CN114716609A - 制备壳聚糖稳定的皮克林乳液及喹乙醇印迹微球的方法 - Google Patents

制备壳聚糖稳定的皮克林乳液及喹乙醇印迹微球的方法 Download PDF

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Abstract

制备壳聚糖稳定的皮克林乳液及喹乙醇印迹微球的方法，以及该微球在动物源食品中喹乙醇及其代谢物提取、净化及富集中的应用。首次以壳聚糖作为皮克林乳液稳定剂制备了一种新型的水包油皮克林乳液，为壳聚糖在食品安全检测领域中的应用提供了一种新的借鉴。通过结合皮克林乳液技术与分子印迹技术制备了一种尺寸均匀、形貌规整、孔穴丰富、选择性好的喹乙醇印迹吸附材料。本发明中所用制备方法简单、成本低廉，制备的吸附材料适用于分离柱中的填充吸附材料，用于高效净化、富集食品中痕量残留的喹乙醇及其代谢物，应用前景巨大。

Description

制备壳聚糖稳定的皮克林乳液及喹乙醇印迹微球的方法
技术领域
本发明属于材料制备技术及动物源性食品中痕量污染物残留检测技术领域，具体涉及一种新型纳米粒子稳定的Pikering即皮克林乳液的聚合方法，以壳聚糖为皮克林（Pikering）乳液稳定剂制备用于净化、富集食品中喹乙醇及其代谢物残留的喹乙醇分子印迹微球的方法。
背景技术
喹乙醇(Olaquindox)属于喹噁啉类药物，是人工合成的非抗生素类抗菌促生长剂，因其可以改变动物肠道菌群、促进蛋白质同化，被广泛用于猪、牛、鸡、羊的促进生长，抗菌治病和水生动物疾病的防治。在过去的几十年里，喹乙醇在渔业和畜牧业中的滥用非常普遍，导致其残留在动物源食品及水体中。研究发现，喹乙醇具有生物毒性，能造成染色体变异，动物受刺激时，会应激出血引发死亡，大量喹乙醇会在动物体内富集，具有蓄积毒性，在动物体内蓄积到一定程度时会对动物和人产生致畸、致癌、致突变的“三致”作用，对消费者健康构成严重威胁，成为当今食品安全中较为严峻的问题。
常用的喹乙醇的检测方法有酶联免疫吸附法、高效液相色谱法、电化学检测法、生物传感器、荧光检测法和高效液相色谱-质谱法等。由于食品样品基质较为复杂，在提取和净化喹乙醇及其代谢物残留时常需进行预处理步骤。常用的预处理方法有固相萃取法、基质分散固相萃取法和固相微萃取法等。这些预处理方法的效率主要取决于吸附剂在萃取装置中的性能，因此研发高效吸附目标物的吸附材料及高灵敏度的检测方法是必要的。
分子印迹技术基于功能单体与模板分子之间多种作用力实现结合，进而加入交联剂和引发剂，通过自由基聚合的方式，制备高度交联的聚合物骨架，经索氏提取洗脱去除模板后，在聚合物骨架中留下特异性识别的孔穴和位点。分子印迹聚合物具有机械／化学稳定性高、选择性好、可重复使用等显著优点。
目前有关分子印迹吸附材料的研究亟待解决，早期使用常规方法制备的分子印迹聚合物，合成过程复杂、合成的材料形貌差，多为块状聚合物，且孔隙率低，吸附下限高等缺点。
发明内容
发明目的：
本发明针对传统的分子印迹材料存在合成过程复杂、合成材料形貌差、孔隙率低以及吸附下限高等缺点，提供了一种基于壳聚糖纳米粒子稳定的皮克林乳液制备喹乙醇及其代谢物分子印迹微球方法及应用。
技术方案：
制备壳聚糖稳定的皮克林乳液的方法，该乳液的制备步骤如下：
(1)将壳聚糖溶解于蒸馏水中；
(2)将模板分子喹乙醇、功能单体甲基丙烯酸、交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯加到致孔剂甲苯中，混匀后加入引发剂偶氮二异丁腈，搅拌使其溶解；
(3)将步骤(2)得到的溶液加入到步骤(1)所得到的溶液中，使用均质器均质，直至形成稳定的皮克林乳液。
在步骤(1)中，将壳聚糖溶解到蒸馏水中进行超声处理，超声功率为200~300W，时间为5~15分钟；壳聚糖与蒸馏水的质量体积比为：1~10mg：1mL。
在步骤(2)中，模板分子喹乙醇的摩尔质量：功能单体甲基丙烯酸的摩尔质量：交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯的摩尔质量：致孔剂甲苯的体积比为：1mmoL：(3~6)mmoL：(4~8)mmoL：(0.5~1)mL；
引发剂与模板分子的质量摩尔比为：40~50mg：1mmoL。
在步骤(3)中，将步骤(2)得到的溶液加入到步骤(1)所得到的溶液中，步骤2与步骤1所取溶液的体积比为：1：3~5；均质器转速为19000~21000转/分钟，均质时间3~5分钟形成稳定的皮克林乳液。
一种基于壳聚糖稳定的皮克林乳液制备喹乙醇印迹微球的方法，该微球是通过以上的皮克林乳液分散聚合的方式制备获得水包油型的喹乙醇分子印迹微球；
制备喹乙醇分子印迹微球的步骤如下：
S1：将制备的皮克林乳液在水浴55~70℃下反应14~18小时；抽滤分离，甲醇洗，得到印迹聚合物-壳聚糖复合微球；
S2：将获得的印迹聚合物-壳聚糖复合微球放入盐酸水溶液中磁力搅拌除去聚合物外层的壳聚糖，甲醇洗，得到印迹聚合物微球；
S3：将获得的印迹聚合物微球经索氏提取除去模板，烘干至恒重，得到喹乙醇分子印迹微球。
所述S1中：用甲醇洗2~4遍，得到印迹聚合物-壳聚糖复合微球；
所述S2中：盐酸水溶液的浓度为0.1%~1%；
所述S3中：索氏提取所用试剂为甲醇和冰乙酸的混合溶液，甲醇与冰乙酸的体积比为7~10：1，提取时间为24~72h。
一种基于壳聚糖稳定的皮克林乳液制备喹乙醇印迹微球的应用。
所述的壳聚糖稳定的皮克林乳液制备喹乙醇印迹微球的应用，在于富集、净化食品中痕量喹乙醇及其代谢物残留中的应用。
优点及效果：
本发明将壳聚糖作为皮克林乳液的稳定剂，通过皮克林乳液技术与分子印迹技术结合，制备了一种尺寸均匀且形貌规整的吸附材料。印迹材料制备结束后再将壳聚糖从材料中洗脱出来，增加了印迹材料的孔穴结构，利于目标物的快速吸附与洗脱。本发明具有制备方法简单、成本低廉的优点，制备的吸附材料适宜用于作为分离柱的填充材料，应用于精准高效的富集、净化食品中痕量喹乙醇及其代谢物残留的样品前处理，具有很好的经济效益和社会效益。
附图说明：
图1中（a）为喹乙醇印迹聚合物-壳聚糖复合微球扫描电镜图，（b）喹乙醇印迹微球透射电镜图和（c）喹乙醇印迹聚合物扫描电镜图。
图2为印迹微球的红外光谱图。
图3为喹乙醇印迹/非印迹微球对喹乙醇的等温吸附曲线。
图4为喹乙醇印迹/非印迹微球对目标物的吸附动力学结果。
图5为喹乙醇印迹微球的选择性吸附结果。
具体实施方式：
本发明公开一种喹乙醇分子印迹的制备方法，以及该微球在饲料中和动物体内痕量喹乙醇及其代谢物提取、净化及富集中的应用。该方法提出以壳聚糖纳米粒子作为稳定剂制备Pickering乳液，水相为壳聚糖纳米粒子，油相中为模板分子喹乙醇、功能单体甲基丙烯酸、交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯以及引发剂偶氮二异丁腈；匀质混合两相形成稳定的Pickering乳液后，加热引发聚合；经过滤、洗涤和索氏提取洗脱后获得喹乙醇分子印迹微球。本发明具备简单易行、耗材方便易得、可循环利用等优点，制备的喹乙醇分子印迹微球适用于固相萃取柱吸附材料，应用于精准高效提取、净化、富集动物源性食品和饲料中的喹乙醇及其代谢物，之后进行定量和定性分析检测。
本发明提供了一种壳聚糖稳定的皮克林乳液制备水包油型喹乙醇分子印迹微球的方法。该方法合成过程简单快速、合成的材料形貌规整，改善了传统分子印迹材料的形貌问题。对所得的吸附材料喹乙醇分子印迹微球通过电镜进行表征，确定其形貌结构，通过吸附实验对其吸附效果进行分析，并且将合成的喹乙醇分子印迹微球用于固相萃取柱填充吸附材料，应用于精准高效的提取、净化、富集样品中痕量喹乙醇及其代谢物残留。通过该方法获得的微球其形貌规整，适用于作为分离柱的填充吸附材料，并且其应用于精准高效的提取、净化、富集样品中痕量喹乙醇及其代谢物残留，也是本发明重要的技术方案。利用皮克林乳液聚合的手段，壳聚糖纳米粒子作为稳定剂，制备出的分子印记微球粒径小，分子印迹表面孔隙更多，改善了传统分子印迹材料的孔隙率低以及传质速率慢等缺点。基于高速均质获得稳定的Pikering乳液进而制备形貌规整的球形吸附材料。本发明首次提出利用壳聚糖纳米粒子作为皮克林乳液的稳定剂，并以此方法制备了一种新型的水包油皮克林乳液，为壳聚糖在食品安全检测领域的应用提供了一种新的借鉴。
制备壳聚糖稳定的皮克林乳液，该乳液的制备步骤如下：
(1)将壳聚糖溶解到蒸馏水中；200~300W功率超声处理5~15分钟；壳聚糖与蒸馏水的质量体积比为：1~10mg：1mL。
(2)将模板分子喹乙醇、功能单体甲基丙烯酸、交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯加到致孔剂甲苯中，摇匀，加入引发剂偶氮二异丁腈，使其溶解；
模板分子喹乙醇的摩尔质量：功能单体甲基丙烯酸的摩尔质量：交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯的摩尔质量：致孔剂甲苯的体积比为：1mmoL：(3~6)mmoL：(4~8)mmoL：(0.5~1)mL；
引发剂与模板分子的质量摩尔比为：40~50mg：1mmoL。
(3)将(2)得到的溶液加入到(1)所得到的溶液中，(2)与(1)溶液的体积比为1：3~5；均质器转速为19000~21000转/分钟，均质时间3~5分钟形成稳定的皮克林乳液。
一种基于壳聚糖稳定的皮克林乳液制备喹乙醇印迹微球的方法，该微球是通过以上的皮克林乳液分散聚合的方式制备获得水包油型的喹乙醇分子印迹微球；
制备喹乙醇分子印迹微球的步骤如下：
S1：将制备的皮克林乳液在水浴55~70℃下反应14~18小时；抽滤分离，甲醇洗，得到印迹聚合物-壳聚糖复合微球；
S2：将获得的印迹聚合物-壳聚糖复合微球放入盐酸水溶液中磁力搅拌除去聚合物外层的壳聚糖，甲醇洗，得到印迹聚合物微球；
S3：将获得的印迹聚合物微球经索氏提取除去模板，烘干至恒重，得到喹乙醇分子印迹微球。
所述S1中：用甲醇洗2~4遍，得到印迹聚合物-壳聚糖复合微球；
所述S2中：盐酸水溶液的浓度为0.1%~1%；
所述S3中：索氏提取所用试剂为甲醇和冰乙酸的混合溶液，甲醇与冰乙酸的体积比为7~10：1，提取时间为24~72h。
一种基于壳聚糖稳定的皮克林乳液制备喹乙醇印迹微球的应用，在于富集、净化食品中痕量喹乙醇及其代谢物残留中的应用。
下面结合附图对本发明做进一步的说明：
实施例1A：
将模板分子喹乙醇（1mmoL）和功能单体甲基丙烯酸（3mmoL）溶解于500µL致孔剂甲苯中，在磁力搅拌的作用下均匀搅拌60分钟，之后加入交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯（4mmoL）和引发剂偶氮二异丁腈（40mg）。将所制备的混合液超声处理10分钟，作为油相备用。将事先制备好的pH=6.4的1%的壳聚糖溶液超声5分钟，作为水相备用。然后将油水两相（油：水=1：3；v/v）混合，19000转/分钟均质器均质3分钟得到稳定的皮克林预聚乳液。随后，将预聚乳液在55℃水浴反应14h，得到喹乙醇分子印迹材料。将所得产物放在0.1%的盐酸溶液中磁力搅拌2~3h，去除表面的壳聚糖外壳，得到喹乙醇分子印迹聚合物。分子印迹聚合物用定性滤纸包裹，以体积比7：1甲醇与冰乙酸混合溶液为洗脱液，用索氏提取器萃取24h，然后用甲醇水溶液洗涤去除残留的冰乙酸，50℃真空干燥，得到喹乙醇分子印迹微球。
非分子印迹微球除不加模板分子外，其他步骤同印迹聚合物的制备过程。
实施例1B：
将模板分子喹乙醇（1mmoL）和功能单体甲基丙烯酸（5mmoL）溶解于800µL致孔剂甲苯中，在磁力搅拌的作用下均匀搅拌60分钟，之后加入交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯（6mmoL）和引发剂偶氮二异丁腈（45mg）。将所制备的混合液超声处理10分钟，作为油相备用。将事先制备好的pH=6.4的1%的壳聚糖溶液超声5分钟，作为水相备用。然后将油水两相（油：水=1：4；v/v）混合，20000转/分钟均质器均质4分钟得到稳定的皮克林预聚乳液。随后，将预聚乳液在65℃水浴反应16h，得到喹乙醇分子印迹材料。将所得产物放在0.1%的盐酸溶液中磁力搅拌2~3h，去除表面的壳聚糖外壳，得到喹乙醇分子印迹聚合物。分子印迹聚合物用定性滤纸包裹，以体积比8：1甲醇与冰乙酸混合溶液为洗脱液，用索氏提取器萃取36h，然后用甲醇水溶液洗涤去除残留的冰乙酸，50℃真空干燥，得到喹乙醇分子印迹微球。
实施例2：
喹乙醇分子印迹微球的电镜表征；
为了考察所制备印迹微球的外部形态，通过扫描电镜和透射电镜对其进行表征。图1（a）为喹乙醇印迹聚合物-壳聚糖复合微球扫描电镜图，（b）喹乙醇印迹微球透射电镜图和（c）喹乙醇印迹聚合物扫描电镜图。图1（a）和图1（b）相比可以看出，图1（a）微球外层包覆一层壳聚糖纳米粒子形成的外壳，说明壳聚糖纳米粒子可以作为皮克林乳液的稳定剂使两相混合形成水包油型皮克林乳液。图1（b）微球外层没有固体粒子，说明外层的壳聚糖纳米粒子已经被盐酸洗掉，将喹乙醇分子印迹聚合物完全暴露。图1（c）表明基于本发明制备的喹乙醇印迹聚合物表面具有丰富的孔穴结构，有利于提高聚合物对目标物的吸附速率。
实施例3：
喹乙醇微球的红外表征：
图2所示为所制备材料的红外光谱图，由红外光谱图可以证明喹乙醇印迹微球的成功制备。图2中（a）是模板分子喹乙醇的光谱图，（b）是未洗脱模板分子的喹乙醇印迹微球的光谱图，（c）是洗脱模板分子的喹乙醇印迹微球的光谱图，（d）是非印迹微球的光谱图。图中（a）可以看到喹乙醇在3435cm-1、2985cm-1、1631cm-1三个振动频率，因为O-H基的伸缩振动出现在3650～3200cm-1范围内，同时N-H伸缩振动频率在3500～3100cm-1范围内，所以3436～3200cm-1波段是-OH伸缩振动，3425cm-1是N-H收缩振动，2985cm-1和1631cm-1处的峰分别为C-H和苯环的收缩振动。图中（c）2989cm-1观察到的峰代表-CH3收缩振动，1732cm-1观察到-COOH的伸缩振动峰，说明功能单体和交联剂已经成功聚合。图中（c）和（d）峰形基本一致，说明模板分子喹乙醇已被完全洗脱。
实施例 4
(1) 吸附平衡实验：
为了考察所制备的喹乙醇印迹微球对喹乙醇的吸附能力，实验中准确称取20mg的印迹材料于12mL的棕色玻璃瓶中，分别加入7mL不同浓度的喹乙醇甲醇溶液（5mg/L，10mg/L，20mg/L，30mg/L，60mg/L，90mg/L，120mg/L）摇床120r/分钟震荡4h吸附。通过离心取得上清液，在波长284nm条件下，采用紫外-可见分光光度法测定上清液的吸光度，计算吸附容量。在相同条件下做非印迹对喹乙醇的吸附平衡实验。
吸附容量是评价吸附剂对模板分子结合能力强弱的重要参数。如图3所示，随着喹乙醇浓度的增加，在喹乙醇的浓度在90mg/L时达到吸附平衡。平衡时，喹乙醇印迹微球和非印迹微球的吸附容量分别为3.08mg/g和2.34mg/g，可以看出，喹乙醇印迹微球的吸附容量明显高于非印迹微球，表明印迹微球中含有较多的与目标物分子结构互补的特异性印迹吸附位点，利于印迹微球应用时对目标物的选择性吸附。说明制备的喹乙醇印迹材料对目标分子具有良好的吸附能力。
(2) 吸附动力学实验：
为了考察所制备的印迹微球对目标物的吸附速率，准确称取10mg喹乙醇印迹微球，置于12mL棕色容量瓶中，用移液管准确移取10mL 40mg/L的喹乙醇甲醇溶液中，分别在室温下吸附5分钟，10分钟，20分钟，30分钟，60分钟，90分钟，120分钟后，通过过膜方式将材料进行分离。在相同条件下做非印迹对喹乙醇的吸附动力学实验。在波长384nm条件下采用紫外-可见分光光度计测定上清液中喹乙醇的浓度，结果如图4。由图4可知，喹乙醇印迹微球在30分钟就可以达到吸附容量的90%，60 分钟后达到吸附平衡。同时经实验测定可知，喹乙醇的浓度越低，达到吸附平衡的时间会越短。本体聚合法制备的聚合物，达到吸附平衡的时间较长，有的甚至要吸附12h，而采用该法制备的喹乙醇微球对模板分子的吸附动力学较快，较快的吸附速率利于印迹微球在食品安全快速检测样品前处理领域的应用。所以，本发明中制备的印迹微球有利于缩短食品安全快速检测样品前处理所需时间，提高食品安全检测效率。
(3) 选择性实验：
本实验选择与模板分子喹乙醇（OLA）结构相似的3-甲基-喹噁啉-2-羧酸(MQCA)、乙酰甲喹（MEQ）、喹噁啉-2-羧酸(QCA)以及分子结构差异较大的磺胺二甲基嘧啶(SMZ)进行选择性实验，测定印迹微球和非印迹微球对这5种溶液的选择性情况。结果如图5所示。从图5可以看出，印迹微球对喹乙醇及其代谢物MQCA和QCA有较好的选择吸附功能。对MEQ和SMZ的无选择吸附性能，这是因为喹乙醇及其代谢物具有相近的分子结构式，与印迹聚合物中的孔穴结构互补，且能和孔穴中的结合位点通过非共价键作用力结合。可见，制备的喹乙醇印迹微球对喹乙醇及其代谢物3-甲基-喹噁啉-2-羧酸和喹噁啉-2-羧酸有较好的选择性吸附功能。
实施例5：
将实施例1的喹乙醇分子印迹微球应用于测定牛奶和鱼肉中喹乙醇残留的具体案例如下：
量取5mL牛奶样品，加入20mL乙腈和乙酸乙酯(1：1；V：V）混合溶剂磁力搅拌30分钟，高速冷冻5500r/分钟离心10分钟，取上清液，重复两次合并上清液。
称取5g鱼肉样品，加入5mL 5mol/L盐酸磁力搅拌1h，加入20mL甲醇水溶液(4：6；V：V)，磁力搅拌30分钟，高速冷冻5500r/分钟离心10分钟，取上清液，重复一次合并上清液。
将合并后的上清液通过固相萃取柱之后，将洗脱液进入液相色谱进行分析。
固相萃取的方法如下：
将50mg实施例1A中所获得的印迹微球装入聚四氟乙烯小柱中，用6mL甲醇/水(90：10v/v)对聚四氟乙烯柱进行活化，以甲醇溶液配置标准样品，并取10mL上样。之后，以2mL甲醇/冰乙酸(90：10；v/v)进行洗脱，然后用液相色谱进行测定，聚四氟乙烯柱使用甲醇/水(60：40；v/v)进行再生，以重复使用。
以本发明的吸附材料作为固相萃取吸附剂，对牛奶和鱼肉中的喹乙醇及其代谢物进行吸附，通过HPLC检测，实验结果：对喹乙醇和喹乙醇代谢物MQCA的加标回收率分别为83.92％～98.08％，相对标准偏差为0.94％～5.84％，富集倍数为15～20倍。实验结果表明本发明中的喹乙醇印迹吸附材料可以用于动物源食品中喹乙醇及其代谢物残留的检测分析中。

Claims (8)

1.制备壳聚糖稳定的皮克林乳液的方法，其特征在于：
该乳液的制备步骤如下：
(1)将壳聚糖溶解于蒸馏水中；
(2)将模板分子喹乙醇、功能单体甲基丙烯酸、交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯加到致孔剂甲苯中，混匀后加入引发剂偶氮二异丁腈，搅拌使其溶解；
(3)将步骤(2)得到的溶液加入到步骤(1)所得到的溶液中，使用均质器均质，直至形成稳定的皮克林乳液。
2.根据权利要求1所述的制备壳聚糖稳定的皮克林乳液的方法，其特征在于：在步骤(1)中，将壳聚糖溶解到蒸馏水中进行超声处理，超声功率为200～300W，时间为5～15分钟；壳聚糖与蒸馏水的质量体积比为：1～10mg：1mL。
3.根据权利要求1所述的制备壳聚糖稳定的皮克林乳液的方法，其特征在于：在步骤(2)中，模板分子喹乙醇的摩尔质量：功能单体甲基丙烯酸的摩尔质量：交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯的摩尔质量：致孔剂甲苯的体积比为：1mmoL：3～6mmoL：4～8mmoL：0.5～1mL；
引发剂与模板分子的质量摩尔比为：40～50mg：1mmoL。
4.根据权利要求1所述的制备壳聚糖稳定的皮克林乳液的方法，其特征在于：在步骤(3)中，将步骤(2)得到的溶液加入到步骤(1)所得到的溶液中，步骤2与步骤1所取溶液的体积比为：1：3～5；均质器转速为19000～21000转/分钟，均质时间3～5分钟形成稳定的皮克林乳液。
5.一种基于权利要求1所述的壳聚糖稳定的皮克林乳液制备喹乙醇印迹微球的方法，其特征在于：该微球是通过权利要求1的皮克林乳液分散聚合的方式制备获得水包油型的喹乙醇分子印迹微球；
制备喹乙醇印迹微球的步骤如下：
S1：将制备的皮克林乳液在水浴55～70℃下反应14～18小时；抽滤分离，甲醇洗，得到印迹聚合物-壳聚糖复合微球；
S2：将获得的印迹聚合物-壳聚糖复合微球放入盐酸水溶液中磁力搅拌除去聚合物外层的壳聚糖，甲醇洗，得到印迹聚合物微球；
S3：将获得的印迹聚合物微球经索氏提取除去模板，烘干至恒重，得到喹乙醇分子印迹微球。
6.根据权利要求5所述的壳聚糖稳定的皮克林乳液制备喹乙醇印迹微球的方法，其特征在于：
所述S1中：用甲醇洗2～4遍，得到印迹聚合物-壳聚糖复合微球；
所述S2中：盐酸水溶液的浓度为0.1％～1％；
所述S3中：索氏提取所用试剂为甲醇和冰乙酸的混合溶液，甲醇与冰乙酸的体积比为7～10：1，提取时间为24～72h。
7.一种基于壳聚糖稳定的皮克林乳液制备喹乙醇印迹微球的应用。
8.根据权利要求7所述的壳聚糖稳定的皮克林乳液制备喹乙醇印迹微球的应用，其特征在于：富集、净化食品中痕量喹乙醇及其代谢物残留中的应用。
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