草芽孢杆菌而不是直接包封bFGF来有效递送bFGF并显著提高血液循环bFGF水平是令人惊讶的。

在一些实施方案中，本公开考虑使用内含肽来构建用于表达bFGF的表达载体，以进一步提高bFGF的表达效率。在一些实施方案中，可用于转化枯草芽孢杆菌的表达载体包含插入物，所述插入物从5’端到3’端包含编码短肽亲和标签、来源于鱼腥藻属的反式剪接内含肽、以及外源多肽的多核甘酸序列，其中所述短肽亲和标签作为所述反式剪接内含肽的N-端外显肽，并且bFGF作为所述反式剪接内含肽的C-端外显肽。

内含肽是能够从宿主蛋白上自切割并催化侧翼序列通过肽键连接的蛋白质元件。可用于本发明的内含肽可以是来源于鱼腥藻属的反式剪接内含肽。在一个实施方式中，内含肽可以是源自鱼腥藻属DNA聚合酶III单元的内含肽(Asp DnaE)。

如本文所使用，术语“反式剪接内含肽”是指具有反式剪切活性的内含肽。根据其存在形式，内含肽可分为整体内含肽和分离内含肽。前者的两个剪接区域共同存在于同一多肽片段上，而后者的两个剪接区域存在于不同的多肽片段上，从而被称为分离内含肽。整体内含肽进行顺式剪接作用，而分离内含肽进行反式剪接作用。分离内含肽也可称为反式剪接内含肽。

如本文所使用，术语“鱼腥藻属DNA聚合酶III单元的内含肽”是指来源于鱼腥藻属DNA聚合酶III单元的内含肽。在一个方面中，编码本发明的内含肽的核苷酸可具有或包含SEQ ID NO:1所示的序列或其互补序列，或者可具有或包含与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或以上的序列同一性的序列或其互补序列，或者可以由上述核苷酸序列组成。在一个方面中，所述内含肽可具有或包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，或者可具有或包含与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或以上的序列同一性的氨基酸序列，或者可以由上述氨基酸序列组成。

在一些实施方案中，bFGF可以是人成纤维细胞生长因子(hbFGF)。成纤维细胞生长因子是一类由约150-200氨基酸组成的多肽，以两种密切相关的形式存在，即碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)。在一个方面，本发明的bFGF可具有或包含SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，或者可具有或包含与SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或以上的序列同一性的核苷酸序列，或者可以由上述核苷酸序列组成。在一个方面中，本发明的bFGF可具有或包含可具有或包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，或者可具有或包含与SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或以上的序列同一性的氨基酸序列，或者可以由上述氨基酸序列组成。

如本文所使用，术语“亲和标签”、“纯化标签”和“蛋白标签”可互换使用，其是指重组蛋白制备过程中与目的蛋白融合表达的蛋白或多肽。亲和标签可用于促进目的蛋白的可溶性和稳定性，便于目的蛋白被检测和纯化。分子量相对较小的短肽亲和标签低于获得成熟和生物相同的(天然的)外源蛋白或多肽是有益的。

在一些实施方案中，可用于本公开的亲和标签可以是短肽亲和标签，其可具有约4-15个例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸的长度。在一些实施方式中，短肽亲和标签包括但不限于：HIS标签、HA标签(例如YPYDVP)、FLAG标签(例如DYKDDDDK)、HSV标签(例如QPELAPEDPED)、MYC标签(例如ILKKATAYIL或EQKLISEEDL)、V5标签(例如GKPIPNPLLGLDST)、Xpress标签(例如DLDDDDK或DLYDDDDK)、Thrombin标签(例如LVPRGS)、BAD(生物素受体域)(例如GLNDIFEAQKIEWHE)、因子Xa标签(例如IEGR或IDGR)、VSVG标签(例如YTDIEMNRLGK)、SV40 NLS标签(例如PKKKRKV或PKKKRKVG)、蛋白C标签(例如EDQVDPRLIDGK)、S标签(例如KETAAAKFERQHMDS)、SB1标签(例如PRPSNKRLQQ)等。在一个方面中，亲和标签可以是5-15x His标签，更具体地可以是6x His标签(H6)。

在一些实施方案中，本发明的短肽亲和标签作为反式剪接内含肽的N-端外显肽，并且bFGF作为反式剪接内含肽的C-端外显肽。在一个示例中，H6标签被融合至Asp DnaE内含肽的N末端，而bFGF被融合至Asp DnaE内含肽的C末端。

如本文所使用，术语“载体”、“表达载体”、“重组载体”和“重组系统”可互换使用，其用来指运载体，通过它可对多核苷酸或DNA分子进行操作或导入宿主细胞。载体可以是线性或环状多核苷酸，或者可以是大尺寸多核苷酸或任意其它类型的构建体，例如来自病毒基因组、病毒体或任意其它生物学构建体的DNA或RNA，其允许对DNA进行操作或将其导入细胞。

本领域技术人员将会理解，对可用的载体类型并无限制，只要所述载体可以是适于增殖，能够获得充足的多核苷酸或基因构建体的克隆载体，或在不同异源生物中适于纯化融合蛋白质的表达载体。在一个实施方式中，根据本发明的合适载体包括原核生物中的表达载体，诸如原核表达载体，包括但不限于：pET14、pET21、pET22、pET28、pET42、pMAL-2c、pTYB2、pGEX-4T-2、pGEX-6T-1、pQE-9、pBAD-his、pBAD-Myc、pECB系列载体、pRB系列载体等，例如pUC18、pUC19、Bluescript及其衍生物、mp18、mp19、pBR322、pBR374、pMB9、CoIE1、pCR1、RP4、噬菌体和“穿梭”载体(例如pSA3和pAT28)。

在一个实施方式中，本发明还考虑穿梭载体。如本文所使用，术语“穿梭载体”是一类可以在两种不同宿主细胞(例如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌)中复制和扩增的载体，从而使得能够将同一表达载体转化入不同的宿主细胞。本发明涉及的穿梭载体可以包括并不限于pECBS1。

载体组分通常可包括但不限于如下的一种或更多种表达控制元件：启动子、增强子、操纵子、核糖体结合位点以及转录终止序列等。

可用于本发明的示例性启动子可包括在原核生物中具有活性的启动子，例如T7启动子、phoA启动子、β-内酰胺酶和乳糖启动子系统、碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统、以及杂合启动子如tac启动子。

可用于本发明的示例性操纵子包括但不限于乳糖操纵子、阿拉伯糖操纵子、色氨酸操纵子等。乳糖操纵子是参与乳糖分解的一个基因群，由乳糖系统的阻遏物和操纵序列组成，使得一组与乳糖代谢相关的基因受到同步的调控。

如本文所使用，术语“核糖体结合位点”(ribosome binding site，简称RBS)，是指位于mRNA的起始密码子上游，在翻译起始时可用于结合核糖体的一段序列。

根据本发明的表达载体还可包含编码标记蛋白的多核苷酸。适于本发明的标记蛋白包括具有抗生素抗性或对其他毒性化合物具有抗性的蛋白。具有抗生素抗性的标记蛋白的实例包括磷酸化新霉素和卡那霉素的新霉素磷酸转移酶，或磷酸化潮霉素的hpt，或赋予对例如博莱霉素、链霉素、四环素、氯霉素、氨苄霉素、庆大霉素、遗传霉素(G418)、大观霉素或杀稻瘟菌素抗性的蛋白。在一个实例中，蛋白质赋予对氯霉素的抗性。例如，该蛋白质是一个来自大肠杆菌的基因，命名为CmR，如Nilsen et al，J.Bacteriol，178：3188-3193，1996中所述。

可使用本领域技术人员公知的标准技术，将编码bFGF的多核苷酸克隆入本发明的载体。例如，利用聚合酶链反应(PCR)产生编码目标多肽的多核苷酸。PCR操作方法是本领域已知的。

在一些实施方案中，本发明的核酸构建体可进一步包含位于插入物上游的第一克隆位点和位于插入物下游的第二克隆位点，其中第一克隆位点和第二克隆位点允许核酸构建体插入表达载体。

克隆位点允许克隆编码异源性多肽的多核苷酸。优选地，克隆位点组合在一起形成多克隆位点。如本文所使用，术语“多克隆位点”指包含一系列两个或更多个彼此相邻定位的限制内切核酸酶靶序列的核酸序列。多克隆位点包含限制内切核酸酶靶位，其允许具有平末端、黏性5’末端或黏性3’末端的片段插入。使用标准分子生物学方法进行目标多核苷酸的插入，例如，如Sambrook et al.(Sambrook et al.Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbour Laboratory Press,1989)和/或Ausubel etal.(Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience(1988)所描述。

如本文所使用，术语“限制性内切酶”或“限制性核酸内切酶”是指可以识别并附着特定的脱氧核苷酸序列，并对每条链中特定部位的两个脱氧核糖核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一类酶。切割方法是将糖类分子与磷酸之间的键结切断，进而于两条DNA链上各产生一个切口，且不破坏核苷酸与碱基。切割形式有两种，分别是可产生具有突出单股DNA的黏状末端，以及末端平整无凸起的平滑末端。由于断开的DNA片段可由DNA连接酶连接，因此染色体或DNA上不同的限制片段，得以经由剪接作用而结合在一起。可用于本发明的限制性内切酶可包括但不限于：EcoRI、PstI、XbaI、BamHI、HindIII、TaqI、NotI、HinfI、Sau3A、PovII、SmaI、HaeIII、AluI、SalI、Dra等。

连接核酸的方法对本领域技术人员是显而易见的，并描述于例如Sambrook etal.Molecular Cloning:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbour LaboratoryPress，1989和/或Ausubel et al.(编者),Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates以及Wiley-Interscience(1988)中。在一个实例中，利用连接酶(例如T4DNA连接酶)连接核酸。

在一些实施方案中，采用本发明的核酸构建体结构，枯草芽孢杆菌能够促进内含肽和外显肽的自动切割，并且可获得令人满意的天然外源多肽/蛋白的表达水平，从而有效提高bFGF的表达水平。

在一些方面中，本发明提供了一种获得转化的枯草芽孢杆菌的方法，其包括将枯草芽孢杆菌与本发明的表达载体在允许表达载体转化入枯草芽孢杆菌的条件下接触。本领域技术人员知晓并可根据表达载体和宿主细胞的类型调整合适的条件。

如本文所使用，术语“转化”意为将DNA作为染色体外元件或者通过染色体整合引入原核宿主中，以使DNA可以复制。取决于所使用的宿主细胞，使用对于此类细胞合适的标准技术进行转化。通常将使用氯化钙的钙处理用于含坚固的细胞壁屏障的细菌细胞。用于转化的另一方法使用聚乙二醇/DMSO。还使用的另一技术是电穿孔。

将本公开的枯草芽孢杆菌转化子培养于本领域已知的并且适合用于枯草芽孢杆菌培养的培养基中进行培养，以用于下一步的微球包封。合适的培养基的实例可包括添加了必需营养补充物的Luria-Bertani(LB)培养基。在一些实施方案中，培养基还含有选择剂，基于构建的表达载体进行选择，以选择性地允许含表达载体的原核细胞生长。例如，将氨苄青霉素和/或卡那霉素加入到用于细胞生长的培养基中，所述细胞表达氨苄青霉素和/或卡那霉素抗性基因。还可以以合适的浓度包括除碳、氮和无机磷源之外的任何必需补充物，其可以单独地或者以与另一补充物或培养基如复合氮源的混合物的形式引入。对于表达基因产物的聚积，在足以聚积基因产物的条件下培养宿主细胞。此类条件可包括例如，允许细胞表达和聚积蛋白质的温度、营养和细胞密度条件。此外，如本领域技术人员已知，此类条件是这样的条件，在该条件下细胞可以进行基本细胞功能，如转录、翻译，以及细胞内表达。在合适的温度培养原核宿主细胞。对于枯草芽孢杆菌培养，例如，一般的温度为约20℃至约39℃。在一个实施方案中，温度为约25℃至约37℃，如37℃。对于诱导，通常培养细胞直到达到确定的光密度，例如约80-100的A55tl，在此时开始诱导(例如，通过添加诱导物，通过耗竭阻遏物、抑制剂或培养基组分等)，以诱导编码异源多肽的基因的表达。

在一些实施方案中，本公开的枯草芽孢杆菌在微球到达肠道后随着微球的分解而释放，并分泌所表达的bFGF，而分泌的bFGF通过肠绒毛被吸收。

膳食补充剂或药物组合物

在一个方面，本公开提供了一种膳食补充剂或药物组合物，其包含本文所描述的控释微球或MCRS，以及任选地，生理学上可接受的载体。

在一些实施方案中，本公开的膳食补充剂或药物组合物包含合适的生理学上可接受的载体例如辅料，如本领域中已知的载体、赋形剂，包括缓冲剂。如本文所用，“生理学上可接受的载体”包括可用于本公开的微球的生理上相容的任何和全部介质。合适的赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、滑石、氯化钠、干燥的脱脂乳、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。对于赋形剂的使用及其用途，亦参见“Handbook of PharmaceuticalExcipients”,第五版,R.C.Rowe,P.J.Seskey和S.C.Owen,Pharmaceutical Press,London,Chicago。在一些实施方案中，本公开的膳食补充剂或药物组合物是片剂、丸剂或胶囊剂等形式。口服配制剂可以包含标准载体和/或赋形剂，如药用级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精。可以通过将本公开的微球与一种或多种任选的药用辅料(Remington’s Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol，A.编(1980))混合来制备包含本文所述的膳食补充剂或药物组合物。

抗衰老用途

在一些实施方案中，本公开提供了一种治疗或预防衰老或与衰老相关的疾病或病况的方法，其包括向受试者施用本公开的控释微球、MCRS、膳食补充剂或药物组合物。在一些实施方案中，本公开还提供了一种非治疗性的抗衰老方法，其包括向受试者施用本公开的控释微球、MCRS、膳食补充剂或药物组合物。具有衰老迹象或患有与衰老相关的疾病或病况或处于与衰老相关的疾病或病况的风险中受试者可被施用本公开的控释微球、MCRS、膳食补充剂或药物组合物，以治疗或预防衰老或与衰老相关的疾病或病况、或阻止衰老或延缓衰老或与衰老相关的疾病或病况的进展。

本公开的控释微球、MCRS、膳食补充剂或药物组合物可以方便地通过口服施用至有需要的受试者。在一些实施方案中，施用的剂量可以被调节或减少以控制潜在的副作用和/或毒性。本领域技术人员将会理解，合适的剂量可因受试者而变化。确定最佳剂量通常涉及治疗或健康益处水平与任何风险或有害副作用的平衡。所选择的剂量水平将取决于多种因素，包括但不限于施用时间、清除速率、治疗持续时间、其他联合使用的药物、病症的严重程度，患者的性别、年龄、体重、病情、一般健康状况和以前的病史等。最终的施用量最终由医生或临床医师决定，但通常选择剂量以达到实现所需效果的作用部位处的浓度，而不会导致实质性的有害或不利副作用。通常，本公开的控释微球、MCRS、膳食补充剂或药物组合物可以以各种剂量范围施用。在一些实施方案中，本文提供的控释微球、MCRS、膳食补充剂或药物组合物可以以约0.01mg/kg至约100mg/kg(例如约0.01mg/kg,约0.5mg/kg,约1mg/kg,约2mg/kg,约5mg/kg,约10mg/kg,约15mg/kg,约20mg/kg,约25mg/kg,约30mg/kg,约35mg/kg,约40mg/kg,约45mg/kg,约50mg/kg,约55mg/kg,约60mg/kg,约65mg/kg,约70mg/kg,约75mg/kg,约80mg/kg,约85mg/kg,约90mg/kg,约95mg/kg,或约100mg/kg)的有效量施用。在这些实施方案的某些中，控释微球、MCRS、膳食补充剂或药物组合物以约50mg/kg或更低的剂量施用，并且在这些实施方案中的某些中，剂量为10mg/kg或更低，5mg/kg或更低，1mg/kg或更低，0.5mg/kg或更低，或者0.1mg/kg或更低。在某些实施方案中，施用剂量可以在整个过程中改变。例如，在某些实施方案中，初始施用剂量可以高于后续施用剂量。在某些实施方案中，取决于受试者的反应，施用剂量可以在整个过程中变化。本领域技术人员可以确定施用频率，例如主治医生基于所治疗病症、所治疗受试者的年龄、所治疗病症的严重程度、所治疗受试者的一般健康状况等的考虑。在某些优选的实施方案中，涉及本公开的控释微球、MCRS、膳食补充剂或药物组合物的治疗过程将包含在数周或数月的时间内施用多剂量。更具体地说，本公开的控释微球、MCRS、膳食补充剂或药物组合物可以每天、每两天、每四天、每周、每十天、每两周、每三周或更长间隔施用。就此而言，可以理解的是，可以基于受试者响应和临床实践来改变剂量或者调整间隔。

如本文所使用，术语“给予”或“施用”指的是(1)由营养师或美容师或医师根据本公开提供、给予、给药和/或开具处方；和/或(2)根据本公开投入哺乳动物受试者例如人、被哺乳动物受试者例如人摄取或消耗。

本文使用的术语“治疗”和“预防”可涉及意图治愈、改善、稳定、预防或控制衰老、疾病、障碍或病理状况(例如与衰老相关)的疾病、障碍、损伤或病理状况的管理。

本发明中的示例性序列示于下表。

实施例

本文中通过以下实施例对本发明进行描述，其仅旨在举例说明，对本发明的范围并无限制。

细菌菌株和化学品

大肠杆菌菌株DH5α购自New England Biolabs(马萨诸塞州伊普斯维奇)。枯草芽孢杆菌WB800菌株描述于在先报道(Chau,Wu Kam,Kwong Wai Yeung,Joey Cho Yi Chauand Choi Man Chung,et al.“Expression of Human Basic Fibroblast Growth FactorMediated by Mini Intein in Bacillus Subtilis.”J Mol Genet Med 14(2020):463doi:10.37421/jmgm.2020.14.463)。合成的DNA片段、限制酶和针对bFGF的抗体购自Thermo Fisher Scientific(马萨诸塞州伊普斯威奇)。除非另有说明，所有其他化学品均购自Sigma-Aldrich(密苏里州圣路易斯)。

bFGF表达构建体的构建

大肠杆菌/枯草杆菌表达穿梭载体(pECBS1-H6-DnaE-bFGF)的构建方法如下：通过Thermo Fisher Scientific合成了一个编码EcoRI-T7启动子(T7)-乳糖操纵子(LacO)-核糖体结合位点(RBS)-6x-His标签(H6)-Asp-DnaE int-c(DnaE)-bFGF-T7转录终止子-XbaI序列的DNA片段，如SEQ ID NO:5所示。用EcoRI和XbaI消化前述合成的DNA片段，然后与枯草杆菌/大肠杆菌穿梭载体pECBS1连接。用同样的两种限制性内切酶被再次用于进一步的消化。最终获得pECBS1-H6-DnaE-bFGF构建体(参见图1)。所获得的构建体的酶切鉴定结果如图2所示。

分批补料发酵

枯草芽孢杆菌转化子在添加了25μg/ml卡那霉素的200ml 2x LB培养基中，37℃(转速250rpm)下生长，直到A600＝1.0。然后将50ml培养物转移到2L烧瓶(含有添加了25μg/ml卡那霉素的450ml 2x LB培养基)中，在温度为37℃(旋转250rpm)条件下继续培养，直到A600值达到1.0。将整个培养物接种到装有添加了25μg/ml卡那霉素的3.5L 2x LB培养基的5L发酵罐中。添加1M NaOH使培养物的pH保持在7.0。培养物中的pO₂值(氧分压)设置为1.5vvm。此外，当pH开始升高时，添加50％的葡萄糖进料溶液以将培养物的pH维持在7.0。之后，当A600＝8时，加入最终浓度为0.2mM IPTG进行诱导培养。用1M H₂SO₄维持pH调节。中间细胞冷冻储存(-20℃)。

海藻酸盐/活性成分/微胶囊的制备

采用标准的藻酸钙直接包埋法进行微胶囊/微球的制备。具体地，将10mL细胞沉淀形式的枯草芽孢杆菌转化子与40mL 1％(w/v)无菌藻酸Na水溶液混合。将混合物与其他活性成分(即β-烟酰胺单核苷酸(NMN)、烟酰胺核糖苷(NR)、白藜芦醇或槲皮素)混合并均质化。使用微注射器系统自动进行逐滴添加，将均质化的混合物在室温下加入1％(w/v)CaCl₂水溶液中，并连续搅拌1小时。通过在40℃、35％湿度条件下干燥获得干的微胶囊/微球。然后将干燥的产物进一步包封入胶囊中并在室温下储存。

肠内刺激条件下胶囊的体外释放速率

通过将如下适当量的成分溶解在去离子水中制成模拟肠液(SIF)的生物相关介质：3mM牛磺胆酸钠、0.2mM卵磷脂、19.1mM马来酸、34.8mM氢氧化钠和68.62mM氯化钠。通过将以下适当量的成分溶解在去离子水中制成模拟胃液(SGF)：237.02mM氯化钠、17.12mM乙酸、29.75mM乙酸钠以及足量的盐酸/氢氧化钠，pH 5。

为了模拟胃肠道的生理状况，将模拟肠液(SIF)和模拟胃液(SGF)维持在37℃，并通过以100rpm的速度摇动来促进运动。为了研究成分的释放，每个试验的每个胶囊首先在模拟胃模型中于37℃孵育2小时。之后，将实验混合物在模拟肠模型中于37℃孵育2小时。

分析方法和结果

用JENWAY UV-vis 7415分光光度计在特定波长下测定上清液(即模型中的SIF)(对于NMN(abs)：260nm；对于NR(abs)：280nm；对于槲皮素(abs)：370nm；对于白藜芦醇(abs)：308nm)。对于细菌控制释放实验，在无菌的0.9％NaCl中制备系列稀释液，并将100μL每种稀释液接种于营养琼脂平板上。将平板在有氧条件下于37℃孵育24小时。然后计数菌落，将胶囊中的细菌数表示为CFU/胶囊。所有样品一式三份制备，并计数包封前后上清液中的菌落形成单位(CFU)的数量。

微球控制释放系统(MCRS)

通过自动微注射器系统逐滴添加在海藻酸钠溶液中的均质活性成分，使其与钙离子结合，形成微球(图3)，并在适当的温度和湿度下进行干燥，以避免活性成分的变性或降解。微球能够抵抗胃液并安全地到达肠道而不受到损害。微球可容易被肠液在肠道中逐渐降解，从而以恒定的速率释放出活性成分NMN、bFGF、槲皮素和白藜芦醇，最后被肠绒毛吸收(图4)。

MCRS在SIF中的表现

通过分光光度法测定在SIF处理下MCRS释放的NMN、NR、槲皮素和白藜芦醇的水平(图5)。MCRS释放的NMN水平显示出相对于直接给予NMN增加了30％。对于NR、槲皮素和白藜芦醇，MCRS的释放水平也高于直接给药，这表明MCRS系统可以提高NMN、NR、槲皮素和白藜芦醇的生物利用度。从图5还可以看出，本公开的MCRS对于NMN生物利用度的提高显著高于对于NR、槲皮素和白藜芦醇生物利用度的提高，这也是进一步令人惊讶的和意想不到的。

血液循环NAD+水平

在志愿者服用NR、NMN或MCRS后，每隔1小时采集一次志愿者的血液以确定NAD+水平(图6)。在没有MCRS的帮助下，供应NMN后NAD+含量保持基本不变，并且对于添加NR，NAD+含量在3小时期间也仅显示出轻微的增加。鉴于MCRS可以控制活性成分的释放速率，结果支持MCRS优于直接施用活性NMN和NR，这使志愿者的血液循环NAD+水平稳定增加。NAD+的水平最终在3小时下降到初始水平，这意味着MCRS释放的NMN可以在前2小时被完全吸收。

血液循环的hbFGF

采集志愿者的血液以确定MCRS的功效并确定MCRS给药后循环bFGF的增加(图7)。如图7的针对抗hbFGF抗体的蛋白质印迹结果所示，循环hbFGF的水平显著增加。而对于直接施用活性成分，仅检测到微弱的bFGF条带，原因在于在无MCRS的情况下，酸性不稳定的hbFGF暴露于胃液时将变性并降解。

本领域技术人员将进一步认识到，在不脱离其精神或中心特征的情况下，本发明可以以其他具体形式来实施。由于本发明的前述描述仅公开了其示例性实施方案，应该理解的是，其他变化被认为是在本发明的范围内。因此，本发明不限于在此详细描述的特定实施方案。相反，应当参考所附权利要求来指示本发明的范围和内容。

序列表

<110> 梦芊科技知识产权有限公司

<120> 控释微球及其抗衰老的用途

<130> GWHWW204220DI

<141> 2021-01-13

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 108

<212> DNA

<213> 鱼腥藻属(Anabaena sp.)

<400> 1

atgattaaaa ttgcgagccg caaatttctg ggcgtggaaa acgtgtatga tattggcgtg 60

cgccgcgatc ataacttttt tattaaaaac ggcctgattg cgagcaac 108

<210> 2

<211> 36

<212> PRT

<213> 鱼腥藻属(Anabaena sp.)

<400> 2

Met Ile Lys Ile Ala Ser Arg Lys Phe Leu Gly Val Glu Asn Val Tyr

1 5 10 15

Asp Ile Gly Val Arg Arg Asp His Asn Phe Phe Ile Lys Asn Gly Leu

20 25 30

Ile Ala Ser Asn

35

<210> 3

<211> 438

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 3

ccagccttgc cagaggatgg cggcagcggc gccttcccgc caggccactt caaggaccca 60

aagcgcctgt actgcaaaaa cgggggcttc ttcctgcgca tccacccaga cggccgcgtt 120

gacggggtcc gcgagaagag cgaccctcac atcaagctac aacttcaagc agaagagcgc 180

ggagttgtgt ctatcaaagg agtgtgtgct aaccgttacc tggctatgaa ggaagatgga 240

cgcttactgg cttctaaatg tgttacggat gagtgtttct tttttgaacg cttggaatct 300

aataactaca atacttaccg ctcacgcaaa tacaccagtt ggtatgtggc actgaaacgc 360

actgggcagt ataaacttgg atccaaaaca ggacctgggc agaaagctat cctttttctt 420

ccaatgtctg ctaagagc 438

<210> 4

<211> 146

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 4

Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly His

1 5 10 15

Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu

20 25 30

Arg Ile His Pro Asp Gly Arg Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp

35 40 45

Pro His Ile Lys Leu Gln Leu Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser

50 55 60

Ile Lys Gly Val Cys Ala Asn Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly

65 70 75 80

Arg Leu Leu Ala Ser Lys Cys Val Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu

85 90 95

Arg Leu Glu Ser Asn Asn Tyr Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr

100 105 110

Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser

115 120 125

Lys Thr Gly Pro Gly Gln Lys Ala Ile Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala

130 135 140

Lys Ser

145

<210> 5

<211> 717

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 5

gaattctaat acgactcact atagggagat tgtgagcgga taacaatttg tttaacttta 60

agaaggagaa tgcatcatca ccatcaccac atgattaaaa ttgcgagccg caaatttctg 120

ggcgtggaaa acgtgtatga tattggcgtg cgccgcgatc ataacttttt tattaaaaac 180

ggcctgattg cgagcaaccc agccttgcca gaggatggcg gcagcggcgc cttcccgcca 240

ggccacttca aggacccaaa gcgcctgtac tgcaaaaacg ggggcttctt cctgcgcatc 300

cacccagacg gccgcgttga cggggtccgc gagaagagcg accctcacat caagctacaa 360

cttcaagcag aagagcgcgg agttgtgtct atcaaaggag tgtgtgctaa ccgttacctg 420

gctatgaagg aagatggacg cttactggct tctaaatgtg ttacggatga gtgtttcttt 480

tttgaacgct tggaatctaa taactacaat acttaccgct cacgcaaata caccagttgg 540

tatgtggcac tgaaacgcac tgggcagtat aaacttggat ccaaaacagg acctgggcag 600

aaagctatcc tttttcttcc aatgtctgct aagagctaaa gacccggggc ttaattaatt 660

aagctagcat aaccccttgg ggcctctaaa cgggtcttga ggggtttttt gtctaga 717

Claims

1.一种控释微球，其包含海藻酸钙水凝胶、表达和分泌碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和一种或多种抗衰老化合物，其中所述海藻酸钙水凝胶包封所述枯草芽孢杆菌和所述抗衰老化合物。

2.根据权利要求1所述的控释微球，其中所述海藻酸钙水凝胶由海藻酸钠和钙盐例如氯化钙制备。

3.根据权利要求2所述的控释微球，其中所述微球通过下列步骤获得：

(a)提供钙盐例如氯化钙的水溶液；

(b)提供包含所述枯草芽孢杆菌和所述抗衰老化合物的海藻酸钠溶液；和

(c)将所述海藻酸钠溶液滴加到所述钙盐例如氯化钙的水溶液中并混合以获得所述微球。

4.根据权利要求3所述的控释微球，其中在步骤(b)中，通过将所述枯草芽孢杆菌与海藻酸钠溶液混合，然后向得到的混合物添加所述抗衰老化合物，并任选地进行均质化，以获得所述包含所述枯草芽孢杆菌和所述抗衰老小分子化合物的海藻酸钠溶液。

5.根据权利要求1-4任一项所述的控释微球，其中所述枯草芽孢杆菌包含表达载体，所述表达载体包含插入物，所述插入物从5’端到3’端包含编码短肽亲和标签、来源于鱼腥藻属(Anabaena sp.)的反式剪接内含肽、以及bFGF的多核甘酸序列，其中所述短肽亲和标签作为所述反式剪接内含肽的N-端外显肽，并且所述bFGF作为所述反式剪接内含肽的C-端外显肽。

6.根据权利要求5所述的控释微球，其中所述内含肽为鱼腥藻属DNA聚合酶III单元的内含肽(Asp DnaE)，优选地，所述内含肽包含与SEQ ID NO:2具有至少75％序列同一性的氨基酸序列或所述内含肽由SEQ ID NO:2所示的序列组成。

7.根据权利要求5或6所述的控释微球，其中所述短肽亲和标签具有约4-15个氨基酸的长度，例如是5-15x His标签，尤其是6x His标签。

8.根据权利要求1-7任一项所述的控释微球，其中所述bFGF是人bFGF。

9.根据权利要求1-8任一项所述的控释微球，其中所述抗衰老化合物是增加烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)含量的化合物或减少NAD消耗的化合物或其组合。

10.根据权利要求9所述的控释微球，其中所述增加烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)含量的化合物选自烟酸核苷、烟酰胺核苷(NR)、烟酸单核苷酸、烟酰胺单核苷酸(NMN)、及其组合。

11.根据权利要求9或10所述的控释微球，其中所述减少NAD消耗的化合物是Sirt1激动剂，优选地，所述Sirt1激动剂选自白藜芦醇、槲皮素、SRT2104、SRT1460、紫铆因、非瑟酮、异烟酰胺(IsoNAM)、白皮杉醇、及其组合。

12.一种膳食补充剂或药物组合物，其包含权利要求1-11任一项所述的控释微球，任选地，所述膳食补充剂或药物组合物具有胶囊的形式。

13.一种制备权利要求1-11任一项所述的控释微球的方法，所述方法包括：(a)提供钙盐例如氯化钙的水溶液；(b)提供包含表达和分泌碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的枯草芽孢杆菌和一种或多种抗衰老化合物的海藻酸钠溶液；和(c)将所述海藻酸钠溶液滴加到所述钙盐例如氯化钙的水溶液中并混合以获得所述微球，其中任选地，在步骤(b)中，通过将所述枯草芽孢杆菌与海藻酸钠溶液混合，然后向得到的混合物添加所述抗衰老化合物，并任选地进行均质化，以获得所述包含所述枯草芽孢杆菌和所述抗衰老化合物的海藻酸钠溶液。

14.一种治疗或预防衰老或与衰老相关的疾病或病况的方法或一种非治疗性的抗衰老方法，所述方法包括向受试者施用权利要求1-11任一项所述的控释微球或权利要求12所述的膳食补充剂或药物组合物。