CN114699469B - 一种玉葡萄非药用部位提取物的制备方法及应用 - Google Patents

一种玉葡萄非药用部位提取物的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种玉葡萄非药用部位提取物及其制备方法与应用，所述玉葡萄非药用部位提取物自玉葡萄的茎部提取而得，划分为醇提取物和水提取物。所述制备方法是将玉葡萄的茎的干燥样品粉碎过筛，获得玉葡萄粉末；加入甲醇或乙醇，回流提取，再过滤、减压浓缩后于45‑50℃下干燥，得到醇提取物。所述应用为作为活性成分在制备抗炎和/或镇痛药物中的应用。本发明采用玉葡萄的非药用部位—茎为原料进行提取，得到的非药用部位提取物具有与药用部位差不多的高效的抗炎、镇痛活性，毒性低（用粗提物做细胞毒性检测，在300μg/mL下无细胞毒性），得率高，制备方法简单快速，得到的非药用部位提取物作为活性成分应用于低毒高效的抗炎镇痛药物的研发具有广阔的前景。

Description

一种玉葡萄非药用部位提取物的制备方法及应用
技术领域
本发明属于中药提取技术领域，具体涉及一种玉葡萄非药用部位提取物及其制备方法与应用。
背景技术
中药非药用部位是指传统中草药入药部位以外的组织结构，如玉葡萄通常以根入药，茎即为非药用部位。国内每年有大量的非药用部位被作为废弃物处理，得不到科学合理利用。
特色民族药玉葡萄，来源为葡萄科蛇葡萄属植物三裂蛇葡萄 Ampelopsis delavayana (Franch.) Planch.，分布于云南省各地，生于海拔300~2200米的山谷林中或山坡灌丛或林中，用于跌打损伤，骨折，烧伤，烫伤，肠炎腹泻，尿涩尿痛，小便淅沥。特别是用于骨折方面效果很好，能显著减轻患者的炎症和疼痛，并对骨折的愈合有促进作用。它又是中成药“云南红药胶囊”、“云南红药散”、“肿痛搽剂”，“肿痛凝胶”，“肿痛气雾剂”，“痛舒胶囊”，“伤益气雾剂”处方药之一，而该民族药来自野生品，入药部位为根，植物挖根会导致植物死亡，“非药用部位”浪费巨大，长此以往势必造成资源日益紧缺，给资源带来巨大压力，严重影响了产业的发展和企业的效益。
近年来随着中医药产业的迅速发展，必须对药用植物资源开发与可持续利用之间关系进行研究，对资源的再开发包括老药新用、扩大药用部位、开发新的用法，以有效减少目前对野生中药材资源的过度采挖，使医药产业得以持续发展。如能将玉葡萄的茎作为新的药用部位，这样对资源破坏也大为减小，且对开发与可持续发展有着重要的意义。
本发明旨在对玉葡萄非药用部位进行开发利用研究。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种玉葡萄非药用部位提取物，本发明的第二目的在于提供所述玉葡萄非药用部位提取物的制备方法，第三目的在于提供所述玉葡萄提取物的应用。
本发明的第一目的是这样实现的，一种玉葡萄非药用部位提取物，由
本发明的第二目的是这样实现的，一种玉葡萄非药用部位提取物的制备方法，醇提取物按以下步骤制备：
1）玉葡萄的茎的干燥样品粉碎过筛，获得玉葡萄粉末；
2）向步骤1获得的玉葡萄粉末中加入甲醇或乙醇，回流提取，再过滤、减压浓缩并干燥得到醇提取物。
水提取物的制备按以下步骤实现：将步骤2回流提取后的药渣加80-100℃蒸馏水回流提取2-3次，以75%-100%的乙醇醇沉，醇沉后得到的粗多糖经冷冻干燥得到水提取物。
本发明的第二目的是这样实现的，玉葡萄非药用部位提取物的应用为作为活性成分在制备抗炎和/或镇痛药物中的应用。
玉葡萄非药用部位提取物可加入药学上可接受的辅料制备成片剂、硬胶囊、软胶囊、散剂、丸剂、颗粒剂。
本发明的有益效果为：本发明采用玉葡萄的非药用部位—茎为原料进行活性物质的提取，得到的非药用部位提取物具有与药用部位差不多的高效的抗炎、镇痛活性，毒性低（用粗提物做细胞毒性检测，在300μg/mL下无细胞毒性），且得率高，制备方法简单快速，得到的非药用部位提取物作为活性成分应用于低毒高效的抗炎镇痛药物的研发具有广阔的前景，具有作为玉葡萄药用部位的替代资源的潜力。
附图说明
图1为本发明玉葡萄药用部位与非药用部位的不同对雌雄小鼠脏器指数的 影响，其中A为雌鼠，B为雄鼠；
图2为玉葡萄药用部位与非药用部位的不同提取物对二甲苯雌雄小鼠耳廓 肿胀的影响，其中A为雌鼠，B为雄鼠(注：与模型组相比：*P＜0.05，**P ＜0.01，***P＜0.001，****P＜0.0001；与阳性药ASP组相比：△P＜0.05， △△P＜0.01，△△△P＜0.001；非药用部位与药用部位同剂量同提取物相比： #P＜0.05，##P＜0.01)；
图3玉葡萄非药用部位不同提取物对二甲苯致炎症小鼠耳组织TNF-α、 IL-6和IL-Iβ的影响(注：与模型组相比：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001， ****P＜0.0001；与阳性药ASP组相比：△P＜0.05，△△P＜0.01，△△△P＜ 0.001，△△△△P＜0.0001；非药用部位与药用部位同剂量同提取物相比：#P ＜0.05，##P＜0.01)；
图4玉葡萄药用部位与非药用部位不同提取物对二甲苯致炎症小鼠血清 IgE的影响(注：与模型组相比：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，****P ＜0.0001；与阳性药ASP组相比：△P＜0.05，△△P＜0.01，△△△P＜0.001， △△△△P＜0.0001；非药用部位与药用部位同剂量同提取物相比：#P＜0.05)；
图5为玉葡萄药用部位与非药用部位不同提取物对小鼠热板的影响( n＝10)(注：与模型组相比：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，****P＜0.0001； 与阳性药ASP组相比：△P＜0.05；非药用部位与药用部位同剂量同提取物相 比：#P＜0.05)；
图6为玉葡萄药用部位与非药用部位不同提取物对雌雄小鼠醋酸扭体的影 响，其中A为雌鼠，B为雄鼠(注：与模型组相比：*P＜0.05，**P＜0.01，***P ＜0.001，****P＜0.0001；与阳性药ASP组相比：△P＜0.05，△△P＜0.01； 非药用部位与药用部位同剂量同提取物相比：#P＜0.05，##P＜0.01)；
图7为采用CCK-8法检测细胞毒性结果图(注：与NC组比较*P＜0.05， **P＜0.01，***P＜0.001，****P＜0.0001)。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明作进一步说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或改进，均落入本发明的保护范围。
本发明一种玉葡萄非药用部位提取物的制备方法，醇提取物按以下步骤制备：
1）玉葡萄的茎的干燥样品粉碎过筛，获得玉葡萄粉末；
2）向步骤1获得的玉葡萄粉末中加入甲醇或95%的乙醇，回流提取，再过滤、减压浓缩后于45-50℃下干燥，得到醇提取物。
所述步骤1中，将玉葡萄的根或茎粉碎至粒度为40-60目。
所述步骤2中，甲醇的浓度为90-99%，乙醇的浓度为90-95%。
所述步骤2中，回流提取的温度为55-65℃，提取次数为2-4次，每次60-90min。
水提取物的制备按以下步骤实现：将步骤2回流提取后的药渣加80-100℃蒸馏水回流提取2-3次，以75%-100%的乙醇醇沉，醇沉后得到的粗多糖经冷冻干燥得到水提取物。
本发明所述制备方法制备得到的玉葡萄非药用部位提取物作为活性成分在制备抗炎和/或镇痛药物中的应用。
所述玉葡萄非药用部位提取物可加入药学上可接受的辅料制备成片剂、硬胶囊、软胶囊、散剂、丸剂、颗粒剂。
实施例1 玉葡萄药用部位提取物的制备
将220g玉葡萄根洗净干燥后粉碎至60目，在60℃下，加入800mL 的95%甲醇回流提取2次，每次60min，减压浓缩后，干燥至得到30.6860g玉葡萄根醇提取物，得率为13.95%。
对醇提完后的药渣加100℃蒸馏水回流提取2次，以95%的乙醇醇沉，醇沉后得到的粗多糖，冷冻干燥得到18.5734g玉葡萄根水提取物，得率为8.44%。
实施例2 玉葡萄非药用部位提取物的制备
将220g玉葡萄茎洗净干燥后粉碎至60目，在60℃下，加入800mL 的95%甲醇回流提取2次，每次60min，减压浓缩后，干燥至得到22.9886g玉葡萄茎醇提取物，得率为10.45%。
对醇提完后的药渣加100℃蒸馏水回流提取2次，以95%的乙醇醇沉，醇沉后得到的粗多糖，冷冻干燥得到14.9823g玉葡萄茎水提取物，得率为6.81%。
实施例3玉葡萄药用部位提取物的制备
将300g玉葡萄根洗净干燥后粉碎至50目，在65℃下，加入1105mL 的99%甲醇回流提取3次，每次80min，减压浓缩后，干燥至得到42.0356g玉葡萄根醇提取物，得率为14.01%。
对醇提完后的药渣加90℃蒸馏水回流提取2次，以75%的乙醇醇沉，醇沉后得到的粗多糖，冷冻干燥得到25.2056g玉葡萄根水提取物，得率为8.40%。
实施例4 玉葡萄非药用部位提取物的制备
将300g玉葡萄茎洗净干燥后粉碎至50目，在65℃下，加入1105mL 的99%甲醇回流提取3次，每次80min，减压浓缩后，干燥至得到31.5905g玉葡萄茎醇提取物，得率为10.53%。
对醇提完后的药渣加90℃蒸馏水回流提取2次，以75%的乙醇醇沉，醇沉后得到的粗多糖，冷冻干燥得到20.2596g玉葡萄茎水提取物，得率为6.75%
实施例5 玉葡萄药用部位提取物的制备
将250g玉葡萄根洗净干燥后粉碎至40目，在55℃下，加入915mL 的90%甲醇回流提取4次，每次90min，减压浓缩后，干燥至得到34.7596g玉葡萄根醇提取物，得率为13.90%。
对醇提完后的药渣加80℃蒸馏水回流提取3次，以85%的乙醇醇沉，醇沉后得到的粗多糖，冷冻干燥得到20.9556g玉葡萄根水提取物，得率为8.38%。
实施例6 玉葡萄非药用部位提取物的制备
将250g玉葡萄茎洗净干燥后粉碎至40目，在55℃下，加入915mL 的90%甲醇回流提取4次，每次90min，减压浓缩后，干燥至得到25.9756g玉葡萄茎醇提取物，得率为10.39%。
对醇提完后的药渣加80℃蒸馏水回流提取3次，以85%的乙醇醇沉，醇沉后得到的粗多糖，冷冻干燥得到16.8543g玉葡萄茎水提取物。得率为6.74%。
实施例7玉葡萄药用部位提取物的制备
将220g玉葡萄根洗净干燥后粉碎至60目，在60℃下，加入800mL 的95%乙醇回流提取2次，每次60min，减压浓缩后，干燥至得到17.3365g玉葡萄根醇提取物，得率为7.88%。
对醇提完后的药渣加100℃蒸馏水回流提取2次，以95%的乙醇醇沉，醇沉后得到的粗多糖，冷冻干燥得到18.5734g玉葡萄根水提取物，得率为8.44%。
实施例8 玉葡萄非药用部位提取物的制备
将220g玉葡萄茎洗净干燥后粉碎至60目，在60℃下，加入800mL 的95%乙醇回流提取2次，每次60min，减压浓缩后，干燥至得到10.6481g玉葡萄茎醇提取物，得率为4.84%。
对醇提完后的药渣加100℃蒸馏水回流提取2次，以95%的乙醇醇沉，醇沉后得到的粗多糖，冷冻干燥得到14.9823g玉葡萄茎水提取物，得率为6.81%。
实施例 9 玉葡萄药用部位提取物的制备
将300g玉葡萄根洗净干燥后粉碎至50目，在65℃下，加入1105mL 的90%乙醇回流提取3次，每次80min，减压浓缩后，干燥至得到23.8546玉葡萄根醇提取物，得率为7.95%。
对醇提完后的药渣加90℃蒸馏水回流提取2次，以90%的乙醇醇沉，醇沉后得到的粗多糖，冷冻干燥得到25.2056g玉葡萄根水提取物，得率为8.40%。
实施例10 玉葡萄非药用部位提取物的制备
将300g玉葡萄茎洗净干燥后粉碎至50目，在65℃下，加入1105mL 的90%乙醇回流提取3次，每次80min，减压浓缩后，干燥至得到14.7652g玉葡萄茎醇提取物，得率为4.92%。
对醇提完后的药渣加90℃蒸馏水回流提取2次，以90%的乙醇醇沉，醇沉后得到的粗多糖，冷冻干燥得到20.2596g玉葡萄茎水提取物，得率为6.75%
实施11 玉葡萄药用部位提取物的制备
将250g玉葡萄根洗净干燥后粉碎至40目，在55℃下，加入915mL 的95%乙醇回流提取4次，每次90min，减压浓缩后，干燥至得到19.6255g玉葡萄根醇提取物，得率为7.85%。
对醇提完后的药渣加80℃蒸馏水回流提取3次，以85%的乙醇醇沉，醇沉后得到的粗多糖，冷冻干燥得到20.9556g玉葡萄根水提取物，得率为8.38%。
实施例12 玉葡萄非药用部位提取物的制备
将250g玉葡萄茎洗净干燥后粉碎至40目，在55℃下，加入915mL 的95%乙醇回流提取4次，每次90min，减压浓缩后，干燥至得到12.0231g玉葡萄茎醇提取物，得率为4.80%。
对醇提完后的药渣加80℃蒸馏水回流提取3次，以85%的乙醇醇沉，醇沉后得到的粗多糖，冷冻干燥得到16.8543g玉葡萄茎水提取物，得率为6.74%。
试验例1 实施例1和2制备的醇提取物及水提取物毒性检测
检测方法：
1、RAW264.7细胞，用含有5mL DMEM完全培养基（90％DMEM基本培
养基+10％胎牛血清）的培养瓶置于培养箱（温度37℃+ CO25％）中培养至状态稳定、量适中。
2、提前设置好实验组别为正常对照组（仅给DMEM完全培养基）和给药
组（实施例1和2制备的提取物即药用部位醇提取物、药用部位水提取物、非药用部位醇提取物及非药用部位水提取物，每种提取物分别配置成50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL及300μg/mL四个浓度），每组均做4个复孔。
3、去除培养好细胞的瓶内原培养基，加入3mL新的培养基后将细胞轻微
吹散为细胞混悬液，取出部分混悬液于15mL离心管中作为母液，将母液轻微混匀并稀释2倍后在显微镜下计数，根据计数结果取出母液配制成浓度为1×10^5个/孔的适量细胞混悬液，后按100μL/孔接种至96孔板中，操作完毕后将其置于培养箱内培养24h。
4、于适当时间配制好浓度为50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL及300μg/mL
的药物备用；将已培养24h的96孔板取出，于显微镜下观察，其细胞状态良好，后将板内细胞上清液去除，分别给予对应组别（100μL/孔、4个复孔）的DMEM完全培养基和已配制好的各浓度药物，操作完毕后亦将其置于培养箱中培养24h.
5、在适当时间于闭光条件下配制原CCK-8检测试剂：培养基=1：10的
CCK-8检测试剂适量备用，取出已给药并培养24h的96孔版，于显微镜下观察，看到各组细胞状态不一、但总体均良好，后将各组上清液去除，再分别将已配好的CCK-8检测试剂（100μL/孔）加到各组中，并于没有细胞的3个孔内加入已配好的CCK-8检测试剂（100μL/mL）设置为空白对照组，试剂加入完毕后将其置于培养箱内培养1.5h，后取出于波长为450nm的酶标仪下测定各组OD值并记录。
6、借助软件Excel和Prism处理上述OD值测定结果，则得各个药物的Cell
Viability图。
7、上述步骤均重复2次，共进行3次实验，检测结果如图7所示。
检测结果:在给小鼠灌胃给药做抗炎镇痛药理活性过程中无小鼠死亡。从图
7可知，在300μg/mL浓度内，实施例1、2中玉葡萄药用部位水、醇提取物以及非药用部位水、醇提取物均无细胞抑制作用。
试验例1-4是采用昆明小鼠建立三种经典镇痛抗炎试验模型：醋酸扭体试
验（化学刺激致痛法）、热板试验（热刺激致痛法）、二甲苯致小鼠耳肿胀试验（急性炎症）对实施例1和实施例2分别制备得到的玉葡萄的药用部位与非药用部位的不同的提取物的抗炎镇痛效果进行相关评价。耳肿胀试验结束后，采集小鼠的耳组织、脏器及血液，计算脏器指数，并检测耳组织中TNF-α、IL-1β、IL-6、等细胞因子含量和血清中IgE含量，评价玉葡萄提取物的抗炎镇痛作用。
表1 实验分组及给药剂量
试验例2 二甲苯致耳肿胀抗炎实验
观察玉葡萄非药用部位不同提取物对小鼠二甲苯耳廓肿胀的影响。(经预实
验发现小鼠雌雄疼痛耐受力差异较大，故增加样本量，实验结果雌雄分开统计分析）
取昆明小鼠 200 只，雌雄各半，随机分为 10组各10 只。适应性喂养3d后开始灌胃给予相应药物，连续灌胃7天,给药体积为0.2mL/10g，末次给药 1 h 后，用移液枪取50 μL 二甲苯，均匀涂抹于每组小鼠右耳的正反两面致炎，并观察昆明小鼠致炎后的状态，涂抹二甲苯 30 min 后经眼球取血处死昆明小鼠，然后沿耳廓基线分别剪下左耳和右耳，并用打孔器在左右耳同一位置取直径为8 mm的圆形耳片，用万分之一电子分析天平称耳片质量，按公式计算小鼠耳肿胀度: 肿胀度 =右耳片质量-左耳片质量。将每组取下的右耳放入EP 管中经液氮速冻后于-80 ℃冰箱里保存，待之后制备耳组织匀浆提取蛋白，用 ELISA法检测制备的组织匀浆上清液中 TNF-α、IL-6 和IL-Iβ。将采集好的血样静置 30min，待血液凝固血块收缩后用冷冻离心机进行离心，转速设置为3000r/min，离心时间 15min。随后用移液枪小心抽取上清液，置于干净 EP 管中，放置-80 ℃冰箱保存，用 ELISA 法检测制备的血清中IgE。取完眼球血及取完耳片后的各组小鼠剥离胸腺、脾脏等主要免疫器官， 称重，按照公式计算脏器指数：脏器指数 = 脏器重 (mg) /体重 ( g)。
检测结果：
1、对二甲苯致小鼠耳肿胀实验后进行解剖取了脾和胸腺两个脏器，结果表明玉葡萄药用部位与非药用部位对脏器指数无影响（图1）。
2、玉葡萄药用部位与非药用部位对二甲苯致小鼠耳肿胀的抑制作用： 与模型组相比，玉葡萄药用和非药用部位不同提取物均能明显减少小鼠耳肿胀度，且有剂量依赖性，部分剂量下优于阳性对照组。对比药用和非药用部位不同提取物、不同剂量下的作用效果，结果表明在耳肿胀实验中两者近无差异，具备一致性（图2）。
3、玉葡萄药用部位与非药用部位对各炎症因子的影响 ：从实验结果表明，与模型组相比较玉葡萄药用部位（根）和非药用部位（茎）的不同提物均对细胞因子IL-6、IL-1β、TNF-a有抑制作用，并且呈现剂量依赖性（图3）。玉葡萄根和茎的不同提取物的效果无显著性差异，从血清中测血清蛋白IgE实验结果可以看出，与模型组比较给药组的IgE明显降低，说明药物组对IgE也有抑制作用，从而表现出抗炎效果，且与现有药物相比具有好的抗炎活性（图4）。进一步从分子水平验证了玉葡萄的抗炎镇痛效果。
试验例3 醋酸扭体镇痛实验
玉葡萄药用部位与非药用部位不同提取物对小鼠醋酸扭体的影响(经预
实验发现小鼠雌雄疼痛耐受力差异较大，故增加样本量，实验结果雌雄分开统计分析）
实验方法：各组小鼠适应性饲养3d后开始灌胃给予相应药物，连续灌胃7天，给药体积为0.2ml/10g，最后一次给药1h后腹腔注射0.6%醋酸溶液，观察注射后15min内小鼠的扭体次数（以腹部收缩成“S”形，躯干与后腿伸张为准）。观察结束后从小鼠眼球取血，并垂直均匀滴入EP管中，采血过后脱颈法处死小鼠。将采集好的血样静置 30min，待血液凝固血块收缩后用冷冻离心机进行离心，转速设置为3000r/min，离心时间 15min。随后用移液枪小心抽取上清液，置于干净 EP 管中，放置-80℃冰箱保存待用。实验结果见图6。
结果分析：从图6可知，与模型组相比，玉葡萄药用和非药用部位不同提取物均能明显减少扭体次数，有剂量依赖性，且部分剂量下优于阳性对照组。对比药用和非药用部位不同提取物、不同剂量下的作用效果，结果表明在醋酸扭体实验中两者近无差异，具一致性。说明玉葡萄药用部位与非药用部位的不同提取物均有显著的抗炎镇痛活性，且两者之间无显著差异。
试验例4 玉葡萄药用部位与非药用部位不同提取物对小鼠热板的影响
热板温度调节至( 55±0. 5) ℃，将昆明小鼠置于热板上，分别测定给药前每只昆明小鼠的正常痛阈值( 以小鼠置于热板上至开始舔舐后足及跳出热板仪所需要的时间作为痛阈值) ，选择正常痛阈值在5～30s内合格小鼠, 再次 测其正常痛阈值, 二次结果求均值作为该鼠的给药前痛阈值( 两次测试间隔时间≥15min) 。取合格小鼠100只, 随机分为10组。各组连续灌胃给药7d, 1次/d, 给药剂量为0.2mL/10g。 于末次给药后 30min、60min、90min、120min、150min分别测小鼠痛阈值1次, 如60s仍无反应, 将小鼠取出以免烫伤, 其痛阈值以 60s计算。观察比较各组小鼠痛阈值变化。小鼠观察结束后脱颈处死。
表2 热板镇痛实验给药后不同时间痛阈值
结果分析：从表2及图5可知，各测定时间内,模型组小鼠痛阈值无明显变化，而玉葡萄药用部位与非药用部位不同提取物各剂量组小鼠痛阈值随给药时间延长而逐渐增大,给药后120min效果达到最大，说明药用部位与非药用部位的水、醇提取物具有明显的镇痛效果，且在部分剂量下优于阳性对照ASP。

Claims (3)

1.一种玉葡萄茎部水提取物作为活性成分在制备镇痛药物中的应用，其特征在于，玉葡萄茎部水提取物按以下步骤制备：
1）玉葡萄的茎的干燥样品粉碎过筛，获得玉葡萄粉末；
2）向步骤1）获得的玉葡萄粉末中加入甲醇或乙醇，55-65℃回流提取2-4次，每次60-90min，再过滤、减压浓缩后于45-50℃下干燥，得到醇提取物和药渣；所述甲醇的浓度为90-99%，乙醇的浓度为90-95%；
3）将药渣加80-100℃蒸馏水回流提取2-3次，以75%-100%乙醇醇沉，醇沉后得到的粗多糖，冷冻干燥得到水提取物。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤1）中，将玉葡萄的茎粉碎至粒度为40-60目。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述玉葡萄茎部水提取物加入药学上可接受的辅料制备成片剂、硬胶囊、软胶囊、散剂、丸剂或颗粒剂。
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