CN110755622A - 磷酸酶和张力蛋白同源物抑制剂在制备药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及PTEN抑制剂在制备药物中的用途，所述药物用于治疗抑郁症、焦虑症及相关疾病。本发明药物抑制5‑HT神经元的PTEN从而提高5‑HT神经元的活性而达到治疗的目的，对焦虑样和抑郁样行为都起到减弱效果，具备广阔的临床应用前景。

Description

磷酸酶和张力蛋白同源物抑制剂在制备药物中的用途

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种磷酸酶和张力蛋白同源物抑制剂在制备药物中的用途。

背景技术

近年来，抑郁症、焦虑症以及其他神经精神疾病的人群越来越多，主要临床表现包括情绪和行为的改变，例如心情低落、思维迟缓、言语动作减少，以及体重减轻、失眠、疲劳、注意力不集中，大多会伴有自杀极端的自残行为，严重影响人们生活和工作并给社会经济造成巨大负担。据世界卫生组织最新数据显示，全球抑郁症的发病率为3.1％，而据不完全统计，目前我国抑郁症发病率高达5％～6％，并呈现逐年上升趋势。

目前对于此类神经精神疾病的治疗主要包括物理疗法，例如静养休息，以及药物治疗，例如5-羟色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)再摄取抑制剂(简称SSRI，如氟西汀等)。当前，药物治疗主要是以5-HT转运体(5-hydroxytryptamine transporter,SERT)作为药物的主要靶点，药物通过作用于SERT来抑制5-HT的再摄取，从而提高突触间隙的5-HT浓度，达到治疗目的。然而，这些药物起效缓慢，需要2-4周甚至更长时间才能起效，而且至少30％至50％的患者对现有药物无应答，且即使对药物应答的患者其抑郁症的复发率也非常高。因此寻找安全、高效、副作用小，起效快的抗抑郁药物尤为重要，不仅具有巨大的经济前景，对于治疗患者病痛，改善患者工作与生活都具有重大意义。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种磷酸酶和张力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog，PTEN)抑制剂在制备药物中的用途，所述药物用于治疗抑郁症、焦虑症及相关疾病，用于解决现有的治疗抑郁症、焦虑症以及其他神经精神疾病的药物效果不佳、治疗周期长、毒副作用大的问题。

本发明的另一个目的是提供一种包括PTEN抑制剂的药物组合物。

本发明的另一个目的是提供一种如上所述的药物组合物的制备方法。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明一方面提供一种PTEN抑制剂在制备药物中的用途，所述药物用于治疗抑郁症、焦虑症及相关疾病。

在本发明一些实施方式中，所述PTEN抑制剂用于降低5-HT神经元的PTEN活性、降低PTEN的稳定性、减少PTEN的有效作用时间、激活PTEN下游磷酸化蛋白激酶B(Akt)/雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路，以及提高5-HT神经元的活性中的至少一项。

在本发明一些实施方式中，PTEN抑制剂为吡啶甲酸双过氧化钒和钾。

在本发明一些实施方式中，所述5-HT神经元位于中脑的背侧中缝核团。

在本发明一些实施方式中，所述PTEN抑制剂被配置为溶解于生理盐水(0.9％NaCl)0.1～0.3mg/ml浓度的液体制剂。

本发明另一方面提供一种药物组合物，所述药物组合物包括PTEN抑制剂。

本发明另一方面提供一种药物组合物的制备方法，所述制备方法包括混合PTEN抑制剂的过程。

综上所述，本发明提供了一种PTEN抑制剂在制备药物中的用途，所述药物用于治疗抑郁症、焦虑症及相关疾病，利用PTEN抑制剂作用于5-HT神经元的PTEN，抑制PTEN活性，提高5-HT神经元的活性而发挥抗抑郁作用。此外，根据本发明提供的药物组合物对焦虑样和抑郁样行为都起到减弱效果，特别是在小鼠中具有显著抗抑郁效果且1-3天可以起效。此外，从本发明的以下描述、随附的参考附图以及随附的权利要求书，将能够更全面地理解本发明的这些及其它目的。

附图说明

图1A显示为小鼠在连续注射PTEN抑制剂和生理盐水3天后的悬尾(TST)测试中的不动时间。

图1B显示为小鼠在连续注射PTEN抑制剂和生理盐水3天后的强迫游泳(FST)测试中的不动时间。

图2A显示为小鼠在连续注射PTEN抑制剂和生理盐水14天后的新环境抑制摄食(NSF)测试中的摄食的潜伏期时间。

图2B显示为小鼠在连续注射PTEN抑制剂和生理盐水14天后的新环境抑制摄食(NSF)测试中的摄食的基础摄食量。

图2C显示为小鼠在连续注射PTEN抑制剂和生理盐水14天后的高架十字迷宫(EPM)测试中的开放臂停留的时间。

图2D显示为小鼠在连续注射PTEN抑制剂和生理盐水14天后的悬尾(TST)测试中的不动时间。

图3A～3B分别显示为小鼠在连续注射PTEN抑制剂和生理盐水3天后的Akt/mTOR信号通路的蛋白磷酸化水平。

图3C显示为小鼠在连续注射PTEN抑制剂和生理盐水3天后的pAkt荧光信号水平。

图3D显示为小鼠在连续注射PTEN抑制剂和生理盐水3天后的pAkt阳性细胞的比例水平。

图4A显示为小鼠在连续注射PTEN抑制剂和生理盐水14天后的体重水平。

图4B显示为小鼠在连续注射PTEN抑制剂和生理盐水14天后的外观。

图4C显示为小鼠在连续注射PTEN抑制剂和生理盐水14天后的自主活动的平均运动速度。

具体实施方式

本发明在经过长期大量的探索研究，发现将5-HT神经元的PTEN作为治疗抑郁症及相关疾病的药物靶点，可以抑制PTEN活性，提高5-HT神经元的活性，从而对焦虑样和抑郁样行为都起到减弱效果，具有良好的产业化前景的潜力。

本发明提供了一种PTEN抑制剂在制备药物中的用途，所述药物用于治疗抑郁症、焦虑症及相关疾病。

所述PTEN抑制剂为任何能够降低PTEN的酶活、降低PTEN的稳定性、减少PTEN的有效作用时间和激活PTEN下游磷酸化Akt/mTOR信号通路。在本发明公开的一具体实施例中，所述PTEN抑制剂例如为吡啶甲酸双过氧化钒和钾(Dipotassium Bisperoxovanadium(pic)dihydrate,Dipotassium bisperoxo(picolinato)oxovanadate(V)dihydrate，bpV(pic))，具有如下的结构式，例如将PTEN抑制剂bpV(pic)溶解于无菌生理盐水(0.9％)中，配置0.1～0.3mg/ml，例如0.2mg/ml浓度的液体制剂，使用方式为腹腔注射，注射量为1～2mg/kg/天，例如2mg/kg/天。

本发明也提供了一种药物组合物及其制备方法，所述药物组合物包括PTEN抑制，例如将PTEN抑制剂混合其他药物学上可接受的，对人和动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂。

所述的药用载体或赋形剂是一种或多种固体、半固体和液体稀释剂、填料以及药物制品辅剂。将本发明的药物组合物采用制药和食品领域公认的方法制备成各种剂型、如液体制剂(注射剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂等)、固体制剂(片剂、胶囊剂、颗粒剂，冲剂等)、喷剂、气雾剂等，并以单位体重服用量的形式使用。本发明的药物组合物可经注射(静脉注射、静脉滴注、肌肉注射、腹腔注射、皮下注射)和口服、舌下给药、粘膜透析等给药途径进行抑郁症、焦虑症及相关疾病的治疗。

本发明进行了小鼠抑郁水平的行为学实验，在一公开的具体实施例中，分别通过强迫游泳(Forced Swimming Test,FST)和悬尾(Tail Suspension Test,TST)行为实验，这两个实验中，小鼠放弃挣扎保持静止不动的时间越短，反应出小鼠抑郁水平越低。

本发明还进行了小鼠焦虑水平的行为学实验，在另一公开的具体实施例中，分别通过高架十字迷宫(Elevated Plus-Maze,EPM)行为实验，小鼠在高架十字的开放臂活动时间越长，反应出小鼠焦虑水平越低，和新环境抑制摄食(Novelty-Suppressed Feeding,NSF)行为实验，小鼠在新颖环境中进行摄食的潜伏期越短，反应出小鼠焦虑水平越低。

本发明还进行了小鼠的Akt/mTOR信号通路的蛋白磷酸化水平实验，在另一公开的具体实施例中，进行Akt/mTOR信号通路的蛋白磷酸化水平检测，施用了本发明的PTEN抑制剂的小鼠的5-HT神经元内的Akt/mTOR信号通路呈现激活状态，表明增加了5-HT神经元活性。

本发明还进行了连续给药后的小鼠安全性水平的实验，在另一公开的具体实施例中，监测了小鼠的基础进食量、体重变化，以及毛色变化等，施用了本发明的PTEN抑制剂的小鼠未见到显著的毒副作用。

下面结合具体的实施例例进一步对本发明实质内容进行说明，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案。

实施例1 PTEN抑制剂的制备

本实施例中的PTEN抑制剂为bpV(pic)，例如购自sigma-aldrich公司，CAS148556-27-8。在本发明中示例性的采用了bpV(pic)，应当知晓，PTEN抑制剂的种类并不限定于此。此外，在其他的实施例中，所述PTEN抑制剂也可以根据需要进行制备获得。需要注意的是，任何能够降低PTEN的酶活、降低PTEN的稳定性、减少PTEN的有效作用时间和激活PTEN下游磷酸化Akt/mTOR信号通路的物质均应当涵盖的在本发明要求保护的范围内。

实施例2 PTEN抑制剂对小鼠抑郁水平的影响

本实施例中采用实施例1中的PTEN抑制剂bpV(pic)在3-4月龄野生型雄性C75/BL6小鼠中进行连续腹腔注射，然后进行强迫游泳(FST)和悬尾(TST)行为测试实验，对小鼠抑郁水平进行评估。

所有小鼠都在SPF(Specific pathogen Free)环境中饲养，且保证饲养环境恒温恒湿并在7:00am-7:00pm给光其他时间不给光来维持小鼠正常昼夜节律。所有动物实验均由中国上海同济大学医学院实验动物委员会审查和批准(TJmed-010-10)。实验过程中，我们尽力减少对动物的使用并优化其舒适度。

取PTEN抑制剂溶解在无菌生理盐水(0.9％NaCl)中，溶解浓度为0.2mg/ml，向小鼠中每天进行腹腔注射，注射量为2mg/kg/天。取16只3月龄的野生型雄性C75/BL6小鼠，随机分成两组，每组8只。对其中8只小鼠连续给药3天，作为短时间给药实验组(bpV-S组)。另外8只小鼠注射相同量生理盐水3天，作为短时间对照组(Saline-S组)。

悬尾(TST)实验

小鼠在实验房间适应1小时后，用灭菌胶带粘住距离小鼠尾巴尖端1-2cm位置将小鼠倒吊起来，对小鼠在倒吊6分钟内的活动进行录像，6min后将小鼠取下放入正常饲养笼。然后由另一个实验者通过录像来分析小鼠在倒吊的后4分钟内放弃挣扎保持静止不动(Immobility)的时间并进行统计。小鼠放弃挣扎保持静止的时间越短提示抑郁水平越低。

强迫游泳(FST)实验

小鼠在实验房间适应1小时后，将小鼠放入装满水的玻璃缸中，玻璃缸直径20厘米，高25里面，水面高度15厘米，水温保持在25℃-28℃。对小鼠在放入水中6分钟内的活动进行录像，6分钟后将小鼠从玻璃缸中捞出并擦干身体后放入正常饲养笼内。由另一个实验者通过录像来分析小鼠在入水的后4分钟内放弃挣扎保持静止不动的时间并进行统计。小鼠放弃挣扎保持静止的时间越短提示抑郁水平越低。

图1A、1B分别示出了小鼠在连续注射PTEN抑制剂和生理盐水3天后的悬尾(TST)和强迫游泳(FST)测试中的不动时间，相较于对照组(即Saline-S组)，在注射PTEN抑制剂3天后，小鼠的不动时间均显著下降，即小鼠抑郁样行为下降，表明本发明的PTEN抑制剂对发挥小鼠抗抑郁起效快。

实施例3 PTEN抑制剂对小鼠焦虑水平的影响

本实施例中采用实施例1中的PTEN抑制剂bpV(pic)在小鼠中进行连续腹腔注射，进行新环境抑制摄食(NSF)、高架十字迷宫(EPM)和悬尾(TST)等行为测试实验，对小鼠焦虑和抑郁水平进行评估。

所有小鼠都在SPF(Specific pathogen Free)环境中饲养，且保证饲养环境恒温恒湿并在7:00am-7:00pm给光其他时间不给光来维持小鼠正常昼夜节律。所有动物实验均由中国上海同济大学医学院实验动物委员会审查和批准(TJmed-010-10)。实验过程中，我们尽力减少对动物的使用并优化其舒适度。

取PTEN抑制剂溶解在缓冲液中，溶解浓度为，向小鼠中每天进行腹腔注射，注射量为2mg/kg/天。取20只3月龄的野生型雄性C75/BL6小鼠，随机分成两组，每组10只。对10只小鼠连续给药14天，作为长时间给药实验组(bpV-L组)。另外10只小鼠注射生理盐水的14天，作为长时间给药对照组(Saline-L组)。

新环境抑制摄食(NSF)实验

将小鼠禁食24小时后，将小鼠放入开放旷场中(从旷场的一角放入)，在旷场正中央放置一颗鼠粮，通过录像分析小鼠从进入旷场到放松下来进食的潜伏期。潜伏期越短则提示小鼠焦虑水平越低。一旦小鼠开始进食后，将小鼠取出放入预先适应的鼠笼内自由取食并测试5分钟内的基础进食量。

图2A示出了小鼠在连续注射PTEN抑制剂和生理盐水14天后的新环境抑制摄食(NSF)行为，相较于对照组(即Saline-L组)，在注射PTEN抑制剂14天后，注射PTEN抑制剂的小鼠在摄食的潜伏期显著缩短，表示小鼠焦虑样行为下降，同时，基础摄食量没有变化(图2B)，表明给予PTEN抑制剂不影响小鼠的摄食行为，仅仅改变了焦虑样行为。

高架十字迷宫(EPM)实验

小鼠在实验房间适应1小时后，将小鼠放入一个离地1米的十字形迷宫内，十字的4个臂中的两个是敞开的，称为开放臂，另外两个臂是有挡板围起来的称为封闭臂。让小鼠在高架十字迷宫内自由活动5分钟并进行录像。由另一个实验者通过录像统计小鼠在开放臂内活动的总时间并进行比较。小鼠在开放臂内活动时间越长反应出焦虑水平越低。

图2C示出了小鼠在连续注射PTEN抑制剂和生理盐水14天后的高架十字迷宫(EPM)行为，相较于对照组(即Saline-L组)，注射PTEN抑制剂的小鼠在开放臂停留的时间显著增加，即小鼠焦虑样行为下降。

同时，给予14天腹腔注射bpV的小鼠(bpV-L)相对14天注射生理盐水的小鼠(Saline-L)在悬尾(TST)实验中的静止不动时间显著缩短(图2D)。

实施例4 PTEN抑制剂对小鼠的蛋白磷酸化水平的影响

本实施例中采用实施例1中的PTEN抑制剂bpV(pic)在小鼠中进行连续腹腔注射3天后，取中脑组织进行Akt/mTOR信号通路的蛋白磷酸化水平检测，结果显示相较于对照组(即Saline-S组)，给药组(bpV-S)的磷酸化Akt、磷酸化mTOR、磷酸化4EBP1的水平显著增高(图3A-B)。同时，免疫组织化学染色显示中脑背侧中缝核内的pAkt荧光信号显著增强(图3C)。细胞计数结果显示，注射PTEN抑制剂3天后，色氨酸羟化酶2(TPH2)标记的5-HT细胞中pAkt阳性细胞的比例显著增加(图3D)。这些结果提示，给予PTEN抑制剂后，5-HT神经元内的Akt/mTOR信号通路明显激活，这可能是bpV(pic)增加5-HT神经元活性并降低小鼠焦虑抑郁水平降低的机制之一。

实施例5 PTEN抑制剂对小鼠安全性水平的影响

本实施例中采用实施例1中的PTEN抑制剂bpV(pic)在小鼠中进行连续腹腔注射14天后，相较于对照组(即Saline-L组)，给药组(bpV-L)的小鼠基础进食量未见明显变化(图2C)，体重未见明显变化(图4A)，毛色外形等未见明显变化(图4B)，小鼠在开放旷场内自主活动的平均运动速度也没有明显变化(图4C)，初步提示未见到显著的毒副作用。

因此，综上所述，不管是短时间，例如3天还是长时间，例如14天腹腔注射注射PTEN抑制剂bpV(pic)都可以降低抑郁样行为，产生抗抑郁效果，长时间给药还可以降低焦虑样行为。PTEN抑制剂在制备治疗和/或改善抑郁症、焦虑症以及其他神经精神疾病的药物中具有巨大的潜力，具高度产业利用价值。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (8)

1.磷酸酶和张力蛋白同源物抑制剂在制备药物中的用途，所述药物用于治疗抑郁症、焦虑症及相关疾病。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述磷酸酶和张力蛋白同源物抑制剂用于降低5-羟色胺神经元的磷酸酶和张力蛋白同源物活性、降低磷酸酶和张力蛋白同源物的稳定性、减少磷酸酶和张力蛋白同源物的有效作用时间、激活磷酸酶和张力蛋白同源物下游磷酸化蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白信号通路，以及提高5-羟色胺神经元的活性中的至少一项。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，磷酸酶和张力蛋白同源物抑制剂为吡啶甲酸双过氧化钒和钾。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述5-羟色胺神经元位于中脑的背侧中缝核团。

5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述磷酸酶和张力蛋白同源物抑制剂被配置为溶解于生理盐水的液体制剂。

6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述包含磷酸酶和张力蛋白同源物抑制剂液体制剂的浓度为0.1～0.3mg/ml。

7.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括磷酸酶和张力蛋白同源物抑制剂。

8.一种药物组合物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括混合磷酸酶和张力蛋白同源物抑制剂的过程。

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