CN114711192A - 一种长效抑郁症动物模型的构建试剂盒及构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种长效抑郁症动物模型的构建试剂盒及构建方法，涉及动物模型技术领域。本发明采用卡介苗(或牛结核分枝杆菌)和低用量的百日咳毒素联合诱导，大大降低了模型的造模成本。利用本发明所述构建方法构建得到的小鼠模型，病态行为和抑郁样行为的时间区段明显分开，具有较好的表面效度和预测效度。本发明所述构建方法简便，不需要像慢性不可预测应激、慢性束缚应激、社会挫败和母子分离等抑郁症模型那样每日大量繁琐操作。利用本发明所述小鼠模型可为抗抑郁疗法研究提供宝贵的长期干预窗口。
Description
技术领域
本发明属于动物模型技术领域，具体涉及一种长效抑郁症动物模型的构建试剂盒及构建方法。
背景技术
抑郁症是一类严重危害人们健康的全球性精神障碍疾病，具高患病率、高复发率、高疾病负担、高自残率、高自杀率特点，主要表现为持续性的心境极度低落、意志活动减退、认知功能损害、思维迟缓等症状(高贵元,黄捷,刘丹,张芳,张超群,张国利,陈丽华,邵迎新.抑郁症的发病机制及抗抑郁药物的研究进展.中国医药导报,2021,18(01):52-55.)。2017年世界卫生组织数据表明，全球约有3.22亿人正遭受抑郁症困扰，患病率约4.4％(World Health Organization.Depression and other common mental disorders:global health estimates(Report).2017,1–24.)。抑郁症动物模型是研究抗抑郁药物和抑郁症疗法的基石。常用的造模动物为啮齿类动物，模型制备方法主要有5种：社会环境应激造模、药物造模、手术造模、遗传造模、基于炎症的抑郁症模型。
伊利诺伊大学香槟分校
Moreau等研究人员于2008年时首次报道小鼠注射卡介苗(BCG，成分为牛结核分枝杆菌Mycobacterium tuberculosis)能够诱导基于免疫炎症的长期抑郁样症状(MoreauM,AndréC,O'ConnorJC,et al.InocμLation ofBacillusCalmette-Guerin to mice induces an acute episode of sickness behaviorfollowed by chronic depressive-like behavior.Brain Behav Immun.2008；22(7):1087-1095.doi:10.1016/j.bbi.2008.04.001)，属于免疫刺激抑郁模型的一种，且该模型具有较好的预测效应。然而，诱导该模型需要较高菌活度的卡介苗诱导剂量一般在107-109CFU/mouse级别(
Moreau,Jacques Lestage,Danièle Verrier,Cécile Mormède,Keith W.Kelley,Robert Dantzer,Nathalie Castanon,Bacille Calmette-Guérin InocμLation Induces Chronic Activation of Peripheral and Brain Indoleamine 2,3-Dioxygenase in Mice,The Journal ofInfectious Diseases,Volume 192,Issue 3,1 Aμgust 2005)，每只小鼠需要使用的卡介苗剂量很大，从而导致卡介苗或牛结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)造模成本较高。因此，亟需寻到到一种能够降低卡介苗或牛结核分枝杆菌剂量同时能够诱导显著性长期抑郁样行为的方法。
相对于社会环境应激、药物、手术和遗传类等抑郁症模型，通过免疫激活构建的抑郁症模型的制作方法较为简便，同时表现出良好的表面效度、结构效度和预测效度，在抗抑郁药物筛选和抑郁症发病机制方面具有广阔的应用前景。但是这类模型有三点普遍性缺点：一是抑郁样行为和病态行为有时不是很好区分，二是抑郁样的持续时间较短，三是有时模型不是很稳定。而卡介苗诱导的抑郁症模型则在很大程度上克服了这三点缺陷，表现出较长的抑郁样行为时间，以及相当较容易区分病态行为时间区间和抑郁样行为区间。但是也存在一个非常大需要解决的重要问题，即卡介苗对于每只小鼠使用的量非常高，这就极大增加了药理实验动物模型的构建成本。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种长效抑郁症动物模型的构建试剂盒及构建方法，解决卡介苗只有在高剂量下才能成功诱导长效抑郁症小鼠模型的技术瓶颈，降低造模成本。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种长效抑郁症动物模型的构建方法，包括以下步骤：采用卡介苗和百日咳毒素联合诱导。
优选的，所述联合诱导包括：第0天，向模型动物注射所述卡介苗的工作液；
分别在第0～1天和第2～3天依次向所述模型动物注射所述百日咳毒素的工作液。
优选的，所述卡介苗的工作液的制备方法，包括：利用1×PBS或生理盐水将卡介苗稀释至牛结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)菌落形成单位浓度为1×106～6×107CFU/mL，得所述工作液。
优选的，所述百日咳毒素的工作液的制备方法，包括：利用超纯水溶解百日咳毒素，制备200μg/mL的储备液；
利用1×PBS或生理盐水将所述储备液稀释为0.5～4μg/mL，得所述工作液。
优选的，所述模型动物包括小鼠。
本发明还提供了一种长效抑郁症小鼠模型的构建方法，包括以下步骤：在第0天时，向小鼠腹腔注射50～400μL卡介苗的工作液，然后在第0～1天时和第2～3天时分别腹腔注射50～400μL百日咳毒素的工作液1次；
所述卡介苗的工作液的牛结核分枝杆菌菌落形成单位浓度为1×106～6×107CFU/mL；
所述百日咳毒素的工作液浓度为0.5～4μg/mL。
优选的，所述卡介苗的牛结核分枝杆菌菌落形成单位剂量为1×105～5×106CFU/鼠；
所述百日咳毒素的腹腔注射量为50～800ng/鼠/次。
本发明还提供了一种构建长效抑郁症动物模型的试剂盒，包括独立包装的卡介苗和百日咳毒素。
优选的，所述试剂盒中还包括溶解和/或稀释用的超纯水、PBS和生理盐水。
本发明还提供了利用上述构建方法得到的动物模型或上述构建方法得到的小鼠模型的用途，将所述动物模型或小鼠模型用于筛选或鉴定能够预防、缓解或者治疗抑郁症的药物；和/或，将所述动物模型或小鼠模型用于筛选或鉴定能够预防抑郁症的疫苗。
有益效果：本发明提供了一种长效抑郁症动物模型的构建方法，采用卡介苗和低用量的百日咳毒素联合诱导，大大降低了模型的造模成本。利用本发明所述构建方法构建得到的小鼠模型，病态行为和抑郁样行为的时间区段明显分开，具有较好的表面效度和预测效度。本发明所述构建方法简便，不需要像慢性不可预测应激、慢性束缚应激、社会挫败和母子分离等抑郁症模型那样每日大量繁琐操作。利用本发明所述小鼠模型可为抗抑郁疗法研究提供宝贵的长期干预窗口。
附图说明
图1为实施例1各处理组小鼠体重变化图(n＝15,Mean±SD)；
图2为实施例1各处理组小鼠第28天时悬尾实验结果(n＝15,Mean±SD)；
图3为实施例1各处理组小鼠第27天时开场实验区域穿梭次数(n＝15,Mean±SD)；
图4为实施例1各处理组小鼠第27天时开场实验探究性行为次数(n＝15,Mean±SD)；
图5为实施例1各处理组小鼠第27天时开场实验探总运动距离(n＝15,Mean±SD)；
图6为实施例2各处理组小鼠第27天时糖水偏好率(n＝12,Mean±SD)；
图7为实施例2中各处理组小鼠第28天时开场实验区域穿梭次数(n＝12,Mean±SD)；
图8为实施例2中各处理组小鼠第28天时开场实验探究性行为次数(n＝12,Mean±SD)；
图9为实施例2中各处理组小鼠第28天时的总运动距离(n＝12，Mean±SD)。
具体实施方式
本发明提供了一种长效抑郁症动物模型的构建方法，包括以下步骤：采用卡介苗和百日咳毒素(PTX)联合诱导。
本发明所述卡介苗(BCG，成分为牛结核分枝杆菌Mycobacterium tuberculosis)在使用时，优选进行稀释至工作液浓度，所述工作液的制备方法，优选包括：利用1×PBS或生理盐水将卡介苗稀释至牛结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)菌落形成单位浓度为1×106～6×107CFU/mL，得所述工作液。本发明对所述卡介苗或牛结核分支杆菌的来源并没有特殊限定，利用本领域的常规市售卡介苗或牛结核分枝杆菌即可，如购自成都生物制品所有限公司、上海生物制品研究所有限公司或法国赛诺菲公司等。
本发明所述百日咳毒素在使用时，优选进行稀释至工作液浓度，所述工作液的制备方法，优选包括：利用超纯水溶解百日咳毒素，制备200μg/mL的储备液；利用1×PBS或生理盐水将所述储备液稀释为0.5～4μg/mL，得所述工作液。本发明对所述百日咳毒素的来源并没有特殊限定，利用本领域的常规市售产品即可，如购自ListBiological Labs(50μg/瓶，#180或#181)。本发明在配制所述储备液时，优选取1瓶百日咳毒素，吸取250μL超纯水加入摇晃溶解至澄清透明，即得到浓度为200μg/mL的百日咳毒素储备液，4℃长期保存。本发明所述百日咳毒素的工作液优选现配现用，在配制时，利用1×PBS或生理盐水稀释至目标浓度即可。
本发明所述联合诱导，优选包括：第0天，向模型动物注射所述卡介苗的工作液；分别在第0～1天和第2～3天依次向所述模型动物注射所述百日咳毒素的工作液。本发明所述模型动物优选包括小鼠。
本发明还提供了一种长效抑郁症小鼠模型的构建方法，包括以下步骤：在第0天时，向小鼠腹腔注射50～400μL卡介苗的工作液，然后在第0～1天时和第2～3天时分别腹腔注射50～400μL百日咳毒素的工作液1次；
所述卡介苗的工作液的牛结核分枝杆菌菌落形成单位浓度为1×106～6×107CFU/mL；
所述百日咳毒素的工作液浓度为0.5～4μg/mL。
本发明所述卡介苗的工作液以及百日咳毒素的工作液的制备方法优选与上述相同，在此不再赘述。本发明实施例中，所选小鼠优选为健康成年CD-1小鼠，但不能仅将其认定为本发明的全部保护范围。本发明对所述小鼠进行造模时，所述卡介苗的菌落形成单位剂量优选为1×105～5×106CFU/鼠；所述百日咳毒素的腹腔注射量优选为50～800ng/鼠/次。
本发明利用百日咳毒素+卡介苗的联合方法，可在较低的卡介苗剂量下，诱导得到显著的长效抑郁症小鼠模型，卡介苗使用的牛结核分枝杆菌菌落形成单位(CFU)剂量可低至1×105CFU/鼠。且本发明所述抑郁症模型小鼠的病态行为和抑郁样行为的时间区段明显分开：在造模后大约第1～7天为病态行为+抑郁行为的混合状态时间区段，大约在第7天之后小鼠基本进入了以抑郁样行为主导的时间区段，抑郁样行为至少能持续到造模后第28天。本发明所述抑郁症模型小鼠表现出显著的探索性行为降低、行为绝望状态增加、逃避行为的增加等。
本发明还提供了一种构建长效抑郁症动物模型的试剂盒，包括独立包装的卡介苗和百日咳毒素。
本发明对所述试剂盒中卡介苗和百日咳毒素的含量并没有特殊限制，能够稀释得到工作液浓度即可。本发明所述试剂盒中优选还包括溶解和/或稀释用的超纯水、PBS和生理盐水。
本发明还提供了利用上述构建方法得到的动物模型或上述构建方法得到的小鼠模型的用途，将所述动物模型或小鼠模型用于筛选或鉴定能够预防、缓解或者治疗抑郁症的药物；和/或，将所述动物模型或小鼠模型用于筛选或鉴定能够预防抑郁症的疫苗。
利用本发明所述构建方法得到的动物模型或小鼠模型，能够保持卡介苗模型的其他优点，并且模型比较稳定，可为抗抑郁疗法研究提供宝贵的长期干预窗口。
下面结合实施例对本发明提供的一种长效抑郁症动物模型的构建方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
(1)百日咳毒素(PTX)母液储备液的配制。取1瓶百日咳毒素(PTX，ListBiological Labs，50μg/瓶，LOT:#181)，吸取250μL超纯水加入摇晃溶解至澄清透明，即得到浓度为200μg/mL的百日咳毒素(PTX)储备液，4℃长期保存。
(2)百日咳毒素工作液的配制。采用1×PBS将浓度为200μg/mL PTX溶液储备液稀释成浓度为1μg/mL的百日咳毒素工作液，现配现用。
(3)卡介苗悬液的配制。将卡介苗(BCG,成都生物制品所有限公司)采用生理盐水配制成菌落形成单位(CFU)浓度为2×107CFU/mL。
(4)丙咪嗪(IMI)阳性对照药物溶液的配制。采用生理盐水配制浓度为1.5mg/mL丙咪嗪溶液。
(5)受试动物与造模处理。选取8周龄的SPF级健康雄性CD-1小鼠，分为空白(Control)组、卡介苗+百日咳毒素(BCG+PTX)组、卡介苗+百日咳毒素+丙咪嗪(BCG+PTX+IMI)组，每组15只小鼠。
空白(Control)组：腹腔注射(ip)无菌生理盐水200μL/mouse。
卡介苗+百日咳毒素(BCG+PTX)组：在第0天时腹腔注射200μL卡介苗悬液，剂量为4×106CFU/mouse；然后在第1天时和第3天时分别腹腔注射1次200μL百日咳毒素工作液，剂量为200ng/mouse。
卡介苗+百日咳毒素+丙咪嗪(BCG+PTX+IMI)组：在第0天时腹腔注射200μL卡介苗悬液，剂量为4×106CFU/mouse；在第1天时和第3天时分别腹腔注射1次200μL百日咳毒素工作液，剂量为200ng/mouse；从第0天开始每天灌胃给药丙咪嗪药物1次，剂量为15mg/kg，连续28天。
注：丙咪嗪(IMI)为临床一线三环类抗抑郁药物，常被用来作为抗抑郁研究的阳性对照药物。
(6)饲养条件。每笼饲养5只受试CD-1小鼠，避免单笼单只饲养。屏障环境饲养，在每个笼具上放上装有纯水的饮水瓶和无菌饲料。12h光照：12小时黑暗，饲养温度22℃，湿度50％。
(7)体重变化的监测病态行为监测
从造模前-4天到造模后第7每天称量一次体重，然后从第8天起每间隔1～3天称一次体重，直到实验结束。目的是通过体重变化监控小鼠对病态行为反应情况。
结果如图1所示，在BCG+PTX联合造模后CD-1小鼠体重出现了一个急剧下降的趋势，下降程度高于BCG单独造模，然后体重逐渐恢复，在第5天时体重已经恢复至与control组CD-1小鼠同等水平，提示这时小鼠已经从病态中恢复过来。
(8)抑郁样行为的评估
1)开场实验
在造模前时、造模后第6天和第27天时，通过开场实验测试来评估小鼠的探索性行为、抑郁焦虑状态和自发运动行为。具体方法：依据Porsolt等报道(参考文献PMID:11378179)中描述，测试前60min将小鼠移到开场实验测试房，测试时将小鼠从笼中取出置于开场实验装置(50×50×415mm)中央，并迅速拉上实验站遮光罩帘。在操作软件中记录小鼠编号、日期、状态后打开记录系统，选取九宫格模式，中心区比例为0.5，通过开场设备上方的摄像机及与其相连的监视器记录5～10min内小鼠的活动情况包括运动时间、静止时间、运动距离、中央区停留时间、中央区穿梭次数、站立行为等。测试结束后将小鼠放回笼内，用70％乙醇彻底擦拭实验装置并用纸巾擦干。
2)悬尾实验
在造模后第28天时，通过悬尾实验来评估小鼠的行为绝望状态。具体方法：依据Steru等报道的方法(参考文献PMID:3923523)稍作修改，实验前60min将小鼠移至一间安静的测试房，以减少动物紧张感。实验时将小鼠尾巴用胶带固定起来(距离尾巴尖部2～3cm)悬挂在实验架上，实验持续6min，全程通过数码摄像机记录实验过程，然后通过双盲方式使用计时器或悬尾实验分析软件(SuperTst,上海欣软信息科技有限公司)统计后4min内小鼠一动不动的总时间。不动时间定为小鼠被悬挂后完全不动的时间。
结果如图2所示，在造模第28天时，BCG+PTX造模组小鼠在悬尾实验中的一动不动时间极显著高于空白组(p<0.01)，优于BCG单独造模组小鼠(p<0.05)，并且阳性对照药丙咪嗪(IMI)能够改善BCG+PTX联合造模小鼠的一动不动时间。
(9)构建的抑郁症小鼠模型评价结果
1)具有良好的表面效度：BCG+PTX组小鼠从5天时从病态中恢复正常，然后开始表现出不受病态行为干扰的抑郁样行为，至少持续到第28天，如悬尾实验中的行为绝望状态增加(p<0.01)，开场实验中的区域穿梭次数(p<0.01)、探究性行为(p<0.001)和总运动距离降低(p<0.01)等。
结果如图3、图4和图5所示，其中图3显示在BCG+PTX联合诱导能够极显著降低CD-1小鼠区域穿梭次数(p<0.01)、探究性行为次数(p<0.001)和总运动距离(p<0.01)，优于BCG单独诱导模型。
2)具有较好的预测效度：临床经典三环类抗抑郁药——丙咪嗪能预防性显著缓解抑郁症模型小鼠的抑郁样行为，如改善悬尾实验中行为绝望状态(p<0.01，图2)，增加开场实验中的区域穿梭次数(p<0.001，图3)，增加开场实验中探究性行为(p<0.05，图4)和总运动距离(p<0.05，图5)等。
实施例2
(1)百日咳毒素(PTX)母液储备液的配制。取1瓶百日咳毒素(PTX)(ListBiological Labs，50μg/瓶，LOT:#180)，吸取200μL超纯水加入摇晃溶解至澄清透明，即得到浓度为250μg/mL的百日咳毒素(PTX)储备液，4℃保存。
(2)百日咳毒素(PTX)工作液的配制。采用生理盐水将浓度为250μg/mLPTX储备液稀释成浓度为2μg/mL的百日咳毒素工作液，现配现用。
(3)卡介苗悬液的配制。将卡介苗(BCG，成都生物制品所有限公司)采用1×PBS配制成菌落形成单位(CFU)浓度为2×106CFU/mL。
(4)阳性对照药物(盐酸氟西汀)溶液的配制。采用生理盐水配制浓度为1.5mg/mL丙咪嗪溶液。
(5)受试动物与造模处理。选取10周龄的SPF级健康雄性CD-1小鼠，分为空白(Control)组和卡介苗+百日咳毒素(BCG+PTX)组、卡介苗+百日咳毒素+丙咪嗪(BCG+PTX+IMI)组，每组12只小鼠。
空白(Control)组：腹腔注射(ip)无菌生理盐水400μL/mouse。
卡介苗+百日咳毒素(BCG+PTX)组：在第0天时腹腔注射400μL浓度为2×106CFU/mL卡介苗悬液，剂量为8×105CFU/mouse；然后在第1天时和第3天时每只小鼠分别腹腔注射200μL浓度为2μg/mL百日咳毒素1次，剂量为400ng/mouse。
卡介苗+百日咳毒素+丙咪嗪(BCG+PTX+IMI)组：第0天时腹腔注射400μL浓度为2×106CFU/mL卡介苗悬液，剂量为8×105CFU/mouse；然后在第1天时和第3天时每只小鼠分别腹腔注射200μL浓度为2μg/mL百日咳毒素1次，剂量为400ng/mouse；从第0天开始每天灌胃给予阳性对照药物丙咪嗪，剂量为15mg/kg，周期28天。
注：丙咪嗪(IMI)为临床一线三环类抗抑郁药物，常被用来作为抗抑郁研究的阳性对照药物。
(6)饲养条件。每笼饲养4只受试CD-1小鼠，避免单笼单只饲养。屏障环境饲养，在每个笼具上放上装有纯水的饮水瓶和无菌饲料。12h光照：12小时黑暗，饲养温度23℃，湿度55％。
(7)体重变化的监测
从造模前4天到造模后第7天，每天称量一次体重，然后从第8天起每间隔1-3天称一次体重，直到实验结束。目的是通过体重变化监控小鼠对病态行为反应情况。
(8)抑郁样行为的评估
1)糖水偏好测试
在造模后第27天时进行糖水偏好测试。糖水偏好实验主要用来评价抑郁小鼠的核心症状之一——快感缺失。根据文献报道中方法进行(参考文献PMID:19632285)。在前72h进行蔗糖水适应训练，每笼中同时放置两个水瓶，一瓶中装有2％蔗糖水溶液，另一瓶中装有自来水，每12h更换一次两个水瓶所在位置。适应糖水后，对小鼠同时剥夺食物和饮水23h。糖水偏好实验实施于第28天7:00p.m，每笼小鼠同时给予1瓶装有2％糖水和1瓶装有自来水的水瓶，让其自由饮水，2h后测定糖水和自来水消耗量，计算糖水偏好率，公式如下：
糖水偏好率＝糖水消耗量/(糖水消耗量+自来水消耗量)×100％。
结果如图6所示，在第27天时BCG+PTX联合诱导可以极显著降低CD-1小鼠的糖水偏好率(p<0.01)，效果优于BCG单独诱导(p<0.05)。
2)开场实验
在造模前和造模后的第28天，通过与实施例1相同的开场实验测试来评估小鼠的探索性行为、抑郁焦虑状态和自发运动行为。
(9)构建的抑郁症小鼠模型特征
1)BCG+PTX组小鼠从5天时从病态中恢复正常(体重降低与Control组无显著性差异，p>0.05)；糖水偏好率在第27天时极显著性降低(p<0.01，图6)；第28天开场实验中的区域穿梭次数(p<0.01，图7)、探究性行为(p<0.05，图8)和总运动距离均降低(p<0.05，图9)等。这表明百日咳毒素联合卡介苗诱导的抑郁症模型具有较好的表面效度。
2)三环类抗抑郁药丙咪嗪在15mg/kg剂量下能够显著缓解抑郁症模型小鼠糖水偏好率(p<0.05，图6)，降低开场实验中的区域穿梭次数(p<0.05，图7)，增加开场实验中探究性行为(p<0.05，图8)和总运动距离(p<0.05，图9)等。这表明该抑郁症小鼠模型具有较好的预测效度。
实施例3
(1)百日咳毒素(PTX)母液储备液的配制。取1瓶百日咳毒素(PTX)(如ListBiological Labs，50μg/瓶，LOT#180)，吸取250μL超纯水加入摇晃溶解至澄清透明，即得到浓度为200μg/mL的百日咳毒素(PTX)储备液，4℃保存。
(2)百日咳毒素(PTX)工作液的配制。采用1×PBS将浓度为200μg/mLPTX溶液储备液稀释成浓度为2μg/mL的百日咳毒素工作液，现配现用。
(3)卡介苗悬液的配制。将卡介苗采用1×PBS配制成菌落形成单位(CFU)浓度为5×105CFU/mL。
(4)受试动物与造模处理。选取8周龄的SPF级健康雄性CD-1小鼠，分为空白(Control)组、卡介苗+百日咳毒素(BCG+PTX)组，每组15只小鼠。
空白(Control)组：腹腔注射(ip)无菌生理盐水200μL/mouse。
卡介苗+百日咳毒素(BCG+PTX)组：在第0天时腹腔注射200μL浓度为5×105CFU/mL卡介苗悬液，菌落形成单位(CFU)剂量为1×105/CFU mouse；然后在第0天时和第2天时分别腹腔注射200μl浓度为2μg/mL的百日咳毒素工作液1次，剂量为400ng/mouse。实验周期15天。
(5)饲养条件。每笼饲养5只受试CD-1小鼠，避免单笼单只饲养。屏障环境饲养，在每个笼具上放上装有纯水的饮水瓶和无菌饲料。12h光照：12小时黑暗，饲养温度23℃，湿度55％。
(6)体重变化的监测
从造模前4天到造模后第7天，每天称量一次体重，然后从第8天起每间隔1-3天称一次体重，直到实验结束。目的是通过体重变化监控小鼠对病态行为反应情况。
(7)抑郁样行为的评估
1)糖水偏好率测试
在造模后第14天时进行与实施例2相同的糖水偏好测试，结果如表1所示。
2)悬尾实验
在造模后第15天，通过与实施例1相同的悬尾实验来评估小鼠的行为绝望状态，结果如表1所示。
表1糖水偏好率测试和悬尾实验结果
(8)构建的抑郁症小鼠模型特征
小鼠在百日咳毒素联合刺激下，卡介苗在剂量低至为1×105CFU/mouse时仍可成功诱导抑郁症模型小鼠。BCG+PTX组在第3天时从病态中恢复，然后表现出显著的抑郁样行为，如第14天时糖水偏好率的降低(p<0.05)和第15天时悬尾实验中的行为绝望状态增加(p<0.05)。
实施例4
以卡介苗(高剂量2×107CFU/mouse、低剂量1×106CFU/mouse)单独诱导方法和百日咳毒素联合卡介苗(低剂量1×106CFU/mouse)诱导方法的对照试验。
(1)百日咳毒素(PTX)母液储备液的配制。取1瓶百日咳毒素(PTX，ListBiological Labs，50μg/瓶，LOT:#181)，吸取250μL超纯水加入摇晃溶解至澄清透明，即得到浓度为200μg/mL的百日咳毒素(PTX)储备液，4℃长期保存。
(2)百日咳毒素工作液的配制。采用1×PBS将浓度为200μg/mL PTX溶液储备液稀释成浓度为2μg/mL的百日咳毒素工作液，现配现用。
(3)高剂量卡介苗悬液的配制。将卡介苗(BCG,成都生物制品所有限公司)采用生理盐水配制成菌落形成单位(CFU)浓度为1×108CFU/mL。
(4)低剂量卡介苗悬液的配制。将卡介苗(BCG,成都生物制品所有限公司)采用生理盐水配制成菌落形成单位(CFU)浓度为5×106CFU/mL。
(5)受试动物与造模处理。选取8周龄的SPF级健康雄性CD-1小鼠，分为空白组、高剂量卡介苗组、低剂量卡介苗组、低剂量卡介苗组+百日咳毒素组，每组12只小鼠。
空白组：腹腔注射(ip)无菌生理盐水200μL/mouse。
高剂量卡介苗组：在第0天时腹腔注射200μL浓度为1×108CFU/mL卡介苗悬液，剂量为2×107CFU/mouse。
低剂量卡介苗组：在第0天时腹腔注射200μL浓度为5×106CFU/mL卡介苗悬液，剂量为1×106CFU/mouse；
低剂量卡介苗组+百日咳毒素组：在第0天时腹腔注射200μL浓度为5×106CFU/mL卡介苗悬液，剂量为1×106CFU/mouse；然后在第1天时和第3天时每只小鼠分别腹腔注射100μL浓度为2μg/mL百日咳毒素1次，剂量为200ng/mouse/次。
(6)饲养条件。每笼饲养4只受试CD-1小鼠，避免单笼单只饲养。屏障环境饲养，在每个笼具上放上装有纯水的饮水瓶和无菌饲料。12h光照：12小时黑暗，饲养温度22℃，湿度50％。
(7)抑郁样行为的评估
1)开场实验
在造模后第28天时进行与实施例1相同的开场实验测试，结果如表2所示。
2)悬尾实验
在造模后第30天，通过与实施例1相同的悬尾实验来评估小鼠的行为绝望状态。
结果如表2所示，采用百日咳毒素联合卡介苗的造模方法，可在较低卡介苗剂量下就能实现对小鼠抑郁模型的成功构建。
表2低剂量卡介苗+百日咳毒素联合诱导与高剂量卡介苗、低剂量卡介苗单独诱导的小鼠抑郁样行为的比较结果
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种长效抑郁症动物模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：采用卡介苗和百日咳毒素联合诱导。
2.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，所述联合诱导包括：第0天，向模型动物注射所述卡介苗的工作液；
分别在第0～1天和第2～3天依次向所述模型动物注射所述百日咳毒素的工作液。
3.根据权利要求1或2所述构建方法，其特征在于，所述卡介苗的工作液的制备方法，包括：利用1×PBS或生理盐水将卡介苗稀释至牛结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)的菌落形成单位浓度为1×106～6×107CFU/mL，得所述工作液。
4.根据权利要求1或2所述构建方法，其特征在于，所述百日咳毒素的工作液的制备方法，包括：利用超纯水溶解百日咳毒素，制备200μg/mL的储备液；
利用1×PBS或生理盐水将所述储备液稀释为0.5～4μg/mL，得所述工作液。
5.根据权利要求2所述构建方法，其特征在于，所述模型动物包括小鼠。
6.一种长效抑郁症小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：在第0天时，向小鼠腹腔注射50～400μL卡介苗的工作液，然后在第0～1天时和第2～3天时分别腹腔注射50～400μL百日咳毒素的工作液1次；
所述卡介苗的工作液的牛结核分枝杆菌菌落形成单位浓度为1×106～6×107CFU/mL；
所述百日咳毒素的工作液浓度为0.5～4μg/mL。
7.根据权利要求6所述构建方法，其特征在于，所述卡介苗的牛结核菌落形成单位剂量为1×105～5×106CFU/鼠；
所述百日咳毒素的腹腔注射量为50～800ng/鼠/次。
8.一种构建长效抑郁症动物模型的试剂盒，其特征在于，包括独立包装的卡介苗和百日咳毒素。
9.根据权利要求8所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括溶解和/或稀释用的超纯水、PBS和生理盐水。
10.利用权利要求1～5所述构建方法得到的动物模型或权利要求6或7所述构建方法得到的小鼠模型的用途，其特征在于，将所述动物模型或小鼠模型用于筛选或鉴定能够预防、缓解或者治疗抑郁症的药物；和/或，将所述动物模型或小鼠模型用于筛选或鉴定能够预防抑郁症的疫苗。
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