CN114698426A - 一种改变烟草连坐土壤微生物群落的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种改变烟草连坐土壤微生物群落的方法，所述的方法包括，种植方式为，改烟草连作为蘑菇、烟草轮作。本发明的有益效果为，1)本发明确定了蘑菇、烟草轮作对土壤微生物群落的影响和变化；2)本发明确定了四种轮作方式以及对土壤pH值大小、土壤基质有机质、速效磷、速效钾、土壤酶活性、细菌物种多样性、真菌物种多样性等的影响情况；3)本发明的研究结论对未来烟草、轮作、土壤微生物结构等研究发展起到高价值参考作用。

Description

一种改变烟草连坐土壤微生物群落的方法
技术领域
本发明属于植物生产技术领域，尤其是涉及一种改变烟草连坐土壤微生物群落的方法技术领域。
背景技术
烟草(Nicotiana tabacum L.)是忌连作的作物，由于宜种烟土地面积的有限性和种植条件等因素，中国地区的烟草大多都采用连作种植。然而研究表明长期连作会导致土壤营养元素的失衡，土壤酶活性降低，土壤微生物多样性降低、病原菌增多、有益菌减少，严重影响了烤烟生产的可持续发展。连作降低土壤pH值，刺激酚酸的积累，从而改变了细菌群落结构和多样性，最终影响了烟草植物的生长。目前对于烟草连作障碍修复的报道，主要集中于传统的轮作模式如稻-烟草水旱轮作、大蒜-烟草轮作和花生-烟草轮作等，而对于蘑菇-烟草轮作对烟草连作土壤微生物群落结构的影响未见报道。
发明内容
本发明正是为了解决上述问题缺陷，提供一种改变烟草连坐土壤微生物群落的方法。
本发明采用如下技术方案实现。
一种改变烟草连坐土壤微生物群落结构的方法，本发明所述的方法包括，将种植方式为，改烟草连作为蘑菇、烟草轮作。
本发明所述的蘑菇、烟草轮作为：Y1：蘑菇-烟草轮作4个月：蘑菇3个月-烟草1个月，轮作后盆底部的连作土，不含蘑菇废渣基质SMS；或，
M1：蘑菇-烟草轮作4个月：蘑菇3个月-烟草1个月，轮作后的连作土与SMS的混合土，包含蘑菇废渣基质SMS；或，
M2：蘑菇-烟草轮作7个月：蘑菇6个月-烟草1个月轮作后盆底部的连作土，不含蘑菇废渣基质SMS；或，
Y2：蘑菇-烟草轮作7个月：蘑菇6个月-烟草1个月轮作后的连作土与SMS的混合土，包含蘑菇废渣基质SMS。
本发明所述的蘑菇废渣基质SMS为，以重量计，由30％阔叶林木屑、30％棉籽壳、15％玉米芯、14％小麦麸皮、10％玉米面和1％石膏粉混合，经过2次翻堆，每次翻堆7天获得。
一种检测烟草土壤微生物群落中细菌的引物，本发明所述的引物为F1：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′，R1：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。
一种检测烟草土壤微生物群落中真菌的引物，本发明所述的引物为F2：5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′，R2：5′-GCTGCGTTCATCGATGC-3′。
一种烟草生产中改变土壤pH值大小的方法，本发明该方法包括：1)增加pH值的方法：使用以下轮作方式：Y1：蘑菇-烟草轮作4个月：蘑菇3个月-烟草1个月，轮作后盆底部的连作土，不含蘑菇废渣基质SMS；或，
M1：蘑菇-烟草轮作4个月：蘑菇3个月-烟草1个月，轮作后的连作土与SMS的混合土，包含蘑菇废渣基质SMS；或，
Y2：蘑菇-烟草轮作7个月：蘑菇6个月-烟草1个月轮作后的连作土与SMS的混合土，包含蘑菇废渣基质SMS；
2)降低pH值的方法：M2：蘑菇-烟草轮作7个月：蘑菇6个月-烟草1个月轮作后盆底部的连作土，不含蘑菇废渣基质SMS。
一种烟草生产中增加土壤基质有机质、速效磷和速效钾的方法，本发明该方法包括使用以下轮作方式：M2：蘑菇-烟草轮作7个月：蘑菇6个月-烟草1个月轮作后盆底部的连作土，不含蘑菇废渣基质SMS。
一种烟草生产中提高土壤酶活性的方法，本发明该方法包括使用以下轮作方式：M2：蘑菇-烟草轮作7个月：蘑菇6个月-烟草1个月轮作后盆底部的连作土，不含蘑菇废渣基质SMS；或M1：蘑菇-烟草轮作4个月：蘑菇3个月-烟草1个月，轮作后的连作土与SMS的混合土，包含蘑菇废渣基质SMS。
一种烟草生产中提高土壤中细菌物种多样性的方法，本发明该方法包括使用以下轮作方式：Y1：蘑菇-烟草轮作4个月：蘑菇3个月-烟草1个月，轮作后盆底部的连作土，不含蘑菇废渣基质SMS；或，Y2：蘑菇-烟草轮作7个月：蘑菇6个月-烟草1个月轮作后的连作土与SMS的混合土，包含蘑菇废渣基质SMS。
一种烟草生产中提高土壤中真菌物种多样性的方法，本发明该方法包括使用以下轮作方式：Y1：蘑菇-烟草轮作4个月：蘑菇3个月-烟草1个月，轮作后盆底部的连作土，不含蘑菇废渣基质SMS；或，M1：蘑菇-烟草轮作4个月：蘑菇3个月-烟草1个月，轮作后的连作土与SMS的混合土，包含蘑菇废渣基质SMS。
本研究利用高通量测序方法，研究烟草连作5年后的土壤轮作种植蘑菇120天和210天后，连作基质中微生物多样性和群落结构的变化趋势。
本发明的有益效果为，1)本发明确定了蘑菇、烟草轮作对土壤微生物群落的影响和变化；2)本发明确定了四种轮作方式以及对土壤pH值大小、土壤基质有机质、速效磷、速效钾、土壤酶活性、细菌物种多样性、真菌物种多样性等的影响情况；3)本发明的研究结论对未来烟草、轮作、土壤微生物结构等研究发展起到高价值参考作用。
下面结合附图和具体实施方式本发明做进一步解释。
附图说明
图1五种处理中细菌(A)和真菌(B)群落的Venn图。
图2不同处理的轮作基质中细菌群落的层次聚类(A)和主坐标分析(B)。
图3不同处理轮作基质中真菌群落的层次聚类(A)和主坐标分析(B)。
图4细菌群落分析：(A)不同处理下土壤门水平优势细菌的相对丰度；(B)不同处理下土壤细菌群落水平的热图分析。群落相对丰度颜色由蓝色变为红色，表示群落相对丰度由低变高。
图5真菌群落分析：(A)不同处理下土壤门水平优势真菌的相对丰度；(B)不同处理下土壤真菌群落水平的热图分析。群落相对丰度颜色由蓝色变为红色，表示群落相对丰度由低变高。
图6环境因素对土壤细菌(A)和真菌(B)群落分布的影响。点代表矩阵样本；蓝色箭头代表基体的物理和化学性质；红色箭头代表基质微生物。
具体实施方式
一种改变烟草连坐土壤微生物群落结构的方法，本发明所述的方法包括，种植方式为，改烟草连作为蘑菇、烟草轮作。
本发明所述的蘑菇、烟草轮作为：Y1：蘑菇-烟草轮作4个月：蘑菇3个月-烟草1个月，轮作后盆底部的连作土，不含蘑菇废渣基质SMS；或，
M1：蘑菇-烟草轮作4个月：蘑菇3个月-烟草1个月，轮作后的连作土与SMS的混合土，包含蘑菇废渣基质SMS；或，
M2：蘑菇-烟草轮作7个月：蘑菇6个月-烟草1个月轮作后盆底部的连作土，不含蘑菇废渣基质SMS；或，
Y2：蘑菇-烟草轮作7个月：蘑菇6个月-烟草1个月轮作后的连作土与SMS的混合土，包含蘑菇废渣基质SMS。
本发明所述的蘑菇废渣基质SMS为，以重量计，由30％阔叶林木屑、30％棉籽壳、15％玉米芯、14％小麦麸皮、10％玉米面和1％石膏粉混合，经过2次翻堆，每次翻堆7天获得。
一种检测烟草土壤微生物群落中细菌的引物，本发明所述的引物为F1：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′，R1：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。
一种检测烟草土壤微生物群落中真菌的引物，本发明所述的引物为F2：5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′，R2：5′-GCTGCGTTCATCGATGC-3′。
一种烟草生产中改变土壤pH值大小的方法，本发明该方法包括：1)增加pH值的方法：使用以下轮作方式：Y1：蘑菇-烟草轮作4个月：蘑菇3个月-烟草1个月，轮作后盆底部的连作土，不含蘑菇废渣基质SMS；或，
M1：蘑菇-烟草轮作4个月：蘑菇3个月-烟草1个月，轮作后的连作土与SMS的混合土，包含蘑菇废渣基质SMS；或，
Y2：蘑菇-烟草轮作7个月：蘑菇6个月-烟草1个月轮作后的连作土与SMS的混合土，包含蘑菇废渣基质SMS；
2)降低pH值的方法：M2：蘑菇-烟草轮作7个月：蘑菇6个月-烟草1个月轮作后盆底部的连作土，不含蘑菇废渣基质SMS。
一种烟草生产中增加土壤基质有机质、速效磷和速效钾的方法，本发明该方法包括使用以下轮作方式：M2：蘑菇-烟草轮作7个月：蘑菇6个月-烟草1个月轮作后盆底部的连作土，不含蘑菇废渣基质SMS。
一种烟草生产中提高土壤酶活性的方法，本发明该方法包括使用以下轮作方式：M2：蘑菇-烟草轮作7个月：蘑菇6个月-烟草1个月轮作后盆底部的连作土，不含蘑菇废渣基质SMS；或M1：蘑菇-烟草轮作4个月：蘑菇3个月-烟草1个月，轮作后的连作土与SMS的混合土，包含蘑菇废渣基质SMS。
一种烟草生产中提高土壤中细菌物种多样性的方法，本发明该方法包括使用以下轮作方式：Y1：蘑菇-烟草轮作4个月：蘑菇3个月-烟草1个月，轮作后盆底部的连作土，不含蘑菇废渣基质SMS；或，Y2：蘑菇-烟草轮作7个月：蘑菇6个月-烟草1个月轮作后的连作土与SMS的混合土，包含蘑菇废渣基质SMS。
一种烟草生产中提高土壤中真菌物种多样性的方法，本发明该方法包括使用以下轮作方式：Y1：蘑菇-烟草轮作4个月：蘑菇3个月-烟草1个月，轮作后盆底部的连作土，不含蘑菇废渣基质SMS；或，M1：蘑菇-烟草轮作4个月：蘑菇3个月-烟草1个月，轮作后的连作土与SMS的混合土，包含蘑菇废渣基质SMS。
实施例
材料方法
试验地点和材料
该试验于2020年9月至4月在位于云南省昆明市云南农业大学进行。
从云南省昆明市安宁烟田表层(0-20cm)收集盆栽试验用土壤，已连续种植烟草5年，连作障碍严重。然后将土壤粉碎，通过2mm的筛子，在使用前储存在密闭的容器中，进行选定的理化分析，包括pH、有机质(OM)、速效氮、速效磷和速效钾。研究土壤的理化性质如表1所示。
蘑菇废渣基质(SMS)由来自昆明市的一家蘑菇种植基地，这个种植基地是昆明市的主要产区之一。SMS由30％阔叶林木屑、30％棉籽壳、15％玉米芯、14％小麦麸皮、10％玉米面和1％石膏粉，经过2次翻堆，每次翻堆7天获得。
试验设计
所有的盆栽都采用随机区组设计，每个重复5次，每个塑料盆(长930cm×宽380cm×高28cm)容纳15kg土壤。将采集的烟草连作土放入2/3盆中，然后放入1/3的SMS，最后接种蘑菇菌种用培养基质覆盖压实并覆土。
试验设置五个处理，
连作烟草(CK)：将采集的连作土种植烟草记为对照；
蘑菇-烟草轮作4个月(Y1)：蘑菇(3个月)-烟草(1个月)轮作后盆底部的连作土(不含SMS)；
蘑菇-烟草轮作4个月(M1)：蘑菇(3个月)-烟草(1个月)轮作后的连作土与SMS的混合土(包含SMS)；
蘑菇-烟草轮作7个月(M2)：蘑菇(6个月)-烟草(1个月)轮作后盆底部的连作土(不含SMS)；
蘑菇-烟草轮作7个月(Y2)：蘑菇(6个月)-烟草(1个月)轮作后的连作土与SMS的混合土(包含SMS)；
烟草品种“红花大金元”和蘑菇品种“大球盖菇”分别由昆明市安宁烟站和昆明市蘑菇种植基地试验站提供。
轮作烟草拔苗后采集土壤样品，每处理取12个样品。
去除0-5cm表面基质并轻轻摇晃根系周围的基质后，将粘附在根表面的土壤刷掉收集并立即作为根际储存在冰盒中。随后，将这些样品分成两部分，一部分风干以测定基质的理化性质，另一部分用于提取基质微生物DNA。本实验共5个处理，每个处理取3个样本进行DNA提取，共留15个样本。
理化性质和酶活性分析
将取回的土样放于4℃冰箱用于土壤理化性质分析，
采用重铬酸钾氧化-外加热法测定土壤有机质含量(OM)；
采用碳酸氢钠浸提-钼锑抗分光光度法测定土壤中有效磷含量(AP)；
采用乙酸铵浸提-原子吸收火焰分光光度计法测定土壤速效钾含量(AK)；
采用碱解扩散法测定土壤中水解性氮含量(AN)；
采用pH计测定土壤pH值。
土壤磷酸酶ACP、脲酶S-UE、过氧化氢酶ACT和蔗糖酶SC活性的测定采用上述方法(Hou,Wang et al.2020)(Guo,Yao et al.)(Johansson and Borg)(Gao,Song et al.)。
微生物群落分析
采用美国MP公司
Figure BDA0003625674970000061
Spin Kit for Soil试剂盒提取，按试剂盒的试验步骤进行土壤微生物总DNA的提取，DNA样品于-20℃保存待用。
提取样品总DNA后，根据设计得到细菌V3+V4
(F：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′，R：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)和真菌ITS1+ITS2
(F：5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′，R：5′-GCTGCGTTCATCGATGC-3′)合成的引物，合并引物接头，进行PCR扩增。
PCR反应体系为：5×FastPfu Buffer 4mL、2.5mmol/L d NTPs 2mL、ForwardPrimer(5mmol/L)0.8mL、Reverse Primer(5mmol/L)0.8mL、Fast-Pfu Polymerase 0.4mL、DNA模板10ng，补充ddH2O至20mL。
PCR反应条件为95℃预变性3min，27个循环(95℃变性30s，55℃退火30s,72℃延伸30s)，然后72℃稳定延伸10min，最后在4℃进行保存(PCR仪：ABI
Figure BDA0003625674970000062
9700型)。PCR扩增后，对其产物进行纯化、定量和均一化形成测序文库，建好的文库先进行文库质检，质检合格的文库用Illumina Miseq PE300进行测序，测序由上海美吉生物医药科技有限公司完成。
数据处理与分析
测序数据经拼接、质控、去接头之后获得优化的有效序列，基于优化序列按照97％的相似性进行OTU聚类，获得OTU丰度表，用于后续生信分析。
利用软件Mothur计算丰富度指数Chao以及多样性指数Shannon，并进行Alpha多样性分析，同时进行细菌群落分布、聚类分析和细菌功能预测分析。
结果与分析
轮作对土壤理化性质和酶活性的影响
蘑菇-烟草轮作处理显著(P<0.05)影响土壤养分状况。
Y1、M1、Y2和M2处理的有机质、速效氮、速效磷、速效钾均显著高于对照CK(表1)。
与对照相比，Y1、M1、Y2处理的基质pH分别增加了8.69％、7.49％和5.10％，M2处理的基质pH降低了16.83％。
与对照相比，在处理Y1中分别增加了45.53、93.44、194.62、38.97％，
在处理M1中分别增加了84.01、135.19、380.95、187.21％，
在处理Y2中分别增加了129.04、191.34、420.50、110.39％，
在处理M2中分别增加了2382.36、135.08、994.54、329.50％。
在轮作处理中，处理M2的基质有机质、速效磷和速效钾达到最高值。
与对照相比，轮作处理(Y1、M1、Y2和M2)中的磷酸酶、过氧化氢酶、脲酶和转化酶活性显著(P<0.05)增加(表2)，表明蘑菇轮作可以提高土壤中的酶活性。在轮作处理中，M2处理的酶活性最高，其次是M1、Y2和Y1。
Table1 Physicochemical properties of substrates treated withdifferent treatments.
Figure BDA0003625674970000071
All data are represented as the means±SE.Values with differentletters in the same row are significantly(P<0.05)different.
Table 2 Enzymatic activities of substrates treated with differenttreatments
Figure BDA0003625674970000072
All data are represented as the means±SE.Values with differentletters in the same row are significantly(P<0.05)different.
轮作对微生物群落的影响
Venn图能够反映样品之间共有和特有OTU数目，能够直观地表现出样品间OTU的重叠情况。在97％的相似度下，得到了每个处理的OTU个数(图1)。
CK、Y1、M1、Y2和M2处理分别获得2193、3926、3746、3714和2744个细菌OTU以及716、1077、950、771和625个真菌OTU。
不同处理之间共有925个细菌OTU，CK、Y1、M1、Y2和M2处理各自独有119、167、91、216和193个细菌OTU(图1A)。
不同处理之间共有161个真菌OTU，CK、Y1、M1、Y2和M2处理各自独有151、103、70、78和48个细菌OTU(图1B)。
α-多样性分析
利用Alpha多样性分析土壤中微生物群落的丰富度和多样性。Shannon指数可反映群落物种多样性，ace和Chao指数可反映群落物种丰富度。
在细菌群落中(表3)，Y1、M1、Y2和M2处理的shannon、chao和ace指数显著高于对照。与对照相比，Y1的shannon、chao、和ace指数分别增加了14.45、96.94、97.22％，M1分别增加了8.31、47.80、48.95％，Y2分别增加了10.84、71.69、73.81％，M2分别增加了4.88、23.14、30.34％。
在真菌群落中(表4)，轮作处理中shannon指数均低于对照，但差异不显著。simpson指数差异不显著，表明轮作处理对土壤真菌群落物种多样性没有显著影响。而Chao指数和ace指数在轮作处理中均高于对照，与对照相比，Y1分别增加了52.87％和55.15％，M1分别增加了52.87％和41.03％，M2分别增加了0.91％和3.01％，表明轮作处理对土壤真菌群落物种多样性存在显著影响。
Table3 The richness and diversity index of bacteria community indifferent rotation treatments were analyzed and observed.
Figure BDA0003625674970000081
All data are represented as the means±SE.Values with differentletters in the same row are significantly(P<0.05)different.
Table4 The richness and diversity index of fungi community indifferent rotation treatments were analyzed and observed.
Figure BDA0003625674970000082
All data are represented as the means±SE.Values with differentletters in the same row are significantly(P<0.05)different.
β-多样性分析
用系统聚类法分析了轮作处理中微生物群落的β多样性。通过层次聚类，将细菌群落划分为5个聚类(图2)，一个由处理CK组成，一个由处理Y1组成，一个由处理Y2组成，一个由处理M1组成，一个由处理M2组成。处理Y1和Y2聚在一起，处理M1和M2聚在一起，与对照CK分开。
基于OTUs的Unifrac加权PCoA也清楚地显示了不同轮作处理和连作土壤之间的差异，连作(CK)处理样品中的细菌群落与其他12个样品明显分开。
通过层次聚类，将真菌群落划分为4个聚类(图3)，一个由处理CK组成，一个由处理M2组成，一个由处理Y1组成，一个由处理Y1和M1聚在一起组成，轮作处理均与对照CK分开。
PcoA图也反应出相似的结果。
结果表明，不同轮作处理土壤细菌和真菌群落结构差异显著。
不同轮作对连作基质微生物群落组成的影响
不同处理间微生物群落组成存在显著差异。
在细菌门的水平上(图4A)，CK、Y1、M1、Y2和M2处理的优势细菌门是Proteobacteria、Actinobacteriota、Acidobacteriota、Chloroflexi、Bacteroidota、Gemmatimonadota和Firmicutes。
处理CK的相对丰度为20.5、37.31、12.03、14.69、0.97、7.62和1.62％、处理Y1的相对丰度为37.16、24.09、9.27、10.53、3.99、2.55和4.17％，处理M1的相对丰度为41.63、19.03、6.72、10.09、4.83、1.75和7.07％，处理Y2的相对丰度为41.86、10.60、12.24、6.89、5.81、7.99和2.56％，处理M2的相对丰度为46.89、8.38、10.03、4.93、13.46、0.88和1.09％。与对照相比，处理Y1、M1、Y2和M2的Proteobacteria相对丰度分别提高了16.66、21.13、21.36、和26.39％。对照CK的Proteobacteria、Bacteroidota、Patescibacteria、Desulfobacterota的丰度显著低于处理Y1、处理M1、处理Y2和处理M2，而Actinobacteriota、Chloroflexi的丰度显著高于处理Y1、处理M1、处理Y2和处理M2。处理Y1和M1的Actinobacteriota和Firmicutes丰度显著高于处理Y2和处理M2。
通过热图分析进一步确定了细菌群落在属水平上的相对丰度(图4B)。对照CK的Granulicella、Devosia、Rhodanobacter的丰度显著低于轮作处理Y1、M1、Y2和M2，而Gaiella的丰度显著高于轮作处理。
在真菌门的水平上(图5A)，CK的优势真菌门是Ascomycota、Basidiomycota和Mortierellomycota，相对丰度分别占77.84、10.75和10.27％。而处理Y1、M1、Y2和M2的优势真菌门是Ascomycota、Basidiomycota、Mortierellomycota和Rozellomycota，处理Y1的相对丰度分别占65.52、6.7、15.8和6.21％，处理M1的相对丰度分别占66.06、16.98、6.58和4.63％，处理Y2的相对丰度分别占40.18、5.23、26.94和15.52％，处理M2的相对丰度分别占33.42、34.69、9.99和13.56％。对照CK的Ascomycota丰度显著高于处理Y1、M1、Y2和M2，处理Y1和M1的Basidiomycota丰度显著高于Y2和M2。通过热图分析进一步确定了真菌群落在属水平上的相对丰度(图5B)。Stropharia(球盖菇属真菌)在对照CK并未检测到，而在处理M1和M2的丰度均显著高于Y1和Y2。对照CK的Penicillium和Gibberella的丰度显著高于处理Y1、M1、Y2和M2，而Cercophora、Ramophialophora的丰度则显著低于轮作处理。
环境因子对土壤微生物群落分布的影响
为了解环境因子对土壤微生物群落的影响，在门水平上对土壤细菌和真菌群落进行冗余分析(RDA)(图6)。分析了7种细菌群落的结构与土壤理化性质的关系(图6A)，细菌群落的RDA分析的前两个轴总共解释了71.69％的群落变化。CK细菌种类与有机质、速效氮、速效磷和速效钾呈负相关，与pH呈正相关。而处理Y1、M1、Y2和M2与有机质、速效氮、速效磷和速效钾呈正相关。分析了5种真菌群落的结构与土壤理化性质的关系(图6B)，真菌群落的RDA分析的前两个轴总共解释了83.26％的群落变化。M2与有机质、速效氮、速效磷和速效钾呈正相关，与pH呈负相关。
以上所述的仅是本发明的部分具体实施例，方案中公知的具体内容或常识在此未作过多描述。应当指出，上述实施例不以任何方式限制本发明，对于本领域的技术人员来说，凡是采用等同替换或等效变换的方式获得的技术方案均落在本发明的保护范围内。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。
<110>云南省烟草公司昆明市公司；云南农业大学
<120>一种改变烟草连坐土壤微生物群落的方法
<160> 4
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ACTCCTACGGGAGGCAGCAG
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
GGACTACHVGGGTWTCTAAT
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
GCTGCGTTCATCGATGC

Claims (10)

1.一种改变烟草连坐土壤微生物群落结构的方法，其特征在于，所述的方法包括，种植方式为，改烟草连作为蘑菇、烟草轮作。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的蘑菇、烟草轮作为：Y1：蘑菇-烟草轮作4个月：蘑菇3个月-烟草1个月，轮作后盆底部的连作土，不含蘑菇废渣基质SMS；或，
M1：蘑菇-烟草轮作4个月：蘑菇3个月-烟草1个月，轮作后的连作土与SMS的混合土，包含蘑菇废渣基质SMS；或，
M2：蘑菇-烟草轮作7个月：蘑菇6个月-烟草1个月轮作后盆底部的连作土，不含蘑菇废渣基质SMS；或，
Y2：蘑菇-烟草轮作7个月：蘑菇6个月-烟草1个月轮作后的连作土与SMS的混合土，包含蘑菇废渣基质SMS。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的蘑菇废渣基质SMS为，以重量计，由30％阔叶林木屑、30％棉籽壳、15％玉米芯、14％小麦麸皮、10％玉米面和1％石膏粉混合，经过2次翻堆，每次翻堆7天获得。
4.一种检测烟草土壤微生物群落中细菌的引物，其特征在于，所述的引物为F1：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′，R1：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。
5.一种检测烟草土壤微生物群落中真菌的引物，其特征在于，所述的引物为F2：5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′，R2：5′-GCTGCGTTCATCGATGC-3′。
6.一种烟草生产中改变土壤pH值大小的方法，其特征在于，该方法包括：1)增加pH值的方法：使用以下轮作方式：Y1：蘑菇-烟草轮作4个月：蘑菇3个月-烟草1个月，轮作后盆底部的连作土，不含蘑菇废渣基质SMS；或，
M1：蘑菇-烟草轮作4个月：蘑菇3个月-烟草1个月，轮作后的连作土与SMS的混合土，包含蘑菇废渣基质SMS；或，
Y2：蘑菇-烟草轮作7个月：蘑菇6个月-烟草1个月轮作后的连作土与SMS的混合土，包含蘑菇废渣基质SMS；
2)降低pH值的方法：M2：蘑菇-烟草轮作7个月：蘑菇6个月-烟草1个月轮作后盆底部的连作土，不含蘑菇废渣基质SMS。
7.一种烟草生产中增加土壤基质有机质、速效磷和速效钾的方法，其特征在于，该方法包括使用以下轮作方式：M2：蘑菇-烟草轮作7个月：蘑菇6个月-烟草1个月轮作后盆底部的连作土，不含蘑菇废渣基质SMS。
8.一种烟草生产中提高土壤酶活性的方法，其特征在于，该方法包括使用以下轮作方式：M2：蘑菇-烟草轮作7个月：蘑菇6个月-烟草1个月轮作后盆底部的连作土，不含蘑菇废渣基质SMS；或M1：蘑菇-烟草轮作4个月：蘑菇3个月-烟草1个月，轮作后的连作土与SMS的混合土，包含蘑菇废渣基质SMS。
9.一种烟草生产中提高土壤中细菌物种多样性的方法，其特征在于，该方法包括使用以下轮作方式：Y1：蘑菇-烟草轮作4个月：蘑菇3个月-烟草1个月，轮作后盆底部的连作土，不含蘑菇废渣基质SMS；或，Y2：蘑菇-烟草轮作7个月：蘑菇6个月-烟草1个月轮作后的连作土与SMS的混合土，包含蘑菇废渣基质SMS。
10.一种烟草生产中提高土壤中真菌物种多样性的方法，其特征在于，该方法包括使用以下轮作方式：Y1：蘑菇-烟草轮作4个月：蘑菇3个月-烟草1个月，轮作后盆底部的连作土，不含蘑菇废渣基质SMS；或，M1：蘑菇-烟草轮作4个月：蘑菇3个月-烟草1个月，轮作后的连作土与SMS的混合土，包含蘑菇废渣基质SMS。
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