CN114728036A - 新治疗用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及Polθ抑制剂用于治疗与Shieldin缺陷相关的癌症、以及包含该Polθ抑制剂的药物组合物。
Description
技术领域
本发明涉及用于治疗与Shieldin缺陷相关的癌症的Polθ抑制剂,以及包含该Polθ抑制剂的药物组合物。
背景技术
体细胞会受到由外源和内源性来源引起的持续DNA损伤。细胞感知、发出信号并修复DNA损伤的一系列过程称为DNA损伤反应(DDR)。存在许多不同类型的DNA损伤加合物,包括但不限于错配、碱基损伤、单链缺口和双链断裂(DSB)。人们普遍认为DSB是最具毒性的DNA损伤形式,必须对其进行精确修复才能使细胞存活并保持基因组完整性。如果不这样做,可能会导致细胞死亡或突变率提高,致使肿瘤发生。
DSB可以通过三种主要途径之一修复:同源重组(HR)、非同源末端连接(NHEJ)和替代性NHEJ(alt-NHEJ)。微同源性介导的末端连接(MMEJ)是最深入表征的alt-NHEJ机制。HR介导的修复是精确修复所必需的高保真机制,可防止诱发癌症的基因组不稳定性(Wood&DoubliéDNA Repair(2016),44,22-32,Wyatt等Mol.Cell(2016)63,662-673)。相反,NHEJ和MMEJ是容易出错的途径,可以在修复部位留下突变疤痕。MMEJ可以与HR和NHEJ途径并行运作(Truong等PNAS 2013,110(19),7720-7725)。正常细胞通常通过无错HR途径指导修复来修复DSB。如果细胞出现HR缺陷,它们可以使用末端连接方法来防止细胞死亡,但这是致突变的,最终可能导致肿瘤发生。
癌细胞的发展依赖于对DNA损伤反应(DDR)的错误调节或抑制,如通过上文所述的HR丧失。这导致对剩余的通常致突变的生存途径的依赖性增加。由于癌基因的激活会导致计划之外的DNA重复和复制压力,与正常细胞相比,癌细胞的DNA损伤负荷升高。这使其对剩余DDR途径的抑制表现出特别的敏感性。因此,可利用DDR缺陷,开发靶向癌症治疗。例如,已显示,抑制DNA修复蛋白PARP1(参与DNA单链断裂检测和修复过程),可以对HR成分(例如BRCA1、BRCA2、ATM、PALB1等)缺陷的癌细胞具有选择性致死性。这一观察结果导致了三种PARP抑制剂(奥拉帕利(olaparib)、尼拉帕利(niraparib)和鲁卡帕利(rucaparib))获批用于治疗HR缺陷型(HRD)卵巢癌和乳腺癌。
最近,发现Shieldin复合物是生理环境中DSBR途径选择的重要调节因子。Shieldin组分与DSB末端结合,可以保护其不受HR介导的修复所需的切除机制的影响,促进通过NHEJ的修复。已经证实,在Shieldin组分缺失的BRCA1null细胞中,可以通过部分恢复HR,来诱导对PARP抑制剂的耐药性。
显然,用于应对损伤的DSBR途径的选择会影响细胞的致瘤潜能及其对癌症治疗的反应。这反映在临床上,对PARP抑制有反应的患者最终会复发耐药疾病。对PARP抑制剂的耐药机制仍知之甚少,因此,需要提供对PARP抑制剂耐药性癌症有效的治疗,尤其是同样对PARP抑制剂耐药的与Shieldin缺陷相关的癌症。
发明概述
根据本发明的第一方面,提供Polθ抑制剂用于治疗与Shieldin缺陷相关的癌症。
附图简述
图1:显示两种DNA聚合酶θ(Polθ)抑制剂,化合物A(a)和化合物B(b),以及PARP抑制剂奥拉帕利(c)对亲本和C20orf196敲除(KO)SUM149类瘤物(tumouroid)大小的影响。数据表示n=4的平均值±SEM。
图2:显示两种Polθ抑制剂,化合物A(a)和化合物B(b),以及PARP抑制剂奥拉帕利(c)对亲本和C20orf196敲除(KO)SUM149类瘤物生长的影响,通过每个类瘤物的平均细胞核数来测量。数据表示n=4的平均值±SEM。
图3:显示两种Polθ抑制剂,化合物A和化合物B,以及PARP抑制剂奥拉帕利对亲本和C20orf196敲除(KO)SUM149类瘤物培养物中死细胞比例的影响。数据表示n≥3的平均值+SEM;p=***≤0.001,****≤0.0001,ns=不显著。
图4:HCC1937细胞的经典NHEJ(cNHEJ)是完整的。将染色体外DNA底物转染到细胞中,通过PCR确认NHEJ介导的修复(a)。设计了一种发光的NHEJ报告底物来检测通过经典NHEJ机制进行的非粘性DSB的细胞修复。如使用qPCR确认,HCC1937细胞的SHLD2缺失(c)。通过Western印迹确认了具有多种cNHEJ基因(LIG4、XRCC4和XLF)缺失的一组等基因HCT116细胞在相应蛋白质上缺失(d)。用(b)中所述底物和Firefly荧光素酶质粒(转染对照)转染HCC1937细胞。cNHEJ修复效率在(e)中表示为相对于Firefly发光归一化的纳米荧光素酶(nanoluciferase)发光(任意单位),并且cNHEJ修复效率在HCC1937细胞中表现强劲。作为对照,cNHEJ缺陷的HCT116细胞对两种底物的修复都有缺陷。数据表示n=4(技术重复)的平均值+SEM。
图5:显示REV7敲除(KO)结合Polθ抑制对DLD1结肠癌细胞存活力的影响,如聚焦CRISPR-Cas9 KO筛选所示。(a)1935个基因(X轴)的CRISPR-Cas9 KO合成致死性筛选结果汇总图。从负选择的最小FDR到最高FDR(Y轴;导致Polθ抑制剂敏感性的敲除效应显示为值<1)对基因进行排序。REV7和BRCA2 KO的位置标记在图上。(b)来自CRISPR-Cas9KO SL筛选的10个REV7 gRNA结合Polθ抑制的性能汇总图。
图6:(a)在CAL51乳腺癌细胞系中进行短干扰(si)RNA筛选,以确定在沉默时导致对化合物A的敏感性的基因。在该筛选中使用1280个siRNA SMARTpools,每个SMARTpools沉默一个不同的基因。对化合物A敏感性的影响显示在(a)中,显示为药物效应Z分数。负Z分数指示导致化合物A敏感性的siRNA。DE Z分数阈值为-2(虚线),用于定义合成性致死相互作用;在这个筛选中,三种不同的对照非靶向siRNA的DE Z分数分别为1.0(Allstar对照)、0.8(siCON1)和1.0(siCON2)。图中显示的值是来自一式三份重复筛选的中值。(b)在其siRNA导致化合物A敏感性增加(DE<-2)的基因中,靶向REV7的siRNA pool导致了敏感性(DE Z分数为-2.88)。图中显示的值是来自一式三份重复筛选的中值。
图7:显示Polθ抑制剂化合物A(a)和PARP抑制剂奥拉帕利(b)对亲本和REV7敲除(KO)22Rv1细胞的克隆存活(clonogenic survival)(Y轴)的影响。(c)中的直方图比较了用12μM化合物A或0.44μM奥拉帕利处理的细胞的相对存活。数据表示三个技术重复的平均值±SEM。这项实验代表三个生物学重复。未配对t检验的P-值:*=P≤0.05,**=P≤0.01,***=P≤0.001。
图8:(a)来自siRNA筛选的化合物A药物效应(DE)Z分数的散点图,其中在BRCA1缺陷型RPE1细胞中评估了1418个siRNA之每一个对化合物A敏感性的影响。按上文针对CAL51siRNA筛选所述,进行此筛选。(b)在其siRNA导致对化合物A敏感性增加(DE<-2)的基因中,靶向FAM35A或REV7的多个不同siRNA导致了敏感性。相比之下,该筛选中三种不同的对照非靶向siRNA的DE Z分数分别为1.3(Allstar对照)、-0.8(siCON1)和-0.6(siCON2)。图中所示的值是来自一式三份重复筛选的中值。
图9:SUM149亲本(C20ORF196/SHLD1野生型,BRCA1突变体)和具有CRISPR-Cas9产生的C20ORF196有害突变的两个不同SUM149子克隆(KO细胞系A和D),暴露于浓度逐渐提高的化合物A(a)或奥拉帕利(b)14天的剂量-反应克隆存活曲线。克隆A中的C20ORF196突变为NM_001303477c.85del5+92insT;克隆D中的C20ORF196突变为NM_001303477c.371del62。
图10:SUM149亲本和3个不同的REV7 KO细胞系暴露于浓度逐渐提高的化合物A(a)或奥拉帕利(b)14天的剂量-反应克隆存活曲线。与SUM149亲本克隆相比,所有三个REV7 KO克隆对化合物A的敏感性和对PARP抑制剂奥拉帕利的耐药性都增加。克隆1中的REV7突变为NM_001127325 1:g.11680401_11680415del GTAGACCTCGCGCAC(SEQ ID NO:3);克隆2中的REV7突变为NM_001127325 1:g.11680393delC;克隆3中的REV7突变是截短蛋白质编码序列的3bp缺失。
图11:显示DNA聚合酶θ(Polθ)抑制剂化合物A、PARP抑制剂奥拉帕利和对照化合物星形孢菌素(staurosporine)对亲本(a)和REV7敲除(KO)(b)SUM149类瘤物中死亡细胞比例的影响。数据表示n≥3的平均值±SEM≥3;p=**≤0.01,****≤0.0001,ns=不显著)。
图12:显示DNA聚合酶θ(Polθ)抑制剂化合物A(a)和PARP抑制剂奥拉帕利(b)对HCC1395细胞的亲本和三个SHLD2 KO克隆的克隆存活(Y轴)的影响。(c)中的直方图比较了用1.3μM化合物A或0.03μM奥拉帕利处理的细胞的相对存活。数据表示三个技术重复的平均值±SEM。这项实验代表了三个生物学重复。未配对t检验的P-值:*=P≤0.05,**=P≤0.01,***=P≤0.001。
图13:显示DNA聚合酶θ(Polθ)抑制剂化合物A(a)和PARP抑制剂奥拉帕利(b)对MDA-MB-436细胞的亲本和三个SHLD2 KO克隆的克隆存活(Y轴)的影响。(c)中的直方图比较了用0.75μM化合物A或0.01μM奥拉帕利处理的细胞的相对存活。数据表示三个技术重复的平均值±SEM,并用Artios CFA程序产生。未配对t检验的P-值:*=P≤0.05,**=P≤0.01,***=P≤0.001。
图14:48小时暴露于化合物A后,Shieldin缺陷、PARPi抗性细胞对奥拉帕利的再敏感化。用DMSO或化合物A(10μM)处理亲本SUM149细胞或具有恢复的BRCA1(SUM149回复突变)或C20orf196(SUM149 C20orf196)或53BP1(SUM149 53BP1)基因缺失的衍生细胞48小时,然后重新接种到含有DMSO或奥拉帕利(1μM)的培养基中,并再培养10天。C20orf196或53BP1的缺失以及BRCA1的表达导致了对奥拉帕利的显著耐药性。在SUM149 C20orf196和SUM149PT53BP1细胞但非BRCA1回复突变细胞系中,用化合物A处理细胞48小时,对存活没有影响但诱导敏感性。数据表示三个技术重复的平均值±SD。未配对t检验的P-值:*=P≤0.05,**=P≤0.01,***=P≤0.001,***=P≤0.0001。
发明详述
根据本发明的第一方面,提供Polθ抑制剂用于治疗与Shieldin缺陷相关的癌症。
根据可提及的本发明的一个方面,提供Polθ抑制剂用于治疗PARP抑制剂耐药性癌症。因此,在一个实施方案中,与Shieldin缺陷相关的癌症也是对PARP抑制剂具有耐药性的癌症。
临床前描述的PARP抑制剂耐药性分子机制包括:(i)通过获得第二突变逆转BRCA1或BRCA2突变等位基因,从而重新激活HR;(ii)NHEJ成分缺失;(iii)Shieldin蛋白复合物成分缺失,如53BP1、rev7、SHLD1、SHLD2、SHLD3;(iv)PARP1表达缺失;(v)PARP1突变;(vi)MDR1药物外流的上调;(vii)PARG蛋白表达缺失;(viii)复制叉稳定化;(ix)MET或PI3K激酶信号传导的上调;以及(x)指导DNA修复途径选择的microRNA的表达(Noordermeer等Nature(2018),560(7716),117-121,Dev等Nature Cell Biology(2018),20(8),954-965,Ghezraoui等Nature(2018)560(7716),122-127,Mirman等Nature(2018)560(7716),112-116,Pettitt等Nat Commun(2018)9(1),1849,以及在Curtin等(2013)34(6),1217-56中的综述)。到目前为止,唯一经临床验证的抗PARP抑制的耐药机制是BRCA1或BRCA2基因逆转,这意味着HR的重新激活是克服PARP抑制剂治疗的细胞杀伤效应的主要驱动因素。最近,已显示Shieldin成分缺失发生在患者来源的肿瘤外植体中(Dev等,Nature Cell Biology(2018),20(8),954-965)。此外,已显示Shieldin成分缺失可以通过阻止毒性NHEJ机制的激活而重新激活HR(Noordermeer等Nature(2018),560(7716),117-121)。
与NHEJ失活的小鼠胚胎成纤维细胞(Wyatt等Mol.Cell(2016)63,662-673,Zelensky等Nat.Comms(2017)8,66)一样,HR受损或失活的癌细胞变得高度依赖MMEJ介导的DNA修复以维持生存(Mateos-Gomez等Nature(2015),518(7538),254-257,Ceccaldi等Nature(2015),518(7358),258-262)。遗传、细胞生物学和生物化学数据已经确定Polθ(UniProtKB-O75417(DPOLQ_HUMAN))是MMEJ中的关键蛋白质(Kent等Nature Structural&Molecular Biology(2015),22(3),230-237,Mateos-Gomez等Nature(2015),518(7538),254-257)。Polθ是一种多功能酶,包含N端解旋酶结构域(SF2 HEL308型)和C端低保真DNA聚合酶结构域(A型)(Wood&DoubliéDNA Repair(2016),44,22-32)。已显示这两个结构域在MMEJ中具有协调的机制功能。解旋酶结构域介导从ssDNA末端去除RPA蛋白并刺激退火。聚合酶结构域延伸ssDNA末端并填补剩余的缺口。因此,Polθ的治疗性失活将使细胞丧失执行MMEJ的能力,并在一系列确定的肿瘤环境中提供一种新的靶向策略。
首先,已显示Polθ对HRD细胞(例如具有FA/BRCA缺陷的合成性致死)的存活至关重要,并且在HRD肿瘤细胞系中上调(Ceccaldi等Nature(2015),518(7538),258-262)。体内研究还显示,Polθ在具有相关预后不良的HRD卵巢癌、子宫癌和乳腺癌亚群中显著过量表达(Higgins等Oncotarget(2010),1,175-184,Lemée等PNAS(2010),107(30),13390-13395,Ceccaldi等(2015),上文)。重要的是,Polθ在正常组织中基本上不存在,但已显示在匹配的癌症样品中上调,因此表达升高与疾病相关(Kawamura等International Journal ofCancer(2004),109(1),9-16)。其次,Polθ的阻抑或抑制赋予肿瘤细胞放射敏感性。最后,可以想到,Polθ抑制可以预防BRCA2突变的MMEJ依赖性功能逆转,这是肿瘤中顺铂和PARP抑制剂耐药性出现的基础(Dhillon等Cancer Sci(2011)102,663-669)。
尽管人们越来越了解Polθ作为治疗靶点的相关性,但应该注意的是,Polθ在MMEJ中的功能直到最近才刚被发现(综述于Wood&DoubliéDNA Repair(2016),44,22-32中)。
本发明人已经发现,Polθ抑制对因Shieldin成分缺失而耐受PARP抑制的癌细胞具有选择性致死性。这对于携带耐受PARP抑制剂治疗的肿瘤的癌症患者来说,具有重要的治疗意义。
Shieldin是一种蛋白质复合物,可以“防止”DNA DSB的末端被切除——这是HR修复所需的必要步骤——并指导通过NHEJ进行修复(Noordermeer等Nature(2018),560(7716),117-121,Dev等Nature Cell Biology(2018),20(8),954-965,Ghezraoui等Nature(2018)560(7716),122-127,Mirman等Nature(2018)560(7716),112-116)。据报道,由任何组成部分的耗竭或缺失引起的Shieldin复合物缺失都可恢复DNA末端切除,从而恢复HR修复。与PARP抑制类似,多种文献报道强调了HRD和Polθ抑制之间的合成性致死相互作用。因此,如下发现是令人惊讶的:尽管由Shieldin缺失而恢复的HR会导致HRD SUM149T细胞对PARP抑制产生耐药性,但同样的细胞对Polθ抑制剂具有选择性敏感性。
在一个实施方案中,所述癌症包含先前对PARP抑制剂敏感的癌细胞。因此,癌症最初可以对基于PARP抑制剂的治疗敏感,但随后对基于PARP抑制剂的治疗产生耐药性,导致患者复发耐药性疾病。
在一个实施方案中,所述癌症包含最初鉴定为同源重组修复途径缺陷的癌细胞。因此,最初对基于PARP抑制剂的治疗敏感的癌症可以在通过HR过程修复其DNA方面具有不足、降低或丧失的能力。HR途径的成分已得到很好的表征并在下文列出。
例如,在一个实施方案中,该缺陷选自以下基因或由所述基因编码的蛋白质中的一个或多个的缺陷:ATM、ATR、BRCA1、BRCA2、BARD1、RAD51C、RAD50、CHEK1、CHEK2、FANCA、FANCB、FANCC、FANCD2、FANCE、FANCF、FANCG、FANCI、FANCL、FANCM、PALB2(FANCN)、FANCP(BTBD12)、ERCC4(FANCQ)、PTEN、CDK12,MRE11、NBS1、NBN、CLASPIN、BLM、WRN、SMARCA2、SMARCA4、LIG1、RPA1、RPA2、BRIP1和PTEN。
应当理解,本文中提及的“同源重组修复途径缺陷”或“同源重组缺陷(HRD)”指的是,可以导致所产生的同源重组修复途径的功能缺陷或丧失的任何基因或基因产物的缺失、表达缺陷或任何变异。所述遗传变异的实例包括突变(例如点突变)、取代、缺失、单核苷酸多态性(SNP)、单倍型、染色体异常、拷贝数变异(CNV)、表观遗传学、DNA倒置、表达减少和错误定位。
在一个实施方案中,所述癌症包含随后重新激活了同源重组修复途径的癌细胞。
在一个实施方案中,所述的同源重组修复途径缺陷包括Shieldin缺陷。
在此实施方案中,个体可以通过任何方式,包括Shieldin复合物成分的表达缺失、突变或表观遗传沉默,失去Shieldin复合物的活性。Shieldin复合物的成员为本领域技术人员公知,目前包括但不限于C20orf196(SHLD1)、FAM35A(SHLD2)和CTC-534A2.2(SHLD3)。因此,在另一个实施方案中,该Shieldin缺陷是以下基因或基因编码的蛋白质中任意一种或多种的缺陷:C20orf196(SHLD1)、FAM35A(SHLD2)和CTC-534A2.2(SHLD3)。
Shieldin复合物的活性也可以因位于Shieldin上游的53BP1复合物的成分的表达缺失、或突变或表观遗传沉默而使其无法被招募到DNA损伤部位而消除。因此,在备选实施方案中,所述Shieldin缺陷是53BP1复合物的缺陷。53BP1复合物作为NHEJ促进复合物发挥作用,包含TP53BP1(53BP1)、RIF1和MAD2L2(REV7)。因此,在另一个实施方案中,53BP1复合物缺陷包括以下基因或基因编码的蛋白质中任意一种或多种的缺陷:TP53BP1(53BP1)、RIF1和MAD2L2(REV7)。
在一个实施方案中,所述癌症包含已形成对微同源性介导的末端连接(MMEJ)的存活依赖性的癌细胞。
已显示Shieldin(SHLD)缺失在生理环境中影响DSBR途径选择。破坏Shieldin复合物,可以通过去除对DNA平末端的保护,导致DNA切除(resection),从而有利于同源重组修复和减少经典NHEJ(cNHEJ)修复。然而,尽管具有Shieldin成分缺陷的细胞优先通过HR修复DSB,但NHEJ途径并未像在核心NHEJ基因(如LIG4和XRCC4)缺失的细胞中一样完全缺失。例如,与核心NHEJ基因缺失的细胞不同,SHLD2缺失的癌细胞可以通过NHEJ有效修复转染的染色体外DSB底物(图4)。因此,具有Shieldin基因缺陷但能够执行NHEJ或HR的细胞,对Polθ抑制剂具有敏感性,是令人惊讶的。因此,具有Shieldin成分缺陷的细胞并不是NHEJ缺陷的。
Polθ抑制剂
本文提及的“Polθ抑制剂”包括能够导致Polθ功能活性降低例如酶活性降低(可以是部分降低或完全降低)的活性剂。“Polθ抑制剂”也指不影响Polθ的固有活性、但损害Polθ与其底物或辅因子的结合能力的活性剂。Polθ功能活性的部分或完全降低可以在Shieldin途径的一种或多种成分缺陷的癌细胞中诱导生长停滞的致死性。
抑制Polθ的功能活性可以是通过对其聚合酶或解旋酶结构域的酶学抑制。在一个实施方案中,通过抑制聚合酶结构域来抑制Polθ功能活性。
用于本发明的Polθ抑制剂可以是多肽、多核苷酸、抗体、肽、小分子化合物、抑制性小干扰RNA分子或任何其他合适的化学品。在一个实施方案中,Polθ抑制剂是小分子化合物。在另一实施方案中,Polθ抑制剂是包含杂环酰胺部分的小分子化合物。
GB专利申请号1813049.2、1813060.9、1813065.8、1817921.8和1821000.5中描述了合适的Polθ抑制剂的实例。
在另一个实施方案中,Polθ抑制剂选自化合物A或B。
化合物A((2S,3R)-1-(3-氰基-6-甲基-4-(三氟甲基)吡啶-2-基)-3-羟基-N-甲基-N-(间甲苯基)吡咯烷-2-甲酰胺)在GB专利申请号1813049.2中作为实施例24描述。
化合物B((2S,4S)-1-(3-氰基-6-甲基-4-(三氟甲基)吡啶-2-基)-4-羟基-N-甲基-N-(间甲苯基)吡咯烷-2-甲酰胺)在GB专利申请号1813049.2中作为实施例3描述。
本文提供的数据证明,与PARP抑制剂(奥拉帕利)相比,在C20orf196 KO细胞中,化合物A和B均导致了在类瘤物大小上更大的减少(参见实施例1和图1)、在每个类瘤物的细胞核数量上更大的减少(参见实施例2和图2)以及显著更多的细胞死亡(参见实施例3和图3)。
癌症
可治疗(或抑制)的癌症(及其良性对应物)的实例包括但不限于:上皮起源的肿瘤(各种类型的腺瘤和癌瘤,包括腺癌、鳞癌、移行细胞癌和其他癌),如膀胱癌和尿路癌、乳腺癌、胃肠道(包括食道、胃、小肠、结肠、直肠和肛门)癌、肝脏癌(肝细胞癌)、胆囊和胆道系统癌、外分泌胰腺癌、肾癌、肺癌(例如腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、支气管肺泡癌和间皮瘤),头颈癌(例如舌癌、口腔癌、喉癌、咽癌、鼻咽癌、扁桃体癌、涎腺癌、鼻腔癌和鼻窦癌)、卵巢癌、输卵管癌、腹膜癌、阴道癌、外阴癌、阴茎癌、宫颈癌、子宫肌层癌、子宫内膜癌、甲状腺癌(例如甲状腺滤泡癌)、肾上腺癌、前列腺癌、皮肤和附件(adnexae)癌(例如黑色素瘤、基底细胞癌、鳞状细胞癌、角化棘皮瘤、发育不良痣);血液系统恶性肿瘤(即白血病、淋巴瘤)和癌前血液系统病症和交界恶性(borderline malignancy)病症,包括血液系统恶性肿瘤和淋巴系相关病况(例如急性淋巴细胞白血病[ALL],慢性淋巴细胞白血病[CLL],B细胞淋巴瘤,如弥漫性大B细胞淋巴瘤[DLBCL]、滤泡性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、MALT淋巴瘤、T细胞淋巴瘤和白血病、天然杀伤[NK]细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、毛细胞白血病、意义不明的单克隆丙种球蛋白病、浆细胞瘤、多发性骨髓瘤和移植后淋巴增生性障碍),以及血液系统恶性肿瘤和髓系相关病症(例如急性髓系白血病[AML],慢性髓系白血病[CML],慢性髓性单核细胞白血病[CMML],嗜酸性粒细胞增多综合征,骨髓增生性疾病,如真性红细胞增多症、原发性血小板增多症(essential thrombocythemia)和原发性骨髓纤维化、骨髓增生综合征、骨髓增生异常综合征和早幼粒细胞白血病);间质起源的肿瘤,例如软组织、骨或软骨肉瘤,如骨肉瘤、纤维肉瘤、软骨肉瘤、横纹肌肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、血管肉瘤、卡波西肉瘤、尤因肉瘤、滑膜肉瘤、上皮样肉瘤、胃肠道间质瘤、良性和恶性组织细胞瘤以及隆突性皮肤纤维肉瘤;中枢或周围神经系统肿瘤(例如星形细胞瘤、胶质瘤和胶质母细胞瘤、脑膜瘤、室管膜瘤、松果体肿瘤和神经鞘瘤);内分泌肿瘤(例如垂体肿瘤、肾上腺肿瘤、胰岛细胞肿瘤、甲状旁腺肿瘤、类癌和甲状腺髓样癌);眼部和附件肿瘤(例如视网膜母细胞瘤);生殖细胞和滋养层肿瘤(例如畸胎瘤、精原细胞瘤、无性细胞瘤(dysgerminoma)、葡萄胎和绒毛膜癌);儿童和胚胎肿瘤(例如髓母细胞瘤、神经母细胞瘤、肾母细胞瘤(Wilms tumour)和原始神经外胚层肿瘤(primitive neuroectodermaltumour));或使患者易患恶性肿瘤的综合征(先天性或其他)(例如色素性干皮病)。
许多疾病的特征在于持续和失调的血管发生。慢性增生性疾病常伴有明显的血管发生,可促进或维持炎症和/或增生状态,或通过血管的侵袭性增殖导致组织破坏。已经发现,肿瘤的生长和转移依赖于血管发生。因此,本发明的化合物可用于预防和阻断肿瘤血管发生的起始。具体而言,本发明的化合物可用于治疗转移和转移性癌症。
转移或转移性疾病是指疾病从一个器官或部分传播到另一个非相邻的器官或部分。可通过本发明的化合物治疗的癌症包括原发性肿瘤(即起源部位的癌细胞)、局部侵袭(在局部区域穿透并浸润周围正常组织的癌细胞)和转移性(或继发性)肿瘤,即恶性细胞通过血流(血源性扩散)或淋巴管或体腔(经体腔)循环至身体其他部位和组织而形成的肿瘤。
具体癌症包括肝细胞癌、黑色素瘤、食道癌、肾癌、结肠癌、结直肠癌、肺癌(如间皮瘤或肺腺癌)、乳腺癌、膀胱癌、胃肠道癌、卵巢癌和前列腺癌。
在一个实施方案中,最初对基于PARP抑制剂的治疗敏感的癌症可以是曾对基于铂的化疗具有完全或部分应答的复发性上皮性卵巢癌、输卵管癌或原发性腹膜癌。
药物组合物
虽然活性化合物可单独施用,但优选将其作为药物组合物(例如制剂)提供。在一个实施方案中,这是无菌药物组合物。
因此,本发明进一步提供如上所述的药物组合物以及制备药物组合物的方法,所述药物组合物包含(例如混合)至少一种化合物、连同一种或多种可药用赋形剂并可选地包含本文所述的其他治疗或预防剂。
可药用赋形剂可选自,例如,载体(例如固体、液体或半固体载体)、助剂、稀释剂、填料或填充剂、造粒剂、包衣剂、控释剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、防腐剂、抗氧化剂、缓冲剂、悬浮剂、增稠剂、调味剂、甜味剂、掩味剂、稳定剂或药物组合物中常规使用的任何其他赋形剂。用于多种类型药物组合物的赋形剂的实例在下文中更详细地阐述。
本文所用的术语“可药用”涉及化合物、材料、组合物和/或剂型,这些化合物、材料、组合物和/或剂型在合理的医学判断范围内,适用于与个体(例如人)的组织接触,且无过度毒性、刺激性、过敏反应或其他问题或并发症,合理的风险/收益比。每种载体、赋形剂等在与制剂的其他成分相容的意义上也必须是“可接受的”。
包含化合物的药物组合物可按照已知的技术配制,参见例如Remington’sPharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Easton,PA,USA。
药物组合物可以是适于口服、胃肠外、局部、鼻内、支气管内、舌下、眼科、耳内、直肠、阴道内或经皮施用的任何形式。如果该组合物拟用于胃肠外施用,则其可配制用于静脉内、肌肉内、腹腔内、皮下使用,或通过注射、输注或其他递送方式直接递送到靶器官或组织中。可以通过推注、短期输注或长期输注进行递送,也可以通过被动输送或通过使用合适的输注泵或注射器驱动器进行递送。
适于胃肠外施用的药物制剂包括水性和非水性无菌注射液,其可以包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、助溶剂、表面活性剂、有机溶剂混合物、环糊精络合剂、乳化剂(用于形成和稳定乳液制剂)、用于形成脂质体的脂质体成分、用于形成聚合物凝胶的可胶凝聚合物、冻干保护剂、和试剂的组合,用于例如稳定可溶形式的活性成分、使制剂与预期受体的血液等渗。用于胃肠外施用的药物制剂也可采用水性和非水性无菌悬液的形式,其可以包含悬浮剂和增稠剂(R.G.Strickly,Solubilizing Excipients in oral and injectableformulations,Pharmaceutical Research,21(2)卷2004,201-230页)。
制剂可在单位剂量或多剂量容器中提供,例如密封安瓿、小瓶和预填充注射器,并可保存在冻干(冷冻干燥)条件下,只需在临用前加入无菌液体载体例如注射用水。在一个实施方案中,制剂以活性药物成分在瓶中的形式提供,用于随后使用适当的稀释剂进行复溶。
药物制剂可通过冷冻干燥化合物或其亚组来制备。冷冻干燥是指冻干组合物的过程。因此,冻干和冷冻干燥在本文中用作同义词。
可使用无菌粉末、颗粒和片剂制备现用现配的(Extemporaneous)注射液和悬液。
用于胃肠外注射的本发明药物组合物还可包含可药用无菌水性或非水性溶液、分散液、悬液或乳剂、以及用于在临使用前复溶为无菌注射液或分散液的无菌粉末。
合适的水性和非水性载体、稀释剂、溶剂或溶媒的实例包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)、羧甲基纤维素及其合适的混合物、植物油(如葵花油、红花油、玉米油或橄榄油)以及可注射有机酯,如油酸乙酯。例如,可以通过使用增稠或包衣材料(如卵磷脂)、在分散剂的情况下通过保持所需的粒径以及通过使用表面活性剂来保持适当的流动性。
本发明的组合物还可包含助剂,如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可通过包含多种抗细菌剂和抗真菌剂(例如,尼泊金酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等)来确保防止微生物的作用。还可能希望包括调整渗透压的试剂,如糖、氯化钠等。可注射药物形式的延长吸收可通过加入延迟吸收的试剂(如单硬脂酸铝和明胶)来实现。
在本发明的一个具体实施方案中,药物组合物是适于例如通过注射或输注静脉施用的形式。对于静脉施用,溶液可按原样施用,或在施用前将注射液注射到输液袋中(含有可药用赋形剂,如0.9%盐水或5%葡萄糖)。
在另一个具体实施方案中,药物组合物是适于皮下(s.c.)施用的形式。
适合口服施用的药物剂型包括片剂(包衣或未包衣)、胶囊剂(硬壳或软壳)、片剂、丸剂、锭剂、糖浆、溶液、粉末、颗粒、酏剂和混悬剂、舌下片剂、口腔膜剂(wafer)或贴片,如口腔贴片。
因此,片剂组合物可以包含单位剂量的活性化合物连同惰性稀释剂或载体,如糖或糖醇,例如乳糖、蔗糖、山梨醇或甘露醇;和/或非糖衍生稀释剂,如碳酸钠、磷酸钙、碳酸钙,或纤维素或其衍生物,如微晶纤维素(MCC)、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素,以及淀粉,如玉米淀粉。片剂还可包含诸如粘合剂和造粒剂(如聚乙烯吡咯烷酮)、崩解剂(例如可膨胀交联聚合物,如交联羧甲基纤维素)、润滑剂(例如硬脂酸盐)、防腐剂(例如对羟基苯甲酸酯)、抗氧化剂(例如BHT)、缓冲剂(例如磷酸盐或柠檬酸盐缓冲剂)和泡腾剂(如柠檬酸盐/碳酸氢盐混合物)等标准成分。此类赋形剂是众所周知的,无需在此详细讨论。
片剂可设计为在与胃液接触时释放药物(速释片),或在较长时间内或在胃肠道的特定区域以受控方式释放(控释片)。
胶囊剂可以是硬明胶或软明胶类型,并且可以包含固体、半固体或液体形式的活性成分。明胶胶囊可由动物明胶或其合成或植物来源的等同物形成。
固体剂型(如片剂、胶囊等)可包衣或不包衣。包衣既可以作为保护膜(例如聚合物、蜡或漆),也可以作为控制药物释放的机制,或用于美观或识别目的。包衣(例如EudragitTM型聚合物)可设计为在胃肠道内的所需位置释放活性成分。因此,可以选择包衣,以便在胃肠道内的特定pH条件下降解,从而在胃或回肠、十二指肠、空肠或结肠中选择性释放化合物。
代替包衣或作为包衣的补充,药物可以在包含释放控制剂,例如释放延迟剂的固体基质中提供,该释放延迟剂可适于在胃肠道中以受控方式释放化合物。或者,药物可以在聚合物包衣中提供,例如聚甲基丙烯酸酯聚合物包衣,其可适于在胃肠道中不同酸碱度的条件下选择性释放化合物。或者,基质材料或释放延迟包衣可以采用可侵蚀聚合物(例如马来酸酐聚合物)的形式,该聚合物在剂型通过胃肠道时基本上持续地被侵蚀。在另一种选择中,包衣可以设计成在肠道微生物作用下分解。作为另一种选择,活性化合物可配制在可以渗透压控释化合物的递送系统中。渗透压释放和其他延迟释放或缓释制剂(例如基于离子交换树脂的制剂)可根据本领域技术人员熟知的方法制备。
化合物可与载体配制并以纳米颗粒的形式施用,纳米颗粒增加的表面积有助于其吸收。此外,纳米颗粒还提供了直接穿透进入细胞的可能性。纳米药物递送系统在“Nanoparticle Technology for Drug Delivery,Ram B Gupta和Uday B.编辑Kompella,Informa Healthcare,ISBN 9781574448573,2006年3月13日出版”中进行了描述。J.Control.Release,2003,91(1-2),167-172和Sinha等,Mol.Cancer Ther.August 1,(2006)5,1909中也描述了用于药物递送的纳米颗粒。
药物组合物通常包含约1%(w/w)至约95%(w/w)的活性成分和99%(w/w)至5%(w/w)的可药用赋形剂或赋形剂组合。具体而言,组合物包含约20%(w/w)至约90%(w/w)的活性成分和80%(w/w)至10%的可药用赋形剂或赋形剂组合。药物组合物包含约1%至约95%,尤其是约20%至约90%的活性成分。本发明的药物组合物例如可以是单位剂量形式,例如安瓿、小瓶、栓剂、预填充注射器、糖衣丸、片剂或胶囊的形式。
可药用赋形剂可根据制剂所需的物理形式来选择,并且可以例如选自稀释剂(例如固体稀释剂,如填料或填充剂;以及液体稀释剂,如溶剂和助溶剂)、崩解剂、缓冲剂、润滑剂、助流剂、释放控制剂(例如缓释或延迟释放聚合物或蜡)、粘合剂、造粒剂、色素、增塑剂、抗氧化剂、防腐剂、调味剂、掩味剂、渗透压调节剂和包衣剂。
本领域技术人员能够选择适当量的成分用于制剂中。例如,片剂和胶囊通常含有0-20%崩解剂、0-5%润滑剂、0-5%助流剂和/或0-99%(w/w)填料/或填充剂(取决于药物剂量)。它们还可以含有0-10%(w/w)聚合物粘合剂、0-5%(w/w)抗氧化剂、0-5%(w/w)色素。此外,缓释片还可含有0-99%(w/w)控释(例如延迟释放)聚合物(取决于剂量)。片剂或胶囊的薄膜包衣通常包含0-10%(w/w)聚合物、0-3%(w/w)色素和/或0-2%(w/w)增塑剂。
胃肠外制剂通常包含0-20%(w/w)缓冲剂、0-50%(w/w)助溶剂和/或0-99%(w/w)注射用水(WFI)(取决于剂量,且如果是冻干)。肌肉内贮库制剂也可以含有0-99%(w/w)油。
用于口服施用的药物组合物可通过以下获得,将活性成分与固体载体组合,如果需要,将所得到的混合物造粒,以及如果需要或必要,在添加适当赋形剂后,将混合物加工成片剂、糖衣丸核心或胶囊。也可将它们掺入到允许活性成分以测定的量扩散或释放的聚合物或蜡状基质中。
本发明的化合物也可以配制成固体分散剂。固体分散剂是两种或两种以上固体的均匀极细分散相。固溶体(分子分散系统)作为一种固体分散体,公知可用于制药技术(参见(Chiou和Riegelman,J.Pharm.Sci.,60,1281-1300(1971)),可用于提高水溶性差的药物的溶解速率和生物利用度。
本发明还提供包含上述固溶体的固体剂型。固体剂型包括片剂、胶囊剂、咀嚼片剂和分散片或泡腾片。已知赋形剂可与固溶体混合以提供所需剂型。例如,胶囊剂可包含与(a)崩解剂和润滑剂或(b)崩解剂、润滑剂和表面活性剂混合的固溶体。此外,胶囊剂可包含填充剂,例如乳糖或微晶纤维素。片剂可以包含与至少一种崩解剂、润滑剂、表面活性剂、填充剂和助流剂混合的固溶体。咀嚼片剂可包含与填充剂、润滑剂和(根据需要)附加的甜味剂(如人工甜味剂)以及合适香料混合的固溶体。固溶体也可以通过将药物溶液和合适的聚合物喷洒到惰性载体(如糖球(“non-pareils”)表面来形成。这些球随后可以装入胶囊或压缩成片剂。
药物制剂可以以“患者药包”的形式提供给患者,该患者药包在单个包装中包含整个疗程,通常是泡罩包装。与传统处方相比,患者药包具有这样的优势,药剂师将大包装供应分成患者的药物供应,这样患者始终可以获得患者药包中包含的包装插页,而这在患者处方中通常是缺失的。已显示,包含包装插页可提高患者对医生指示的依从性。
用于局部使用和鼻腔递送的组合物包括软膏剂、乳膏剂、喷雾剂、贴剂、凝胶剂、液滴剂和插入剂(例如眼内插入剂)。此类组合物可根据已知方法配制。
用于直肠或阴道内施用的制剂的实例包括例如可由含有活性化合物的成型可模塑或蜡状材料形成的栓子和栓剂。活性化合物溶液也可用于直肠施用。
通过吸入施用的组合物可以采用可吸入粉末组合物或液体或粉末喷雾的形式,并且可以使用粉末吸入器装置或气溶胶分配装置以标准形式施用。此类装置是众所周知的。对于吸入施用,粉末制剂通常包含活性化合物连同惰性固体粉末稀释剂,如乳糖。
化合物通常以单位剂型提供,因此通常含有足够的化合物,以提供所需的生物活性水平。例如,制剂可以含有1ng至2g活性成分,例如1ng至2mg活性成分。在这些范围内,化合物的具体子范围为0.1mg至2g活性成分(通常为10mg至1g,例如50mg至500mg),或1mg至20mg(例如1mg至10mg,例如0.1mg至2mg活性成分)。
对于口服组合物,单位剂型可含有1mg至2g,更通常为10mg至1g,例如50mg至1g,例如100mg至1g活性化合物。
活性化合物将以足以达到所需治疗效果的量对有需要的患者(例如人或动物患者)施用。
治疗方法
根据本发明的另一个方面,提供治疗与Shieldin缺陷相关的癌症(尤其是对PARP抑制剂也具有耐药性的癌症)的方法,其包括对有需要的患者施用Polθ抑制剂。
这些化合物通常用于对需要此类施用的个体施用,例如人或动物患者,尤其是人。
这些化合物通常以对治疗或预防有用且通常无毒的量施用。然而,在某些情况下(例如在危及生命的疾病的情况下),施用化合物的益处可能大于任何毒性作用或副作用的缺点,在这种情况下,以与毒性程度相关的量施用化合物,可能被认为是期望的。
化合物可以长期施用以维持有益的治疗效果,或可以仅短期施用。或者,它们可以以连续的方式施用、或以提供间歇剂量的方式(例如脉冲式)施用。
化合物的典型日剂量为每千克体重100pg至100mg,更典型的是每千克体重5ng至25mg,更常见的情况是每千克体重10ng至15mg(例如10ng至10mg,更典型的情况是每千克体重1μg至20mg,例如每千克1μg至10mg),但可以根据需要施用更高或更低的剂量。例如,化合物可以每天或每隔2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、14天、21天或28天重复施用。
化合物可在一定剂量范围内口服施用,例如1至1500mg、2至800mg或5至500mg,例如2至200mg或10至1000mg,剂量的具体实例包括10、20、50和80mg。化合物可每天施用一次或多次。化合物可连续施用(即在治疗方案持续期间每天施用,不间断)。或者,化合物可以间歇施用(即在治疗方案持续期间,连续给药一段时间,如一周,然后停止给药一段时间,如一周,然后连续施用另一段时间,如一周等等)。涉及间歇施用的治疗方案的实例包括如下方案:施用周期为一周施用、一周休息;或者两周施用,一周休息;或者三周施用,一周休息;或者两周施用,两周休息;或者四周施用,两周休息;或者一周施用,三周休息;进行一个或多个周期,例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个周期。
在一个具体的给药计划中,患者将每天输注化合物1小时,持续多达10天,尤其是多达每周5天,并以所需的间隔(如两到四周,尤其是每三周一次)重复该治疗。
更具体而言,患者可以每天输注化合物1小时,持续5天,并且每三周重复一次治疗。
在另一个具体的给药计划中,对患者输注30分钟到1小时,然后进行可变持续时间的维持输注,例如1到5小时,例如3小时。
在另一个具体的给药计划中,对患者连续输注12小时至5天,尤其是连续输注24小时至72小时。
在另一个具体的给药计划中,患者每周口服一次化合物。
在另一个具体的给药计划中,患者每天口服化合物一次,持续7至28天,如7、14或28天。
在另一个具体的给药计划中,患者每天口服化合物一次,持续1天、2天、3天、5天或1周,然后休息所需的天数,以完成一周或两周的周期。
在另一个具体的给药计划中,患者每天口服化合物一次,持续2周,然后休息2周。
在另一个具体的给药计划中,患者每天口服化合物一次,持续2周,然后休息1周。
在另一个具体的给药计划中,患者每天口服化合物一次,持续1周,然后休息1周。
然而,最终,施用化合物的数量和所使用的组合物类型将与正在治疗的疾病或生理状况的性质相称,并由医生决定。
应了解,Polθ抑制剂可作为单一活性剂或与其他抗癌活性剂组合使用。例如,可以进行组合实验,如Chou TC,Talalay P.Quantitative analysis of dose-effectrelationships:the combined effects of multiple drugs or enzyme inhibitors.AdvEnzyme Regulat 1984;22:27–55中所述。
本文定义的化合物可作为唯一治疗剂施用,或可与一种或多种其他化合物(或治疗)联合施用,以治疗具体的疾病状态,例如肿瘤性疾病,如上文定义的癌症。对于上述病症的治疗,本发明的化合物可有利地与一种或多种其他药物组合使用,更具体而言,与癌症治疗中的其他抗癌剂或助剂(治疗中的支持剂)组合使用。可与化合物一起施用(无论是并行施用还是以不同时间间隔施用)的其他治疗剂或治疗的实例包括但不限于:
·拓扑异构酶I抑制剂;
·抗代谢物;
·微管蛋白靶向剂;
·DNA结合剂和拓扑异构酶II抑制剂;
·烷化剂;
·单克隆抗体;
·抗激素;
·信号转导抑制剂;
·蛋白酶体抑制剂;
·DNA甲基转移酶抑制剂;
·细胞因子和视黄醇类化合物(retinoids);
·染色质靶向治疗;
·放射治疗;和
·其他治疗或预防剂。
抗癌剂或助剂(或其盐)的具体实例包括但不限于,选自以下(i)-(xlvii)组和可选地选自(xlviii)组的任何活性剂:
(i)铂化合物,例如顺铂(可选地与氨磷汀组合)、卡铂或奥沙利铂;
(ii)紫杉烷化合物(taxane compound),例如紫杉醇(paclitaxel)、紫杉醇蛋白质结合颗粒(AbraxaneTM)、多西紫杉醇(docetaxel)、卡巴他赛(cabazitaxel)或拉罗他塞(larotaxel);
(iii)拓扑异构酶I抑制剂,例如喜树碱化合物,例如喜树碱、伊立替康(CPT11)、SN-38或拓扑替康;
(iv)拓扑异构酶II抑制剂,例如抗肿瘤表鬼臼毒素或鬼臼毒素衍生物,例如依托泊苷或替尼泊苷;
(v)长春花生物碱类化合物(Vinca alkaloid),例如长春花碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)、脂质体长春新碱(Onco-TCS)、长春瑞滨、长春地辛、长春氟宁(vinflunine)或长春维星(vinvesir);
(vi)核苷衍生物,例如5-氟尿嘧啶(5-FU,可选地与甲酰四氢叶酸组合)、吉西他滨、卡培他滨、替加氟、UFT、S1、克拉屈滨、阿糖胞苷(Ara-C、cytosine arabinoside)、氟达拉滨、氯法拉滨或奈拉滨;
(vii)抗代谢药物,例如氯法拉滨、氨基蝶呤或甲氨蝶呤、阿扎胞苷、阿糖胞苷、氟尿苷、戊甾烷、硫鸟嘌呤、硫嘌呤、6-巯基嘌呤或羟基脲(hydroxycarbamide);
(viii)烷基化剂,如氮芥或亚硝基脲,例如环磷酰胺、苯丁酸氮芥、卡莫司汀(BCNU)、苯达莫司汀、硫替哌、美法仑、曲奥舒凡、洛莫司汀(CCNU)、六甲蜜胺、白消安、达卡巴嗪、雌莫司汀、福莫司汀、异环磷酰胺(可选地与mesna组合)、溴丙哌嗪、甲苄肼、链脲佐菌素、替莫唑胺、尿嘧啶、二氯甲基二乙胺、甲基环己基氯乙基硝基脲或尼莫司汀(ACNU);
(ix)蒽环类药物、蒽二酮和相关药物,例如柔红霉素(daunorubicin)、阿霉素(doxorubicin)(可选地与右雷佐生组合)、阿霉素脂质体制剂(例如CaelyxTM、MyocetTM、DoxilTM)、伊达比星(idarubicin)、米托蒽醌、表阿霉素、安吖啶或戊柔比星(valrubicin);
(x)埃博霉素类药物(Epothilones),例如伊沙匹隆(ixabepilone)、帕图匹隆(patupilone)、BMS-310705、KOS-862和ZK-EPO、埃博霉素A(epothilone A)、埃博霉素B(epothilone B)、去氧埃博霉素B(desoxyepothilone B)(也称为埃博霉素D或KOS-862)、aza-epothilone B(也称为BMS-247550)、aulimalide、isolaulimalide或luetherobin;
(xi)DNA甲基转移酶抑制剂,例如替莫唑胺(temozolomide)、氮胞苷(azacytidine)或地西他滨(decitabine),或SGI-110;
(xii)抗叶酸类药物(Antifolates),例如甲氨蝶呤(methotrexate)、培美曲塞二钠(pemetrexed disodium)或雷替曲塞(raltitrexed);
(xiii)细胞毒性抗生素,例如抗霉素D(antinomycin D)、博莱霉素(bleomycin)、丝裂霉素C(mitomycin C)、更生霉素(dactinomycin)、洋红霉素(carminomycin)、道诺霉素(daunomycin)、左旋咪唑(levamisole)、普卡霉素(plicamycin)或光神霉素(mithramycin);
(xiv)微管蛋白结合剂,例如考布他汀(combrestatin)、秋水仙碱(colchicines)或诺考达唑(nocodazole);
(xv)信号转导抑制剂,如激酶抑制剂(例如EGFR(上皮生长因子受体)抑制剂,VEGFR(血管内皮生长因子受体)抑制剂,PDGFR(血小板衍生生长因子受体)抑制剂,MTKI(多靶点激酶抑制剂),Raf抑制剂,mTOR抑制剂,例如甲磺酸伊马替尼(imatinib mesylate)、厄洛替尼(erlotinib)、吉非替尼(gefitinib)、达沙替尼(dasatinib)、拉帕替尼(lapatinib)、多沃替尼(dovotinib)、阿西替尼(axitinib)、尼洛替尼(nilotinib)、凡德他尼(vandetanib)、瓦他拉尼(vatalinib)、帕唑帕尼(pazopanib)、索拉非尼(sorafenib)、舒尼替尼(sunitinib)、替西罗莫司(temsirolimus)、依维莫司(everolimus)(RAD 001)、维莫非尼(vemurafenib)(PLX4032/RG7204)、达拉非尼(dabrafenib)、康奈替尼(encorafenib),或IκB激酶抑制剂,如SAR-113945、bardoxolone、BMS-066、BMS-345541、IMD-0354、IMD-2560或IMD-1041,或MEK抑制剂,如Selumetinib(AZD6244)和曲美替尼(Trametinib)(GSK1211202);
(xvi)Aurora激酶抑制剂,例如AT9283、barasertib(AZD1152)、TAK-901、MK0457(VX680)、cenisertib(R-763)、danusertib(PHA-739358)、alisertib(MLN-8237)或MP-470;
(xvii)CDK抑制剂,例如AT7519、roscovitine、seliciclib、alvocidib(flavopiridol)、dinaciclib(SCH-727965)、7-羟基星形孢菌素(UCN-01)、JNJ-7706621、BMS-387032(又名SNS-032)、PHA533533、PD332991,ZK-304709,或AZD-5438
(xviii)PKA/B抑制剂和PKB(akt)途径抑制剂,例如AKT抑制剂,如KRX-0401(perifosine/NSC 639966)、ipatasertib(GDC-0068;RG-7440)、afuresertib(GSK-2110183;2110183)、MK-2206、MK-8156、AT13148、AZD-5363、磷酸曲西瑞宾(triciribinephosphate)(VQD-002;磷酸曲西瑞宾一水合物(API-2;TCN-P;TCN-PM;VD-0002)、RX-0201、NL-71-101、SR-13668、PX-316、AT13148、AZ-5363、Semaphore、SF1126或盐酸Enzastaurin(LY317615),或MTOR抑制剂,如雷帕霉素类似物,如RAD 001(依维莫司)、CCI779(替西罗莫司)、AP23573和地磷莫司(ridaforolimus)、西罗莫司(sirolimus)(最初称为雷帕霉素)、AP23841和AP23573,钙调蛋白抑制剂,例如CBP-501(Forkhead转位抑制剂)、盐酸enzastaurin(LY317615),或PI3K抑制剂,如dactolisib(BEZ235)、buparlisib(BKM-120;NVP-BKM-120)、BYL719、copanlisib(BAY-80-6946)、ZSTK-474、CUDC-907、apitolisib(GDC-0980;RG-7422)、pictilisib(pictrelisib、GDC-0941、RG-7321)、GDC-0032、GDC-0068、K-2636771、idelalisib(原名CAL-101、GS 1101、GS-1101)、MLN1117(INK117)、MLN0128(INK128)、IPI-145(INK1197)、LY-3023414、ipatasertib、afuresertib、MK-2206、MK-8156、LY-3023414、LY294002、SF1126或PI-103或sonolisib(PX-866);
(xix)Hsp90抑制剂,例如AT13387、除莠霉素(herbimycin)、格尔德霉素(GA)、17-烯丙基氨基-17-去甲氧基格尔德霉素(17-AAG),例如NSC-330507、Kos-953和CNF-1010、17-二甲氨基乙基氨基-17-去甲氧基格尔德霉素盐酸盐(17-DMAG),例如NSC-707545和Kos-1022、NVP-AUY922(VER-52296)、NVP-BEP800、CNF-2024(BIIB-021口服嘌呤)、ganetespib(STA-9090)、SNX-5422(SC-102112)或IPI-504;
(xx)单克隆抗体(未缀合或缀合放射性同位素、毒素或其他活性剂)、抗体衍生物和相关活性剂,如抗CD、抗VEGFR、抗HER2、抗CTLA4、抗PD-1或抗EGFR抗体,例如利妥昔单抗(CD20),奥法木单抗(CD20),ibritumomab tiuxetan(CD20),GA101(CD20),托西单抗(CD20),依帕珠单抗(CD22),林妥珠单抗(CD33),吉妥珠单抗(CD33),阿仑单抗(CD52),加利昔单抗(CD80))、曲妥珠单抗(HER2抗体)、帕妥珠单抗(HER2)、曲妥珠单抗-DM1(HER2)、厄妥昔单抗(HER2和CD3)、西妥昔单抗(EGFR)、帕尼单抗(EGFR)、奈昔单抗(EGFR)、尼妥珠单抗(EGFR)、贝伐单抗(VEGF))、catumaxumab(EpCAM和CD3)、abagovomab(CA125)、farletuzumab(叶酸受体)、elotuzumab(CS1)、denosumab(RANK配体)、figitumumab(IGF1R)、CP751,871(IGF1R)、mapatumumab(TRAIL受体)、metMAB(met)、mitumomab(GD3神经节苷脂)、naptumomab estafenatox(5T4)、siltuximab(IL6),或免疫调节剂,例如CTLA-4阻断抗体和/或针对PD-1和PD-L1和/或PD-L2的抗体例如ipilimumab(CTLA4)、MK-3475(pembrolizumab,原名lambrolizumab,抗PD-1),nivolumab(抗PD-1),BMS-936559(抗PD-L1),MPDL320A,AMP-514或MEDI4736(抗PD-L1),或tremelimumab(以前为ticilimumab,CP-675,206,抗CTLA-4);
(xxi)雌激素受体拮抗剂或选择性雌激素受体调节剂(SERM)或雌激素合成抑制剂,例如他莫昔芬(tamoxifen)、氟维司群(fulvestrant)、托瑞米芬(toremifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、faslodex或雷洛昔芬(raloxifene);
(xxii)芳香酶抑制剂及相关药物,如依西美坦(exemestane)、阿那曲唑(anastrozole)、来曲唑(letrazole)、睾内酯氨基谷氨酰胺(testolactoneaminoglutethimide)、米托坦(mitotane)或伏罗唑(vorozole);
(xxiii)抗雄激素(即雄激素受体拮抗剂)和相关药物,例如比卡鲁胺(bicalutamide)、尼鲁米特(flutamide)、氟他胺(cyproterone)、环丙孕酮(nilutamide)或酮康唑(ketoconazole);
(xxiv)激素及其类似物,如甲羟孕酮、己烯雌酚(又称二乙基己烯雌酚)或奥曲肽;
(xxiv)激素及其类似物,例如甲羟孕酮(medroxyprogesterone)、己烯雌酚(diethylstilbestrol)(又名diethylstilboestrol)或奥曲肽(octreotide);
(xxv)类固醇,例如屈他雄酮丙酸酯(dromostanolone propionate)、醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)、诺龙(nandrolone)(癸酸盐、苯丙酸盐)、氟甲睾酮(fluoxymestrone)或棉酚(gossypol);
(xxvi)类固醇细胞色素P450 17α-羟化酶-17,20-裂解酶抑制剂(CYP17),例如阿比特龙(abiraterone);
(xxvii)促性腺激素释放激素激动剂或拮抗剂(GnRA),例如阿巴瑞克(abarelix)、醋酸戈舍瑞林(goserelin acetate)、醋酸组瑞林(histrelin acetate)、醋酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)、布舍瑞林(buserelin)、曲普瑞林(triptorelin)或德舍瑞林(deslorelin);
(xxviii)糖皮质激素,例如泼尼松(prednisone)、泼尼松龙(prednisolone)、地塞米松(dexamethasone);
(xxix)分化剂,例如维甲酸类、rexinoids、维生素D或视黄酸和视黄酸代谢阻断剂(RAMBA),例如accutane、alitreinoin、bexarotene或维甲酸(tretinoin);
(xxx)法尼基转移酶抑制剂,例如替吡法尼(tipifarnib);
(xxxi)染色质靶向治疗剂,如组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂,例如帕比司他(panobinostat)、瑞米诺司他(resminostat)、阿贝西诺司他(abexinostat)、伏立诺司他(vorinostat)、罗米地蛋白酶(romidepsin)、贝利诺司他(belinostat)、恩替诺司他(entinostat)、奎西诺司他(quisinostat)、普拉西诺司他(pracinostat)、特氟诺司他(tefinostat)、莫西诺司他(mocetinostat)、吉维诺司他(givinostat)、CUDC-907、CUDC-101、ACY-1215、MGCD-290、EVP-0334、RG-2833、4SC-202、罗米地蛋白酶、AR-42(俄亥俄州立大学)、CG-200745、丙戊酸(valproic acid)、CKD-581、丁酸钠、辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)、depsipeptide(FR 901228)、达诺司他(dacinostat)(NVP-LAQ824)、R306465/JNJ-16241199、JNJ-26481585、曲古抑菌素(trichostatin)A、chlamydocin A-173、JNJ-MGCD-0103、PXD-101或apicidin;
(xxxii)蛋白酶体抑制剂,例如硼替佐米(bortezomib)、卡非佐米(carfilzomib)、德兰佐米(delanzomib)(CEP-18770)、伊沙唑米布(ixazomib)(MLN-9708)、奥普唑米(oprozomib)(ONX-0912)或马里佐米(marizomib);
(xxxiii)光动力药物,例如porfimer sodium或替莫泊芬(temoporfin);
(xxxiv)海洋生物衍生抗癌剂,如trabectidin;
(xxxv)用于放射免疫治疗的放射性标记药物,例如具有发射β粒子的同位素(例如碘-131、钇-90)或发射α粒子的同位素(例如铋-213或锕-225),例如ibritumab或碘-tositumab;
(xxxvi)端粒酶抑制剂,例如telomestatin;
(xxxvii)基质金属蛋白酶抑制剂,例如batimastat、marimastat、prinostat或metastat;
(xxxviii)重组干扰素(例如干扰素-γ和干扰素-α)和白介素(例如白介素2),例如阿地白介素(aldesleukin)、地尼白介素(denileukin diftitox)、干扰素α2a、干扰素α2b或聚乙二醇干扰素α2b;
(xxxix)选择性免疫反应调节剂,例如沙利度胺(thalidomide)或来那度胺(lenalidomide);
(xl)治疗性疫苗,如sipuleucel-T(Provenge)或OncoVex;
(xli)细胞因子激活剂,包括Picibanil、罗莫泰德(Romurtide)、Sizofiran、Virulizin或胸腺肽(Thymosin);
(xlii)三氧化二砷;
(xliii)G蛋白偶联受体(GPCR)抑制剂,例如阿曲森坦(atrasentan);
(xliv)酶,如L-天冬酰胺酶、聚乙二醇天冬酰胺酶、拉布立酶(Rasburicase)或pegademase;
(xlv)DNA修复抑制剂,如PARP抑制剂,例如奥拉帕利、维拉帕利、伊尼帕利、鲁卡帕利(AG-014699或PF-0136738)、他拉唑帕利(talazoparib)或AG-014699;
(xlvi)DNA损伤反应抑制剂,如ATM抑制剂AZD0156 MS3541、ATR抑制剂AZD6738、M4344、M6620 wee1抑制剂AZD1775;
(xlvii)死亡受体(例如TNF相关凋亡诱导配体(TRAIL)受体)的激动剂,如mapatumumab(原为HGS-ETR1)、conatumumab(原为AMG 655)、PRO95780、利沙单抗(lexatumumab)、杜拉乐明(dulanermin)、CS-1008、apomab或重组TRAIL配体,如重组人TRAIL/载脂蛋白2配体;
(xlviii)预防剂(辅助剂);即,减少或减轻化疗剂相关的一些副作用的活性剂,例如
-止吐剂,
–预防或缩短化疗相关中性粒细胞减少持续时间,并预防因血小板、红细胞或白细胞水平降低引起的并发症的药物,例如白介素-11(例如oprelvekin)、促红细胞生成素(EPO)及其类似物(例如阿法达贝泊(darbepoetin alfa)),集落刺激因子类似物,如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)(例如沙格司亭(sargramostim))和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)及其类似物(例如非格司亭(filgrastim)、聚乙二醇非格司亭),
–抑制骨重吸收的活性剂,如地诺沙单抗(denosumab)或双膦酸盐(bisphosphonates),如唑来膦酸盐(zoledronate)、唑来膦酸(zoledronic acid)、帕米膦酸(pamidronate)和伊班膦酸(ibandronate),
–抑制炎症反应的活性剂,如地塞米松、泼尼松(prednisone)和泼尼松龙(prednisolone),
–用于降低患有肢端肥大症或其他罕见的产激素肿瘤的患者血液中生长激素和IGF-I(及其他激素)水平的药物,如合成形式的生长抑素,如醋酸奥曲肽(octreotideacetate),
–降低叶酸水平的药物的解毒剂,如甲酰四氢叶酸或叶酸,
-止痛剂,例如吗啡、二吗啡和芬太尼等阿片类药物,
–非甾体抗炎药(NSAID),如COX-2抑制剂,例如塞来昔布(celecoxib)、埃托昔布(etoricoxib)和卢米拉昔布(lumiracoxib),
-用于粘膜炎的药物,例如帕利夫明(Palifermin),
–用于治疗副作用的药物,包括厌食症、恶病质、水肿或血栓栓塞发作,如醋酸甲地孕酮。
在一个实施方案中,抗癌剂选自重组干扰素(例如干扰素-γ和干扰素-α)和白介素(例如白介素2),例如阿地白介素(aldesleukin)、地尼白介素(denileukin diftitox)、干扰素α2a、干扰素α2b或聚乙二醇干扰素α2b;干扰素-α2(500μ/ml),尤其是干扰素-β;以及信号转导抑制剂,例如激酶抑制剂(例如EGFR(上皮生长因子受体)抑制剂、VEGFR(血管内皮生长因子受体)抑制剂、PDGFR(血小板衍生生长因子受体)抑制剂、MTKI(多靶点激酶抑制剂)、Raf抑制剂、mTOR抑制剂,例如甲磺酸伊马替尼(imatinib mesylate)、厄洛替尼(erlotinib)、吉非替尼(gefitinib)、达沙替尼(dasatinib)、拉帕替尼(lapatinib)、多沃替尼(dovotinib)、阿西替尼(axitinib)、尼洛替尼(nilotinib)、凡德他尼(vandetanib)、瓦他拉尼(vatalinib)、帕唑帕尼(pazopanib)、索拉非尼(sorafenib)、舒尼替尼(sunitinib)、替西罗莫司(temsirolimus)、依维莫司(everolimus)(RAD001)、维莫非尼(vemurafenib)(PLX4032/RG7204)、达拉非尼(dabrafenib)、康奈替尼(encorafenib),或IκB激酶抑制剂,如SAR-113945、bardoxolone、BMS-066、BMS-345541、IMD-0354、IMD-2560或IMD-1041,或MEK抑制剂,如Selumetinib(AZD6244)和曲美替尼(Trametinib)(GSK1211202),Raf抑制剂(例如,维莫非尼)或MEK抑制剂(例如曲美替尼)。
本发明的组合中存在的每一种化合物可以以各自不同的剂量表和通过不同的途径施用。因此,两种或两种以上活性剂的剂量学可以不同:每种活性剂可以在同一时间或不同时间施用。本领域技术人员基于公知常识将知晓待使用的给药方案和联合疗法。例如,本发明化合物可与根据其现有组合方案施用的一种或多种其他活性剂组合使用。下面提供了标准组合方案的实例。
紫杉烷化合物以每平方米体表面积50至400mg(mg/m2)的剂量(例如75至250mg/m2)有利地施用,尤其是每疗程紫杉醇以约175至250mg/m2的剂量、多西紫杉醇以约75至150mg/m2的剂量施用。
喜树碱化合物以每平方米体表面积0.1至400mg(mg/m2)的剂量(例如1至300mg/m2)有利地施用,尤其是每疗程伊立替康以约100至350mg/m2的剂量、拓扑替康以约1至2mg/m2的剂量施用。
抗肿瘤鬼臼毒素衍生物以每平方米体表面积30至300mg(mg/m2)的剂量(例如50至250mg/m2)有利地施用,尤其是每疗程依托泊苷以约35至100mg/m2的剂量、替尼泊苷以约50至250mg/m2的剂量施用。
抗肿瘤长春花生物碱类化合物以每平方米体表面积2至30mg(mg/m2)的剂量有利地施用,尤其是每疗程长春花碱以约3至12mg/m2的剂量、长春新碱以约1至2mg/m2的剂量、长春瑞滨以约10至30mg/m2的剂量施用。
抗肿瘤核苷衍生物以每平方米体表面积200至2500mg(mg/m2)的剂量(例如700至1500mg/m2)有利地施用,尤其是每疗程5-FU以200至500mg/m2的剂量、吉西他滨以约800至1200mg/m2的剂量、卡培他滨以约1000至2500mg/m2的剂量施用。
烷基化剂如氮芥或亚硝基脲以每平方米体表面积100至500mg(mg/m2)的剂量(例如120至200mg/m2)有利地施用,尤其是每疗程环磷酰胺以约100至500mg/m2的剂量、苯丁酸氮芥以约0.1至0.2mg/kg的剂量、卡莫司汀以约150至200mg/m2的剂量、洛莫司汀以约100至150mg/m2的剂量施用。
抗肿瘤蒽环类衍生物以每平方米体表面积10至75mg(mg/m2)的剂量(例如15至60mg/m2)有利地施用,尤其每疗程阿霉素以约40至75mg/m2的剂量、柔红霉素以约25至45mg/m2的剂量、伊达比星以约10至15mg/m2的剂量施用。
抗雌激素剂取决于具体活性剂和正在治疗的病症以每天约1至100mg的剂量有利地施用。他莫昔芬有利地以5至50mg(尤其是10至20mg)的剂量每天两次口服施用,持续治疗足以达到并维持治疗效果的时间。托瑞米芬有利地以约60mg的剂量每天一次口服施用,持续治疗足以达到并维持治疗效果的时间。阿那曲唑有利地以约1mg的剂量每天一次口服施用。屈洛昔芬有利地以约20-100mg的剂量每天一次口服施用。雷洛昔芬有利地以约60mg的剂量每天一次口服施用。依西美坦有利地以约25mg的剂量每天一次口服施用。
抗体以约每平方米体表面积1至5mg(mg/m2)的剂量或如本领域已知(如果不同)的剂量有利地施用。曲妥珠单抗以每平方米体表面积1至5mg(mg/m2)的剂量有利地施用,尤其是每疗程2至4mg/m2。
如果化合物与一种、两种、三种、四种或更多种其他治疗剂(尤其是一种或两种,更特别是一种)进行联合治疗,则化合物可以同时或顺次施用。在后一种情况下,该两种或多种化合物将在一段时间内以足以确保达到有利或协同效应的量和方式施用。当顺次施用时,可以以紧密间隔(例如5-10分钟)或更长间隔(例如间隔1、2、3、4小时或更长时间,或根据需要间隔更长时间)施用,精确的给药方案与治疗剂的性质相称。这些剂量可在每个疗程中施用例如一次、两次或更多次,所述疗程可例如每7、14、21或28天重复一次。
在一个实施方案中,提供化合物用于制造治疗用药物,其中所述化合物与一种、两种、三种或四种其他治疗剂组合使用。在另一个实施方案中,提供包含化合物的用于治疗癌症的药物,其中该药物与一种、两种、三种或四种其他治疗剂组合使用。本发明还提供化合物在制造用于增强或强化正在使用一种、两种、三种或四种其他治疗剂进行治疗的癌症患者的应答率的药物中的用途。
应了解,组合中每个成分的具体施用方法和顺序以及相应给药量和给药方案将取决于正在施用的本发明化合物和具体的其他药物、它们的施用途径、正在治疗的具体肿瘤以及正在治疗的具体宿主。本领域技术人员可利用常规方法并基于本文所述信息容易地确定最佳施用方法和顺序以及给药量和给药方案。
当作为组合施用时,本发明的化合物和一种或多种其他抗癌剂的重量比可由本领域技术人员确定。如本领域技术人员公知,该比例以及确切的施用剂量和频率取决于本发明的具体化合物和所使用的其他抗癌剂、所治疗的具体病症、所治疗病症的严重程度、具体患者的年龄、体重、性别、饮食、施用时间和一般身体状况、施用方式以及个体可能正在服用的其他药物。此外,显而易见,取决于所治疗个体的反应和/或取决于开具本发明化合物处方的医生的评价,每日有效量可以降低或增加。化合物和其他抗癌剂的具体重量比可在1/10至10/1范围内,更具体而言,在1/5至5/1范围内,甚至更具体而言,在1/3至3/1范围内。
本发明化合物还可与非化疗治疗(如放疗、光动力治疗、基因治疗、手术和控制饮食)结合施用。
本发明的化合物还可用于使肿瘤细胞对放疗和化疗敏感。因此,本发明的化合物可以用作“放疗增敏剂”和/或“化疗增敏剂”,或者可以与其他“放疗增敏剂”和/或“化疗增敏剂”组合使用。在一个实施方案中,本发明化合物用作化疗增敏剂。
术语“放疗增敏剂”定义为以治疗有效量对患者施用以增加细胞对电离辐射的敏感性和/或促进可通过电离辐射治疗的疾病的治疗的分子。
术语“化疗增敏剂”定义为以治疗有效量对患者施用以增加细胞对化疗的敏感性和/或促进可通过化学疗法治疗的疾病的治疗的分子。
在一个实施方案中,本发明化合物与“放疗增敏剂”和/或“化疗增敏剂”组合施用。在一个实施方案中,本发明化合物与“免疫增敏剂”组合施用。
术语“免疫增敏剂”定义为以治疗有效量对患者施用以增加细胞对Polθ抑制剂的敏感性的分子。
目前,许多癌症治疗方案采用放疗增敏剂与x射线照射结合。x射线活化的放疗增敏剂的实例包括但不限于以下:甲硝唑(metronidazole)、米索硝唑(misonidazole)、去甲基米索硝唑(desmethylmisonidazole)、哌莫硝唑(pimonidazole)、依他硝唑(etanidazole)、尼莫拉唑(nimorazole)、丝裂霉素C(mitomycin C)、RSU 1069、SR 4233、EO9、RB 6145、烟酰胺(nicotinamide)、5-溴脱氧尿苷(5-bromodeoxyuridine(BUdR))、5-碘脱氧尿苷(5-iododeoxyuridine(IUdR))、溴脱氧胞苷(bromodeoxycytidine)、氟脱氧尿苷(fluorodeoxyuridine(FudR))、羟基脲(hydroxyurea)、顺铂(cisplatin),及其治疗有效的类似物和衍生物。
癌症的光动力疗法(PDT)利用可见光作为致敏剂的辐射激活剂。光动力放疗增敏剂的实例包括但不限于:血卟啉衍生物(hematoporphyrin derivatives)、光扶林(Photofrin)、苯并卟啉衍生物(benzoporphyrin derivatives)、初卟啉锡(tinetioporphyrin)、pheoborbide-a、细菌叶绿素-a(bacteriochlorophyll-a)、萘酞菁(naphthalocyanines)、酞菁(phthalocyanines)、锌酞菁(zinc phthalocyanine),以及其治疗有效的类似物和衍生物。
放疗增敏剂可与治疗有效量的一种或多种其他化合物结合施用,包括但不限于:本发明化合物;促进放疗增敏剂掺入靶细胞的化合物;控制药物、营养素和/或氧气流向靶细胞的化合物;在有或无附加辐射的情况下作用于肿瘤的化疗剂;或其他用于治疗癌症或其他疾病的治疗有效化合物。
化疗增敏剂可与治疗有效量的一种或多种其他化合物结合施用,包括但不限于:本发明化合物;促进化疗增敏剂掺入靶细胞的化合物;控制药物、营养素和/或氧气流向靶细胞的化合物;作用于肿瘤的化疗剂或其他用于治疗癌症或其他疾病的治疗有效化合物。钙拮抗剂,例如维拉帕米(verapamil),发现可用于与抗肿瘤药物组合,以在对公认的化疗剂耐药的肿瘤细胞中建立化疗敏感性,并增强此类化合物在药物敏感性恶性肿瘤中的疗效。
免疫增敏剂的实例包括但不限于:免疫调节剂,例如,单克隆抗体,如免疫检查点抗体[例如CTLA-4阻断抗体和/或抗PD-1和PD-L1和/或PD-L2的抗体,例如ipilimumab(CTLA4)、MK-3475(pembrolizumab,原为lambrolizumab,抗PD-1)、nivolumab(抗PD-1)、BMS-936559(抗PD-L1)、MPDL320A、AMP-514或MEDI4736(抗PD-L1)或tremelimumab(原为ticilimumab,CP-675206,抗CTLA-4)];或信号转导抑制剂;或细胞因子(如重组干扰素);或溶瘤病毒;或免疫佐剂(例如卡介苗)。
免疫增敏剂可与治疗有效量的一种或多种其他化合物结合施用,包括但不限于:本发明化合物;促进免疫增敏剂掺入靶细胞的化合物;控制药物、营养素和/或氧气流向靶细胞的化合物;作用于肿瘤的治疗剂或其他用于治疗癌症或其他疾病的治疗有效化合物。
为了与其他化疗剂进行联合治疗,例如,化合物和一种、两种、三种、四种或更多种其他治疗剂可以一起配制成含有两种、三种、四种或更多种治疗剂的剂型,即在含有所有活性剂的单一药物组合物中。在备选实施方案中,可单独配制各治疗剂,并以药盒的形式一起提供,可选地带有其使用说明书。
在一个实施方案中,提供化合物与一种或多种(例如1种或2种)其他治疗剂(例如上文所述的抗癌剂)的组合。在另一个实施方案中,提供如本文所述的Polθ抑制剂和选自以下的PI3K/AKT途径抑制剂的组合:apitolisib、buparlisib、Copanlisib、pictilisib、ZSTK-474、CUDC-907、GSK-2636771、LY-3023414、ipatasertib、afuresertib、MK-2206、MK-8156、Idelalisib、BEZ235(dactolisib)、BYL719、GDC-0980、GDC-0941、GDC-0032和GDC-0068。
在另一实施方案中,提供化合物与一种或多种(例如1种或2种)其他治疗剂(例如抗癌剂)组合用于治疗,例如用于癌症的预防或治疗。
在一个实施方案中,药物组合物包含化合物以及可药用载体并可选地包含一种或多种治疗剂。
在另一实施方案中,本发明涉及本发明的组合在制备用于抑制肿瘤细胞生长的药物组合物中的用途。
在另一个实施方案中,本发明涉及包含化合物和一种或多种抗癌剂的产品,所述产品为同时、单独或顺次用于治疗癌症患者的组合制剂。
本文提供证据证明,Shieldin缺失是在HR完整(HR proficient)的情况下有效的Polθ抑制剂患者筛选生物标记物(参见实施例5至7和图5至7)。
本文还提供证据证明,Shieldin缺失是在HR缺陷和PARP耐药的情况下有效的Polθ抑制剂患者筛选生物标记物(参见实施例8至12和图8至12)。
本文还提供证据证明,Shieldin缺失是在HR缺陷和PARP敏感的情况下有效的Polθ抑制剂患者筛选生物标记物(参见实施例13和图13)。
本文还提供证据证明,Shieldin缺失是Polθ抑制剂和PARP抑制剂联合治疗的有效生物标记物(参见实施例14和图14)。
实施例
现在将参考以下非限制性实施例来描述本发明:
材料和方法
细胞系与细胞培养
细胞在正常生长条件(37℃、5%CO2)下培养,并在80%汇合时传代。表1列出了所有细胞系及其组织来源、同源重组(HR)状态、培养基和来源。
表1:细胞系信息
缩写:HR:同源重组,FBS:胎牛血清
由于BRCA1基因的功能缺失突变,亲本SUM149乳腺癌细胞天然为同源重组修复缺陷。C20orf196 SUM149细胞是SUM149的衍生物,其具有Shieldin成分C20orf196(SHLD1)的基因缺失(Noordermeer等Nature(2018)560,117-121/Asterand)。
SUM149乳腺癌细胞和衍生的SUM149细胞系C20orf196 SUM149在正常生长条件(37℃,5%CO2)下培养,并在80%汇合时传代。生长培养基由补充5%热灭活胎牛血清(FBS)(Sigma-Aldrich)、10μg/mL胰岛素(Sigma-Aldrich)、0.5μg/mL氢化可的松(Sigma-Aldrich)和青霉素/链霉素(Gibco)的Ham’s F-12培养基(Gibco)组成。
MDA-MB-436、HCC1395和22Rv1细胞系中的REV7-KO和SHLD2-KO克隆由OxfordGenetics按其管线中所述产生。简言之,CRISPR/Cas9的合成向导RNA(sgRNA)设计为特异性靶向目的基因的关键编码外显子。通过瞬时共转染与CRISPR/Cas9蛋白复合的sgRNA,产生携带经编辑的基因的细胞池。分离单个细胞,通过Sanger测序对所靶向的外显子进行测序。对所有等位基因中均存在框外插入/缺失的选定克隆进行扩增,并通过PCR和随后的高通量测序进行验证。REV7蛋白的缺失也通过Western印迹验证。产生了一个REV7 KO 22Rv1克隆以及三个SHLD2 KO HCC1395和MDA-MB-436克隆。
类瘤物(tumouroid)测定试验
将细胞以不同密度接种到384孔高容量成像微孔板中,置于含有10%鼠尾胶原(OcellO)的水凝胶中,以补偿不同的生长特性(表2)。
表2:细胞接种密度
SUM149细胞系 | 每孔接种的细胞数 |
亲本 | 2250 |
C20orf196 KO | 3000 |
REV7 KO | 2250 |
接种24小时后,以三分之一系列稀释和八个剂量点,加入测试化合物和奥拉帕利(Selleckchem)(除REV7 KO细胞实验中化合物A最大浓度为30μM外,所有化合物的最大浓度为12μM)。二甲基亚砜(DMSO)和1μM星形孢菌素(Med Chem Express)处理分别作为阴性对照和阳性对照。所有处理均一式四份进行。
对于20orf196 KO和REV7 KO实验,分别进行七天或十四天的处理后,用5x固定和染色溶液(OcellO)在4℃下固定细胞16小时,以用Hoechst 33258对细胞核进行染色,用罗丹明-鬼笔环肽对肌动蛋白细胞骨架进行染色。用磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤细胞四次,并使用OcellO的三维图像分析软件(Ominer)对板进行成像和分析。对于每个孔,使用配备了4倍放大/0.2NAPlanApo物镜的自动显微镜系统:Molecular Devices ImageXpress MicroXLS,采集两个通道的16位图像栈。对于每个图像切片(n=47),像素大小为0.324μm,z方向的步长为50μm。
DNA修复底物的产生
按Wyatt等(Mol.Cell(2016)63,662-673)所述,产生染色体外MMEJ/NHEJ测定DNA底物,以得到这样的DNA分子,该分子包含中央dsDNA区域,侧翼为45个核苷酸的ssDNA突出端,带有末端互补的4nt微同源物。
检测cNHEJ介导的非粘性DSB修复的报告分子(图4)基于Bennardo等PLoS Genet(2008)4(6):e1000110中所述的“EJ5”报告分子。在这个版本中,GFP开放阅读框被纳米荧光素酶(Promega)取代,DSB侧翼的I-SceI识别位点具有相反的极性以确保它们不互补并需要细胞处理来连接。该构建体由GeneWiz合成,并使用现有的5'KpnI和3'XhoI限制位点亚克隆到pcDNA5/FRT中。通过I-SceI消化和凝胶纯化(Qiagen)产生可转染底物。
GB专利申请号1909439.0(其内容在此引入作为参考)中描述了检测cNHEJ介导的平端DSB修复的报告分子。简言之,可转染底物包含EcoRV切除的平端片段,该片段通过琼脂糖凝胶电泳从载体骨架分离,并通过凝胶提取(Qiagen)纯化。EcoRV位点位于纳米荧光素酶开放阅读框内,因此需要无末端处理的cNHEJ介导的连接,以在细胞修复后维持完整的ORF。
染色体外MMEJ/NHEJ测定试验
按照Wyatt等(Mol.Cell(2016)63,662-673)中的描述,其中修改以使用脂质介导的DNA底物转染,进行该测定。将500,000个HCC1937细胞与0.1%DMSO在37℃下在盖有松散盖子的15ml试管中孵育。然后用500ng Firefly荧光素酶质粒和2.5μg MMEJ/NHEJ DNA底物转染细胞。按照制造商的说明,用JetTime(Polyplus)进行脂质转染。简言之,将DNA和转染试剂在200μL转染缓冲液中以1μg:2μL的比例混合,并在室温下孵育10分钟,然后添加到细胞中。将转染的细胞接种在6孔板中,最终体积为2mL含有0.1%DMSO的培养基,并在37℃下培养24小时。通过胰蛋白酶消化收集细胞,并用PBS洗涤一次。然后将细胞在含12.5U/mLbenzonase的HBSS中37℃孵育15分钟。在PBS中洗涤细胞两次。按照制造商的说明,使用DNA迷你试剂盒(Qiagen)提取基因组DNA。为了检测MMEJ,按照制造商的说明,使用KOD热启动聚合酶试剂盒(Merck)进行PCR。每个反应添加100ng基因组DNA,引物序列(正向5’CTTACGTTTGATTTCCCTGACTATACAG-3’(SEQ ID NO:1),反向5’-AGCAGGGTAGCCAGTCTGAGATGGG-3’(SEQ ID NO:2))。将编码MMEJ和NHEJ产物的质粒作为对照。PCR反应在Eppendorf热循环仪中进行,使用以下程序:95℃2分钟,[95℃20秒,64℃ 10秒,70℃ 10秒]x35个循环,70℃ 1分钟,4℃保持。样品在6%TBE凝胶(Invitrogen)上分离。凝胶在室温下在含1X SYBRSafe(Invitrogen)的TBE中孵育5分钟,并使用Amersham AI600成像仪成像。
染色体外纳米荧光素酶NHEJ报告分子测定试验
通过胰蛋白酶消化收集细胞,用DPBS(PAN Biotech)洗涤,在新鲜培养基中重悬,并计数。将200,000个细胞以400x g离心5分钟,并重悬在20μL含有纳米荧光素酶DNA底物和Firefly荧光素酶质粒(Promega)的补充SE核转染溶液(Lonza)中。
对于HCT116细胞(野生型和NHEJ缺陷型),报告分子底物与对照质粒的比率为1μg纳米荧光素酶底物:400ng Firefly质粒。对于HCC1937细胞,该比率为103.9ng纳米荧光素酶底物:400ng Firefly质粒。
将细胞转移到比色皿中,在4D nucleofector X装置(Lonza)上使用程序EN-113(HCT116)或EN-138(HCC1937)电穿孔,并将其回收到新鲜培养基中,最终密度为250,000个细胞/mL。将每个孔20,000个细胞(80μL悬液)接种在白色96孔微孔板(Costar 3610)中,并在37℃下培养24小时。
按照制造商的说明,使用报告分子测定系统(Promega)检测Firefly和纳米荧光素酶水平,并使用制造商的方案“Firefly”和“纳米荧光素酶”,使用Clariostar读板器(BMG Labtech)测量发光。在每个孔中,将纳米荧光素酶信号对Firefly信号归一化,用作细胞密度和转染效率的量度。
Western印迹
HCT116细胞在标准Laemmli缓冲液中裂解,在100℃下煮沸10分钟,并使用27G针头进行机械剪切。使用BCA测定(Thermo)测量蛋白质浓度。将裂解产物与含有β-巯基乙醇的蛋白质上样染料(Life Technologies)混合,并在4-12%Bis-Tris蛋白质凝胶(Thermo)上以150V电泳70分钟。使用iBlot 2凝胶转移装置(Thermo)和预设程序P3,将蛋白质转移到0.2μm硝化纤维素膜(Thermo)上。通过在Ponceau S(Sigma)中短暂孵育显示总蛋白质,并在Amersham AI600成像仪中成像。将膜在含有5%BSA的含0.1%吐温20的TBS缓冲液(TBST)中在室温下孵育2小时,然后在4℃与一抗孵育过夜。将膜在TBST中洗涤两次,然后在室温下在二抗中孵育1小时。膜在TBST中洗涤四次,覆盖ECL检测试剂(GE Healthcare),并暴露在Amersham AI600成像仪中。以下抗体用于Western印迹:LIG4(Abcam ab193353)、XLF(Abcamab33499)、XRCC4(SCBT sc-271087)、山羊抗小鼠IgG HRP(Thermo 31430)、山羊抗兔IgGHRP(Thermo 31460)。一抗和二抗分别1:1000和1:2000稀释在5%BSA中。
CRISPR KO筛选
CRISPR KO筛选、样品制备和数据分析由Horizon Discovery利用针对1965个基因的CRISPR文库进行,其中每个基因有10个gRNA。DLD-1结肠癌细胞在含有10%FBS的RPMI培养基中生长,感染慢病毒文库(每个病毒颗粒含有Cas9和sgRNA),用嘌呤霉素选择2周,并用化合物B(EC17.1%)或DMSO处理15天。通过将来自化合物处理细胞的sgRNA计数相对于DMSO处理对照进行标准化,以计算合成致死性分数。
Q-PCR
按照制造商方案,在ViiA7实时PCR系统中使用Applied Biosystems测定,进行实时Q-PCR。简言之,收集细胞沉淀,按照制造商的说明,使用RNeasy Plus迷你试剂盒(Qiagen)提取RNA。在384孔板的10μl反应中,逆转录和PCR扩增反应包含30ng RNA,使用Luna Universal Probe一步RT-qPCR试剂盒(NEB)和表3中列出的基因特异性Taqman Q-PCR扩增探针组(Applied Biosystems)。使用表4所述的方案进行PCR反应。FAM-(测试基因)和VIC-(管家基因)标记测定试验在同一个孔中复合。
表3:Taqman探针组
基因 | 荧光团 | 测定ID |
GAPDH | VIC | Hs99999905_m1 |
ACTB | VIC | Hs99999903_m1 |
FAM35A N1 | FAM | Hs00414285_m1 |
FAM35A N2 | FAM | Hs04189036_m1 |
表4:RT-PCR方案
使用QuantStudio实时PCR软件对数据进行分析,以计算每个基因的CT值(循环阈值)。△CT计算为测试基因的CT减去管家基因的CT。将相对表达计算为2^(-△CT)乘以100,以将测试基因的表达表示为管家基因的表达的百分比。
siRNA筛选
siRNA文库购自Dharmacon。每个孔包含靶向靶转录物的不同序列的四种不同siRNA的SMART pool、以及靶向Shieldin复合物成分的单个siRNA。每个平板补充阴性siCONTROL(12个孔;Dharmacon)和阳性对照(4个孔,siPLK1,Dharmacon)。按先前所述(Lord等DNA Repair(2008)7,2010-2019)优化RNAi筛选条件并产生原始CellTitre-Glo(Promega)发光存活率读数。转染后24h以5μM(CAL51)或10μM(RPE TP53-/-BRCA1缺陷)浓度在培养基中添加化合物A或载体(DMSO),使细胞暴露5天。siRNA筛选的统计分析按其他地方所述(Lord等DNA Repair(2008)7,2010-2019)进行。简言之,在暴露化合物A和DMSO的细胞中来自CellTitre Glo测定的发光值经过log2转换,然后相对于平板中位数(PM)效应归一化。使用以下公式,从PM归一化数据计算药物效应(DE)分数:DE=(存在化合物A情况下的log2 PM归一化siRNA信号)-(不存在化合物A情况下的log2 PM归一化siRNA信号)。然后根据筛选中位数和中位数绝对偏差值,对DE值进行Z分数标准化。
集落形成测定试验
指数生长期的细胞用胰蛋白酶脱壁,计数并以表5所示的密度重悬在培养基中。在24孔板的每孔中接种1mL细胞,一式三份,并在37℃下培养过夜。在表5中所列的时间点,用七点剂量反应曲线和三分之一系列稀释化合物,处理细胞。对于MDA-MB-436细胞,每五天更换一次培养基。
表5:集落形成测定试验的接种密度和终点
细胞系 | 群体 | 密度(细胞/mL) | 实验终点(天) |
22Rv1 | 亲本 | 400 | 14 |
22Rv1 | REV7 KO克隆 | 3200 | 14 |
MDA-MB-436 | 亲本 | 1000 | 14 |
MDA-MB-436 | SHLD2 KO克隆D1 | 3000 | 14 |
MDA-MB-436 | SHLD2 KO克隆G4 | 1500 | 14 |
MDA-MB-436 | SHLD2 KO克隆G1 | 3000 | 14 |
HCC1395 | 亲本 | 2500 | 15 |
HCC1395 | SHLD2 KO克隆E6 | 2500 | 15 |
HCC1395 | SHLD2 KO克隆G2 | 5000 | 15 |
HCC1395 | SHLD2 KO克隆E5 | 5000 | 15 |
用70%乙醇,在室温下摇动,固定细胞20分钟。然后用0.04%结晶紫(Sigma-Aldrich)在室温下摇动染色细胞20分钟。用水洗涤细胞6次,并风干过夜。
使用Gelcount(Oxford Optronix)对平板进行成像,并使用针对每个细胞系优化的参数对集落进行计数。22Rv1存活率曲线从集落计数单独产生。MDA-MB-436和HCC1935存活率曲线从溶解的集落产生。使用10%乙酸(VWR)溶解集落30分钟,使用Clariostar读板器(BMG Labtech)读取595nm吸光度,并应用空白校正。通过将化合物处理的孔相对于DMSO处理的孔进行归一化,来计算相对存活。
集落形成测定(ICR)试验
克隆存活(clonogenic survival)测定试验如前所述(Edwards等Nature(2008)451,1111-1115;Farmer等Nature(2005)434,917-921)进行。为了测量对化合物A抑制剂的敏感性,将指数生长的细胞以每孔1000-2000个细胞的浓度接种在六孔板中。对于化合物A,细胞连续暴露于含有药物的培养基,每72小时更换一次药物。14天后,将细胞固定并用sulphorhodamine-B(Sigma)染色,并计数集落。如前所述(Farmer等Nature(2005)434,917-921)计算SF并绘制药物敏感性曲线。
对奥拉帕利的重敏化
为了测量对奥拉帕利的重敏化,将指数生长的细胞暴露于化合物A 48小时。之后,将细胞以每孔1000-2000个细胞的浓度接种在96孔培养板中。接种后24小时,开始奥拉帕利处理,细胞连续暴露于含有药物的培养基,每72小时更换一次药物。10天后,使用Cell-Titre Glo(Promega)估计细胞存活率。如前所述(Farmer等Nature(2005)434,917-921)计算SF并绘制药物敏感性曲线。
实施例1:Polθ和PARP抑制剂对亲本和C20orf196 KO SUM149类瘤物大小的影响
研究了两种DNA聚合酶θ(Polθ)抑制剂(化合物A和化合物B)和PARP抑制剂奥拉帕利对亲本和C20orf196缺失(C20orf196 KO)SUM149类瘤物大小的影响。
将亲本或C20orf196 KO SUM149细胞接种到384孔板中含有胶原蛋白的水凝胶中,并培养过夜。产生的类瘤物用Polθ抑制剂或奥拉帕利的系列稀释液处理七天,固定,并染色以显示DNA和F-肌动蛋白。对平板进行成像,并使用OcellO的三维图像分析软件测量类瘤物大小。
结果显示在图1中,证明C20orf196 KO细胞比亲本细胞对两种Polθ抑制剂都更敏感,表现为类瘤物大小的减少更大。相比之下,C20orf196 KO细胞对奥拉帕利的敏感性低于亲本细胞,表现为类瘤物大小的减少更小。
实施例2:Polθ和PARP抑制剂对亲本和C20orf196 KO SUM149类瘤物生长的影响
研究了两种DNA聚合酶θ(Polθ)抑制剂(化合物A和化合物B)和PARP抑制剂奥拉帕利对亲本和C20orf196 KO SUM149类瘤物生长的影响。
将亲本或C20orf196 KO SUM149细胞接种到384孔板中含有胶原蛋白的水凝胶中,并培养过夜。产生的类瘤物用Polθ抑制剂或奥拉帕利的系列稀释液处理七天,固定,并染色以显示DNA和F-肌动蛋白。对平板进行成像,并使用OcellO的三维图像分析软件计算每个类瘤物的细胞核数。
结果显示在图2中,证明C20orf196 KO细胞比亲本细胞对两种Polθ抑制剂都更敏感,表现为每个类瘤物的细胞核数的减少更多。相比之下,C20orf196 KO细胞对奥拉帕利的敏感性低于亲本细胞,表现为每个类瘤物的细胞核数的减少更小。
实施例3:Polθ和PARP抑制剂对亲本和C20orf196 KO SUM149类瘤物培养物中死细胞比例的影响
研究了两种Polθ抑制剂(化合物A和化合物B)和PARP抑制剂奥拉帕利对亲本和C20orf196 KO SUM149类瘤物培养物中死亡细胞比例的影响。
将亲本或C20orf196 KO SUM149细胞接种到384孔板中含有胶原蛋白的水凝胶中,并培养过夜。产生的类瘤物用Polθ抑制剂、奥拉帕利或对照化合物(以所示浓度)处理七天,固定,并染色以显示DNA和F-肌动蛋白。对平板进行成像,并使用OcellO的三维图像分析软件,计算没有相关肌动蛋白细胞骨架的细胞核比例。
结果显示在图3中,证明与亲本细胞相比,两种Polθ抑制剂在C20orf196 KO细胞中均诱导了显著更多的细胞死亡。相比之下,与亲本细胞相比,奥拉帕利在C20orf196 KO细胞中诱导了显著较少的细胞死亡。
实施例4:SHLD2缺失的HCC1937细胞中染色体外底物的经典NHEJ修复是完整的
使用检测DSB修复的测定试验,研究了含有SHLD2基因缺失的HCC1937细胞中cNHEJ介导的修复的完整性,该测定使用可转染入细胞并通过细胞机制修复的染色体外DNA底物。
图4所示的结果显示,HCC1937细胞能够进行稳健的cNHEJ,这由(a)中PCR检测到的cNHEJ产物形成、和设计用于检测cNHEJ介导的非粘性末端修复(需要部分末端处理和连接)的细胞报告分子测定试验中发光蛋白的产生所证实。相比之下,具有核心NHEJ机器成分(连接酶IV、XLF和XRCC4)缺陷的细胞中,这些底物的修复几乎完全被消除(图(e)中的右图)。
实施例5:DLD1癌细胞中REV7KO和Polθ抑制之间的合成致死性
在DLD1结肠癌细胞系中评估了Polθ抑制剂(化合物B)与1965个基因中任一个的敲除之间的合成致死效应。使用暴露于DMSO的细胞(化合物载体)作为对照,按近似EC20使用化合物B,在DLD1细胞中进行CRISPR KO筛选。通过下一代测序测量含有每个sgRNA的细胞的数量。(图5(a))基于FDR分数连同与经验证的合成致死性伴侣BRCA2的比较,在所筛选的1935个基因中,REV7位列前50名。(b)基于log倍数变化,REV7进入了前25名。图5的图b显示了10个不同的CRISPR-Cas9向导RNA(gRNA)在KO筛选中的表现。10个gRNA中有7个与Polθ抑制存在合成致死性。
实施例6:Cal51细胞中Polθ抑制和REV7缺失之间的合成致死
为了发现与Polθ抑制剂合成致死的基因,使用CAL51乳腺癌细胞,使用1280个siRNA进行了siRNA筛选。以384孔板阵列型式,用siRNA SMARTPools转染细胞,然后在24小时后暴露于DMSO或化合物A。然后在化合物A或DMSO存在下继续培养细胞5天,此时使用CellTitre-Glo试剂(测量细胞ATP水平的发光测定试验)测量细胞的存活率。对384孔板的每个孔的发光值进行log2转换,然后相对于每块板上的中位数信号归一化(以解释板间变异)。通过比较DMSO和化合物A暴露细胞中每个siRNA SMARTPool的归一化值,计算每个siRNA对化合物A敏感性的影响,表示为药物效应(DE)Z分数。Z分数<-2.0表明siRNA和化合物A之间存在显著的合成致死效应。如图6所示,REV7是位列前面的基因之一,Z分数为-2.88,表明REV7的基因沉默导致对化合物A的敏感性。
实施例7:Polθ和PARP抑制剂对亲本和REV7 KO 22Rv1细胞存活的影响
在集落形成测定试验(CFA-见上述方案)中,研究了DNA聚合酶θ(Polθ)抑制剂(化合物A)或PARP抑制剂奥拉帕利对亲本(REV7野生型)或REV7缺失(REV7 KO)22Rv1细胞存活的影响。简言之,每个细胞群(亲本或REV7缺失)在体外培养中以低密度接种,暴露于不同浓度的化合物2周,并且计数在此时间后存活的集落数作为实验终点,以计算Polθ抑制剂或PARP抑制剂暴露细胞与药物载体(DMSO)暴露细胞的相对存活。22Rv1是一种对PARP抑制剂耐药的前列腺癌细胞系。图7所示的结果显示,与REV7野生型22Rv1亲本细胞相比,REV7 KO22Rv1细胞对Polθ抑制剂(化合物A,a中及c的左图中)的敏感性显著更高,表现为REV7 KO细胞的相对存活降低。REV7 KO 22Rv1细胞仍然对PARP抑制剂(奥拉帕利,b中及c的右图中)保持耐药,表现为REV7野生型和REV7 KO细胞中具有类似的存活比例。
实施例8:RPE1 TP53-/-BRCA1-/-细胞中Polθ抑制和Shieldin基因之间的合成致死性
为了在缺乏同源重组DSBR的细胞中发现与Polθ抑制剂合成致死的基因,使用BRCA1缺陷的RPE1 TP53-/-BRCA1-/-细胞,使用1418个siRNA进行了siRNA筛选。按图8中针对CAL51筛选所述进行了筛选和分析。REV7和SHLD2(FAM35A)是位列前面的两个基因(图8(a)),确认了SHLD成分缺陷和Polθ抑制剂敏感性之间的关联性。
实施例9:Polθ和PARP抑制剂对SUM149亲本(C20ORF196/SHLD1野生型,BRCA1突变体)和具有CRISPR-Cas9产生的C20ORF196有害突变的SUM149子代克隆的生长的影响
研究了化合物A或PARP抑制剂奥拉帕利对SUM149亲本(C20ORF196/SHLD1野生型,BRCA1突变体)和具有CRISPR-Cas9产生的C20ORF196有害突变的两个不同的SUM149子代克隆(KO细胞系A和D)的生长的影响。
将亲本或C20orf196 KO SUM149细胞接种到6孔板中,并培养过夜。然后将细胞暴露于Polθ抑制剂或奥拉帕利的系列稀释液中14天,固定,并用sulphorhodamine B染色。计数每个孔中的集落,并将归一化的存活数据作图,以产生剂量-反应曲线,如前所述。
结果如图9所示,证明C20orf196 KO细胞比亲本细胞对Polθ抑制剂更敏感,表现为集落数量的减少更多。相比之下,正如预期的那样,亲本SUM149细胞对PARP抑制剂奥拉帕利高度敏感(由于其BRCA1突变),但C20orf196 KO克隆比亲本细胞对奥拉帕利的耐药性更高,表现为与该药物孵育后集落的减少更小。
实施例10:Polθ和PARP抑制剂对亲本和REV7 KO SUM149集落的生长的影响
研究了化合物A或PARP抑制剂奥拉帕利对亲本和REV7 KO SUM149细胞的生长的影响。
将亲本或REV7 KO SUM149细胞接种到6孔板中,并培养过夜。然后,用Polθ抑制剂或奥拉帕利的系列稀释液处理细胞14天,固定,并用sulphorhodamine B染色。计数每个孔中的集落,将归一化的存活数据作图,以产生剂量-反应曲线。
结果如图10所示,证明REV7 KO细胞比亲本细胞对Polθ抑制剂更敏感,表现为集落数量的减少更大。相比之下,与亲本细胞相比,所有三个REV7 KO克隆对奥拉帕利的耐药性更强,表现为与该药物孵育后集落的减少更小。
实施例11:Polθ和PARP抑制剂对亲本和REV7 KO SUM149类瘤物培养物中死亡细胞比例的影响
研究了DNA聚合酶θ(Polθ)抑制剂(化合物A)和PARP抑制剂奥拉帕利对亲本和REV7缺失(REV7 KO)SUM149类瘤物中死亡细胞比例的影响。
将亲本或REV7 KO SUM149细胞接种到384孔板中含有胶原蛋白的水凝胶中,并培养过夜。用Polθ抑制剂、奥拉帕利或对照化合物(以所示浓度)处理产生的类瘤物14天,固定,并染色以显示DNA和F-肌动蛋白。对平板进行成像,并使用OcellO的三维图像分析软件计算没有相关肌动蛋白细胞骨架的细胞核比例。
结果如图11所示,证明与亲本细胞相比,Polθ抑制剂在REV7 KO细胞中诱导了显著更多的细胞死亡。相比之下,与亲本细胞相比,奥拉帕利在REV7 KO细胞中诱导了较少的细胞死亡。
实施例12:Polθ和PARP抑制剂对亲本和SHLD2 KO HCC1395细胞存活的影响
通过集落形成测定,研究了DNA聚合酶θ(Polθ)抑制剂(化合物A)和PARP抑制剂奥拉帕利对亲本和SHLD2缺失(SHLD2 KO)HCC1395细胞存活的影响。简言之,每个群体以低密度接种,用不同浓度的化合物孵育,并用集落溶解方案测量相对于未处理细胞归一化的相对存活。
HCC1395是BRCA1缺陷型乳腺癌细胞系。图12所示的结果显示,SHLD2 KO HCC1395细胞对Polθ抑制剂化合物A(a及c的左图)的敏感性显著高于亲本HCC1395细胞,表现为相对存活降低。此外,SHLD2 KO HCC1395细胞比亲本HCC1395细胞对PARP抑制剂奥拉帕利(b及c的右图)具有显著更高的耐药性,表现为相对存活增加。
实施例13:Polθ和PARP抑制剂对亲本和SHLD2 KO MDA-MB-436细胞存活的影响
通过集落形成测定,研究了DNA聚合酶θ(Polθ)抑制剂(化合物A)和PARP抑制剂奥拉帕利对亲本和SHLD2缺失(SHLD2 KO)MDA-MB-436细胞存活的影响。简言之,每个群体以低密度接种,用不同浓度的化合物孵育,并用集落溶解方案测量相对于未处理细胞归一化的相对存活。
MDA-MB-436是BRCA1缺陷型乳腺癌细胞系。图13所示的结果显示,SHLD2 KO MDA-MB-436细胞对Polθ抑制剂(化合物A,a中及c的左图中)的敏感性显著高于亲代MDA-MB-436细胞,表现为相对存活降低。还观察到SHLD2-KO MDA-MB-436对PARP抑制剂(奥拉帕利、b中及c的右图中)的耐药性增加的趋势,表现为相对存活增加。
实施例14:Polθ抑制恢复Shieldin缺陷PARPi耐药细胞对奥拉帕利的敏感性的能力
测定了DNA Polθ抑制剂化合物A在Shieldin缺陷PARPi耐药的SUM149细胞中恢复对奥拉帕利的敏感性的能力。
简言之,在组织培养瓶中,用化合物A处理亲本SUM149细胞、或恢复了BRCA1或缺失了C20orf196或53BP1基因的衍生细胞,48小时。然后洗涤细胞,然后在96孔培养板中以低密度接种。接种24小时后,将细胞与奥拉帕利或DMSO再培养10天。使用Cell-Titre Glo测量相对于未处理细胞归一化的相对存活。
图14所示的结果确认,在HRD情况下,Shieldin成分的缺失可诱导对奥拉帕利的耐药性,并显示使用Polθ抑制剂处理可恢复敏感性。
Claims (13)
1.Polθ抑制剂,用于治疗与Shieldin缺陷相关的癌症。
2.权利要求1所述的Polθ抑制剂的用途,其中与Shieldin缺陷相关的癌症也是对PARP抑制剂耐药的癌症。
3.权利要求2所述的Polθ抑制剂的用途,其中所述癌症包含先前对PARP抑制剂敏感的癌细胞。
4.权利要求1至3中任一项所述的Polθ抑制剂的用途,其中所述癌症包含最初鉴定为同源重组修复途径缺陷的癌细胞。
5.权利要求4所述的Polθ抑制剂的用途,其中所述缺乏选自以下基因或由所述基因编码的蛋白质中任意一个或多个的缺陷:ATM、ATR、BRCA1、BRCA2、BARD1、RAD51C、RAD50、CHEK1、CHEK2、FANCA、FANCB、FANCC、FANCD2、FANCE、FANCF、FANCG、FANCI、FANCL、FANCM、PALB2(FANCN)、FANCP(BTBD12),ERCC4(FANQ)、PTEN、CDK12、MRE11、NBS1、NBN、CLASPIN、BLM、WRN、SMARCA2、SMARCA4、LIG1、RPA1、RPA2、BRIP1和PTEN。
6.权利要求1至5中任一项所述的Polθ抑制剂的用途,其中所述癌症包含已经随后重新激活了同源重组修复途径的癌细胞。
7.权利要求1至6中任一项所述的Polθ抑制剂的用途,其中所述Shieldin缺陷是以下基因或由所述基因编码的蛋白质中任意一个或多个的缺陷:C20orf196(SHLD1)、FAM35A(SHLD2)和CTC-534A2.2(SHLD3)。
8.权利要求1至6中任一项所述的Polθ抑制剂的用途,其中所述Shieldin缺陷是53BP1复合物的缺陷。
9.权利要求8所述的Polθ抑制剂的用途,其中所述53BP1复合物缺陷是以下基因或由所述基因编码的蛋白质中任意一个或多个的缺陷:TP53BP1(53BP1)、RIF1和MAD2L2(REV7)。
10.权利要求1至9中任一项所述的Polθ抑制剂的用途,其中所述癌症包含已成为其存活依赖于微同源性介导的末端连接(MMEJ)的癌细胞。
11.药物组合物,其包含权利要求1至10中任一项所述用途的Polθ抑制剂以及可药用载体,用于治疗与Shieldin缺陷相关的癌症。
12.权利要求11的药物组合物,其还包含一种或多种治疗剂。
13.权利要求11的药物组合物,其还包含一种或多种抗癌剂。
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