CN114686585A - Tmem65在预警和/或治疗高原病中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了TMEM65在预警和/或治疗高原病中的应用。本发明提供的以TMEM65作为标志物在制备预警和/或治疗高原病产品中的应用，可以方便快捷地在基因水平上实现对高原病的预警和诊断，以TMEM65为靶点的药物有望成为高原病靶向治疗的一种新手段。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，特别涉及TMEM65在预警高原病，特别是高原心脏病，中的应用。
背景技术
高原病指人由平原进入高原，由于对低压低氧环境的适应能力不全或失调而发生的综合征，又称高山病。高原低氧环境引起机体缺氧是其病因。上呼吸道感染、疲劳、寒冷、精神紧张、饥饿、妊娠等为发病诱因，高原病一般分为急性高原病和慢性高原病两大类，两者共同的临床表现有头痛、头昏、心慌、气促、恶心、呕吐、乏力、失眠、眼花、嗜睡、手足麻木、唇指发绀、心律增快等，其他症状和体征则视类型不同而异。在高原长期生活的世居者或移居者，受低大气压和低氧分压的影响，引起机体各系统、器官、组织缺氧。轻则高原劳动力受限，重则可继发高原性肺水肿、脑水肿、高原性心脏病等进而危及生命。因此找出预防及治疗高原病的方法就变得极为重要。
专利文献CN110051662A公开了银杏内酯在制备预防或治疗高原病的药物中的应用，动物模型及临床疗效观察的药效证实了银杏内酯具有预防和改善高原病的作用。
专利文献CN113181147A公开了一种虾青素在制备防治高原病的药物中的应用，研究发现，虾青素在防治高原病方面具有显著的疗效。
跨膜蛋白65(transmembrane protein 65，TMEM65)是一种包含N末端MTS的线粒体内膜蛋白，它包含三个的跨膜区域，N末端暴露于基质、C末端暴露于膜间空间，目前现有技术中尚未见TMEM65与高原病相关、利用TMEM65对高原病进行预警和防治的相关报道，鉴于此，特提出本发明。
发明内容
为克服现有技术中存在的不足，本发明提供了TMEM65在制备预警和/或治疗高原病产品中的应用。
本发明第一方面提供了TMEM65作为标志物在制备预警和/或诊断高原病产品中的应用。
进一步地，所述TMEM65包括TMEM65基因和/或TMEM65蛋白。
进一步地，所述预警和/或诊断高原病的产品包括检测TMEM65基因的mRNA表达水平或蛋白表达水平的产品。
进一步地，所述检测TMEM65基因的mRNA表达水平或蛋白表达水平的产品包括能够结合TMEM65基因的核酸或能够结合TMEM65基因所表达的蛋白的物质。
进一步地，所述检测TMEM65基因mRNA表达水平的产品可基于使用核酸分子的已知方法来发挥其功能：例如，可以采用聚合酶链式反应(PCR)、Southern印迹杂交、Northern印迹杂交、点杂交、荧光原位杂交(FISH)、DNA微阵列、高通量测序平台、芯片检测等，特别是PCR方法，例如实时荧光定量PCR法、恒温扩增技术(滚环核酸扩增、环介导等温扩增、链替代扩增等)。使用该产品可以定性地、定量地、或半定量地实施分析。
进一步地，所述检测TMEM65基因mRNA表达水平的产品中所含的核酸可以通过化学合成来获得，或通过从生物材料制备含有所需核酸的基因，然后使用设计用于扩增所需核酸的引物对其进行扩增来获得，或mRNA通过逆转录形成cDNA，通过引物扩增cDNA获得对应的mRNA水平。
在本发明的一个实施方式中，mRNA通过逆转录形成cDNA，通过引物扩增cDNA获得对应的mRNA水平。
进一步地，所述核酸可以包括特异性扩增基因的引物。
进一步地，所述的引物为能够与核酸杂交并容许互补核酸聚合(一般通过提供游离的3’-OH基团)的单链多核苷酸。
进一步地，所述核酸还可包括特异性识别基因的探针。
进一步地，所述的探针为一段带有检测标记与目的基因(TMEM65基因)互补的多核苷酸序列。
进一步地，所述检测TMEM65基因mRNA表达水平的产品可以为试剂、试剂盒、试纸、基因芯片等，其可以包含能够结合TMEM65基因的核酸(例如特异性扩增TMEM65基因的引物和/或特异性识别TMEM65基因的探针)或将上述引物/探针制备于承载物上(如固相芯片)；检测TMEM65基因mRNA表达水平的产品也可以为高通量测序平台，其可以使用能够结合TMEM65基因的核酸(例如特异性扩增TMEM65基因的引物和/或特异性识别TMEM65基因的探针)针对TMEM65基因进行检测。
进一步地，所述检测TMEM65基因蛋白表达水平的产品可以包括能够结合TMEM65基因所表达的蛋白的物质(例如抗体或其片段)。
进一步地，所述检测TMEM65基因蛋白表达水平的产品可基于使用蛋白的已知方法来发挥其功能：例如，可以采用ELISA、放射免疫测定法、免疫组织化学法、Western印迹、蛋白质组学(例如抗体芯片、质谱(例如数据非依赖采集(Data Independent Acquision，DIA)质谱)等。
进一步地，所述检测TMEM65基因蛋白表达水平的产品可以包括特异性结合TMEM65基因所表达的蛋白的抗体或其片段。可以使用任何结构、尺寸、免疫球蛋白类别、起源等的抗体或其片段，只要它结合靶蛋白质即可。检测TMEM65基因蛋白表达水平的产品中所包括的抗体或其片段可以是单克隆的或多克隆的。抗体片段指保留抗体对抗原的结合活性的抗体一部分(部分片段)或含有抗体一部分的肽。抗体片段可以包括F(ab′)2、Fab′、Fab、单链Fv(scFv)、二硫化物键合的Fv(dsFv)或其聚合物、二聚化V区(双抗体)、或含有CDR的肽。检测基因蛋白表达水平的产品可以包括编码抗体或编码抗体片段的氨基酸序列的分离的核酸、包含该核酸的载体或携带该载体的细胞。抗体可以通过本领域技术人员公知的方法来获得，也可采用可用的市售产品。
进一步地，所述检测TMEM65基因蛋白表达水平的产品可以为试剂、试剂盒、试纸、基因芯片等，其可以包含能够结合TMEM65基因所表达的蛋白的物质(例如抗体或其片段)；检测TMEM65基因蛋白表达水平的产品也可以为仪器平台，其可以包含测量模块(用于测量待测样本中TMEM65基因所表达的蛋白的含量)，还可以包含分析模块(用于分析待测样本与参比样本中TMEM65基因所表达的蛋白的含量差异)。
进一步地，受试者为哺乳动物，特别是人类。
进一步地，样本可以使用例如自活检受试者获得的组织样品或流体，例如，组织、全血、血浆、血清、淋巴液、尿液、浆膜腔液、脊髓液、滑液、房水、泪液、唾液等或其级分或经过处理的材料；特别是，全血或其级分，优选为全血。
进一步地，所述应用为TMEM65作为标志物在制备预警心衰的产品中的应用。
本发明第二方面提供了TMEM65的基因表达诱导剂或蛋白激动剂在制备预防和/或治疗高原病的产品中的应用。
进一步地，所述TMEM65包括TMEM65基因和/或TMEM65蛋白。
进一步地，所述预防和/或治疗高原病的产品可以是药物组合物，所述的药物组合物可用于预防或治疗高原病。
进一步地，所述的TMEM65基因表达诱导剂可诱导TMEM65基因表达，提高其表达水平。
进一步地，所述的TMEM65蛋白激动剂可增强TMEM65蛋白分子活性。
进一步地，所述药物组合物包括TMEM65基因表达诱导剂和/或TMEM65蛋白激动剂。
进一步的，所述药物组合物还包括药学上可接受的辅料。
进一步的，所述的药学上可接受的辅料选自载体、赋形剂、稀释剂、润滑剂、润湿剂、乳化剂、防腐剂、抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、使制剂与接受者的血液等渗的溶质、悬浮剂、助悬剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂、甜味剂以及香料中的一种或两种以上的组合。
更进一步的，所述药学上可接受的辅料选自乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、细结晶纤维素、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油中的一种或两种以上的组合。
本发明第三方面提供了一种高原病的预警和/或诊断方法，其包括检测TMEM65的步骤。
进一步地，上述方法可包括如下步骤：
(1)获取受试者样本；
(2)检测受试者样本中TMEM65的基因或蛋白的表达水平；
(3)将测得的表达水平与受试者的患病与否或患病风险关联起来。
特别是，与正常对照相比，TMEM65的基因或蛋白的表达水平下降，则该受试者可被诊断为高原病或患高原病的风险高。需要说明的是，具体疾病风险、严重程度、预后情况，还需临床医生结合该受试者的其他检测指标综合评估。
进一步地，受试者为哺乳动物，特别是人类。
进一步地，样本可以使用例如自活检受试者获得的组织样品或流体，例如，组织、全血、血浆、血清、淋巴液、尿液、浆膜腔液、脊髓液、滑液、房水、泪液、唾液等或其级分或经过处理的材料；特别是，全血或其级分，优选为全血。
本发明第四方面提供了TMEM65作为标志物在制备预警和/或诊断心功能不全产品中的应用。
进一步地，所述应用为TMEM65作为标志物在制备预警心衰的产品中的应用。
进一步地，所述TMEM65包括TMEM65基因和/或TMEM65蛋白。
进一步地，所述预警心功能不全的产品包括检测TMEM65基因的mRNA表达水平或蛋白表达水平的产品。
进一步地，所述检测TMEM65基因的mRNA表达水平或蛋白表达水平的产品包括能够结合TMEM65基因的核酸或能够结合基因所表达的蛋白的物质。
进一步地，所述检测TMEM65基因mRNA表达水平的产品可基于使用核酸分子的已知方法来发挥其功能：例如，可以采用聚合酶链式反应(PCR)、Southern印迹杂交、Northern印迹杂交、点杂交、荧光原位杂交(FISH)、DNA微阵列、高通量测序平台、芯片检测等，特别是PCR方法，例如实时荧光定量PCR法、恒温扩增技术(滚环核酸扩增、环介导等温扩增、链替代扩增等)。使用该产品可以定性地、定量地、或半定量地实施分析。
进一步地，所述检测TMEM65基因mRNA表达水平的产品中所含的核酸可以通过化学合成来获得，或通过从生物材料制备含有所需核酸的基因，然后使用设计用于扩增所需核酸的引物对其进行扩增来获得，或mRNA通过逆转录形成cDNA，通过引物扩增cDNA获得对应的mRNA水平。
在本发明的一个实施方式中，mRNA通过逆转录形成cDNA，通过引物扩增cDNA获得对应的mRNA水平。
进一步地，所述核酸可以包括特异性扩增基因的引物。
进一步地，所述的引物为能够与核酸杂交并容许互补核酸聚合(一般通过提供游离的3’-OH基团)的单链多核苷酸。
进一步地，所述核酸还可包括特异性识别基因的探针。
进一步地，所述的探针为一段带有检测标记与目的基因(TMEM65基因)互补的多核苷酸序列。
进一步地，所述检测TMEM65基因mRNA表达水平的产品可以为试剂、试剂盒、试纸、基因芯片等，其可以包含能够结合基因的核酸(例如特异性扩增TMEM65基因的引物和/或特异性识别TMEM65基因的探针)或将上述引物/探针制备于承载物上(如固相芯片)；检测基因mRNA表达水平的产品也可以为高通量测序平台，其可以使用能够结合基因的核酸(例如特异性扩增TMEM65基因的引物和/或特异性识别TMEM65基因的探针)针对TMEM65基因进行检测。
进一步地，所述检测TMEM65基因蛋白表达水平的产品可以包括能够结合基因所表达的蛋白的物质(例如抗体或其片段)。
进一步地，所述检测TMEM65基因蛋白表达水平的产品可基于使用蛋白的已知方法来发挥其功能：例如，可以采用ELISA、放射免疫测定法、免疫组织化学法、Western印迹、蛋白质组学(例如抗体芯片、质谱(例如数据非依赖采集(Data Independent Acquision，DIA)质谱)等。
进一步地，所述检测TMEM65基因蛋白表达水平的产品可以包括特异性结合基因所表达的蛋白的抗体或其片段。可以使用任何结构、尺寸、免疫球蛋白类别、起源等的抗体或其片段，只要它结合靶蛋白质即可。检测基因蛋白表达水平的产品中所包括的抗体或其片段可以是单克隆的或多克隆的。抗体片段指保留抗体对抗原的结合活性的抗体一部分(部分片段)或含有抗体一部分的肽。抗体片段可以包括F(ab′)2、Fab′、Fab、单链Fv(scFv)、二硫化物键合的Fv(dsFv)或其聚合物、二聚化V区(双抗体)、或含有CDR的肽。检测基因蛋白表达水平的产品可以包括编码抗体或编码抗体片段的氨基酸序列的分离的核酸、包含该核酸的载体或携带该载体的细胞。抗体可以通过本领域技术人员公知的方法来获得，也可采用可用的市售产品。
进一步地，所述检测TMEM65基因蛋白表达水平的产品可以为试剂、试剂盒、试纸、基因芯片等，其可以包含能够结合TMEM65基因所表达的蛋白的物质(例如抗体或其片段)；检测TMEM65因蛋白表达水平的产品也可以为仪器平台，其可以包含测量模块(用于测量待测样本中TMEM65基因所表达的蛋白的含量)，还可以包含分析模块(用于分析待测样本与参比样本中TMEM65基因所表达的蛋白的含量差异)。
进一步地，受试者为哺乳动物，特别是人类。
进一步地，所述检测的样本可以使用例如自活检受试者获得的组织样品或流体，例如，组织、全血、血浆、血清、淋巴液、尿液、浆膜腔液、脊髓液、滑液、房水、泪液、唾液等或其级分或经过处理的材料；特别是，肺组织、全血或其级分，优选为全血。
本发明第五方面提供了TMEM65的基因表达诱导剂或蛋白激动剂在制备预防和/或治疗心功能不全的产品中的应用。
进一步地，所述应用为TMEM65的基因表达诱导剂或蛋白激动剂在制备预防和/或治疗心衰的产品中的应用。
进一步地，所述TMEM65包括TMEM65基因和/或TMEM65蛋白。
进一步地，所述预防和/或治疗心功能不全的产品可以是药物组合物，所述的药物组合物可用于预防或治疗心功能不全(如心衰)。
进一步地，所述的TMEM65基因表达诱导剂可诱导TMEM65基因表达，提高其表达水平。
进一步地，所述的TMEM65蛋白激动剂可增强TMEM65蛋白分子活性。
进一步地，所述药物组合物包括TMEM65基因表达诱导剂和/或TMEM65蛋白激动剂。
进一步的，所述药物组合物还包括药学上可接受的辅料。
进一步的，所述的药学上可接受的辅料选自载体、赋形剂、稀释剂、润滑剂、润湿剂、乳化剂、防腐剂、抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、使制剂与接受者的血液等渗的溶质、悬浮剂、助悬剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂、甜味剂以及香料中的一种或两种以上的组合。所述药学上可接受的辅料选自乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、细结晶纤维素、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油中的一种或两种以上的组合。
本发明第六方面提供了一种心功能不全的预警和/或诊断方法，其包括检测TMEM65的步骤。
进一步地，上述方法可包括如下步骤：
(1)获取受试者样本；
(2)检测受试者样本中TMEM65的基因或蛋白的表达水平；
(3)将测得的表达水平与受试者的患病与否或患病风险关联起来。
特别是，与正常对照相比，TMEM65的基因或蛋白的表达水平下降，则该受试者可被诊断为心功能不全或患心功能不全疾病的风险高。需要说明的是，具体疾病风险、严重程度、预后情况，还需临床医生结合该受试者的其他检测指标综合评估。
进一步地，受试者为哺乳动物，特别是人类。
进一步地，所述检测的样本可以使用例如自活检受试者获得的组织样品或流体，例如，组织、全血、血浆、血清、淋巴液、尿液、浆膜腔液、脊髓液、滑液、房水、泪液、唾液等或其级分或经过处理的材料；特别是，肺组织、全血或其级分，优选为全血。
进一步的，本发明中所述的高原病选自在高原环境下产生的急性高原病和慢性高原病中的一种，优选的，本发明中所述的高原环境为海拔3000～8000m(如3000m、3500m、4000m、4500m、5000m、5500m、6000m、6500m、7000m、7500m、8000m)，具有低压、缺氧的条件，进一步优选的，本发明中所述的高原环境为海拔4000～8000m，具有低压、缺氧的条件下。
进一步的，本发明中所述的高原病为慢性高原病。
进一步的，本发明中所述的高原环境为海拔5500m，具有低压、缺氧的条件下。
进一步的，本发明中所述的急性高原病包括但不限于高原昏迷、高原脑水肿、高原肺水肿、高原视网膜出血或脑肺异常症状同时存在的混合型疾病。
进一步的，本发明中所述的慢性高原病包括但不限于高原心脏病、高原红细胞增多症、高原高血压、高原低血压、高原心脏病、红细胞增多症同时存在的混合型疾病，优选的，所述的高原病为高原心肺及血管损伤；进一步优选的，所述的高原病为高原心脏病。
进一步的，本发明中所述的高原心脏病包括右心室肥厚、右心衰竭、肺动脉高压、右心室扩大、充血性或右心功能不全，优选的，所述高原病的临床表现选自头疼、头昏、心慌、心率加快、疲倦、胸闷、气短、呼吸加深、恶心、呕吐、失眠、乏力、眼花、嗜睡、食欲减退、抽搐、意识恍惚、手足麻木、唇指发绀、颜面水肿、四肢水肿或认知能力骤降中的一种或两种以上的组合。
进一步的，本发明中所述的心功能不全包括但不限于心脏扩大、心肌梗塞、心肌炎、心衰。
进一步地，本发明中所述的心衰是指射血分数降低性心衰(HFrEF，LVEF<40％)。
进一步的，本发明中所述的心功能不全的病因为各种引起心肌损伤的因素(心肌梗死、心肌病、心肌炎等)，导致心室舒缩功能与心脏泵血能力受损，包括但不限于心肌病变、心脏负荷过重、心室前负荷不足。
进一步的，本发明中所述的心肌病变包括原发性心肌损害和继发性心肌损害，其中原发性心肌损害包括心肌缺血(心肌梗死、冠状动脉弼样硬化心脏病)、炎症、免疫性反应(心肌炎、扩张性心肌病)、遗传病(肥厚型心肌病、心肌致密化不全)等引起的心肌损害，继发性心肌损害包括代谢性疾病(糖尿病、甲亢)、系统性浸润性疾病(心肌淀粉样变性)、结缔组织病、心肌毒性药物损害等引起的心肌损害。
进一步的，本发明中所述的心脏负荷过重包括压力负荷过大(见于高血压、肺动脉高压、主动脉瓣狭窄等疾病)或容量负荷过大(见于心脏瓣膜关闭不全、先天性心血管病、慢性贫血、甲亢等)。
进一步的，本发明中所述的心室前负荷不足包括二尖瓣狭窄、心脏压塞、限制性心包病、缩窄性心包炎。进一步的，本发明中所述的高原病选自在高原环境下产生的急性高原病和慢性高原病中的一种，优选的，本发明中所述的高原环境为海拔3000～8000m(如3000m、3500m、4000m、4500m、5000m、5500m、6000m、6500m、7000m、7500m、8000m)，具有低压、缺氧的条件，进一步优选的，所述的高原环境为海拔4000～8000m，具有低压、缺氧的条件下。
进一步的，本发明中所述的高原病为慢性高原病。
进一步的，本发明中所述的高原环境为海拔5500m，具有低压、缺氧的条件下。
进一步的，本发明中所述的急性高原病包括但不限于高原昏迷、高原脑水肿、高原肺水肿、高原视网膜出血或脑肺异常症状同时存在的混合型疾病。
进一步的，本发明中所述的慢性高原病包括但不限于高原心脏病、高原红细胞增多症、高原高血压、高原低血压、高原心脏病和红细胞增多症同时存在的混合型疾病，优选的，本发明中所述的高原病为高原心肺及血管损伤；进一步优选的，本发明中所述的高原病为高原心脏病。
进一步的，本发明中所述的高原心脏病包括右心室肥厚、右心衰竭、肺动脉高压、右心室扩大、充血性或右心功能不全，特别是肺动脉高压、右心室肥厚，优选的，所述高原病的临床表现选自头疼、头昏、心慌、心率加快、疲倦、胸闷、气短、呼吸加深、恶心、呕吐、失眠、乏力、眼花、嗜睡、食欲减退、抽搐、意识恍惚、手足麻木、唇指发绀、颜面水肿、四肢水肿或认知能力骤降中的一种或两种以上的组合。
本申请发现所述的TMEM65基因在高原病患者的肺动脉平滑肌细胞和全血中的表达量明显下降，当TMEM65基因在高原病患者体内过表达时可显著抑制高原低氧引起的肺动脉/心室压力升高和右室肥厚症状。本发明提供的以TMEM65作为标志物在制备预警和/或治疗高原病产品中的应用，可以方便快捷地在基因水平上实现对高原病的预警和诊断，以TMEM65为靶点的药物有望成为高原病靶向治疗的一种新手段。
附图说明
图1为大鼠左室、右室中TMEM65表达的变化。
图2为为人全血样本TMEM65表达的变化。
图3为TMEM65高表达抑制肺动脉压力升高。
图4为TMEM65高表达抑制右室肥厚的形成。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
实施例1
1、材料与仪器：
(1)动物
SD大鼠，250g左右，雄性，清洁级，购自北京维通利华实验动物有限公司，许可证号：SCXK(京)2016-0006。低压氧舱饲养，给予全价营养饲料喂食，室温22-25℃，湿度30％-50％。
(2)仪器
小动物低压氧舱(冰轮高压氧舱有限公司)；小动物呼吸机(kent scientific,美国)；多功能生理仪(Millar,美国)；小动物超声(Visual Sonics Inc,加拿大)；基因扩增仪(Biometra,Germany)；Q-PCR仪(Bio-Rad,USA)
2、实验方法
(1)动物指标检测方法
3％的戊巴比妥钠，0.2ml/100g腹腔注射麻醉大鼠，行超声检测。之后将大鼠仰卧位固定于手术台上，气管切管，连接呼吸机，开胸，暴露心脏，导管插入右心室，行右心导管检查。
(2)TMEM65基因表达量检测方法
吸出细胞培养基或动物组织块，将细胞/组织用冰冷的PBS清洗2遍，按照RNA提取试剂盒的要求提取RNA，并进行浓度测定。按照RNA逆转录试剂盒的要求，将RNA逆转录为cDNA，-80℃保存。将cDNA稀释10倍后，按照Q-PCR试剂盒的要求，建立20ul体系，设置标准反应模式和溶解曲线，运行程序。
(3)统计学方法
所有数据用x±s表示，组间比较为单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义，采用SPSS19.0软件包进行统计学处理。
3、实验设计
(1)动物实验设计
将40只大鼠随机分为2组，每组10只，其中1组置于实验舱中，调节舱内压力至380mmHg，模拟海拔5500米的高原环境，每天打开实验舱1小时，以便给动物添加饲料和水及给予相应的药物处理，同时保持大鼠所处的环境12:12小时昼夜交替，1组大鼠放在同一房间中常压常氧环境下饲养。
(2)人类参与者与样本获得
对于人体研究，招募参与者，并从中国人民解放军总医院采集了全血样本。血样保存在BD paxgene管中用于RNA提取。疾病人群的诊断基于根据症状或体征、心电图、胸片和超声心动图的标准指南。如果患者射血分数降低(LVEF<40％)，则他们被纳入疾病组。排除标准为恶性肿瘤、急性主动脉夹层、近期外伤、免疫性疾病、深静脉血栓形成，排除任何抗凝药物的混杂因素。体检正常，没有上述疾病的纳入正常组，即平原无疾病人群，正常组人数为20人。疾病组人群数目20人，临床诊断标准为LVEF<40％，有一半去过高原，一半未去过高原。
(3)TMEM65心脏特异性过表达大鼠试验设计
利用CRISPR-Cas9技术构建TMEM65过表达大鼠及Myh6-Cre鼠，通过杂交获得肺动脉平滑肌特异性过表达大鼠。他莫昔芬作为诱导剂，诱导TMEM65心脏特异性过表达动物模型的建成。另设野生组大鼠各14只，高原诱导肺动脉高压模型，取正常对照组大鼠6只。5500米的高原环境持续4周，可诱导高原右心室肥厚模型的建成。
4、实验结果
(1)TMEM65蛋白在高原病模型中特异性低表达
如图1所示，大鼠在低压低氧环境饲养28天后，模型组大鼠的左室、右室中TMEM65的表达显著下调，差异具有显著性(P＜0.05)。
(2)TMEM65在疾病组人全血中特异性低表达
如图2所示，受高原影响引起心室肥厚、心衰症状，此疾病组人群与正常组(平原无疾病)人群相比较，全血中TMEM65的表达显著下调，差异具有显著性(P＜0.05)。
(3)TMEM65高表达抑制右室肥厚的形成
在大鼠中建立TMEM65心脏特异性过表达模型，验证结果显示心脏组织中TMEM65高表达。在TMEM65心脏特异性过表达大鼠模型中进行右心室肥厚诱导实验，图3和图4的结果显示，过表达TMEM65在高原环境下明显减低肺动脉压力、右心指数等指标。
上述结果表明，TMEM65对高原环境引起的心室肥厚、心衰具有预警价值。高表达TMEM65能抑制右室肥厚等疾病的发生、发展。
Claims (15)
1.TMEM65作为标志物在制备预警和/或诊断高原病产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述预警和/或诊断高原病的产品包括检测TMEM65基因的mRNA表达水平或蛋白表达水平的产品。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述检测TMEM65基因的mRNA表达水平或蛋白表达水平的产品包括能够结合TMEM65基因的核酸或能够结合TMEM65基因所表达的蛋白的物质。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述检测基因mRNA表达水平的产品选自试剂、试剂盒、试纸、基因芯片和高通量测序平台中的一种或两种以上的组合，所述检测基因蛋白表达水平的产品选自试剂、试剂盒、试纸、基因芯片和仪器平台中的一种或两种以上的组合。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述检测的样本使用来自活检受试者获得的组织样品或流体，优选为全血。
6.TMEM65的基因表达诱导剂或蛋白激动剂在制备预防和/或治疗高原病的产品中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述预防和/或治疗高原病的产品包括药物组合物，所述药物组合物包括TMEM65基因表达诱导剂和/或TMEM65蛋白激动剂。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述药物组合物还包括药学上可接受的辅料。
9.根据权利要求1-5任一项所述的应用或权利要求6-8任一项所述的应用，其特征在于，所述的高原病选自在高原环境下产生的急性高原病和慢性高原病中的一种。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的急性高原病包括高原昏迷、高原脑水肿、高原肺水肿、高原视网膜出血或脑肺异常症状同时存在的混合型疾病，所述的慢性高原病包括高原心脏病、高原红细胞增多症、高原高血压、高原低血压、高原心脏病和红细胞增多症同时存在的混合型疾病，优选的，所述的高原病为高原心脏病，更优选的，所述的高原心脏病包括右心室肥厚、右心衰竭、肺动脉高压、右心室扩大、充血性或右心功能不全中的一种或多种。
11.TMEM65作为标志物在制备预警和/或诊断心功能不全产品中的应用。
12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，所述预警和/或诊断心功能不全的产品包括检测TMEM65基因的mRNA表达水平或蛋白表达水平的产品。
13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述检测TMEM65基因的mRNA表达水平或蛋白表达水平的产品包括能够结合TMEM65基因的核酸或能够结合TMEM65基因所表达的蛋白的物质。
14.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述检测基因mRNA表达水平的产品选自试剂、试剂盒、试纸、基因芯片和高通量测序平台中的一种或两种以上的组合，所述检测基因蛋白表达水平的产品选自试剂、试剂盒、试纸、基因芯片和仪器平台中的一种或两种以上的组合。
15.根据权利要求12所述应用，其特征在于，所述检测的样本使用来自活检受试者获得的组织样品或流体，优选为全血。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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