CN114729943A - 用大分子调节剂进行il-17靶接合测定的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了测量包含IL‑17和IL‑17的大分子调节剂的生物样品中的总IL‑17的方法。

Description

用大分子调节剂进行IL-17靶接合测定的组合物和方法

相关申请的交叉引用

本申请根据《美国法典》第35条第119款第(e)项的规定要求2020年9月14日提交的美国临时申请号63/077,992、2020年1月12日提交的美国临时申请号62/960,031和2019年9月30日提交的美国临时申请号62/908,195的权益，其全部公开内容据此以引用方式并入本文。

以电子方式提交的参考序列表

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背景技术

白介素-17A(IL-17或IL-17A)是由活化的Thl7细胞、CD8+T细胞、γδT细胞和NK细胞响应于细胞因子诸如IL-23和TGF-β而分泌的细胞因子。IL-17调节由包括上皮细胞、成纤维细胞和滑膜细胞的多种细胞类型产生的介体，诸如抗微生物肽、促炎细胞因子和趋化因子，这些介体参与中性粒细胞的募集和炎症或宿主防御中组织损伤的病理学。IL-17也与其它细胞因子(诸如TNF-α和IL-Iβ)协同作用以增强促炎环境。

由于其参与免疫调节功能，IL-17的抑制剂正被研究作为各种自身免疫性疾病的可能治疗。抗IL-17单克隆抗体(mAb)在临床上被验证用于治疗银屑病、银屑病性关节炎、强直性脊柱炎，并且已经证明了用于治疗多发性硬化症的概念证明。

尽管抗IL-17单克隆抗体(下文称为IL-17的大分子(LM)调节剂)具有临床实用性，但仍缺乏针对IL-17的LM调节剂的靶接合测定。具体地，在涉及LM调节剂的研究中，本领域中可商购获得的测定通常仅能够测量包含IL-17和LM调节剂的生物样品中游离IL-17的量，而不能测量LM结合的IL-17的量。此外，尽管Peng等人开发了一种特异性针对一种抗IL-17抗体即MCAF5352A测量靶接合的测定，但该方法展示了用单一抗体的实用性。参见，即，Peng等人，Measurement of IL-17AA and IL-17FF as Pharmacodynamic Biomarkers toDemonstrate Target Engagement in the Phase I Study of MCAF5352A,The AAPSJournal(2019)21:9)。因此，缺乏关于多种LM调节剂的IL-17靶接合水平的信息。

此外，尽管已使用疾病相关的生物标志物来监测患者中的抗IL-17治疗作用，但是还未开发出生物标志物来监测健康受试者中的抗IL-17作用，该健康受试者通常包括在临床评估的早期阶段。因此，可证明IL-17LM调节剂与受试者(例如，人)中的IL-17的靶接合的测量对于通过临床研究推进LM调节剂是重要的。还另外需要一种或多种方法来评估样品中LM调节剂的IL-17接合，以研究临床相关参数，诸如药代动力学(PK)和药效学(PD)信息，这继而可帮助确定用于安全和有效疗法的最佳剂量。因此，仍然需要一种稳健的免疫测定来评估总IL-17的量(例如，结合和未结合到LM调节剂的IL-17)，并且进一步提供涉及较大数量的LM调节剂的样品中的靶接合信息。

发明内容

在一般方面，本申请涉及一种免疫测定，其可检测包含IL-17和LM调节剂的样品中的总IL-17(即游离IL-17和调节剂结合的IL-17两者)，使得可通过从总IL-17的水平中减去游离IL-17的水平来评估LM调节剂的靶接合。

本文提供了一种确定包含IL-17和IL-17的大分子(LM)调节剂的样品中IL-17(游离IL-17和LM调节剂结合的IL-17)的总量的方法，该方法包括：

i.使样品与捕获抗体接触以形成包含第一复合物和第二复合物的混合物，该第一复合物包含捕获抗体和未结合到LM调节剂的IL-17，该第二复合物包含捕获抗体和结合到LM调节剂的IL-17；

ii.使来自步骤i)的混合物与检测剂接触，从而形成包含捕获抗体、未结合到LM调节剂的IL-17和检测剂的第三复合物，以及包含捕获抗体、结合到LM调节剂的IL-17和检测剂的第四复合物；以及

iii.通过测量第三复合物和第四复合物中检测剂的量来确定总IL-17的量，

其中，该捕获抗体是抗IL-17抗体AF-317，并且该检测剂是mAb4538。

在该方法的另一个实施方案中，在步骤(ii)中使来自步骤i)的第一混合物与检测剂接触之前执行洗涤步骤。

在该方法的另一个实施方案中，LM调节剂具有在约2,000道尔顿-250,000道尔顿、或约5,000道尔顿-160,000道尔顿范围内的分子量。

在该方法的另一个实施方案中，LM调节剂选自由以下项组成的组：苏金单抗(secukinumab)、mAb7024和mAb732，优选地该LM调节剂是苏金单抗或mAb7024。

在该方法的另一个实施方案中，检测剂用可检测标记进行标记。

在该方法的另一个实施方案中，可检测标记是酶或生物素。

在该方法的另一个实施方案中，样品是从用LM调节剂离体或体内治疗的受试者获得的生物样品。

在该方法的另一个实施方案中，受试者是哺乳动物，优选地人。

在该方法的另一个实施方案中，生物样品选自由以下项组成的组：由细胞、组织或血清、血浆或另一生物流体样品制备的样品。

在该方法的另一个实施方案中，免疫测定是酶联免疫吸附测定(ELISA)。

本文还提供了一种用于确定包含IL-17和IL-17的LM调节剂的样品中总IL-17的量的试剂盒，该试剂盒包括：

i.捕获抗体，其中在与样品接触时，该捕获抗体形成包含捕获抗体和未结合到LM调节剂的IL-17的第一复合物，以及包含捕获抗体和结合到LM调节剂的IL-17的第二复合物；和

ii.检测剂，其中在与第一复合物和第二复合物接触时，检测剂形成包含捕获抗体、未结合到LM调节剂的IL-17和检测剂的第三复合物，以及包含捕获抗体、结合到LM调节剂的IL-17和检测剂的第四复合物，

其中，该捕获抗体是抗IL-17抗体AF-317，并且该检测剂是mAb4538。

在试剂盒的另一个实施方案中，检测剂用可检测的标记进行标记，更优选地，标记是酶或生物素。

在另一个实施方案中，试剂盒用于进行ELISA。

根据以下公开内容，包括本发明的详细描述和其优选的实施方案以及所附权利要求书，本发明的其他方面、特征和优点将显而易见。

附图说明

结合附图进行阅读时，能够更好地理解前述发明内容和以下对本专利申请的优选实施方案的详细说明。但是，应当理解，本专利申请不限于附图中示出的精确实施方案。

图1A-图1C示出了IL-17检测测定的示意图：图1A-使用捕获抗体/检测剂对检测靶抗原(例如，IL-17)的常规免疫测定；图1B-在LM调节剂的存在下使用可商购获得的捕获抗体/检测剂对检测游离IL-17(即，未结合到调节剂的IL-17)的免疫测定；以及图1C-在LM调节剂的存在下使用本发明的捕获抗体/检测剂对检测总IL-17(包括游离IL-17和调节剂结合的IL-17)的免疫测定。

图2示出了在具有IL-17的LM调节剂(苏金单抗，10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml或0.01μg/ml)或不具有LM调节剂的情况下使用DuoSet ELISA DY317(R&D Systems,Inc.)的游离IL-17的检测。

图3示出了使用抗IL-17抗体AF-317(目录号AF-317-NA，来自R&D systems)作为捕获抗体并且使用mAb4538作为检测剂在具有IL-17的LM调节剂(苏金单抗，10pg/ml、1pg/ml、0.1pg/ml、0.01pg/ml或0.001pg/ml)或不具有LM调节剂的样品中总IL-17的检测。

图4A示出了使用DuoSet ELISA试剂盒DY317在具有IL-17的LM调节剂(苏金单抗、mAb7024或mAb732)或不具有LM调节剂的样品中游离IL-17的检测。

图4B示出了使用抗IL-17抗体AF-317(目录号AF-317-NA，R&D systems)作为捕获抗体并且使用mAb4538作为检测剂在具有IL-17的LM调节剂(苏金单抗、mAb7024或mAb732)或不具有LM调节剂的样品中总IL-17的检测。

具体实施方式

背景以及说明书全篇中引用或描述了各种出版物、文章和专利；这些参考文献中的每一者全文均以引用方式并入本文。本说明书中包括的对文件、行为、材料、装置、文章等的讨论旨在为本发明提供上下文。此类讨论并不是承认这些事项中的任一事项或全部事项均相对于所公开或受权利要求书保护的任何发明形成现有技术的一部分。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同。否则，本文所用的某些术语具有本说明书中所述的含义。本文引用的所有专利、公布的专利申请和出版物均以引用方式并入本文，如同在本文中进行了充分阐述。

应该注意的是，除非上下文清楚地指明，否则如本文和所附权利要求中所用的单数形式“一个/一种”和“所述/该”包括复数引用物。

除非另有说明，否则在一系列元素之前的术语“至少”应理解为指代系列中的每个元素。本领域的技术人员将会认识到、或仅使用常规实验就能够确定本文所述发明的具体实施方案的多种等同物。此类等同物旨在由本发明所涵盖。

贯穿本说明书和随后的权利要求书，除非上下文另有要求，否则词语“包括”以及诸如“包含”和“含有”的变型形式将被理解为暗示包括所陈述的整数或步骤或者整数或步骤的组，但不排除任何其他整数或步骤或者整数或步骤的组。当在本文使用时，术语“包含”可用术语“含有”或“包括”替代，或者有时在本文使用时用术语“具有”替代。

当在本文使用时，“由……组成”排除权利要求要素中未指定的任何要素、步骤或成分。当在本文使用时，“基本上由……组成”不排除没有实质上影响权利要求的基本和新颖特征的材料或步骤。每当在本文中用于本申请的一个方面或实施方案的情境时，任何前述术语“包含”、“含有”、“包括”和“具有”均可用术语“由……组成”或“基本上由……组成”替代以改变本公开的范围。

如本文所用，多个列举的要素之间的连接术语“和/或”被理解为包含单个选项和组合选项两者。例如，在两个要素由“和/或”连接的情况下，第一种选项是指在没有第二个要素的情况下适用第一个要素。第二种选项是指在没有第一个要素的情况下适用第二个要素。第三种选项是指适合一起使用第一要素和第二要素。这些选项中的任一种均被理解为落在含义内，并且因此满足如本文所用的术语“和/或”的要求。多于一种选项的并行适用性也被理解为落在含义内，并且因此满足术语“和/或”的要求。

除非另行指出，否则任何数值，诸如本文所述的浓度或浓度范围被理解为在所有情况下用术语“约”修饰。因此，数值通常包括所述值±10％。例如，1mg/mL的浓度包括0.9mg/mL至1.1mg/mL。同样，1mg/mL至10mg/mL的浓度范围包括0.9mg/mL至11mg/mL。除非上下文另有明确指示，否则如本文所用，使用的数值范围明确地包括所有可能的子范围、该范围之内的所有单个数值，包括此类范围之内的整数和该范围之内的分数。

当参考氨基酸序列使用时，短语“序列同一性百分比(％)”或“同一性％”或“与...％相同”)描述与构成氨基酸序列的总长度的氨基酸残基的数量相比，两个或更多个比对氨基酸序列的相同氨基酸的匹配数(“命中”)。换句话说，如使用本领域已知的序列比较算法测量的比较和比对序列的最大对应性时，或当手动比对和目视检查时，使用比对，对于两个或更多个序列，可确定相同的氨基酸残基的百分比(例如，在氨基酸序列全长上的90％、91％、92％、93％、94％、95％、97％、98％、99％或100％同一性)。因此，被比较以确定序列同一性的序列可能因氨基酸的取代、添加或缺失而不同。用于比对蛋白质序列的合适程序是技术人员已知的。蛋白质序列的序列同一性百分比可例如用程序诸如CLUSTALW、Clustal Omega、FASTA或BLAST，例如使用NCBI BLAST算法(Altschul SF等人(1997)，Nucleic Acids Res.25:3389-3402)来确定。

如本文所用，“受试者”是指任何动物，优选地哺乳动物，最优选地人，将通过或者已经通过根据本申请的实施方案的方法对其进行治疗。如本文所用，术语“哺乳动物”涵盖任何哺乳动物。哺乳动物的示例包括但不限于奶牛、马、绵羊、猪、猫、狗、小鼠、大鼠、兔子、豚鼠、非人灵长类(NHP)(诸如，猴子或猿)、人等，更优选地包括人。

为了帮助本申请的读者，已将说明书分成各个段落或章节，或者将读者引向本申请的不同实施方案。这些分割不应被认为是将段落或章节或实施方案的实质与另一段落或章节或实施方案的实质拆开。相反，本领域技术人员将理解，本说明书具有广泛的应用，并且涵盖可设想到的各个章节、段落和句子的所有组合。对任何实施方案的讨论仅意图是示例性的，并且不旨在表明本公开(包括权利要求书)的范围限于这些示例。

如本文所用，“IL-17”或“IL-17A”是指白介素17A。它也被命名为IL17、CTLA8、CTLA-8。白介素17A是一种促炎细胞因子。这种细胞因子是由称为T辅助性17细胞的一组T辅助性细胞响应于用IL-23刺激而产生的。由IL17A编码的蛋白质是IL-17家族的创始成员，包括IL17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E和IL-17F。IL-17E也称为IL-25。IL-17家族的所有成员具有类似的蛋白质结构。IL-17调节NF-κb和丝裂原活化蛋白激酶的活性。它可刺激IL6和环加氧酶-2(PTGS2/COX-2)的表达，以及增强一氧化氮(NO)的产生。高水平的IL17与几种慢性炎性疾病相关，包括类风湿性关节炎、银屑病和多发性硬化症。“IL-17”包括来自任何动物物种的IL-17A，以及IL-17A的重组产物。IL-17可以是IL-17A的同源二聚体或IL-17A和IL-17F的异源二聚体。人IL-17的示例性氨基酸序列在GenBank登录号NP 002181.1中表示，其可由诸如GenBank登录号NM_002190.3的核酸序列编码。

如本文所用，术语“调节剂”是指能够结合IL-17的任何剂或分子，包括小分子化合物和大分子诸如抗体。

术语“小分子调节剂”和/或“SM调节剂”和/或“IL-17的SM调节剂”在本文中可互换使用，并且是指能够结合IL-17并具有在约100g/mol至约1500g/mol范围内的分子量的任何小分子化合物。

术语“大分子调节剂”和/或“LM调节剂”和/或“IL-17的LM调节剂”在本文中可互换使用，并且是指能够结合IL-17并具有高于约1500道尔顿的分子量或优选地具有在约2,000道尔顿至约250,000道尔顿、或约5000道尔顿至约160,000道尔顿、或约150,000道尔顿至约250,000道尔顿范围内的分子量的任何大分子化合物(例如，抗体、蛋白质等)。道尔顿(符号Da)在本文中用作摩尔质量单位，定义为1Da＝1g/mol。

如本文所用，术语“游离IL-17”或“未结合的IL-17”是指不与生物样品中的任何调节剂结合的IL-17。

术语“样品”和“生物样品”在本文中可互换使用并且涵盖从生物体获得或衍生的各种样品类型，并且可用于诊断或监测测定。该术语涵盖生物来源的血液和其它液体样品、固体组织样品，诸如活检标本或组织培养物或源自其的细胞及其后代。该术语涵盖在采购后已以任何方式操纵的样品，诸如用试剂处理、溶解或富集某些组分。该术语涵盖临床样品，并且也包括细胞培养物中的细胞、细胞上清液、细胞裂解物、血清、血浆、生物液体和组织样品。

如本文所用，术语“抗体”广义地使用，并且包括免疫球蛋白或抗体分子，包括人抗体、人源化抗体、复合抗体和嵌合抗体以及单克隆或多克隆抗体片段。一般来讲，抗体是蛋白质或肽链，其对于特定抗原表现出结合特异性。抗体可来源于任何物种，并且例如可以是IgM、IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)、IgD、IgA或IgE。

如本文所用，术语“抗原结合片段”是指抗体片段，诸如例如双抗体、Fab、Fab'、F(ab’)2、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)₂、双特异性dsFv(dsFv-dsFv¹)、二硫键稳定的双抗体(ds双抗体)、单链抗体分子(scFv)、单结构域抗体(sdab)、scFv二聚体(二价双抗体)、由包含一个或多个CDR的抗体的一部分形成的多特异性抗体、骆驼化单结构域抗体、纳米抗体、结构域抗体、二价结构域抗体或结合至抗原但不包含完整抗体结构的任何其他抗体片段，或包含抗原结合片段的任何肽。

如本文所用，术语“单克隆抗体”是指单分子组合物的抗体的制剂。

如本文所用，术语“多克隆抗体”是指不同抗体分子的组合物，其能够与相同或不同抗原上的几种不同特异性抗原决定簇结合或反应。多克隆抗体的抗原特异性的可变性位于构成多克隆抗体的单个抗体的可变区中，特别是互补决定区CDR1、CDR2和CDR3区中。

如本文所用，术语“捕获抗体”是指与IL-17特异性结合的抗体，而不管IL-17是否与调节剂结合。此类捕获抗体可以是可商购获得的或研究性剂。捕获抗体可在溶液中提供或预涂覆到表面上。

如本文所用，术语“检测剂”是指特异性结合未结合到调节剂的IL-17或结合到调节剂的IL-17或两者的剂。“检测剂”(诸如检测抗体)或检测可溶性受体可用于检测未结合到调节剂的IL-17或结合到调节剂的IL-17。检测剂(诸如检测抗体)可以是可商购获得的或研究性的。检测剂可通过本领域已知的任何方法来检测，诸如使用放射性标签或荧光标签，或者通过直接或间接结合到酶或生物素来检测。优选地，检测剂(诸如检测抗体)用可检测标记(诸如酶或生物素)进行标记。

酶可将某些底物转化为可检测产物。例如，酶可以是通常用于酶联免疫吸附测定(ELISA)中的以下酶中的一种酶：

·辣根过氧化物(HRP)，通常用于与蛋白质缀合，将邻苯二胺二盐酸盐(OPD)转化为琥珀色产物；

·HRP将3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)转变成蓝色产物，其在硫酸或磷酸的存在下变为黄色；

·HRP将2,2'-联氮双[3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸]-二铵盐(ABTS)转化为绿色产物；以及

·碱性磷酸酶将对硝基苯基磷酸酯(PNPP)转化为黄色产物。

生物素是一种水溶性B族维生素，也称为维生素B7。生物素能够以相当大的亲和力与亲和素、链霉亲和素和中性亲和素结合。这些蛋白质(亲和素、链霉亲和素和中和亲和素)可进一步与上述可检测酶缀合以产生信号。

术语“特异性结合”是指两种剂(例如，抗原和抗体)之间的结合，其特征在于一种剂(例如，抗原)与另一种剂(例如，抗体)缔合的能力，即使在许多其他不同剂的存在下，即在多种剂的混合物中显示出一种剂对另一种剂的优先结合。例如，“特异性结合”抗原的抗体是指以1×10^-7M或更小、优选地1×10^-8M或更小、更优选地5×10^-9M或更小、1×10^-9M或更小、5×10^-10M或更小、或1×10^-10M或更小的KD与抗原结合的抗体或其抗原结合片段。KD是抗体与其抗原之间的平衡解离常数，即K_off/K_on的计算比值。例如，抗体的KD可通过使用表面等离振子共振，诸如通过使用生物传感器系统(例如

系统)，或者通过使用生物层干涉测量技术(诸如Octet RED96系统)来确定。抗体KD的值越小，抗体与靶抗原结合的亲和力越高。

如本文所用，术语“试剂盒”是指试剂和其他材料的组合。预期试剂盒可以包括试剂，诸如缓冲剂、蛋白质稳定试剂、信号产生系统(例如荧光信号生成系统)、抗体、对照蛋白以及测试容器(例如微量滴定板等)。不旨在将术语“试剂盒”限制于试剂和/或其他材料的特定组合。在一个实施方案中，该试剂盒还包括使用试剂的说明书。该测试试剂盒可以任何合适的方式包装，通常根据需要用单个容器或各种容器中的元件包装，以及用一张用于进行测试的说明书包装。在一些实施方案中，该试剂盒还优选地包括阳性对照样品。可以以本领域已知的多种方式生产试剂盒。

本申请整体涉及一种用于测量包含IL-17和LM调节剂的样品中总IL-17(即，结合或未结合到LM调节剂的IL-17)的量的IL-17靶接合测定。

在涉及LM调节剂的研究中，本领域中可商购获得的测定通常仅能够测量包含IL-17和LM调节剂的生物样品中游离IL-17的量。如前所讨论的，尽管Peng等人开发了一种特异性针对一种抗IL-17抗体即MCAF5352A测量靶接合的测定，本申请提供了用于较大数量的LM调节剂的确定总IL-17(例如，结合和未结合的IL-17)的量的方法。该方法包括：

i.使样品与捕获抗体接触以形成包含第一复合物和第二复合物的混合物，该第一复合物包含捕获抗体和未结合到LM调节剂的IL-17，该第二复合物包含捕获抗体和结合到LM调节剂的IL-17；

ii.使来自步骤i)的混合物与检测剂(优选地检测抗体)接触，从而形成包含捕获抗体、未结合到LM调节剂的IL-17和检测剂的第三复合物，以及包含捕获抗体、结合到LM调节剂的IL-17和检测剂的第四复合物；以及

iii.通过测量第三复合物和第四复合物中检测剂的量来确定总IL-17的量。

在使样品与捕获抗体接触后，捕获抗体特异性结合样品中的IL-17(游离IL-17和与LM调节剂结合的那些两者)，在混合物中分别形成第一复合物和第二复合物。在某些实施方案中，捕获抗体附接到固体载体，并且混合物含有附接到固体载体的第一IL-17复合物和第二IL-17复合物以及样品的其余部分。

如本文所用，术语“检测剂”是指一种剂，诸如抗体或受体，其特异性结合被捕获抗体捕获的游离IL-17和被捕获抗体捕获的调节剂结合的IL-17。具体地，当使检测剂与第一复合物和第二复合物接触时，其形成包含捕获抗体、游离IL-17和检测剂的第三复合物，以及包含捕获抗体、调节剂结合的IL-17和检测剂的第四复合物。

因此，捕获抗体和检测剂成对使用来测量样品中总IL-17的量。

在一个实施方案中，捕获抗体是抗IL-17抗体AF-317(目录号AF-317-NA，来自R&DSystems,Inc.)，并且检测剂是mAb4538(抗IL-17抗体，来自Janssen Biotech,Inc.)。mAb4538公开于美国专利8,519,107，该专利全文以引入方式并入本文。其详细的序列信息列于表1中。

表1.抗体序列

在某些实施方案中，检测剂(诸如检测抗体)用可检测标记进行标记，优选地，标记是酶或生物素。在另一个实施方案中，检测剂用标志物(诸如生物素)进行标记，用于与标记的酶(诸如链霉亲和素缀合的辣根过氧化物酶)相互作用，该标记的酶在过氧化氢的存在下作用于四甲基联苯胺生成颜色信号，以确定第一检测剂的量。

如本文所用，术语“洗涤(wash)”、“洗涤步骤”或“洗涤(washing)”是指用于从步骤(i)的混合物中分离未结合到捕获抗体的总IL-17(包括游离IL-17和调节剂结合的IL-17两者)的过程。用于洗涤的溶液通常是缓冲液(“洗涤缓冲液”)。在一些实施方案中，洗涤缓冲液含有低浓度的洗涤剂。在一些实施方案中，洗涤缓冲液是包含150mM NaCl和0.05％吐温20的pH约7.4的10mM磷酸盐缓冲液。洗涤缓冲液的pH优选地在约6至约9的范围内。在一些实施方案中，pH值为约7.0。洗涤步骤可进行一次或多次(例如，一次、两次、三次、四次、五次或六次)。在一个优选的实施方案中，洗涤步骤进行三次至六次。

在某些实施方案中，在步骤(ii)中使来自步骤(i)的第一混合物与第一检测剂接触之前执行洗涤步骤。

在某些实施方案中，在步骤(ii)中使来自步骤(i)的第一混合物与第一检测剂接触之前不执行洗涤步骤。

如本文所用，术语“LM调节剂”或“IL-17的LM调节剂”指任何大分子，包括抗体或其抗原结合片段，或包含其抗原结合片段的蛋白质，其能够结合IL-17并具有高于约1500道尔顿的分子量，或优选地具有在约2,000道尔顿至约250,000道尔顿、或约5000道尔顿至约160,000道尔顿、或约15,000道尔顿至约250,000道尔顿、或约100,000道尔顿至约200,000道尔顿、或约125,000道尔顿至约175,000道尔顿范围内的分子量。

在某些实施方案中，本文使用的LM调节剂是特异性结合IL-17的抗体。根据本申请的实施方案的方法可用于在任何LM调节剂的存在下测量总IL-17，LM调节剂的示例包括但不限于抗体或其抗原结合片段，或包含其抗原结合片段的蛋白质。本文使用的示例性LM调节剂包括但不限于苏金单抗、mAb7024、mAb732、或它们的结合片段。

苏金单抗(Caligor Coghlan,Secaucus,NJ)，也公开于WO 2006/013107(也公开为US20090280131，其全文以引用方式并入本文)中，是IgGl/K类的重组高亲和力完全人单克隆抗人白介素-17A抗体。苏金单抗具有约151kDa的分子量；苏金单抗的两条重链都含有寡糖链。苏金单抗与人IL-17A结合并中和该细胞因子的生物活性。苏金单抗对IL-17具有非常高的亲和力，即KD约为100pM-200pM，IC50约为0.4nM，用于0.67nM人IL-17A的生物活性的体外中和。

mAb7024和mAb732是来自Janssen Biotech,Inc的IL-17的抗体并公开于美国专利8,519,107中，该专利全文以引用方式并入本文。mAb7024和mAb732的详细序列信息列于表1中。mAb7024具有约146kDa的分子量。mAb732具有约150kDa的分子量。

在某些实施方案中，IL-17是人IL-17。

在某些实施方案中，样品是从用人IL-17的小分子调节剂离体或体内治疗的人受试者获得的生物样品。

在某些实施方案中，生物样品选自由以下项组成的组：由细胞、组织或血清、血浆或另一生物流体样品制备的样品。

通常，可商购获得的试剂盒(例如，ELISA试剂盒)仅检测游离IL-17，由于其水平低，当与抗IL-17mAb一起施用时，在健康受试者中很少检测到。然而，本文所述的方法检测总IL-17(包括游离和LM结合的IL-17)，其提供了高于检测下限的可测量量的IL-17。因此，所要求保护的方法提供了LM调节剂靶接合的定量证据。此外，临床血清样品的分析表明，由于IL-17/LM复合物的半衰期增加，IL-17的增加具有剂量和暴露依赖性(Peng K.等人)，这支持了测量总IL-17用于靶接合评估的概念。此外，本文所述的本发明测定在LM调节剂的存在下测量总IL-17，而与疾病的存在无关，并且可应用于健康受试者或患者。

此外，如上所述，即使Peng等人开发了一种特异性针对抗IL-17抗体即MCAF5352A测量靶接合的测定，该方法展示了仅用单一抗体的实用性。然而，本文所述的本发明方法可用于测量较大数量的LM调节剂的靶接合。测试分子的这种靶接合读出和药代动力学(PK)可用于建模以确定最佳剂量以实现功效并最小化安全研究中的信号。

此外，本文所述的本发明方法可与可商购获得的在LM调节剂的存在下测量游离IL-17的测定结合使用，以确定LM调节剂的靶接合。具体地，在包含IL-17和LM调节剂的样品中，通过从总IL-17水平(使用本文所公开的本发明捕获抗体和检测剂对确定)中减去游离IL-17水平(使用可商购获得的测定确定)，可评估LM调节剂的靶接合程度。

本申请还提供了一种用于确定包含IL-17和LM调节剂的样品中总IL-17的量的试剂盒，该试剂盒包括：

i.捕获抗体，其中在与样品接触时，该捕获抗体形成分别包含捕获抗体和未结合到LM调节剂的IL-17的第一复合物以及包含捕获抗体和结合到LM调节剂的IL-17的第二复合物；和

ii.检测剂(诸如第一检测抗体)，其中在与第一复合物和第二复合物接触时，检测剂形成包含捕获抗体、未结合到LM调节剂的IL-17和检测剂的第三复合物，以及包含捕获抗体、结合到LM调节剂的IL-17和检测剂的第四复合物。

在一些实施方案中，试剂盒还包括用于检测检测剂的一种或多种试剂。

在一实施方案中，捕获抗体是抗IL-17抗体AF-317，并且检测剂是mAb4538。

实施方案

本发明还提供了以下非限制性实施方案。

实施方案1是一种确定包含IL-17和IL-17的大分子(LM)调节剂的样品中总IL-17的量的方法，所述方法包括：

i.使所述样品与捕获抗体接触以形成包含第一复合物和第二复合物的混合物，所述第一复合物包含所述捕获抗体和未结合到所述LM调节剂的IL-17，所述第二复合物包含所述捕获抗体和结合到所述LM调节剂的IL-17；

ii.使来自步骤i)的所述混合物与检测剂接触，从而形成包含所述捕获抗体、未结合到所述LM调节剂的IL-17和所述检测剂的第三复合物，以及包含所述捕获抗体、结合到所述LM调节剂的IL-17和所述检测剂的第四复合物；以及

iii.通过测量所述第三复合物和所述第四复合物中所述检测剂的量来确定总IL-17的所述量，

其中所述捕获抗体是抗IL-17抗体AF-317，并且所述检测剂是mAb4538。

实施方案2是根据实施方案1所述的方法，其中在步骤(ii)中使来自步骤i)的所述第一混合物与所述检测剂接触之前执行洗涤步骤。

实施方案3是根据实施方案1或2中任一项所述的方法，其中所述LM调节剂选自由以下项组成的组：苏金单抗、mAb7024和mAb732。

实施方案3a是根据实施方案3所述的方法，其中所述LM调节剂是苏金单抗或mAb7024

实施方案3b是根据实施方案3所述的方法，其中所述LM调节剂是苏金单抗。

实施方案4是根据实施方案1-3中任一项所述的方法，其中所述检测剂用可检测标记进行标记。

实施方案5是根据实施方案4所述的方法，其中所述可检测标记是酶或生物素。

实施方案6是根据实施方案1-5中任一项所述的方法，其中所述样品是从用所述LM调节剂离体或体内治疗的受试者获得的生物样品。

实施方案6a是根据实施方案6所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物，优选地人。

实施方案6b是根据实施方案6所述的方法，其中所述生物样品选自由以下项组成的组：由细胞、组织或血清、血浆或另一生物流体样品制备的样品。

实施方案7是根据实施方案1-6中任一项所述的方法，其中所述方法是酶联免疫吸附测定(ELISA)。

实施方案8是一种用于确定包含IL-17和IL-17的LM调节剂的样品中总IL-17的量的试剂盒，所述试剂盒包括：

i.捕获抗体，其中在与所述样品接触时，所述捕获抗体形成包含所述捕获抗体和未结合到所述LM调节剂的IL-17的第一复合物，以及包含所述捕获抗体和结合到所述LM调节剂的IL-17的第二复合物；和

ii.检测剂，其中在与所述第一复合物和所述第二复合物接触时，所述检测剂形成包含所述捕获抗体、未结合到所述LM调节剂的IL-17和所述检测剂的第三复合物，以及包含所述捕获抗体、结合到所述LM调节剂的IL-17和所述检测剂的第四复合物，

其中所述捕获抗体是抗IL-17抗体AF-317，并且所述检测剂是mAb4538。

实施方案9是根据实施方案8所述的试剂盒，其中所述检测剂用可检测标记进行标记，更优选地，所述标记是酶或生物素。

实施方案10是根据实施方案8或9所述的试剂盒，所述试剂盒用于进行ELISA。

实施例

本领域的技术人员应当理解，在不脱离本发明的广义的发明构思的情况下，可对上述实施方案作出修改。因此，应当理解，本发明不局限于所公开的特定实施方案，但本发明旨在涵盖在本发明实质和范围内的修改，如本说明书所定义。

实施例1

材料

实施例中使用的捕获抗体/检测剂对列于表2中。

表2

方法

能够用ELISA检测总IL-17(游离和LM调节剂结合的IL-17)的捕获抗体/检测剂对的筛选：在稀释剂中以1ng/ml的终浓度开始制备两倍和8点连续稀释的重组IL-17，一式两份。制备苏金单抗(150mg/ml注射用溶液；NDC：00078-0639-98；Caligor OPCO,LLC)，最终浓度为10μg/ml、1pg/ml、0.1μg/ml和0.01μg/ml以及0.001μg/ml。

将高结合96孔板用100μL/孔的4pg/ml PBS中的捕获抗体在室温下包被过夜。将包被的板在洗板机(Zoom HT微板清洗机)上以6×400μL/孔洗涤，并在室温下用300μL/孔封闭剂(含1％BSA的PBS)封闭2.5小时，随后在洗板机上以6×400pL/孔洗涤。

通过向捕获抗体包被的板中添加95μL/孔样品，在ELISA测定中测量与测试分子一起孵育后样品中的IL-17。将板在室温下保持30分钟，然后在洗板机上以6×400μL/孔洗涤。添加5μL/孔的检测剂至最终500ng/mL，在室温下保持另外30分钟，然后在洗板机上以6×400μL/孔洗涤。通过以100μL/孔添加链霉亲和素缀合的辣根过氧化物酶并在室温下在黑暗中孵育20分钟，随后在洗板机上以6×400μL/孔洗涤，然后添加100μL/孔的底物溶液，在室温下在黑暗中孵育20分钟，来进行测量颜色的显色。然后通过添加50μL/孔的终止溶液终止反应，并在读板仪中在450nm-540nm处测量板。

用Softmax Pro6.3和GraphPad Prism分析来自读板仪(Molecular DevicesSpectra Max 340fPC)的光密度(OD)读数，并绘制为OD值对IL-17浓度的剂量响应曲线。

结果

游离或总人IL-17的检测(图2-图3)：图2A-图2D示出了使用DuoSet DY317 ELISA试剂盒与未添加IL-17LM调节剂的样品中的水平相比较的在含有10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml或0.01μg/ml苏金单抗的样品中的IL-17水平。如本文所示，使用DuoSet DY317 ELISA试剂盒，仅能够检测游离IL-17，而不能检测调节剂结合的IL-17。游离IL-17的水平是苏金单抗浓度依赖性的，游离IL-17水平随苏金单抗浓度的降低而增加。然而，如图3所示，当AF-317/mAb4538用作捕获抗体/检测剂对时，在苏金单抗的存在下检测总IL-17，并且IL-17水平不依赖于苏金单抗浓度

实施例2

在本实施例中，使用与实施例1中所述类似的ELISA测定，使用三(3)种不同的IL-17的LM调节剂即苏金单抗(10μg/ml)、mAb7024(10μg/ml)和mAb732(10μg/ml)，测试了两(2)种捕获抗体/检测剂对(表2中列出)。

如图4A所示，DuoSet DY317 ELISA试剂盒检测游离IL-17。在高浓度LM调节剂的存在下，IL-17与LM结合，因此仅检测到零至最低水平的游离IL-17，并且未检测到调节剂结合的IL-17。而当AF-317/mAb4538用作捕获抗体/检测剂对时，在LM调节剂(苏金单抗、mAb7024或mAb732)的存在下以浓度依赖性方式检测总IL-17。

Claims (13)

1.一种确定包含IL-17和IL-17的大分子（LM）调节剂的样品中IL-17（游离IL-17和LM调节剂结合的IL-17）的总量的方法，所述方法包括：

i. 使所述样品与捕获抗体接触以形成包含第一复合物和第二复合物的混合物，所述第一复合物包含所述捕获抗体和未结合到所述LM调节剂的IL-17，所述第二复合物包含所述捕获抗体和结合到所述LM调节剂的IL-17；

ii. 使来自步骤i)的所述混合物与检测剂接触，从而形成包含所述捕获抗体、未结合到所述LM调节剂的IL-17和所述检测剂的第三复合物，以及包含所述捕获抗体、结合到所述LM调节剂的IL-17和所述检测剂的第四复合物；以及

iii. 通过测量所述第三复合物和所述第四复合物中的所述检测剂的量来确定总IL-17的所述量，

其中，所述捕获抗体是抗IL-17抗体AF-317，并且所述检测剂是mAb4538。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤(ii)中使来自步骤i)的所述第一混合物与所述检测剂接触之前执行洗涤步骤。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述LM调节剂具有在约2,000道尔顿-250,000道尔顿、或约5,000道尔顿-160,000道尔顿范围内的分子量。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，所述LM调节剂选自由以下项组成的组：苏金单抗、mAb7024和mAb732，优选地所述LM调节剂是苏金单抗或mAb7024。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，所述检测剂用可检测标记进行标记。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述可检测标记是酶或生物素。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中，所述样品是从用所述LM调节剂离体或体内治疗的受试者获得的生物样品。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述受试者是哺乳动物，优选地人。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其中所述生物样品选自由以下项组成的组：由细胞、组织或血清、血浆或另一生物流体样品制备的样品。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，所述方法是酶联免疫吸附测定（ELISA）。

11. 一种用于确定包含IL-17和IL-17的LM调节剂的样品中总IL-17的量的试剂盒，所述试剂盒包括：

i. 捕获抗体，其中在与所述样品接触时，所述捕获抗体形成包含所述捕获抗体和未结合到所述LM调节剂的IL-17的第一复合物，以及包含所述捕获抗体和结合到所述LM调节剂的IL-17的第二复合物；和

ii. 检测剂，其中在与所述第一复合物和所述第二复合物接触时，所述检测剂形成包含所述捕获抗体、未结合到所述LM调节剂的IL-17和所述检测剂的第三复合物，以及包含所述捕获抗体、结合到所述LM调节剂的IL-17和所述检测剂的第四复合物，

其中，所述捕获抗体是抗IL-17抗体AF-317，并且所述检测剂是mAb4538。

12.根据权利要求11所述的试剂盒，其中所述检测剂用可检测标记进行标记，更优选地，所述标记是酶或生物素。

13.根据权利要求11或12所述的试剂盒，所述试剂盒用于进行ELISA。

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