CN114698847B - 一种含益生菌的冻干皮克林乳剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种含益生菌的冻干皮克林乳剂及其制备方法，按重量百分数计，包括以下步骤：(1)将益生菌菌粉加入到油相中，混合均匀得到油菌混合物；所述油菌混合物中，益生菌菌粉占10～14％，油相占86～90％；(2)将油菌混合物加入到水相中，剪切分散得到皮克林乳液；所述皮克林乳液中，油菌混合物占6～10％，水相占90～94％，水相中含有蛋白纤维；(3)将皮克林乳液干燥得到含益生菌的冻干皮克林乳剂。本发明防止油相和菌体在苛刻的加工和存储条件下发生化学、物理降解以及失活。本发明制备方法简单，制作时间短，且所述的原料来源广泛、价格低廉，易于工业化。
Description
技术领域
本发明属于益生菌微囊化技术领域，具体涉及一种含益生菌的冻干皮克林乳剂及其制备方法。
背景技术
近年来，功能性食品受到了广泛的重视和快速的发展，益生菌是活的微生物补充剂，有利于宿主肠道的微生物平衡，由于其对人类的各种健康问题都有显著的作用，因此在各种食品中添加益生菌越来越受到人们的关注。补充益生菌的最终目标是让这些有益细菌在人体中生存和生长，这需要在食用前有足够数量的活益生菌，并且在胃肠道生理条件下存活的能力来保证。然而，有许多因素影响益生菌在食品中的生存，如加工、储藏时的高温、高湿以及氧气，摄入后的胃酸和胆盐等，都会造成菌体失活。因此，需要新的方法来提高益生菌的体内外活性。
微囊化利用物理化学或机械作用，将一种物质包埋于另一种材料中，最终形成的颗粒大小从几纳米到几毫米不等。微囊化可以提高产品质量，如增加货架期，保护生物活性化合物的降解，并控制所选化合物的释放。在目前益生菌微胶囊领域，主要有两个关键之处：一是微囊大小，由于益生菌的大小通常在1至5μm之间，所以纳米包埋技术不适用于此领域中，而过大的尺寸会限制在食品中的应用，如挤压法制备的微囊大小在毫米级别；二是在制备过程中，必须保证益生菌仍然处于存活状态。
目前，还未有利用乳液结构制备益生菌菌粉的报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的问题，提供一种含益生菌的冻干皮克林乳剂及其制备方法，该冻干皮克林乳剂以包含益生菌的油相为芯材、蛋白纤维为壁材，有效增加其稳定性，改善益生菌的存活状态。
为实现上述目的，本发明乳剂采用的技术方案是：
包括以下重量百分数的组分：6～10％的油菌混合物和90～94％的水相；
其中，油菌混合物由10～14％的益生菌菌粉和86～90％的油相组成；水相中含有蛋白纤维。
进一步地，所述水相的pH值为6～7；所述水相采用乳清分离蛋白纤维溶液。
进一步地，所述油相采用黄油。
本发明制备方法的技术方案是，按重量百分数计，包括以下步骤：
(1)将益生菌菌粉加入到油相中，混合均匀得到油菌混合物；所述油菌混合物中，益生菌菌粉占10～14％，油相占86～90％；
(2)将油菌混合物加入到水相中，剪切分散得到皮克林乳液；所述皮克林乳液中，油菌混合物占6～10％，水相占90～94％，水相中含有蛋白纤维；
(3)将皮克林乳液干燥得到含益生菌的冻干皮克林乳剂。
进一步地，步骤(1)中益生菌菌粉的制备步骤包括：将菌悬液加入到保护溶液中，搅拌均匀后进行冷冻干燥得到菌粉；其中，菌悬液浓度为1010CFU/mL；菌悬液和保护溶液的体积比为1:100。
进一步地，保护溶液是由乳清分离蛋白和蔗糖溶于水形成的，其中，乳清分离蛋白的质量浓度为3％，蔗糖的质量浓度为2％。
进一步地，步骤(1)中，益生菌菌粉与油相混合的温度在38～40℃；油相采用黄油。
进一步地，步骤(2)中，所述水相采用乳清分离蛋白纤维溶液，其制备步骤包括：将乳清分离蛋白溶液的pH值调节为1.8～3，再在75～95℃条件下加热9～11h，冷却后将pH值调至6～7，得到所述乳清分离蛋白纤维溶液。
进一步地，所述乳清分离蛋白溶液的质量浓度为3～6％。
进一步地，步骤(2)中，剪切条件为10000rpm剪切4min；
步骤(3)中，干燥条件是在-80℃冷冻24～48h。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明不仅提供了一种油相的微囊化方法，还添加了益生菌，成功地将益生菌与油相包裹在由单一的蛋白纤维构成的外壳内，本发明基于蛋白纤维的优越的乳化性和增稠性，不仅为油脂屏蔽了氧和光来抑制自由基自氧化和油的光氧化，还通过将益生菌包埋在油脂内为其构建了一个构建阻氧阻湿的屏障，防止油相和菌体在苛刻的加工和存储条件下发生化学、物理降解以及失活；本发明制得的微囊具有纤维和脂肪外壳，可以为益生菌抵抗胃肠液中的恶劣条件，如酶降解、强酸性环境等，极大的改善了菌体在胃肠液中的存活；在巴氏杀菌中益生菌几乎不死亡，热抵抗能力强。同时本发明制备方法简单，制作时间短，且所述的原料来源广泛、价格低廉，易于工业化具有极高的生产应用价值。
附图说明
图1是本发明微囊设计原理图；
图2为乳清分离蛋白和乳清分离蛋白纤维稳定黄油乳液的宏观图片；
图3为乳清分离蛋白和乳清分离蛋白纤维的粘度；
图4为乳清分离蛋白和乳清分离蛋白纤维稳定的黄油乳剂冻干粉宏观图片；
图5为乳清分离蛋白和乳清分离蛋白纤维稳定的黄油乳剂冻干粉微观图片；
图2至图5中的百分数均为所采用的乳清分离蛋白溶液的浓度，具体地，在WPI溶液中指其本身溶液浓度，在WPIF溶液中，指用于制备WPIF的原料乳清分离蛋白溶液的浓度。
具体实施方式
下面将结合本发明中的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
1、本发明的处方
含益生菌的黄油冻干皮克林乳剂原料由下列重量百分比的成分组成：
油相：6～10％(w/w)油菌混合物；菌粉：占油菌混合物10～14％；水相：90～94％乳清分离蛋白纤维乳液；
水相优选为乳清分离蛋白纤维乳液；乳清分离蛋白纤维溶液是由质量浓度3％～6％的乳清分离蛋白制得的，其余为水。
水相浓度的优选为5～6％；
水相pH的优选为6～7；
油相优选为黄油；
2、本发明的成型工艺
含益生菌的黄油冻干皮克林乳剂的制备方法包括以下步骤：
1)制备菌粉：将菌悬液加入到保护溶液中，搅拌均匀后进行冷冻干燥得到菌粉；菌悬液浓度优选1010CFU/mL；菌悬液和保护溶液的体积比为1:100。
2)制备乳清分离蛋白纤维水相：质量浓度3～6％的乳清分离蛋白在pH值1.8～3、75～95℃条件下加热9～11小时后，放入冰水浴中冷却，将pH调至6～7；
3)在一定温度下，将菌粉加入到油相中，充分混合，使菌粉均匀分布在油相中，得到油菌混合物；
4)将油菌混合物加入水相中，高速剪切制备得到由乳清分离蛋白纤维稳定的皮克林乳液；
5)冷冻干燥得到含益生菌的黄油冻干乳剂。
步骤(1)中保护溶液为乳清分离蛋白和蔗糖溶于水得到的，其中乳清分离蛋白的质量浓度为3％，蔗糖的质量浓度为2％。
步骤(2)中乳清分离蛋白纤维的制备条件优选为乳清分离蛋白浓度为5～6％、pH值为2、80℃加热10小时，形成纤维后将pH调至6.5。
步骤(3)中油相优选为黄油，与菌体混匀的温度优选为40℃。
步骤(4)中高速剪切条件优选为10000rpm高速剪切4分钟。
步骤(5)中冻干条件优选为-80℃冰箱中预冻24小时，使样品冻结成固态；并在-80℃冻干机中冷冻干燥24小时，使水分从固态升华成气态。
如图1所示，本发明微囊主要的反应机理及设计原理如下：
在酸性高温条件下，球形蛋白质分子经过去折叠和水解，多肽片段发生横向β-折叠堆积可形成原型纤维，原型纤维再进一步相互缠绕可形成多股扭曲带状纤维。淀粉样原纤维的典型特征是纳米级的厚度和微米级的长度，蛋白纤维独特的杆状结构和高纵横比使蛋白纤维始终具有独特的界面吸附行为、凝胶行为和乳化活性等特点，使其成为具有发展前景的各向异性纳米结构。此外，由于其氢键网络高度有序，是最坚硬的蛋白质材料之一。黄油是一种具有独特香气色泽的动物乳脂肪，相较于植物脂肪，乳脂肪更有利于益生菌的保护；在室温下呈现固体状态，有利于固定生物活性物质；且富含多种营养物质，如独特的脂肪酸组成、必需脂肪酸、维生素A、以及钙、磷、钾等矿物质等等。
为抵抗外界环境对益生菌造成的伤害，本发明提出了一种具有空间隔离功能的核壳结构益生菌微囊，即利用蛋白纤维优越的乳化性以及高粘度，以固体油脂黄油包裹的益生菌作为内核，以乳清分离蛋白纤维(WPIF)为外壳，构建阻氧阻湿益生菌微囊(S/O/W微囊)。该结构中的黄油可固定益生菌在内相，减少其与外界环境的接触，形成一个具有阻氧、阻湿、隔离消化液等功能的微环境；蛋白纤维的乳化性可起到乳化黄油的功能，蛋白纤维的较高粘度可以很好地稳定黄油乳液，保证乳液在静置、冷冻干燥等过程中不发生分层，同时有利于黄油液滴间的分散，有利于制备益生菌和黄油分散均一的益生菌菌粉。干燥工艺是益生菌微囊制备的关键工艺，这是因为益生菌干粉是益生菌稳态化的主要形式，只有益生菌干粉可以实现益生菌的长期储藏和广泛应用。
实施例1(蛋白纤维化及其浓度对冻干乳剂制备的影响)
步骤1、水相的制备
1)水相A：称取乳清分离蛋白粉末溶解，分别配置1％-5％的乳清分离蛋白溶液，在室温下充分溶解2小时后将pH调至6.5，备用；
2)水相B：称取乳清分离蛋白粉末溶解，分别配置1％-5％的乳清分离蛋白溶液，在室温下充分溶解2小时，用6.0M盐酸将pH值调整到2.0，并在80℃下加热溶液10小时后取出放入冰水浴中冷却20分钟，用6.0M的NaOH将pH调至6.5，备用。
步骤2、油相的制备
将黄油放置在40℃水浴锅中使其融化，备用。
步骤3、乳液的制备
分别称取水相A和水相B13.8g(pH6.5的1％-5％乳清分离蛋白和乳清分离蛋白纤维溶液)，再分别加入黄油1.2g，10000rpm高速剪切4min，取一部分新鲜乳液观察，其他的新鲜乳液倒入一次性平皿-80℃冷冻24小时，冻干24小时得到两组黄油冻干乳剂，其具体原料组分如下：
第一组：水相A(1％-5％的乳清分离蛋白溶液，以下简称蛋白溶液)+黄油；
第二组：水相B(1％-5％的乳清分离蛋白溶液制得的乳清分离蛋白纤维溶液，以下简称纤维溶液)+黄油。
对两组黄油冻干乳剂分别进行乳液粒径测试，并常温放置3h进行观察，结果如图2、图3和表1所示。
乳液粒径测量方法如下：
用Malven Mastersizer 2000(马尔文仪器有限公司，英国马尔文)测量了乳状液颗粒尺寸。乳状液颗粒的折射率为1.475，分散剂介质的折射率为1.330。乳液粒径与许多乳状液样品密切相关，可以反映样品颗粒的大小。
表1蛋白纤维化及其浓度对黄油乳液外观及粒径的影响
根据图2和表1的总结结果可知，采用水相A(1～5％的蛋白溶液)和水相B(由1～5％蛋白溶液水解得到的纤维溶液)，均能够与黄油形成乳液，且乳液粒径在45微米左右，一般来说菌体的大小通常在1至5μm之间，因此，在此条件下形成的乳液可以用来包埋菌体。
然而水相A(1％～5％的蛋白溶液)和1％～2％的乳清分离蛋白制得的水相B(纤维溶液)均不能很好的稳定以黄油为油相的乳液。原因可能是蛋白浓度和粘度共同影响，蛋白浓度过低，不能完全的覆盖住黄油油滴，蛋白的粘度过低，不能有效地阻止黄油在常温下发生的自聚集。如由图3可知，水相B(纤维溶液)的粘度均高于水相A(蛋白溶液)的，并且随着所采用蛋白溶液浓度的增加，其粘度逐渐增加。3％～5％的乳清分离蛋白制得的水相B可以较好的稳定黄油乳液，并且在室温下放置3小时仍然呈现均匀的乳液，因此考虑将3％～5％的蛋白溶液制备的纤维溶液用作黄油乳剂的制备原料。
对两组黄油冻干乳剂分别进行宏观和微观(扫描电镜)观察，结果如图4、图5和表2所示。
表2蛋白纤维化及其浓度对冻干黄油乳剂外观的影响
根据图4和表2的总结结果可知，1-5％的水相A和1％、2％蛋白制得的水相B制备的黄油乳剂效果差，黄油和蛋白在冷冻过程中分层，不能形成均匀的冻干乳剂粉末，3％-5％蛋白制得的水相B制备的黄油乳剂宏观上可以看到是均匀的粉末，无黄油漏出的现象，从图5的扫描电镜也可以观察到较多明显的球型微囊。因此3％-5％蛋白制得的水相B(纤维溶液)可制备出含黄油的冻干乳剂，成功实现黄油的微囊化。
实施例2(菌粉制备优化)
步骤1、菌悬液的制备
将冷冻保藏的Lactobacillus reuteri TMW 1.656(来源于阿尔伯塔大学食品微生物学实验室)接种于mMRS液体培养基中活化，37℃静置培养24小时；再以4％(v/v)的接种量转接到新的5瓶100mL的mMRS液体培养基中，37℃静置培养24小时后；在4℃、10000rpm条件下冷冻离心15分钟，收集菌体，用蛋白胨溶液洗涤两次后，重悬于2.5mL蛋白胨水溶液中，制成浓度为1010CFU/mL的菌悬液，备用；
步骤2、保护溶液的制备
称取一定质量的乳清分离蛋白粉末溶解于无菌水中，充分溶解，制备浓度为3％(w/w)的乳清分离蛋白溶液，将pH调为6.5，加入2％的蔗糖，充分溶解后，备用；
步骤3、益生菌菌粉的制备
将步骤1中制备的菌悬液加入步骤2中的溶液中，分别加入107、108、109、1010CFU(即分别为0.001、0.01、0.1、1mL的1010CFU/mL的菌悬液添加至10mL保护液中)的菌，充分混匀后放入-80℃冰箱冷冻24小时，然后放入真空冷冻干燥机中冷冻干燥24h，得到所述益生菌菌粉，置于-20℃冰箱保存备用。
其中蛋白胨溶液为：1g/L蛋白胨，8.5g/L NaCl，调pH至6.8；
mMRS液体培养基包括：麦芽糖10g/L，蛋白胨10g/L，麦芽提取物10g/L，果糖5g/L，葡萄糖5g/L，酵母提取物5g/L，牛肉提取物5g/L，磷酸二氢钾2.6g/L，磷酸氢二钾4g/L，氯化铵3g/L，吐温801g/L，L-半胱氨酸-HCl0.5g/L，七合水硫酸镁0.1g/L和四合水硫酸锰0.05g/L，pH6.8～7.0。
冻干失活对数测定：
将冷冻干燥后的新鲜益生菌菌粉(0.01g)加入0.99g蛋白胨溶液中。混合物在37℃孵育10分钟，旋涡30秒分散。将菌液按10倍顺序稀释，涂布于mMRS固体培养基上，在37℃厌氧培养48小时后计数菌落数。冷冻干燥后菌粉细胞失活对数按下式计算：
其中N为冻干菌粉的活细胞总数，N0为菌悬液的活细胞总数。统计不同菌添加量制备的菌粉的冻干失活对数(冻干失活对数是指在冻干过程中菌体的死亡对数，数值越大，代表菌体死亡数量越多，数值越小，代表菌体死亡数量越少。失活对数呈现负值，是因为平板技术法存在一定误差，因此可以看做是在该添加量下，菌体的数量几乎没有损失)，结果如表3所示。
表3不同菌添加量制备的菌粉的冻干失活情况
如表3所示，当菌悬液的添加量为107-109CFU时，菌体的数量几乎没有损失；而当菌添加量为1010CFU时，有0.66logCFU/g的菌体死亡，同时考虑到经济效率以及后期菌体存活数量等问题，最终选取菌添加量为109CFU进行后续包埋实验，即固定后期菌粉制备方法为将0.1mL的1010CFU/mL菌悬液加入到10mL保护溶液中。
实施例3(油相种类对乳剂中菌体存活的影响)
步骤1水相的制备
称取乳清分离蛋白粉末溶解，分别配置5％的乳清分离蛋白溶液，在室温下充分溶解2小时，用6.0M盐酸将pH值调整到2.0，并在80℃下加热溶液10小时后取出放入冰水浴中冷却20分钟，用6.0M的NaOH将pH调至6.5，备用；
步骤2油相的制备
将油相放置在40℃水浴锅中使其融化，加入实施例2中优选的菌粉(109CFU)，在40℃水浴锅充分溶解，直至得到均匀的油菌混合物，选择油相为黄油、棕榈油和中链甘油三酯(MCT)，菌粉添加量为油相的12％；
步骤3冻干乳剂的制备
称取水相13.8g，再加入油菌混合物1.2g，10000rpm高速剪切4min，倒入一次性平皿在-80℃冷冻24小时，冻干24小时得到含益生菌的冻干乳剂。
储藏存活测定
测定乳剂的40天菌体存活率。将实施例3制备得到的含益生菌的黄油冻干乳剂置于相对湿度为33％、30℃的密封玻璃容器(900mL)中，由100mL氯化镁饱和盐溶液控制相对湿度进行储藏。每隔一段时间取出样品，平板计数样品中存活细胞。其中乳剂活菌计数方法具体为：将0.01g冻干乳剂加入到0.99g蛋白胨溶液中，37℃温育10min，用旋涡振荡器分散30秒至完全溶解。使用生理盐水(9g/L NaCl)通过10倍连续稀释溶液，将稀释液涂布于MRS固体培养基上，并在37℃厌氧培养48小时后计数菌落数。
菌体储藏失活情况表示为相对存活率分数的对数值(ΔN)：
其中N0是冷干乳剂中的活细胞数，Nt为贮藏t天时冷干乳剂中的活细胞数。
统计不同油相种类制备的冷干乳剂中益生菌的40天储藏失活情况，结果如表4所示。
表4不同油相种类制备的冷干乳剂中益生菌的储藏失活情况
不同种类的油相对菌体的储藏存活影响如表4所示，将益生菌包埋在油相中可以通过将环境中的氧气、水分子排除在外从而达到保护菌体的效果。因此，内部油相的特征有利于提高胶囊化益生菌的生存能力。如表4，在储藏40天后，在黄油中的菌体死亡数量为1.46个对数，在棕榈油和MCT中死亡的数量分别为1.84和2.46个对数，因此，不同油相对菌体的保护效果是：黄油>棕榈油>MCT，可能是由于黄油是动物性源，比植物性源的棕榈油和MCT更有利于益生菌存活；且黄油和棕榈油在常温下都是呈现固体状态，比MCT更有利于储藏，因此菌体的储藏稳定性会更好。综上所述，在常温储藏过程中，由于油脂包埋的特征和油相在常温下呈固体的特性，冷干乳剂可以作为一种很有前景的载体来提高益生菌的生存能力。因此用黄油作为油相是优选。
实施例4
将实施例3制得的纤维溶液，直接替换成大豆蛋白纤维溶液和大米谷蛋白溶液，其他制备步骤相同。
统计不同蛋白纤维制备的冷干乳剂中益生菌的40天储藏失活情况，结果如表5所示。
表5不同蛋白纤维制备的冷干乳剂中益生菌的储藏失活情况
如表5所示，使用大豆分离蛋白纤维和大米谷蛋白纤维作为包埋壁材比乳清分离蛋白纤维菌体死亡数量多0.5个对数，可能是由于乳清分离蛋白纤维是动物源蛋白，而大豆分离蛋白纤维和大米谷蛋白纤维是植物源蛋白制备的，因此根据实验结果选择乳清分离蛋白纤维溶液用于后续的包埋实验。
实施例5(乳清分离蛋白纤维pH对乳剂中菌体存活的影响)
步骤1水相的制备同实施例3步骤1，不同在于制备好纤维后，将溶液pH调至4、5、6、6.5、8、9；
步骤2油相的制备同实施例3步骤2，选择油相为黄油，菌粉添加量为12％；
步骤3冻干乳剂的制备同实施例3步骤3。
统计不同pH值的水相制备的冷干乳剂中益生菌的40天储藏失活情况，结果如表6所示。
表6不同pH的乳剂中益生菌储藏失活情况
如表6所示，在储藏40天后，随着pH的增加，乳剂中菌体的死亡数量呈现先降低再增加的趋势。当pH值为6～7时，乳清分离蛋白纤维在油滴表面聚集时，在储藏过程中其保护作用最强，pH值过高或过低都会对益生菌造成一定的伤害。因此蛋白纤维的pH值6～7是优选。
实施例6(不同用量的油菌混合物对乳剂中菌体存活的影响)
步骤1水相的制备同实施例3步骤1；
步骤2油相的制备同实施例3步骤2；
步骤3冻干乳剂的制备步骤同实施例3步骤3，不同之处在于油菌混合物占乳剂的比例，分别为4％、8％以及12％(即油菌混合物添加量分别为0.6、1.2、1.8g，水相添加量依次为14.4、13.8、13.2g)。
统计不同用量的油菌混合物制备的冷干乳剂中益生菌的40天储藏失活情况，结果如表7所示。
表7不同用量的油菌混合物的乳剂中益生菌储藏失活情况
如表7所示，添加4％和8％的油菌混合物，对益生菌在储藏期间的储藏失活数量影响不显著，但当油菌混合物添加量增加到12％时，菌体在储藏过程中的失活数量增加，这可能是油菌混合物添加量过量，使得微囊包埋效果不好，菌体暴露在外面，加速了益生菌的死亡，考虑到菌体不足或过量问题，固定后期油菌混合物的占比为8％。
实施例7(乳清分离蛋白纤维浓度对乳剂中菌体存活的影响)
步骤1水相的制备同实施例3步骤1，不同在于制备乳清分离蛋白纤维的蛋白浓度分别为3％、4％、5％、6％；
步骤2油相的制备同实施例3步骤2，选择油相为黄油，菌粉添加量为12％；
步骤3冻干乳剂的制备同实施例3步骤3。
模拟胃肠液存活率测定：
模拟胃液：将胃蛋白酶溶解在0.2％氯化钠(w/v)溶液中至浓度为3.2g/L，并用1.0M HCl溶液pH调节至2.0。模拟肠液：由2g/L氯化钠、1g/L胰酶和4.5g/L胆盐在磷酸盐缓冲液(0.02mol/L，pH7.4)中组成。
将0.1g的冻干乳剂在0.9g蛋白胨溶液中37℃水合10分钟。将膨胀后的冻干乳剂混合物加入9g预温的模拟胃液/模拟肠液中，37℃、100rpm孵育120/60分钟。模拟肠液处理后的样品在4℃、10000rpm离心10min，微胶囊沉淀重新分散到9.9gPS溶液中。将模拟胃液处理后的样品pH调至6.0-8.0后离心。如前所述，使用平板计数技术计算模拟胃液/模拟肠液处理后的存活细胞。用生理盐水处理的细胞作为对照。模拟胃液/模拟肠液冻干乳剂的细胞失活计算为活细胞对数值的减小(log(N0/N))，其中N为模拟胃液/模拟肠液处理冻干乳剂的活细胞数，N0为生理盐水处理冻干乳剂的活细胞数。
热处理后的存活率测定：
为了测量封装的益生菌在巴氏灭菌(63℃，30分钟)后存活的能力，将冻干乳剂在63℃加热30分钟。经热处理和室温水浴冷却后，用实施例2中测定冻干存活的方法计算存活细胞计数。细胞失活计算为活细胞对数值的减小(log(N0/N))，其中N为热处理后的活细胞数，N0为热处理前的活细胞数。
统计不同浓度纤维溶液稳定的冻干乳剂中益生菌的模拟胃肠液和热处理后的失活情况，结果如表8所示。
表8不同冻干乳剂中益生菌模拟胃肠液和巴氏杀菌失活情况
益生菌胃肠道存活是益生菌发挥生理功能的重要前提，只有将足够数量的活的益生菌递送至其在小肠上的结合位点，才有利于益生菌发挥其功能特性。如表8所示，随着蛋白纤维浓度的增加，菌体的死亡数量逐渐减少，当蛋白纤维浓度为5％、6％后，菌体死亡数量没有明显差别。在模拟胃液中，5％和6％制得的纤维稳定的乳剂菌数量死亡在1.0logCFU/g左右，比3％和4％的少0.6-1.0log CFU/g；在模拟肠液中菌死亡数量在0.5log CFU/g左右，比3％和4％的少0.3-0.4log CFU/g。本发明制得的微囊具有纤维和脂肪外壳，可以为益生菌抵抗胃肠液中的恶劣条件，如酶降解、强酸性环境等，极大的改善了菌体在胃肠液中的存活，且随着蛋白浓度的增加，保护效果也逐渐增加，直至达到饱和。为了保证食品质量和食品安全，巴氏杀菌在食品加工中被广泛应用，一般情况下，巴氏杀菌处理会导致益生菌的部分死亡，并显著降低细胞活力。而在本发明中，巴氏杀菌过程中菌的数量几乎不死亡，且随乳清分离蛋白纤维浓度的不断增大，在巴氏杀菌过程中死亡的菌数量更少，当蛋白纤维的制备浓度为5％、6％后，菌数量没有明显差别。这说明用油脂制备的乳剂包埋菌体对热有一定的抵抗能力。
储藏存活测定：
测定方法同实施例3。
表9不同浓度蛋白纤维稳定的冻干乳剂中益生菌储藏失活情况
如表9所示，随乳清分离蛋白纤维浓度的不断增大，在储藏过程中死亡的菌数量逐渐减少，3％蛋白制得的纤维稳定的乳剂在40天储藏后死亡在2.64个对数，当蛋白纤维的制备浓度为5％、6％后，菌数量死亡在1.5个对数左右，且没有明显差别。这说明在油水界面上积累的蛋白纤维有利于增强封装的益生菌对恶劣环境的抵抗能力，直至达到饱和。因此综合实施例1和实施例5，蛋白纤维的制备原料(蛋白溶液)浓度优选为5％～6％。
本发明基于新型生物材料蛋白纤维的乳化性和高粘度，利用黄油在室温下呈现固体的特性，将益生菌细胞包裹在黄油中，以黄油作为内核，蛋白纤维为外壳，为菌体构建阻氧阻湿微囊。以黄油为内相，蛋白纤维为壁材的基质中可以改善益生菌的存活，相比于普通微囊可显著增加其稳定性，从而提供更长的货架寿命，具有较高的生产应用价值。本发明提供了以包含益生菌的黄油为芯材、乳清分离蛋白纤维为壁材的冻干皮克林乳剂。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种含益生菌的冻干皮克林乳剂，其特征在于，包括以下重量百分数的组分：6～10%的油菌混合物和90～94%的水相；
其中，油菌混合物由10～14%的益生菌菌粉和86～90%的油相组成；
所述水相采用乳清分离蛋白纤维溶液；
所述油相采用黄油。
2.根据权利要求1所述的含益生菌的冻干皮克林乳剂，其特征在于，所述水相的pH值为6～7。
3.一种含益生菌的冻干皮克林乳剂的制备方法，其特征在于，按重量百分数计，包括以下步骤：
（1）将益生菌菌粉加入到油相中，混合均匀得到油菌混合物；所述油菌混合物中，益生菌菌粉占10～14%，油相占86～90%；油相采用黄油；
（2）将油菌混合物加入到水相中，剪切分散得到皮克林乳液；所述皮克林乳液中，油菌混合物占6～10%，水相占90～94%，所述水相采用乳清分离蛋白纤维溶液；
（3）将皮克林乳液干燥得到含益生菌的冻干皮克林乳剂。
4.根据权利要求3所述的含益生菌的冻干皮克林乳剂的制备方法，其特征在于，步骤（1）中益生菌菌粉的制备步骤包括：将菌悬液加入到保护溶液中，搅拌均匀后进行冷冻干燥得到菌粉；其中，菌悬液浓度为1010CFU/mL；菌悬液和保护溶液的体积比为1:100。
5.根据权利要求4所述的含益生菌的冻干皮克林乳剂的制备方法，其特征在于，保护溶液是由乳清分离蛋白和蔗糖溶于水形成的，其中，乳清分离蛋白的质量浓度为3%，蔗糖的质量浓度为2%。
6.根据权利要求3所述的含益生菌的冻干皮克林乳剂的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，益生菌菌粉与油相混合的温度在38～40℃。
7.根据权利要求3所述的含益生菌的冻干皮克林乳剂的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述乳清分离蛋白纤维溶液，其制备步骤包括：将乳清分离蛋白溶液的pH值调节为1.8～3，再在75～95℃条件下加热9～11h，冷却后将pH值调至6～7，得到所述乳清分离蛋白纤维溶液。
8.根据权利要求7所述的含益生菌的冻干皮克林乳剂的制备方法，其特征在于，所述乳清分离蛋白溶液的质量浓度为3～6%。
9.根据权利要求3所述的含益生菌的冻干皮克林乳剂的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，剪切条件为10000rpm剪切4min；
步骤（3）中，干燥条件是在-80℃冷冻24～48h。
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