CN114716568B

CN114716568B - 一种胰蛋白酶抑制剂修饰的β-酪蛋白纳米载体的构建方法及其应用

Info

Publication number: CN114716568B
Application number: CN202210278940.1A
Authority: CN
Inventors: 金鹏; 非祖琪; 杜琪珍; 王圆圆; 王满
Original assignee: Zhejiang A&F University ZAFU
Current assignee: Zhejiang A&F University ZAFU
Priority date: 2022-03-18
Filing date: 2022-03-18
Publication date: 2023-06-16
Anticipated expiration: 2042-03-18
Also published as: CN114716568A

Abstract

本发明公开了一种胰蛋白酶抑制剂修饰的β‑酪蛋白纳米载体的构建方法及其应用，属于生物工程技术领域。本发明利用基于蛋白结构模拟、蛋白连接肽链Linker文库构建和蛋白重组表达分析，构建Tsp3044和β‑Cas的最优重组融合蛋白表达序列；从蛋白异源表达技术上优化表达系统、调控元件、发酵技术和提纯工艺，实现重组Tsp3044/β‑Cas融合蛋白的高效制备平台；验证了重组Tsp3044/β‑Cas融合蛋白的结构自组装与对抗蛋白酶消化的能力。本发明构建了具有显著抵抗蛋白酶消化与肠胃高效递送功能的高分子重组蛋白纳米递送系统，为酪蛋白靶向输送药物分子奠定了技术基础，具有较大的应用潜能。

Description

一种胰蛋白酶抑制剂修饰的β-酪蛋白纳米载体的构建方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种胰蛋白酶抑制剂修饰的β-酪蛋白纳米载体的构建方法及其应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

近年来，纳米技术的快速发展已在医药、食品、化工和环境等领域发挥了巨大的作用，而高效的递送体系和对生物活性成份的有效保护是纳米技术在医药和食品科学等领域最重要的应用。因此，人们对纳米技术的研究重点大都聚焦在先进纳米材料的开发及应用上，并已取得了显著的成效。例如，根据分子特性和用途特点用于递送系统的各种纳米载体，包括脂质体，醇质体，水凝胶和乳剂等等。酪蛋白是哺乳动物包括牛，羊和人奶中的主要蛋白质，而牛奶中的蛋白质80％以酪蛋白(Casein)为主。牛奶酪蛋白由于其优良稳定的乳化特性，价格低廉、来源广泛、具有良好的生物相容性和生物可降解性等，被作为水包油型乳剂广泛应用于疏水性药物分子和活性化合物的乳化、递送使用。

β-酪蛋白(β-Cas)作为酪蛋白最主要的组成成分，其理化特性与酪蛋白基本相似，具有两亲性和自组装性。当前，其蛋白结构信息和核酸编码序列已被报道，β-酪蛋白有一条单链209个氨基酸残基多肽构成。特别是近年来蛋白分离纯化技术和重组表达技术的发展，β-Cas胶束被广泛应用为口服递送载体，负载塞来昔布、布洛芬、米托蒽醌、柚皮素、紫杉醇以及紫杉烷(紫杉醇和多西他赛)和喜树碱(伊立替康)等疏水性药物，显著提高了药物的溶解度和稳定性。然而，尽管β-Cas纳米口服递送药物在体外具有优异的成药性，但在临床使用过程发现药物有效成分的吸收主要在小肠部位，而酪蛋白很容易被胃肠道蛋白酶液消化降解，从而导致纳米递送系统遭受严重破坏。因此，针对β-酪蛋白口服递送系统易被胃/胰蛋白酶降解这一关键问题，亟需开发一种新的制备简单、生物兼容性好和绿色无污染的制备技术，为β-Cas作为杰出的口服递送系统并规模化应用奠定技术基础。

蛋白酶抑制剂是一类广泛存在于自然界中的非特异性对蛋白酶有抑制活性的物质，包括胰蛋白酶抑制剂、胃蛋白酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶抑制剂等，主要参与生物体内蛋白酶活性的调节，能够高效抑制蛋白酶水解活性。当前，已有大量来源于微生物、植物、动物的蛋白酶抑制剂编码基因被报道，例如，荞麦胰蛋白酶抑制剂编码基因被克隆并通过DNA重组实现在原核大肠杆菌表达系统的活性表达。而牛肺来源的胰蛋白酶抑制剂作为商品化蛋白酶抑制剂被广泛应用于临床并成为重要的生化药物之一。最近Zhang等人(High-level expression and characterization of two serineprotease inhibitors from Trichinella spiralis，公开于2016年)对来源于旋毛虫的三种丝氨酸蛋白酶重组大肠杆菌系统异源表达，通过系统优化实现了三种蛋白酶抑制剂的高效重组表达，特别是蛋白酶抑制剂Tsp03044和TspAd5均对胃蛋白酶和胰蛋白酶表现出了明显的活性抑制。

那么是否能够利用蛋白酶抑制剂的性能提高β-Cas在人消化系统的耐受性、从而使药物能够精准送达到吸收部位，是目前仍待解决的问题。

发明内容

针对目前存在的问题，发明人尝试将蛋白酶抑制剂与β-Cas进行融合，但是，荞麦胰蛋白酶抑制剂、牛胰蛋白酶抑制剂等仅对胰蛋白酶有抑制活性，而对胃蛋白酶活性极低或没有活性，故没有取得预期的效果，因此，发明人发掘了来源于旋毛虫的对胃蛋白酶和胰蛋白酶均有较好抑制活性的Tsp3044蛋白酶抑制剂，以期能够提升β-Cas在消化系统中的耐受性、从而达到吸收部位。

本发明提供了一种重组融合蛋白，所述重组融合蛋白由β-cas蛋白、蛋白酶抑制剂蛋白Tsp3044以及连接肽组成；编码所述β-cas蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码所述蛋白酶抑制剂蛋白Tsp3044的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，连接肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

在一种实施方式中，按照β-cas蛋白、连接肽、蛋白酶抑制剂蛋白Tsp3044的顺序连接，或者按照蛋白酶抑制剂蛋白Tsp3044、连接肽、β-cas蛋白的顺序连接。

在一种实施方式中，所述β-cas蛋白来源于牛奶。

本发明提供了含有所述重组融合蛋白的重组质粒。

在一种实施方式中，以pET系列、Duet系列、pGEX系列、pHY300、pHY300PLK、pPIC3K或pPIC9K系列载体为出发载体。

本发明提供了表达所述重组融合蛋白的微生物细胞。

在一种实施方式中，以大肠杆菌为宿主细胞，优选地，以大肠杆菌BL21为宿主细胞。

本发明提供了一种生产所述重组融合蛋白的方法，所述方法是利用表达所述重组融合蛋白的微生物细胞生产所重组融合蛋白。

在一种实施方式中，将所述微生物细胞的单菌落接种至LB培养基中，过夜培养后接种至摇瓶中在37℃培养4h，加入终浓度为0.1mM的IPTG作为诱导剂，对菌株诱导过夜。

在一种实施方式中，培养温度控制在37℃。

在一种实施方式中，诱导温度控制在20℃。

在一种实施方式中，诱导时间控制为24h。

本发明提供了利用所述重组融合蛋白包埋姜黄素的方法，方法为：

(1)对重组融合蛋白进行超声处理；

(2)将处理过后的重组融合蛋白与姜黄素混合后超声处理，得到姜黄素-重组融合蛋白纳米颗粒。

在一种实施方式中，将重组融合蛋白进行超声处理3min，停止2min后再超声3min。

在一种实施方式中，将重组融合蛋白与姜黄素按照(8～10):1的比例混合，将混合后的溶液超声处理3～4min，得到姜黄素-重组融合蛋白纳米颗粒。

在一种实施方式中，超声破碎仪的功率为400W，温度为室温25℃，参数设定：单次超声时间4s，间隔2s。

本发明提供了所述的重组融合蛋白、或所述的重组质粒、或所述的重组质粒在制备纳米载体中的应用。

在一种实施方式中，所述纳米载体用于食品、化学、医药领域；所述纳米载体用于药物、化妆品活性物、益生菌的包埋与递送。

本发明的有益效果：利用大肠杆菌制备重组胰蛋白酶抑制剂/β-酪蛋白纳米载体，与为开发能耐受胃肠道蛋白酶液消化的新型口服β-酪蛋白纳米递送载体奠定技术理论基础。首先，本发明过程中使用的宿主具有较强的生长能力，胞内表达，培养基影响杂质较少，产品易于分离纯化；其次，以酵母粉等廉价碳源为底物，可进行高密度发酵；再次，酪蛋白与胰蛋白酶抑制剂为食品级蛋白，不会对产物的医用食品安全带来隐患。基于应用分析，本发明制备的具有抗胃蛋白酶消化的酪蛋白纳米载体在食品医药等领域具有潜在而非常广泛的应用价值。

附图说明

图1为重组融合蛋白纯化电泳图；泳道M：蛋白marker，泳道1：全细胞破碎液；泳道2：上清液流出液；泳道3：30mM咪唑洗出液；泳道4：目标蛋白洗脱液；箭头所指为纯化的目标融合蛋白。

图2为不同linker的融合重组蛋白的蛋白酶抑制活性检测图；重组融合蛋白加入到目标蛋白(被保护)溶液中，添加胰蛋白酶对目标蛋白水解，SDS-PAGE检测蛋白被水解情况；泳道M为蛋白Marker；泳道1为目标蛋白+胰蛋白酶；泳道2为目标蛋白；泳道3为目标蛋白+胰蛋白酶+融合重组蛋白(10％)；泳道4为目标蛋白+胰蛋白酶+融合重组蛋白(1％)。

图3为不同宿主表达的融合重组蛋白的蛋白酶抑制活性检测图；重组融合蛋白加入到目标蛋白(被保护)溶液中，添加胰蛋白酶对目标蛋白水解，SDS-PAGE检测蛋白被水解情况；泳道M为蛋白Marker；泳道1为目标蛋白+胰蛋白酶；泳道2为目标蛋白；泳道3-7为目标蛋白+胰蛋白酶+融合重组蛋白(融合重组蛋白加入量分别1％、2％、、4％、6％、10％)；

图4为重组蛋白抗胃蛋白酶活性测定；泳道1：蛋白marker，泳道2：人工肠液消化对照组，泳道3：酪蛋白对照组，泳道4：加入1mL破碎液上清液。

图5为重组酪蛋白纳米包埋自组装示意图。

图6为SEM电镜观察融合蛋白β-cas-Tsp3044纳米颗粒复合物。

图7为融合蛋白β-cas-Tsp3044纳米颗粒复合物抗胃蛋白酶消化试验；泳道M：蛋白marker；泳道1：酪蛋白对照组泳道；2：人工肠液消化组。

具体实施方式

高密度发酵培养基：酵母粉10g/L，甘油21.6g/L，MgSO₄ 0.64g/L，CaCl₂ 0.011g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 17.1g/L，KH₂PO₄ 3g/L，NaCl 0.5g/L，NH₄Cl 1g/L，微量元素0.335mL/L，氨苄青霉素浓度为50μg/mL，pH 5.5±0.5。

重组蛋白胰蛋白酶抑制活性测定(5mL人工模拟肠道消化环境)：重组蛋白液1mL，加入2.5mL 20mg/mL酪蛋白溶液，加入150μL人工肠液，1.35mL PBS缓冲液，在37℃条件下水浴10min，加入NaOH终止反应，通过SDS-PAGE电泳显示其消化程度。

重组蛋白制备纳米粒的电镜观察前处理：①取干净铜网，将铜网覆盖至姜黄素-酪蛋白-胰蛋白酶抑制剂样品滴上，吸附5min；②用滤纸吸干液体；③将铜网覆盖至2％磷钨酸染色液上，染色30s；④用滤纸吸干液体；⑤将铜网冻干后置于-20℃冰箱待检。

实施例1：重组蛋白酶抑制剂Tsp3044和β-Cas的融合共表达系统构建

(1)重组蛋白酶抑制剂与β-Cas的融合表达

选用两种Linker：6个氨基酸的连接肽Linker 1和12个氨基酸的连接肽Linker 2分别尝试构建重组蛋白：

Linker 1：GGSGGG(SEQ ID NO.5)；

Linker 2：GGGGSGGGGSGG(SEQ ID NO.6)。

①利用Linker 1构建重组融合蛋白

在Tsp3044的核苷酸序列(如SEQ ID NO.1所示)去除终止密码子之后加上Linker1，在Linker 1之后再加上β-cas的核苷酸序列(如SEQ ID NO.2所示)，将构建得到的重组融合片段连接至pET21a载体构建得到重组载体，将重组载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)中。培养至长出单菌落，挑取单菌落进行PCR验证。按照上述类似的方法构建得到正确的含有重组融合片段的酵母表达载体pPIC9K。将含有重组融合片段的表达载体分别转化至大肠杆菌BL21和毕赤酵母GS115中。

②利用Linker 2构建重组融合蛋白

构建的具体方式同步骤①，只是将中间的连接肽替换为Linker2，分别构建得到含有重组融合片段的表达载体的大肠杆菌和毕赤酵母。

③重组融合蛋白的表达及纯化

使用灭菌接种针刮取平板上长出的单菌落，混匀在LB培养基试管中，37℃摇床中200rpm过夜培养，取出后按1％(v/v)比例接入摇瓶中37℃培养4h，加入终浓度0.1mM的IPTG，在20℃、200rpm诱导过夜。诱导完毕后离心取菌体，用pH＝7的PBS缓冲液混匀(体积为10:1浓缩)后超声破碎，离心弃沉淀，上层澄清液存留。超声破碎菌体：大肠杆菌BL21表达为胞内表达，因此需对菌体进行超声波破碎处理，使胞内的蛋白暴露溶解在缓冲液之中。将PBS缓冲液混合好的菌体置于50mL离心管中，置于装有冰水混合物的大烧杯之中，将探头深入至液面至底部中间的位置。每管菌体超声2次，每次4min，间隔3min，至菌液对光时有明显光柱透过即可。

酵母阳性重组子单菌落接种于含5mL YPD液体培养基置于30℃、200rpm培养过夜作为种子培养物，随后按10％(v/v)的接种量转接到100mL BMGY培养基并置于30℃、200rpm培养24h，收集细胞并转移到50BMMY诱导培养基中，加1％(v/v)甲醇诱导蛋白表达，每间隔24h按1％(v/v)的量补充一次甲醇，培养96h。结束后收集培养基上清液。

目的蛋白的纯化：由于表达宿主中含有较多分子量不同的杂蛋白，所以采用铁镍磁性微球对上清液进行蛋白纯化。将目的蛋白的破碎上清液加入至铁镍磁柱，在4℃条件下使之充分结合过夜。取出后使用1M咪唑/50mM PBS溶液稀释至10mM、30mM、50mM的咪唑溶液，对铁镍磁柱按浓度递增顺序进行洗脱杂蛋白，收集每一步流出液，最后将目的蛋白使用500mM咪唑溶液洗脱下来，体积为浓缩10倍。在纯化后的蛋白溶液进行透析，去除溶液中的杂盐离子，为保护蛋白的结构不被破坏且保证不会失活，在大体积纯净水之中加入10％体积甘油，纯化后进行SDS-PAGE电泳。纯化后电泳图如图1所示。

(2)不同连接肽连接的重组融合蛋白酶抗胰蛋白酶的活性

采用蛋白酶水解目标蛋白情况检验重组融合蛋白的蛋白酶抑制活性，结果如下图2所示(图中为以大肠杆菌为宿主)，重组融合蛋白加入到目标蛋白(被保护)溶液中，添加胰蛋白酶对目标蛋白水解，Linker 1的重组融合蛋白处理组中目标蛋白(泳道3和4)大部分被水解，说明该融合蛋白受linker 1的影响，蛋白酶抑制剂的活性极低。相反，采用linker2的重组融合蛋白组中对目标蛋白展现了明显的保护效果(泳道3的目标蛋白基本未被消化)。这说明采用linker 2作为两个蛋白的融合肽不会影响其活性，因此本发明中采用linker2。同时，对两个蛋白的融合顺序做了调换，结果显示活性未收到影响。

(3)不同宿主表达的重组融合蛋白酶抗胰蛋白酶的活性

在大肠杆菌与毕赤酵母系统表达的融合蛋白产物分别用于抗胰蛋白酶消化活性测试，重组融合蛋白加入到目标蛋白(被保护)溶液中，添加胰蛋白酶对目标蛋白水解。由图3看出，毕赤酵母表达的重组蛋白即使添加了10％也没有对胰蛋白酶有抑制效果；而大肠杆菌表达的重组融合蛋白在6％添加量就展现了明显的蛋白酶抑制活性，因此本发明中表达宿主优选大肠杆菌。

实施例2：重组Tsp3044/β-cas融合蛋白的纳米自组装

β-Cas蛋白所形成的纳米颗粒大小、载药量以及负载稳定性等与多种因素有关，本实施例以姜黄素的包埋为例，利用重组融合蛋白β-cas-Tsp3044制备纳米颗粒，具体操作如下：

(1)超声法制备姜黄素-融合蛋白Tsp3044/β-Cas纳米颗粒。

设置超声破碎仪的超声参数：功率400W，温度为室温25℃，参数设定：单次超声时间4s，间隔2s。

先对重组蛋白进行超声处理3min，停止2min后再超声3min，随后按照重组蛋白：姜黄素的质量比为10:1加入姜黄素溶液，整个混合体系再超声3min，得到姜黄素-融合蛋白Tsp3044/β-Cas纳米颗粒。

(2)电镜观察姜黄素-融合蛋白Tsp3044/β-Cas纳米颗粒

①取干净铜网，将铜网覆盖至姜黄素-酪蛋白-胰蛋白酶抑制剂样品滴上，吸附5min；

②用滤纸吸干液体；

③将铜网覆盖至2％磷钨酸染色液上，染色30s；

④用滤纸吸干液体；

⑤将铜网冻干后置于-20℃冰箱待检。

对Tsp3044融合修饰的β-Cas纳米颗粒以及装载姜黄素的纳米粒采用SEM(scanningelectron microscope)进行纳米复合物结构观察，结果如图6如图所示，融合蛋白纳米颗粒的自组装结构呈现明显的均匀性圆球形颗粒，这一结果表明重组融合蛋白β-cas-Tsp3044纳米载体具有优异的自组装能力，可以用于口服纳米递送载体。

实施例3：融合蛋白Tsp3044/β-Cas纳米系统递送性能

在获得Tsp3044/β-Cas融合蛋白自组装为纳米粒的基础上，通过直接与胃蛋白酶混合进行反应30min，对处理后的样品采用SDS-PAGE蛋白凝胶电泳对酶消化液进行电泳蛋白检测。结果如图7所示，对照组酪蛋白纳米颗粒经SDS-PAGE电泳显示条带完整；而β-cas-Tsp3044纳米复合物经胃蛋白酶处理后，仍然完整保证酪蛋白的存在，与对照组酪蛋白几乎一样，这说明Tsp3044修饰的β-Cas纳米颗粒说明完全抵抗了胃蛋白酶的消化能力，这说明本发明所制备的蛋白酶抑制剂修饰的β-酪蛋白纳米载体具备良好的纳米自组装性能和抗胃蛋白酶消化能力。

本发明中所用到的序列：

SEQ ID NO.1(Tsp3044)

ATGGCCAATCTCTATAATAGTATGATGTTAATATCCTTGATCATTTTGTGTCCGTTAAACGAAATTTGGAACTCTTGTGGAAGTTCATGTGAAGAAACTTGTGAAAGCATTGCTAGTGGCAAAGACACACCTTGCACTCTGCAGTGCGTTCCTGGTTGCTTTTGTGTAGACGGTTTTGTACGAGATTTAAGAGGTCGTTGCATTCCAATGTCATTATGTCCAAATAAAGTCAACAGTTCATGTCCTGAAAATGAAGTCTTTCAAGAATGCGGTTCCGCTTGTCCAGAAACATGCGATACAGTTTCCTCGGGATTTGAAAGACCTTGCACGGGGAATTGTATTGCTGGTTGTTTTTGTAAGAATGGGTATGTACGAGGTTACGATGGAAAATGCATTCCACCAGAAGATTGTGGAAAACCTAATAACGACAAATGTGGATCAAATGAAGTTTTCATGAAGTGTGGTAGCGCTTGTCCCGCAACCTGCGATTCGATCCGAAGTGAAAATATTATTCCATGCACTAAAGAGTGTGTTTCGGGTTGCTTCTGCAAATCTGGCTACGTCAGAGCATCTACCGGTGAATGTTTAGCTCCGGAGGCTTGTGGTGCGCATTTGGGCGGCTGTGGACCCCGAGAAGAGTACAGAGCTTGTGGAAGTGCTTGTCCAGAATCTTGTGAATCTATAAAAGATCTTGCGCCACACGCGTGTCCTGCTATGTGTGTACCTGGATGTTTCTGCAAGTTTCCATTCGTTCGTGGGTACGATCTGCGTTGCATAATGCCTGATGATTGCTAA

SEQ ID NO.2(β-cas)

ATGCGTGAATTAGAGGAGTTGAGAGAGCTGGAAGAACTCAATGTACCTGGTGAGATTGTGGAAAGCCTTTCAAGCAGTGAGGAATCTATTACACGCATCAATAAGAAAATTGAGAAGTTTCAGAGTGAGGAACAGCAGCAAACAGAGGATGAACTCCAGGATAAAATCCACCCCTTTGCCCAGACACAGTCTCTAGTCTATCCCTTCCCTGGACCCATCCATAACAGCCTCCCACAAAACATCCCTCCTCTTACTCAAACCCCTGTGGTGGTGCCGCCTTTCCTTCAGCCTGAAGTAATGGGAGTCTCCAAAGTGAAGGAGGCTATGGCTCCTAAGCACAAAGAAATGCCCTTCCCTAAATATCCAGTTGAGCCCTTTACTGAAAGCCAGAGCCTGACTCTCACTGATGTTGAAAATCTGCACCTTCCTCTGCCTCTGCTCCAGTCTTGGATGCACCAGCCTCACCAGCCTCTTCCTCCAACTGTCATGTTTCCTCCTCAGTCCGTGCTGTCCCTTTCTCAGTCCAAAGTCCTGCCTGTTCCCCAGAAAGCAGTGCCCTATCCCCAGAGAGATATGCCCATTCAGGCCTTTCTGCTGTACCAGGAGCCTGTACTCGGTCCTGTCCGGGGACCCTTCCCTATTATTGTCTAA

SEQ ID NO.3(Linker 1)

GGAGGCTCAGGCGGAGGA

SEQ ID NO.4(Linker 2)

GGTGGTGGTGGTTCAGGTGGTGGTGGTTCAGGTGGT

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江农林大学

<120> BAA220154A

<130> 一种胰蛋白酶抑制剂修饰的β-酪蛋白纳米载体的构建方法及其应用

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 795

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggccaatc tctataatag tatgatgtta atatccttga tcattttgtg tccgttaaac 60

gaaatttgga actcttgtgg aagttcatgt gaagaaactt gtgaaagcat tgctagtggc 120

aaagacacac cttgcactct gcagtgcgtt cctggttgct tttgtgtaga cggttttgta 180

cgagatttaa gaggtcgttg cattccaatg tcattatgtc caaataaagt caacagttca 240

tgtcctgaaa atgaagtctt tcaagaatgc ggttccgctt gtccagaaac atgcgataca 300

gtttcctcgg gatttgaaag accttgcacg gggaattgta ttgctggttg tttttgtaag 360

aatgggtatg tacgaggtta cgatggaaaa tgcattccac cagaagattg tggaaaacct 420

aataacgaca aatgtggatc aaatgaagtt ttcatgaagt gtggtagcgc ttgtcccgca 480

acctgcgatt cgatccgaag tgaaaatatt attccatgca ctaaagagtg tgtttcgggt 540

tgcttctgca aatctggcta cgtcagagca tctaccggtg aatgtttagc tccggaggct 600

tgtggtgcgc atttgggcgg ctgtggaccc cgagaagagt acagagcttg tggaagtgct 660

tgtccagaat cttgtgaatc tataaaagat cttgcgccac acgcgtgtcc tgctatgtgt 720

gtacctggat gtttctgcaa gtttccattc gttcgtgggt acgatctgcg ttgcataatg 780

cctgatgatt gctaa 795

<210> 2

<211> 651

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgcgtgaat tagaggagtt gagagagctg gaagaactca atgtacctgg tgagattgtg 60

gaaagccttt caagcagtga ggaatctatt acacgcatca ataagaaaat tgagaagttt 120

cagagtgagg aacagcagca aacagaggat gaactccagg ataaaatcca cccctttgcc 180

cagacacagt ctctagtcta tcccttccct ggacccatcc ataacagcct cccacaaaac 240

atccctcctc ttactcaaac ccctgtggtg gtgccgcctt tccttcagcc tgaagtaatg 300

ggagtctcca aagtgaagga ggctatggct cctaagcaca aagaaatgcc cttccctaaa 360

tatccagttg agccctttac tgaaagccag agcctgactc tcactgatgt tgaaaatctg 420

caccttcctc tgcctctgct ccagtcttgg atgcaccagc ctcaccagcc tcttcctcca 480

actgtcatgt ttcctcctca gtccgtgctg tccctttctc agtccaaagt cctgcctgtt 540

ccccagaaag cagtgcccta tccccagaga gatatgccca ttcaggcctt tctgctgtac 600

caggagcctg tactcggtcc tgtccgggga cccttcccta ttattgtcta a 651

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggaggctcag gcggagga 18

<210> 4

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggtggtggtg gttcaggtgg tggtggttca ggtggt 36

<210> 5

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Gly Gly Ser Gly Gly Gly

1 5

<210> 6

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

1 5 10

Claims

1. 一种重组融合蛋白，其特征在于，由β-cas蛋白、蛋白酶抑制剂蛋白Tsp3044以及连接肽组成；编码所述β-cas蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码所述蛋白酶抑制剂蛋白Tsp3044的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，连接肽的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示。

2.根据权利要求1所述的重组融合蛋白，其特征在于，按照β-cas蛋白、连接肽、蛋白酶抑制剂蛋白Tsp3044的顺序连接，或者按照蛋白酶抑制剂蛋白Tsp3044、连接肽、β-cas蛋白的顺序连接。

3.含有编码权利要求1或2所述重组融合蛋白的基因的重组质粒。

4.根据权利要求3所述的重组质粒，其特征在于，以pET系列、Duet系列、pGEX系列、pHY300、pHY300PLK、pPIC3K或pPIC9K系列载体为出发载体。

5.表达权利要求1或2所述重组融合蛋白的微生物细胞。

6.根据权利要求5所述的微生物细胞，其特征在于，以大肠杆菌为宿主细胞。

7.利用权利要求1或2所述重组融合蛋白包埋姜黄素的方法，其特征在于，方法为：

（1）对重组融合蛋白进行超声处理；

（2）将处理过后的重组融合蛋白与姜黄素混合后超声处理，得到姜黄素-重组融合蛋白纳米颗粒。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，将重组融合蛋白与姜黄素按照(8~10):1的比例混合，将混合后的溶液超声处理3~4min，得到姜黄素-重组融合蛋白纳米颗粒。

9.权利要求1或2所述的重组融合蛋白、或权利要求3或4所述的重组质粒、或权利要求5或6所述的微生物细胞在制备纳米载体中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述纳米载体用于药物包埋与递送。

11.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述纳米载体用于化妆品活性物的包埋与递送。

12.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述纳米载体用于益生菌的包埋与递送。