CN114711112B - 一种增加分蘖来提高富硒水稻产量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种增加分蘖来提高富硒水稻产量的方法，属于纳米农业技术领域。本发明所述的方法是在水稻苗期，叶面施加球型Se NMs溶液；其中球型Se NMs的尺寸在10～90nm，水合半径在160～200nm，表面电荷为‑15～‑18mV，纯度在95％以上；水稻苗期是指水稻达到“三叶一心”时期；球型Se NMs溶液为球型Se NMs水溶液，浓度为1～3mg/L。本发明的方法能够显著改善水稻根际微生物群落和增加根系分泌物，改变土壤环境，促进根部养分的吸收；显著提高水稻内Se含量；能够调控水稻赤霉素的合成，增加分蘖基因的上表达；显著提高水稻植株分蘖数；增加其产量。

Description

一种增加分蘖来提高富硒水稻产量的方法

技术领域

本发明涉及一种增加分蘖来提高富硒水稻产量的方法，属于纳米农业技术领域。

背景技术

硒(Se)是人体内谷胱甘肽过氧化物酶的组成元素以及维持多种酶活性的重要成分，它在人体具有抗氧化、抗癌以及提高免疫力等功能。食源性补Se是满足人体Se供应的主要措施之一。

富Se水稻目前是人体Se摄入的主要途径之一，其经济价值也比普通水稻高1到5倍。目前，生产富Se水稻的主要方式是在土壤中施加Se肥，主要是硒酸钠和亚硒酸钠等。然而，这些传统Se肥的利用效率不足20％，大量的Se肥残留，造成了严重的土壤环境问题。也有一些施加零价硒作为硒肥，而零价硒作为惰性硒矿，存在亲水性低，生物可利用性低的缺点。还有一些施加纳米硒作为硒肥，但施用的纳米硒纯度较低，肥料中有其它多类成分(稳定剂和抗菌剂等)，对植物和土壤环境造成不必要的影响。

而且，目前对富硒水稻的研究主要集中于水稻的富硒效果。有研究报道指出，SeNMs能够促进植物愈伤组织器官的形成和根系生长，增加作物光合作用及产量，提高作物的营养品质(Se含量、可溶性糖、可溶性蛋白、抗氧化酶活性等)。但是，这些机制研究的对象都是绿豆芽、烟草等，都属于双子叶植物，而水稻属于单子叶植物，两者性状差异极大；从生长环境上来说，二者区分度较大，不同于前者，水稻属于水田作物，全生命周期中存在干湿交替的情况；相比于前者，后者的产量更注重的是对成熟期果实的研究；更重要的是，分蘖期的生长对于水稻极为重要，而绿豆芽、烟草等植物没有分蘖的需求，从而无法直接从绿豆芽、烟草等植物的生长效果来预期水稻的分蘖效果。

此外，提高水稻产量一般是通过增加农用化肥施肥量和提供微生物肥料实现的，其中施加化肥可以供给水稻更多的有效养分，促进水稻生长进而提高产量；施加微生物肥料可以供给根际土壤中更多的有益菌，减少稻瘟病等的发病率，保证水稻产量。然而，现有的这些方法中都存在一定的缺陷，过度依赖化肥可能会导致环境污染严重、土壤结构恶化以及出现“烧苗”等现象；而过度依赖微生物肥料可能会引起土壤中微生物群落发生极大变化，对作物生长产生恶劣影响。目前对于如何影响水稻分蘖期性状进而提高水稻产量的研究较少，而且水稻分蘖期的相关调控机制尚不清晰。

近年来，Se纳米材料(Se NMs)具有高活性，在用作Se肥方面逐渐得到关注和认可。但是，并未有文献提及何种条件下Se NMs能够稳定且高效地促进水稻生长及增加Se的含量；也未提及Se NMs的施用量如何影响Se在作物内的积累；更未提及Se NMs是否可以通过调控水稻激素水平、基因表达及根际环境、增加养分的利用有效性、促进水稻分蘖及生长，从而达到增产富硒的目标。

发明内容

[技术问题]

目前富硒水稻的制备需要采用硒酸钠以及复合肥料，其富硒效果差，容易带来环境污染；且产量促进效果不明显，根本没有提及分蘖的效果。

[技术方案]

为了解决上述至少一个问题，本发明提供了一种增加分蘖来提高富硒水稻产量的方法，明确了生产富Se水稻的Se纳米肥的粒径、施用量、施加时期和施加方式等因素，明确了通过根际环境、关键基因、激素水平等因素的关键作用，提高土壤养分的吸收效率，增加水稻有效分蘖数，从而达到增产硒的目标。本发明在水稻苗期，叶面施加合成的Se纳米肥，能够显著改善土壤微生物群落结构和根系分泌物的产生，促进养分的吸收，提高水稻的有效分蘖，增加产量，同时促进Se在水稻的富集。

本发明的第一个目的是提供一种增加分蘖来提高富硒水稻产量的方法，所述的方法是在水稻苗期，叶面施加球型Se NMs溶液。

在本发明的一种实施方式中，所述的球型Se NMs的尺寸在10～90nm，水合半径在160～200nm，表面电荷为-15～-18mV，纯度在95％以上，进一步优选为40～60nm。

在本发明的一种实施方式中，所述的球型Se NMs溶液为球型Se NMs水溶液，浓度为1～3mg/L。

在本发明的一种实施方式中，所述的球型Se NMs溶液的施加量为0.5～2mL/株。

在本发明的一种实施方式中，所述的球型Se NMs溶液可以分1～5次施加，具体是从水稻达到“三叶一心”时期开始，每次间隔5～7天。

在本发明的一种实施方式中，所述的水稻苗期是指水稻达到“三叶一心”时期。

在本发明的一种实施方式中，所述的球型Se NMs的制备方法见专利CN112010271A，具体包括如下步骤：

(1)取硒源与还原剂混合后充分研磨，研磨至呈红色糊状，停止研磨；

(2)向步骤(1)研磨得到的红色糊状物中加水分散；

(3)将步骤(2)得到的溶液倒入容器中，向其中滴加表面修饰剂，进行超声处理，处理完毕后离心，所得上清液和沉淀分别进行冷冻干燥，最终得到球型Se NMs；

其中，步骤(1)中所述硒源为二氧化硒、亚硒酸钠、亚硒酸、硒酸钠中任意一种或几种混合；所述还原剂为抗坏血酸、柠檬酸、蔗糖、果糖中的任意一种或几种混合；所述硒源与还原剂的摩尔比为1：2；

步骤(3)中所述的表面修饰剂为聚乙烯吡咯烷酮、十二烷基硫酸钠、十二烷基苯磺酸钠、葡聚糖、壳聚糖中的任意一种；所述表面修饰剂的加入量占Se源与还原剂的总质量的5～25％；所述表面修饰剂的加入量占Se源与还原剂的总质量的10％～15％；所述超声的温度为18～25℃，超声的功率为100～500W，超声的时间为30～120min。

本发明的第二个目的是本发明所述的方法在农业领域的应用。

本发明的第三个目的是提供一种提高水稻中硒含量的方法，所述的方法是在水稻苗期，叶面施加球型Se NMs溶液；其中所述的球型Se NMs的尺寸在10～90nm；所述的水稻苗期是指水稻达到“三叶一心”时期；所述的球型Se NMs溶液为球型Se NMs水溶液，浓度为1～3mg/L；所述的球型Se NMs溶液的施加量为0.5～2mL/株；所述的球型Se NMs溶液可以分1～5次施加，具体是从水稻达到“三叶一心”时期开始，每次间隔5～7天。

[有益效果]

(1)本发明增加分蘖、促进富硒的机理为：Se NMs能够提高根际环境中根系分泌物的含量改善土壤环境，以根系分泌物作为碳源可以招募更多有益微生物，促进水稻根部生长，提高土壤养分的有效性，提高水稻的富硒效率；调控水稻体内赤霉素水平以及分蘖基因的表达，提高水稻的分蘖数。

(2)本发明的方法能够显著改善水稻根际微生物群落和增加根系分泌物，改变土壤环境，促进根部养分(N)的吸收；显著提高水稻内Se含量，相对于不加硒肥的植株提升1.5倍以上；能够调控水稻赤霉素的合成，增加分蘖基因的上表达；显著提高水稻植株分蘖数，相对于不加硒肥的植株提升1.5倍以上；增加其产量，相对于不加硒肥的植株提升1.4倍以上。

(3)本发明所用Se纳米材料(Se NMs)和常规所述的零价硒、纳米硒肥相比，具有纯度高、亲水性高、生物可利用性高、不含其它杂质等优点。

附图说明

图1为实施例1中Se NMs的TEM照片。

图2为实施例2和对比例1中水稻根部N含量的对比。

图3为实施例2和对比例1中水稻中Se含量的对比。

图4为实施例2和对比例1中水稻有效分蘖数对比。

图5为实施例2和对比例1中水稻产量的对比。

图6为实施例2和对比例1中水稻根系微生物的差异性。

图7为实施例2和对比例1中水稻根系分泌物的变化。

图8为实施例2和对比例1中水稻赤霉素的含量的变化；其中A为GA1的含量；B为GA4的含量。

图9为实施例2和对比例1中水稻分蘖基因的含量的变化。

具体实施方式

以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解实施例是为了更好地解释本发明，不用于限制本发明。

测试方法：

1、Se和氮含量的测定：

Se含量：将完全干燥的水稻籽粒样品磨碎后混合均匀过筛(60目)，称取一定质量的样品置于消解管中，加入硝酸后密封消解管放入微波消解仪中消解。消解完成后，将样品过滤，然后使用电感耦合等离子质质谱仪测试。

氮含量：将完全干燥的水稻根系样品磨碎后混合均匀过筛(60目)，称取一定质量的样品置于锡舟中包好，采用元素分析仪进行测定。

2、根际微生物的测定：

将采集的新鲜土壤样品立即用液氮冷冻，取2g土壤磨匀后装入离心管，采用16SrRNA基因标准法测定土壤中的微生物。

3、根系分泌物的测定：

将采集的土壤鲜样立即用液氮冷冻，取1g土壤样品于液氮中研磨均匀后置于2ml离心管内，加入1.5ml提取液(80％甲醇水溶液(内含0.1％甲酸和内标)，置于4℃冰箱预冷保存)涡旋混匀；冰浴超声30min(35kHz)；之后在4℃、12000rpm条件下离心15min，取上清液用旋转蒸发浓缩仪(接冷井)真空旋干，并用200μL甲醇乙腈水(4:4:2)复溶，在4℃、12000rpm条件下离心10min取上清液。上清液置于4℃环境临时保存，然后将处理好的样品上机测试，若长期保存需置于-20℃。

仪器型号：Thermo Scientific UPLC Vanquish。

梯度洗脱(体积比)

流动相：

水相A：0.1％甲酸水溶液有机相B：0.1％甲酸乙腈溶液

流动相流速：0.35ml/min

进样量：5μL

柱温：35℃

柱型：ACQUITY UPLC HSS T3(2.1×100mm,1.8μm)。

4、水稻激素的测定：

采用异丙醇/水/盐酸溶液的方法提取液水稻植株中内源性激素，通过二氯甲烷萃取并以氮气吹扫方式浓缩样品，然后使用液相-质谱联用技术(ESI-HPLC-MS/MS)进行测定。

5、水稻分蘖基因的测定：

通过DNA聚合酶链式反应测定分蘖关键基因。首先使用RNA提取试剂盒提取总RNA，然后使用逆转录试剂盒得到DNA模板。最后将DNA模板、荧光探针以及分蘖基因引物按照试剂盒的方法混合后使用DNA聚合酶链式反应仪进行测试。

6、分蘖数的测试：

一般地，水稻插秧后1个月开始分蘖，持续一个月左右。选取插秧后第60天进行水稻分蘖数的取值，采用“Z”字取样法在田间设定五个采样点，每个采样点选取10个数据，共50个数据，取平均值。

7、产量的测试：

一般地，以收获期的水稻单株籽粒重量作为本发明中水稻的产量值。

实施例1

一种球型Se NMs的制备方法，包括如下步骤：

(1)称取二氧化硒0.11g和抗坏血酸0.36g，两者摩尔比为1：2，放入研钵中，混合后，在20℃下进行充分研磨1～10min，直至红色糊状；

(2)向步骤(1)研磨得到的红色糊状物中加入20mL去离子水分散；

(3)将步骤(2)得到的溶液倒入容器中，向其中加聚乙烯吡咯烷酮(PVP)47mg，进行20℃，300W超声处理60min，处理完毕后在4℃，10000r/min离心，所得沉淀进行冷冻干燥，最终得到球型Se NMs。

将得到的球型Se NMs进行性能测试，测试结果见表1：

表1球型Se NMs的表征

粒径	水合半径	电荷	纯度
				60nm	180nm	-16.6mV	99％

实施例2

一种增加分蘖来提高富硒水稻产量的方法，包括如下步骤：

(1)将来自江苏省农业科学院的水稻种子在育苗基地进行生长；

(2)选择“两叶一心”时期的水稻苗采用机器插秧的方式，移植在标准水稻田(种植密度为每亩一万颗)里；

(3)培养10天，达到“三叶一心”时期，叶面喷施1.5mg/L的实施例1的球型Se NMs水溶液，继续培养140天，收获水稻；其中喷施量为1mL/株。

对比例1

将实施例2中的球型Se NMs溶液替换为水溶液，其他和实施例2保持一致，得到水稻。

将实施例2和对比例1的水稻进行性能测试，测试结果如下：

图2为实施例2和对比例1中水稻根部N含量的对比。从图2可以看出：Se NMs处理后的水稻根部氮含量提高了10％，这意味着水稻的养分供给得到了提升，有助于水稻的生长；

图3为实施例2和对比例1中水稻中Se含量的对比。从图3可以看出：Se NMs处理后的水稻籽粒硒含量提高了50％，这说明了本发明的富硒技术是有价值的，达到了富硒农产品的标准；

图4为实施例2和对比例1中水稻有效分蘖数对比。从图4可以看出：Se NMs处理后的水稻分蘖数提高了50％，这意味着水稻的成熟期穗数理论上要增加50％左右，可以显著影响到水稻的产量；

图5为实施例2和对比例1中水稻产量的对比。从图5可以看出：Se NMs处理后的水稻产量增加了40％，这是分蘖数增加带来的结果；

图6为实施例2和对比例1中水稻根系微生物的差异性。从图6可以看出：Se NMs处理后根际土壤中有益微生物增加，其中草螺菌(Herbaspirillum sp.)的相对丰度增加了88.7％，脱硫弧菌(Desulfovibrio putealis)的相对丰度增加了29.2％，地杆菌(Geobacter daltonii)的相对丰度增加了199.0％，厌氧粘细菌(Anaeromyxobacter sp.)的相对丰度增加了144.8％，这有助于水稻根系生长，提高水稻对土壤养分的获取能力；

图7为实施例2和对比例1中水稻根系分泌物的变化。从图7可以看出：Se NMs处理后的水稻根际土壤中低分子量有机质含量增加，其中丙酮酸(Pyruvic acid)的相对丰度增加了58.9％，苯丙氨酸(L-Phenylalanine)的相对丰度增加了607.4％，柠檬酸(Citricacid)的相对丰度增加了584.8％，这有助于调节土壤中的酸碱平衡，提高土壤养分的有效性，促进水稻生长；

图8为实施例2和对比例1中水稻赤霉素的含量的变化；其中A为GA1的含量；B为GA4的含量。从图8可以看出：Se NMs处理后水稻赤霉素水平的变化，分蘖期赤霉素(GA1和GA4)含量升高会降低水稻的分蘖数进而降低产量，Se NMs降低了水稻的赤霉素水平，这有助于提高水稻的分蘖数，提高水稻的产量；

图9为实施例2和对比例1中水稻分蘖基因的含量的变化。从图9可以看出：Se NMs处理后水稻分蘖基因(MOC1、TB1、OSH1)的相对表达量提高，这意味着水稻分蘖数的增加，最终产量提高。

对比例2

将实施例2中的球型Se NMs溶液替换为浓度为含硒量1.5mg/L的亚硒酸钠溶液，其他和实施例2保持一致，得到水稻。

对比例3

将实施例2中的球型Se NMs替换为市售零价硒(纯度99％，20μm)，其他和实施例2保持一致，得到水稻。

对比例4

将实施例2中的球型Se NMs替换为市售片状纳米硒(纯度90％，长200nm，宽90nm)，其他和实施例2保持一致，得到水稻。

对比例5

将实施例2中的球型Se NMs替换为市售线状纳米硒(纯度90％，长1μm，直径20nm)，其他和实施例2保持一致，得到水稻。

对比例6

将实施例2中的球型Se NMs替换为市售球型Se NMs(纯度80％，直径80nm)，其他和实施例2保持一致，得到水稻。

将实施例2、对比例1～6的水稻进行测试，测试结果如下：

表2实施例2和对比例1～6的测试结果

实施例3

参考专利CN112010271A的球型Se NMs合成方法，调整实施例1中球型Se NMs的粒径为10nm、40nm、100nm、200nm，其他和实施例2保持一致，得到水稻。

将得到的水稻进行测试，测试结果如下：

表3实施例3的测试结果

实施例4

调整实施例2中球型Se NMs溶液的施加量为0.5、1.5和2mL/株，其他和实施例2保持一致，得到水稻。

将得到的水稻进行测试，测试结果如下：

表4实施例4的测试结果

实施例5

将实施例2中球型Se NMs溶液分1、2、3、5次施用，从水稻达到“三叶一心”时期开始，每次间隔7天，其它和实施例2保持一致，得到水稻。

表5实施例5的测试结果

实施例6

调整实施例2中球型Se NMs溶液的施用浓度为1、2和3mg/L，其他和实施例2保持一致，得到水稻。

表6实施例6的测试结果

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (3)

1. 一种增加分蘖来提高富硒水稻产量的方法，其特征在于，所述的方法是在水稻苗期，叶面施加球型Se NMs溶液；所述的水稻苗期是指水稻达到“三叶一心”时期；所述的球型Se NMs的尺寸在40~90 nm，水合半径在160~200 nm，表面电荷为-15~-18mV，纯度在95%以上；所述的球型Se NMs溶液为球型Se NMs水溶液，浓度为1~2mg/L；所述的球型Se NMs溶液的施加量为1~2 mL/株；所述的球型Se NMs溶液分1~5次施加，具体是从水稻达到“三叶一心”时期开始，每次间隔5~7天；

所述的球型Se NMs的制备方法，包括如下步骤：

（1）取硒源与还原剂混合后充分研磨，研磨至呈红色糊状，停止研磨；

（2）向步骤（1）研磨得到的红色糊状物中加水分散；

（3）将步骤（2）得到的溶液倒入容器中，向其中滴加表面修饰剂，进行超声处理，处理完毕后离心，所得上清液和沉淀分别进行冷冻干燥，最终得到球型Se NMs；步骤（1）中所述硒源为二氧化硒、亚硒酸钠、亚硒酸、硒酸钠中任意一种或几种混合；所述还原剂为抗坏血酸、柠檬酸、蔗糖、果糖中的任意一种或几种混合；步骤（3）中所述的表面修饰剂为聚乙烯吡咯烷酮、十二烷基硫酸钠、十二烷基苯磺酸钠、葡聚糖、壳聚糖中的任意一种。

2.权利要求1所述的方法在农业领域的应用。

3. 一种提高水稻中硒含量的方法，其特征在于，所述的方法是在水稻苗期，叶面施加球型Se NMs溶液；所述的水稻苗期是指水稻达到“三叶一心”时期；所述的球型Se NMs的尺寸在10~90 nm，水合半径在160~200 nm，表面电荷为-15~-18mV，纯度在95%以上；所述的球型Se NMs溶液为球型Se NMs水溶液，浓度为1~2mg/L；所述的球型Se NMs溶液的施加量为1~2 mL/株；所述的球型Se NMs溶液分1~5次施加，具体是从水稻达到“三叶一心”时期开始，每次间隔5~7天；所述的球型Se NMs的制备方法，包括如下步骤：

（1）取硒源与还原剂混合后充分研磨，研磨至呈红色糊状，停止研磨；

（2）向步骤（1）研磨得到的红色糊状物中加水分散；

（3）将步骤（2）得到的溶液倒入容器中，向其中滴加表面修饰剂，进行超声处理，处理完毕后离心，所得上清液和沉淀分别进行冷冻干燥，最终得到球型Se NMs；步骤（1）中所述硒源为二氧化硒、亚硒酸钠、亚硒酸、硒酸钠中任意一种或几种混合；所述还原剂为抗坏血酸、柠檬酸、蔗糖、果糖中的任意一种或几种混合；步骤（3）中所述的表面修饰剂为聚乙烯吡咯烷酮、十二烷基硫酸钠、十二烷基苯磺酸钠、葡聚糖、壳聚糖中的任意一种。

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