CN114716364B - 一种标记Aβ斑块的水溶性探针及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种标记Aβ斑块的水溶性探针及其制备方法，属于荧光探针技术领域，所述水溶性探针具有如下结构通式：或其中，A为芳环基团，B为亲水的吡啶阳离子或喹啉阳离子。本发明提供的探针在水介质中是完全溶解的状态，不会发生自聚集和背景干扰，只有与AD鼠脑中的Aβ斑块结合之后才会发出荧光，因此能够实现原位实时标记，该探针通过原位实时染色的方法与fMOST系统相结合，可以有效构建全脑Aβ斑块的3D分布，从而避免了耗时的组织透明化处理过程、荧光预标记和标记后繁琐的漂洗过程，将成像周期从两周缩短至1‑2.5天，为Aβ斑块3D分布研究提供了低成本、便捷、高效的研究手段。
Description
技术领域
本发明属于荧光探针技术领域，具体涉及一种标记Aβ斑块的水溶性探针及其制备方法和应用。
背景技术
蛋白质折叠是蛋白质链获得天然3D生物活性结构的物理过程。无法折叠成天然状态的蛋白质通常会产生错误折叠，形成淀粉样纤维的聚集体，从而导致神经退行性疾病和其它疾病，例如阿尔茨海默症(AD)、亨廷顿氏病和帕金森氏病(PD)等。阿尔茨海默症(AD)是临床上最常见的中枢神经系统退行性疾病，以记忆力减退、失语、认知能力下降和执行功能障碍为特征。阿尔茨海默症(AD)最主要的病理特征是β-淀粉样蛋白(Aβ)纤维在大脑中聚集形成Aβ斑块，可能直接导致血管弹性退化和硬化，甚至引起血栓或血管破裂，从而诱发神经细胞凋亡。已有研究表明，Aβ斑块在不同脑区内的分布状况以及三维微观形貌具有显著性的差异，此外，Aβ斑块与其周围微环境(例如，血管和小胶质细胞)具有复杂的关联。并且AD的病情是逐渐发展进行的，全脑Aβ斑块数量的变化和分布是AD疾病发生和发展的重要指标。因此，对全脑Aβ斑块的3D空间分布状态的研究，对于了解有关神经退行性疾病的起因、发生和发展至关重要。
传统的2D成像难以观察到Aβ斑块在不同脑区的分布状况、三维精细结构及其与周围微环境的相互作用。常规的非连续性对全脑组织切片逐片进行免疫组化染色，然后进行成像的方法，因不同脑片在处理过程中可能会引起不同的形变，从而导致获取全脑信息时会存在图像配准困难、工作量巨大等问题。近几年，研究者通过免疫组化(IHC)与组织透明化技术相结合对组织块或全脑Aβ斑块进行免疫标记，然后使用选择性光片照明(SPIM)显微镜进行成像，最后对成像结果进行计算分析获取Aβ斑块在脑组织中的3D分布情况。但是，该方法同时也存在一些缺点，例如：1)免疫组化(IHC)实验步骤繁琐且耗时长；2)抗体作为生物大分子，价格昂贵且在生物组织中渗透性差；3)需要繁琐、费时的组织透明化处理过程和荧光标记后的漂洗过程(通常十数天或数周)；4)检测效率较低，深部脑区检出率较低。因此，建立全脑Aβ斑块3D分布的经济、简单而高效的方法是亟待解决的难题。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种价格便宜、定位准确度高的标记Aβ斑块的水溶性探针；
本发明的第二目的在于提供此种水溶性探针的制备方法，该方法制备简单、操作方便、成本低。
本发明的第三目的在于提供水溶性探针在获取全脑Aβ斑块3D分布的高效成像方面的应用。
本发明的目的通过以下技术方案来实现：
一种标记Aβ斑块的水溶性探针，所述探针具有如式(一)、式(二)或式(三)中任一结构通式：
其中，A为芳环基团，B为亲水的吡啶阳离子或喹啉阳离子。
进一步地，所述A为下述取代基中的任意一个：
其中，X为O或S，R1为下述取代基中的任意一个：
R2为下述取代基中的一个：
其中n＝1-5内的整数，/>表示基团与基团之间的连接。
进一步地，所述B为下述取代基中的任意一个：
其中，Y为Cl、Br或I；
R3为下述取代基中的任意一个：
其中，Z为Li、Na或K，表示基团与基团之间的连接。
上述的一种标记Aβ斑块的水溶性探针的制备方法，所述制备方法为：
其中，所述A为芳环基团，B为亲水的吡啶阳离子或喹啉阳离子；C为下述取代基中的任意一个：
其中，/>表示基团与基团之间的连接；
所述D为下述化合物中的任意一种：
其中，Y为Cl、Br或I；Z为Li、Na或K。
进一步地，所述碱催化缩合反应的催化剂为四氢吡咯，反应的温度为30～50℃，反应时间为7～9h。
进一步地，所述离子化反应的反应温度为70～90℃，反应时间为7～9h。
上述的水溶性探针在获取全脑Aβ斑块3D分布的高效成像方面的应用。
进一步地，所述水溶性探针用于荧光标记AD鼠脑中的Aβ斑块。
本发明具有以下优点：现有AD鼠脑Aβ全脑成像是在水介质中进行的，对标记探针提出了更高的要求。传统的脂溶性Aβ探针是疏水的，在水介质中会自发的聚集，发生沉淀，也会附着于样本的表面，造成标记效果差、背景干扰等情况，难以满足实时标记的需求；免疫标记流程复杂繁琐，需要较长的孵育时间及反复的清洗过程，也不能实现实时标记。本发明提供的一种标记Aβ斑块的水溶性探针在水介质中是完全溶解的状态，不会发生自聚集和背景干扰，只有与AD鼠脑中的Aβ斑块结合之后才会发出荧光，因此能够实现原位实时标记，结合fMOST系统进行原位标记/成像/切片一体化的成像策略。该探针通过原位实时染色的方法与fMOST系统相结合，可以有效构建全脑Aβ斑块的3D分布，从而避免了耗时的组织透明化处理过程、荧光预标记和标记后繁琐的漂洗过程，将成像周期从两周缩短至1-2.5天，是一种构建全脑Aβ斑块3D分布的便捷高效的方法，为Aβ斑块3D分布研究提供了低成本、便捷、高效的研究手段。
附图说明
图1为全脑Aβ斑块原位标记/成像/切片一体化的高效成像技术示意图。
图2为全脑Aβ斑块原位标记/成像/切片一体化的高效成像技术定位准确度统计，其中，(A)Aβ抗体和(B)PD-BZ-OH共同染色AD鼠脑切片的成像图；(C)(F)Aβ抗体和(D)(G)PD-BZ-OH方框区域的放大图；(E)为(C)(D)的叠加图像，(H)为(F)(G)的叠加图像，(标尺＝30μm)；(I)四个不同脑区Aβ斑块的定位准确度统计。
图3为从鼠脑的嗅球端到尾端提取了四个不同位置的冠状面成像图；其中(A)Tg小鼠(5XFAD，6个月大，雄性)全脑Aβ斑块的3D分布，(标尺＝1mm)；(b)图(a)中提取Bregam坐标分别为2.22，0.62，-3.08和-4.04四个位置的冠状面成像图，(标尺＝1mm)；(C)(上)Tg小鼠四个代表性脑区(MOs，LS，MM和SUB)中Aβ斑块的3D重构图像，(标尺＝50μm)，(下)通过表面渲染，显示了Aβ斑块的3D形态和大小；热图表示Aβ斑块的面积；红色＝较大，紫色＝较小。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明做进一步的描述，本发明的保护范围不局限于以下所述：
实施例1：
如式AD-1、式AD-2、式AD-3和式AD-4所示的水溶性探针，其合成路线为：
具体的合成方法包括以下步骤：
称取摩尔比1:1的化合物a和化合物b，溶于甲醇中，加入催化量的四氢吡咯催化剂，加热至30℃反应7小时，冷却过滤得到橙红色中间体c。称取c(1eq.)溶于乙腈中，分别加入d、e、f、或g(2eq.)加热至70℃反应7小时，冷却过滤用乙腈或乙酸乙酯重结晶洗涤对应得到暗红色化合物AD-1、AD-2、AD-3和AD-4。AD1：MS(ESI,m/z)：294.18；AD-2：MS(ESI,m/z)：307.19；AD-3：MS(ESI,m/z)：350.28；AD-4：MS(ESI,m/z)：385.51。
实施例2：
如式AD-5、式AD-6、式AD-7和式AD-8所示的水溶性探针，其合成路线为：
具体的合成方法包括以下步骤：
称取摩尔比1:1的化合物a和化合物b-1，溶于甲醇中，加入催化量的四氢吡咯催化剂，加热至50℃反应9小时，冷却过滤得到橙红色中间体c-1。称取c-1(1eq.)溶于乙腈中，分别加入d、e、f、或g(2eq.)加热至90℃反应9小时，冷却过滤用乙腈/乙酸乙酯重结晶洗涤得到暗红色化合物AD-5～AD-8。AD5：MS(ESI,m/z)：294.18；AD-6：MS(ESI,m/z)：307.19；AD-7：MS(ESI,m/z)：350.28；AD-8：MS(ESI,m/z)：385.51。
实施例3：
如式AD-9、式AD-10、式AD-11和式AD-12所示的水溶性探针，其合成路线为：
具体的合成方法包括以下步骤：
称取摩尔比1:1的化合物a-1和化合物b-1，溶于甲醇中，加入催化量的四氢吡咯催化剂，加热至40℃反应8小时，冷却过滤得到橙红色中间体c-2。称取c-2(1eq.)溶于乙腈中，加入d、e、f、或g(2eq.)加热至80℃反应8小时，冷却过滤用乙腈/乙酸乙酯重结晶洗涤得到暗红色化合物AD-9～AD-12。AD-9：MS(ESI,m/z)：334.26；AD-10：MS(ESI,m/z)：347.22；AD-11：MS(ESI,m/z)：390.30；AD-12：MS(ESI,m/z)：425.22。
实施例4：
如式AD-13、式AD-14、式AD-15和式AD-16所示的水溶性探针，其合成路线为：
具体的合成方法包括以下步骤：
称取摩尔比1:1的化合物a-2和化合物b-1，溶于甲醇中，加入催化量的四氢吡咯催化剂，加热至40℃反应8小时，冷却过滤得到橙红色中间体c-3。称取c-3(1eq.)溶于乙腈中，加入d、e、f、或g(2eq.)加热至80℃反应8小时，冷却过滤用乙腈/乙酸乙酯重结晶洗涤得到暗红色化合物AD-13～AD-16。AD-13：MS(ESI,m/z)：295.18；AD-14：MS(ESI,m/z)：308.20；AD-15：MS(ESI,m/z)：351.28；AD-16：MS(ESI,m/z)：386.16。
实施例5：
如式AD-17、式AD-18、式AD-19和式AD-20所示的水溶性探针，其合成路线为：
具体的合成方法包括以下步骤：
称取摩尔比1:1的化合物a-1和化合物b-2，溶于甲醇中，加入催化量的四氢吡咯催化剂，加热至40℃反应8小时，冷却过滤得到橙红色中间体c-4。称取c-4(1eq.)溶于乙腈中，加入d、e、f、或g(2eq.)加热至80℃反应8小时，冷却过滤用乙腈/乙酸乙酯重结晶洗涤得到暗红色化合物AD-17～AD-20。AD-17：MS(ESI,m/z)：384.26；AD-18：MS(ESI,m/z)：397.22；AD-19：MS(ESI,m/z)：440.32；AD-20：MS(ESI,m/z)：475.26。
实施例6：
如式AD-21、式AD-22、式AD-23和式AD-24所示的水溶性探针，其合成路线为：
具体的合成方法包括以下步骤：
称取摩尔比1:1的化合物a-2和化合物b-2，溶于甲醇中，加入催化量的四氢吡咯催化剂，加热至40℃反应8小时，冷却过滤得到橙红色中间体c-5。称取c-5(1eq.)溶于乙腈中，加入d、e、f、或g(2eq.)加热至80℃反应8小时，冷却过滤用乙腈/乙酸乙酯重结晶洗涤得到暗红色化合物AD-21～AD-24。AD-21：MS(ESI,m/z)：345.20；AD-22：MS(ESI,m/z)：358.18；AD-23：MS(ESI,m/z)：401.28；AD-24：MS(ESI,m/z)：436.18。
实施例7：
如式AD-25、式AD-26、式AD-27和式AD-28所示的水溶性探针，其合成路线为：
具体的合成方法包括以下步骤：
称取摩尔比1:1的化合物a-3和化合物b-1，溶于甲醇中，加入催化量的四氢吡咯催化剂，加热至40℃反应8小时，冷却过滤得到橙红色中间体c-6。称取c-6(1eq.)溶于乙腈中，加入d、e、f、或g(2eq.)加热至80℃反应8小时，冷却过滤用乙腈/乙酸乙酯重结晶洗涤得到暗红色化合物AD-25～AD-28。AD-25：MS(ESI,m/z)：348.26；AD-26：MS(ESI,m/z)：397.24；AD-27：MS(ESI,m/z)：440.32；AD-28：MS(ESI,m/z)：475.22。
实施例8：
如式AD-29、式AD-30、式AD-31和式AD-32所示的水溶性探针，其合成路线为：
具体的合成方法包括以下步骤：
称取摩尔比1:1的化合物a-4和化合物b-1，溶于甲醇中，加入催化量的四氢吡咯催化剂，加热至40℃反应8小时，冷却过滤得到橙红色中间体c-7。称取c-7(1eq.)溶于乙腈中，加入d、e、f、或g(2eq.)加热至80℃反应8小时，冷却过滤用乙腈/乙酸乙酯重结晶洗涤得到暗红色化合物AD-29～AD-32。AD-29：MS(ESI,m/z)：344.20；AD-30：MS(ESI,m/z)：357.20；AD-31：MS(ESI,m/z)：400.28；AD-32：MS(ESI,m/z)：435.20。
实施例9：
如式AD-33、式AD-34、式AD-35和式AD-36所示的水溶性探针，其合成路线为：
具体的合成方法包括以下步骤：
称取摩尔比1:1的化合物a-3和化合物b-2，溶于甲醇中，加入催化量的四氢吡咯催化剂，加热至40℃反应8小时，冷却过滤得到橙红色中间体c-8。称取c-8(1eq.)溶于乙腈中，加入d、e、f、或g(2eq.)加热至80℃反应8小时，冷却过滤用乙腈/乙酸乙酯重结晶洗涤得到暗红色化合物AD-33～AD-36。AD-33：MS(ESI,m/z)：434.26；AD-34：MS(ESI,m/z)：447.26；AD-35：MS(ESI,m/z)：490.32；AD-36：MS(ESI,m/z)：525.26。
实施例10：
如式AD-37、式AD-38、式AD-39和式AD-40所示的水溶性探针，其合成路线为：
具体的合成方法包括以下步骤：
称取摩尔比1:1的化合物a-4和化合物b-2，溶于甲醇中，加入催化量的四氢吡咯催化剂，加热至40℃反应8小时，冷却过滤得到橙红色中间体c-9。称取c-9(1eq.)溶于乙腈中，加入d、e、f、或g(2eq.)加热至80℃反应8小时，冷却过滤用乙腈/乙酸乙酯重结晶洗涤得到暗红色化合物AD-37～AD-40。AD-37：MS(ESI,m/z)：394.22；AD-38：MS(ESI,m/z)：408.22；AD-39：MS(ESI,m/z)：450.30；AD-40：MS(ESI,m/z)：485.18。
实施例11：
如式AD-41、式AD-42、式AD-43和式AD-44所示的水溶性探针，其合成路线为：
具体的合成方法包括以下步骤：
称取摩尔比1:1的化合物a-5和化合物b-1，溶于甲醇中，加入催化量的四氢吡咯催化剂，加热至40℃反应8小时，冷却过滤得到橙红色中间体c-10。称取c-10(1eq.)溶于乙腈中，加入d、e、f、或g(2eq.)加热至80℃反应8小时，冷却过滤用乙腈/乙酸乙酯重结晶洗涤得到暗红色化合物AD-41～AD-44。AD-41：MS(ESI,m/z)：333.18；AD-42：MS(ESI,m/z)：346.20；AD-43：MS(ESI,m/z)：389.28；AD-44：MS(ESI,m/z)：424.18。
实施例12：
如式AD-45、式AD-46、式AD-47和式AD-48所示的水溶性探针，其合成路线为：
具体的合成方法包括以下步骤：
称取摩尔比1:1的化合物a-6和化合物b-1，溶于甲醇中，加入催化量的四氢吡咯催化剂，加热至40℃反应8小时，冷却过滤得到橙红色中间体c-11。称取c-11(1eq.)溶于乙腈中，加入d、e、f、或g(2eq.)加热至80℃反应8小时，冷却过滤用乙腈/乙酸乙酯重结晶洗涤得到暗红色化合物AD-45～AD-48。AD-45：MS(ESI,m/z)：397.22；AD-46：MS(ESI,m/z)：410.22；AD-47：MS(ESI,m/z)：453.30；AD-48：MS(ESI,m/z)：488.22。
实施例13：
如式AD-49、式AD-50、式AD-51和式AD-52所示的水溶性探针，其合成路线为：
具体的合成方法包括以下步骤：
称取摩尔比1:1的化合物a-7和化合物b-1，溶于甲醇中，加入催化量的四氢吡咯催化剂，加热至40℃反应8小时，冷却过滤得到橙红色中间体c-12。称取c-12(1eq.)溶于乙腈中，加入d、e、f、或g(2eq.)加热至80℃反应8小时，冷却过滤用乙腈/乙酸乙酯重结晶洗涤得到暗红色化合物AD-49～AD-52。AD-49：MS(ESI,m/z)：346.22；AD-50：MS(ESI,m/z)：359.20；AD-51：MS(ESI,m/z)：402.28；AD-52：MS(ESI,m/z)：437.20。
实施例14：
如式AD-53、式AD-54、式AD-55和式AD-56所示的水溶性探针，其合成路线为：
具体的合成方法包括以下步骤：
称取摩尔比1:1的化合物a-7和化合物b-2，溶于甲醇中，加入催化量的四氢吡咯催化剂，加热至40℃反应8小时，冷却过滤得到橙红色中间体c-13。称取c-13(1eq.)溶于乙腈中，加入d、e、f、或g(2eq.)加热至80℃反应8小时，冷却过滤用乙腈/乙酸乙酯重结晶洗涤得到暗红色化合物AD-53～AD-56。AD-53：MS(ESI,m/z)：396.22；AD-54：MS(ESI,m/z)：490.22；AD-55：MS(ESI,m/z)：452.30；AD-56：MS(ESI,m/z)：487.24。
实施例15：
如式AD-57、式AD-58、式AD-59和式AD-60所示的水溶性探针，其合成路线为：
具体的合成方法包括以下步骤：
称取摩尔比1:1的化合物a-8和化合物b-1，溶于甲醇中，加入催化量的四氢吡咯催化剂，加热至40℃反应8小时，冷却过滤得到橙红色中间体c-14。称取c-14(1eq.)溶于乙腈中，加入d、e、f、或g(2eq.)加热至80℃反应8小时，冷却过滤用乙腈/乙酸乙酯重结晶洗涤得到暗红色化合物AD-57～AD-60。AD-57：MS(ESI,m/z)：320.22；AD-58：MS(ESI,m/z)：333.18；AD-59：MS(ESI,m/z)：376.28；AD-60：MS(ESI,m/z)：411.18。
实施例16：
如式AD-61、式AD-62、式AD-63和式AD-64所示的水溶性探针，其合成路线为：
具体的合成方法包括以下步骤：
称取摩尔比1:1的化合物a-8和化合物b-2，溶于甲醇中，加入催化量的四氢吡咯催化剂，加热至40℃反应8小时，冷却过滤得到橙红色中间体c-15。称取c-15(1eq.)溶于乙腈中，加入d、e、f、或g(2eq.)加热至80℃反应8小时，冷却过滤用乙腈/乙酸乙酯重结晶洗涤得到暗红色化合物AD-61～AD-64。AD-61：MS(ESI,m/z)：370.22；AD-62：MS(ESI,m/z)：383.20；AD-63：MS(ESI,m/z)：426.30；AD-64：MS(ESI,m/z)：461.24。
实施例17：全脑Aβ斑块原位标记/成像/切片一体化的高效成像
将琼脂糖包埋的AD鼠脑固定于三维精密移动平台上，并在样本槽内分别加入本发明实施例制备的式如AD-1～AD-64的水溶性Aβ探针水溶液(浓度范围1μM～10μM)，淹没AD鼠脑样本，使用水镜(20×/Water，1.0NA)进行样本扫描，根据需求利用科研级相机以0.32μm×0.32μm×1～5μm体素分辨率采集荧光信号，通过三维精密平台的移动，对样本表面进行马赛克式扫描，采集完成单层样本信号后，切到自动切除已成像片层，而后继续采集下一层图像，直至完成小鼠全脑数据获取，如图1所示。染料在鼠脑组织中的渗透速度为10～20μm/min，fMOST系统扫描成像的平均速度为2片/min(即4～10μm/min)，小鼠脑从嗅球端到脑干端的长度约为14000μm，根据设置的每张切片厚度1～5μm，采集整个鼠脑样本数据时间约为1-2.5天，实验发现式如AD-1～AD-64的水溶性探针均可对Aβ斑块进行标记。
如图2所示，随机选取成像采集完的脑片(采集过程中已被水溶性Aβ探针标记)(图2B)，通过免疫组化方法对Aβ斑块进行标记(图2A)，与水溶性Aβ探针标记的信号进行比较统计。通过局部放大图(图2C-D和图2F-G)及重叠图(图2E和2H)，可以看到，免疫标记信号与水溶性Aβ探针标记的信号吻合程度良好。并且还对四个不同脑区标记信号进行了统计(图2I)，发现水溶性Aβ探针的标记率在95％左右，说明此方法得到的数据具有很高的精确度。
如图3所示，从鼠脑的嗅球端到尾端提取了四个不同位置的冠状面成像图，Bregam坐标分别为2.22，0.62，-3.08和-4.04。可以直观的看到，使用fMOST系统进行的原位实时染色获得的图像显示出较高的信噪比，并且不同脑区内Aβ斑块的分布密度差异很大(图3B)。为了观察不同脑区Aβ斑块的3D分布情况，我们选择了四个代表性的脑区(MOs，LS，MM和SUB)，提取大小为200μm×200μm×200μm的数据块展示了Aβ斑块的3D空间分布情况，并通过表面渲染显示了Aβ斑块的3D形态和大小(图3C)。可以看到，不同脑区内Aβ斑块的分布密度、大小和形态存在显著差异。表明通过这种便捷的原位实时染色的方法与fMOST系统相结合，可以有效构建全脑Aβ斑块的3D分布，从而避免了耗时的组织透明化处理过程、荧光预标记和标记后繁琐的漂洗过程，是一种构建全脑Aβ斑块3D分布的便捷高效的方法，为Aβ斑块3D分布研究提供了低成本、便捷、高效的研究手段。
因此，采用本发明水溶性探针进行荧光标记AD鼠脑中的Aβ斑块再成像的方法与现有的先全脑预标记再成像的方法相比，1)流程简单：通过将标记/切片/成像一体化的方法，省去了繁琐、耗时的先全脑预标过程。2)成本低：相比于昂贵的抗体，水溶性Aβ探针用量少，价格便宜。3)准确度高：通过定位准确度统计，水溶性Aβ探针的定位准确度高达95％，且不用漂洗，避免了抗体漂洗不干净造成的假信号难题。4)检出率高：通过原位标记/切片/成像的的方式，使得每一片的标记都是完整的，避免了全脑样本染色深部脑区染色不均匀的情况。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种标记Aβ斑块的水溶性探针，其特征在于，所述探针的化学结构式为：
2.根据权利要求1所述的一种标记Aβ斑块的水溶性探针的制备方法，其特征在于，所述制备方法为：
3.权利要求1所述的水溶性探针在制备获取全脑Aβ斑块3D分布的高效成像产品中的应用。
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