CN114657171A - 一种用于酶固定化的微型生物反应器及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种用于酶固定化的微型生物反应器及制备方法,方法包括:以含有酶及具有增稠作用的大分子水相溶液为第一内相,以植物基生物大分子溶液和凝胶剂的混合水相溶液为第二内相,以促凝胶剂和助表面活性剂在有机溶剂中的混合液为外相,通过微流控芯片制备得到尺寸均一的单分散乳液液滴,在收集液中得到微球,对微球表面进行处理,移除外相中的有机溶剂,获得包埋酶的核‑壳结构的水凝胶型生物反应器。本发明制备方法简单易行,反应条件要求低,生物反应器的尺寸、厚度及酶的固定量可以精准调控。本发明所制备的微型生物反应器能够将酶固定于内部空腔,形成微米级的生物反应器,可保护酶并提高其反应效率,在提高酶活性方面有良好的应用前景。
Description
技术领域:
本发明属于生物医用材料技术领域,具体涉及一种用于酶固定化的微型生物反应器及其制备方法。
背景技术:
酶是一类大分子生物催化剂,能够加快化学反应的速度。酶的应用非常广泛,与人类的生产和生活息息相关,从绿色化学品生产到疾病治疗。但是天然酶一般为蛋白质,对环境条件敏感并且易失活。因此,提高天然酶的稳定性和反应活性在扩展酶在绿色加工产业等应用方面具有十分重要的意义。
酶固定化是一种常用的提高天然酶稳定性及反应活性的方法。该方法利用物理或化学相互作用将酶固定于包埋体系中,保持酶结构的稳定,降低酶对环境的敏感度。但是目前已有的酶固定方法往往会导致酶的初始活性低于游离酶,而且无法对酶的包埋量进行精准控制。
在生物细胞中,酶促反应通常在球形的“核-壳”微室中进行,该方式能够保证酶能够以较高的活性进行反应。因此,受启发于这种自然界的酶固定化方法,本发明利用天然生物大分子形成仿生型的微胶囊结构,并将酶固定于微胶囊内,作为微型生物反应器。该特殊结构不仅可以高效地固定酶,并且可以显著提高酶的活性。
发明内容:
本发明的目的是针对现有技术的不足,提供一种用于酶固定化的微型生物反应器及其制备方法。
为实现上述技术目的,本发明采用以下技术方案:
一种用于酶固定化的微型生物反应器的制备方法,包括以下步骤:
S1、生成单分散性乳液液滴:搭建微流控芯片,以含有酶以及具有增稠作用的大分子水相溶液为第一内相,以植物基生物大分子溶液和凝胶剂的混合水相溶液为第二内相,以促凝胶剂和助表面活性剂在有机溶剂中的混合溶液为外相,通过微流控芯片制备得到尺寸均一的单分散乳液液滴。其中,单分散乳液液滴中,第一内相构成液滴内部的空腔,形成“核”结构,第二内相为包裹在第一内相外的“壳”结构;
S2、制备具有核-壳结构的水凝胶型生物反应器:将S1制备的单分散乳液液滴收集在固定容器中,通过微球的表面进行处理,移除外相中的有机溶剂,获得包埋酶的核-壳结构的水凝胶型生物反应器。
进一步的,S1中,所述第一内相为酶与羧甲基纤维素钠(CMC)/糊精的水溶液;第二内相为甲基化低甲氧基果胶(AP)与乙二胺四乙酸钙(Ca-EDTA)的水溶液。
进一步的,所述第一内相中,酶的浓度为1mg/mL,羧甲基纤维素钠(CMC)或糊精的浓度为10~20mg/mL。通过在10~20mg/mL范围内改变第一内相中羧甲基纤维素钠(CMC)或糊精的浓度,可调节聚合物微胶囊的形貌。
进一步的,所述第二内相中,甲基化低甲氧基果胶(AP)的浓度为20~60mg/mL,乙二胺四乙酸钙(Ca-EDTA)的浓度为10~100mM。通过在10~100mM范围内改变第二内相中乙二胺四乙酸钙(Ca-EDTA)的浓度,可调节聚合物微球的壳厚度及尺寸大小。
进一步的,S1中,所述外相中,助表面活性剂为聚甘油聚蓖麻醇酸酯(PGPR4175)或山梨醇酐油酸酯(Span 80),促凝胶剂为乙酸,有机溶剂为油相溶剂,具体为植物油或矿物油。
进一步的,所述外相中,助表面活性剂的浓度为30mg/mL,促凝胶剂的浓度为1mg/mL。
进一步的,S2中,将固定容器中得到乳液液滴依次经过己烷和水洗,并离心处理,以去除表面多余的有机溶剂,从而获得纯化的用于酶固定化的微型生物反应器。
进一步的,所述微流控芯片由经过疏水处理的聚二甲基硅氧烷(PDMS)模块、玻璃片和点样针头组装而成,所述聚二甲基硅氧烷模块上设置有微流道。
进一步的,所述聚二甲基硅氧烷模块上的微流道管径为50~100μm,通过改变内外相流速或内外相毛细管管径调节单分散性乳液液滴的粒径。
进一步的,所述固定容器选用塑料或玻璃制容器。
本发明还提供了采用上述方法制备得到的用于酶固定化的微型生物反应器,仿生型的包埋方式有助于提高酶的反应效率,从而本发明在提高酶活性方面有良好的应用前景。
本发明的有益效果:
(1)相对于传统酶包埋的方法,本发明的制备方法通过微流控芯片制备了一种核-壳结构的微胶囊,作为微米级生物反应器,依托微流控技术,采用微流控芯片进行液滴制备,通道简单、搭建步骤少,不需要复杂的机械加工过程,工艺简单;
(2)本发明利用天然生物大分子形成仿生型的微胶囊结构,并将酶固定于微胶囊内,作为微型生物反应器。该特殊结构不仅可以高效地固定酶,并且可以显著提高酶的活性。
附图说明:
图1为本发明实施例用于酶固定化的微型生物反应器制备流程图;其中,图a为高速相机观察到的微流控芯片通道内单分散性乳液液滴的实时生成图像,图b为单分散性乳液液滴的光镜图片,图c为将微反应器从单分散性乳液液滴中分离示意图;
图2为酶固定化微型反应器的微观结构及酶分布图,其中,图a为酶固定化微型反应器的激光共聚焦图,其中微型反应器呈核-壳结构;图b为在单个微型反应器的轴纵向上,酶的分布情况,其中酶均匀分布于反应器的内部壳部位;
图3为酶固定化微型反应器的酶促反应效率图,其中,a为反应前后微型反应器的显微镜图,由图可见微型反应器形貌未发生变化;b为游离酶、微型反应器固定酶和实心凝胶球固定酶的比酶活。
图4为酶固定后余留酶活性图。
具体实施方式:
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例是本发明的一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。下述实施例中所使用的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法,所用的试剂、方法和设备,如无特殊说明,均为本技术领域常规试剂、方法和设备。
本发明提供一种用于酶固定化的微型生物反应器的制备方法,包括以下步骤:
(1)生成单分散性乳液液滴:搭建微流控芯片,以含有酶以及具有增稠作用的大分子水相溶液为第一内相,第一内相构成液滴内部的空腔,形成“核”结构;以植物基生物大分子溶液和凝胶剂的混合水相溶液为第二内相,第二内相为包裹在第一内相外的“壳”结构;以促凝胶剂和助表面活性剂在油相溶剂中的混合溶液为外相,通过微流控芯片制备得到尺寸均一的单分散乳液液滴。
所述第一内相为酶与羧甲基纤维素钠(CMC)/糊精的水溶液;酶的浓度为1mg/mL,羧甲基纤维素钠(CMC)或糊精的浓度为10~20mg/mL。通过在10~20mg/mL范围内改变第一内相中羧甲基纤维素钠(CMC)或糊精的浓度,可调节聚合物微胶囊的形貌。
第二内相为甲基化低甲氧基果胶(AP)与乙二胺四乙酸钙(Ca-EDTA)的水溶液,甲基化低甲氧基果胶(AP)的浓度为20~60mg/mL,乙二胺四乙酸钙(Ca-EDTA)的浓度为10~100mM。通过在10~100mM范围内改变第二内相中乙二胺四乙酸钙(Ca-EDTA)的浓度,可调节聚合物微球的壳厚度及尺寸大小。
所述外相中,助表面活性剂为聚甘油聚蓖麻醇酸酯(PGPR 4175)或山梨醇酐油酸酯(Span 80),促凝胶剂为乙酸,有机溶剂为油相溶剂,具体为植物油或矿物油。所述外相中,助表面活性剂的浓度为30mg/mL,促凝胶剂的浓度为1mg/mL。
所述微流控芯片由经过疏水处理的聚二甲基硅氧烷(PDMS)模块、玻璃片和点样针头通过速干胶组装而成,所述聚二甲基硅氧烷模块上设置有微流道,微流道管径为50~100μm,可通过改变内外相流速或内外相毛细管管径调节单分散性乳液液滴的粒径。
(2)制备具有核-壳结构的水凝胶型生物反应器:将S1制备的单分散乳液液滴收集在塑料或玻璃制固定容器中,将乳液液滴依次经过己烷和水洗,并离心处理,以去外相中的有机溶剂,从而获得纯化的用于酶固定化的微型生物反应器。
实施例1
本发明实施例提供一种用于酶固定化的微型生物反应器,制备流程如图1所示,包括以下步骤:
(1)配制内外相溶液、收集液:
1.1)内水相1溶液:由羧甲基纤维素溶液组成;将羧甲基纤维素溶解于水中,形成20mg/mL的水溶液;将酶固体粉末溶解于羧甲基纤维素溶液中,配置成酶浓度为1mg/mL的水溶液。
1.2)内水相2溶液:由氨基化低甲氧基果胶(AP)和乙二胺四乙酸钙混合液组成,甲基化低甲氧基果胶的浓度为20mg/mL。
1.3)外相1溶液:由30mg/mL表面活性剂和植物油组成,选择聚甘油聚蓖麻醇酸酯(PGPR)作为表面活性剂,溶于植物油中配合而成。
1.4)外相2溶液:由30mg/mL表面活性剂,1mg/mL促凝胶剂和植物油组成,选择聚甘油聚蓖麻醇酸酯(PGPR)作为表面活性剂,并选择乙酸作为促凝胶剂,溶于植物油中配合而成。
(2)组装油包水(W/O)单乳液微流控芯片:利用软光刻法制备微流控芯片。首先将光刻胶以一定厚度附着于干净的硅片表面,随后利用紫外线辐照,将微流控芯片的管道设计通过透明的膜片转移至硅片上。当印有芯片管道的光刻胶凝固后,聚二甲基硅氧烷(PDMS)和凝胶剂以10:1的比例混合,覆盖于凝固的光刻胶表面,真空除气泡后,放置于65℃固定至少四小时。微流控的芯片由PDMS模块和玻璃片粘合组成;通道的疏水处理由表面疏水处理剂(Aquapel)完成。
(3)制备单分散性乳液液滴:
将内外相溶液抽取到相应规格的玻璃注射器中,并将其分别安放在蠕动泵上,玻璃注射器和O/W单乳液微流控芯片通过聚乙烯管连接,设定内外相流速,启动蠕动泵工作。在微流控通道内,当内外相流体相遇时,由于粘性力和界面张力的共同作用,内相流体被拉伸并最终断裂形成单分散性乳液液滴。
图1为制备核-壳结构微反应器的示意图,其中,图a为高速相机观察到的微流控芯片通道内单分散性乳液液滴的实时生成图像,图b为单分散性乳液液滴的光镜图片,图c为将微反应器从单分散性乳液液滴中分离示意图。由图1(a)可见,单分散性乳液液滴在上述W/O单乳液微流控芯片通道中生成,且单分散性乳液液滴尺寸均一。
(4)制备核-壳结构微型反应器:
将步骤(3)制备的尺寸均一的单分散性乳液液滴收集在离心管中,经过离心后,除去多余的外相。随后添加己烷,稍加震荡后,待液滴沉淀至离心管底部,除去多余的己烷。最后添加收集液(1mg/mL的氯化钙溶液),经过离心后,移去上部的废液,获得微型反应器。利用激光共聚焦显微镜观察核-壳结构微型反应器的结构实物图,如图2所示,果胶分子在钙离子的作用下形成凝胶,成为反应器的“壳”,羧甲基纤维素溶液作为内相填充物,成为反应器的“核”。酶均匀分散于微型反应器内部。
(5)测定用于酶固定化的微型反应器的活性:
将步骤(4)获得的酶固定化微型反应器,放置于含有酶反应底物的溶液中,反应一段时间后,取出反应溶液进行分析测定。图3为酶固定化微型反应器的酶促反应效率图,其中,a为反应前后微型反应器的显微镜图,由图可见微型反应器形貌未发生变化;b为游离酶、微型反应器固定酶和实心凝胶球固定酶的比酶活,如图3b所示,相比于游离酶,酶固定化微型反应器的酶反应效率提高约50%;此外相比于实心凝胶球固定酶,本实施例中的微型反应器的核-壳结构显著得提高了酶的反应速率。
图4为酶固定后余留酶活性图,由图4可以看出,相比于现有技术中的酶固定材料(层-层吸附式微胶囊,3D打印水凝胶和金属有机框架材料),本实施例所制备的微型反应器可以在固定后显著提高原有的酶活性。
以上仅是本发明的优选实施方式,本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例,凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰,应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种用于酶固定化的微型生物反应器的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1、生成单分散性乳液液滴:搭建微流控芯片,以含有酶以及具有增稠作用的大分子水相溶液为第一内相,以植物基生物大分子溶液和凝胶剂的混合水相溶液为第二内相,以促凝胶剂和助表面活性剂在有机溶剂中的混合溶液为外相,通过微流控芯片制备得到尺寸均一的单分散乳液液滴;
S2、制备具有核-壳结构的水凝胶型生物反应器:将S1制备的单分散乳液液滴收集在固定容器中,通过对微球的表面进行处理,移除外相中的有机溶剂,获得包埋酶的核-壳结构的水凝胶型生物反应器。
2.根据权利要求1所述的用于酶固定化的微型生物反应器的制备方法,其特征在于,S1中,所述第一内相为酶与羧甲基纤维素钠/糊精的水溶液;第二内相为甲基化低甲氧基果胶与乙二胺四乙酸钙的水溶液。
3.根据权利要求2所述的用于酶固定化的微型生物反应器的制备方法,其特征在于,所述第一内相中,酶的浓度为1mg/mL,羧甲基纤维素钠(CMC)或糊精的浓度为10~20mg/mL。
4.根据权利要求2所述的用于酶固定化的微型生物反应器的制备方法,其特征在于,所述第二内相中,甲基化低甲氧基果胶的浓度为20~60mg/mL,乙二胺四乙酸钙的浓度为10~100mM。
5.根据权利要求1所述的用于酶固定化的微型生物反应器的制备方法,其特征在于,S1中,所述外相中,助表面活性剂为聚甘油聚蓖麻醇酸酯或山梨醇酐油酸酯,促凝胶剂为乙酸,有机溶剂为植物油或矿物油。
6.根据权利要求5所述的用于酶固定化的微型生物反应器的制备方法,其特征在于,所述外相中,助表面活性剂的浓度为30mg/mL,促凝胶剂的浓度为1mg/mL。
7.根据权利要求1所述的用于酶固定化的微型生物反应器的制备方法,其特征在于,S2中,将固定容器中得到乳液液滴依次经过己烷和水洗,并离心处理,以去除表面多余的有机溶剂,从而获得纯化的用于酶固定化的微型生物反应器。
8.根据权利要求1所述的用于酶固定化的微型生物反应器的制备方法,其特征在于,所述微流控芯片由经过疏水处理的聚二甲基硅氧烷模块、玻璃片和点样针头组装而成,所述聚二甲基硅氧烷模块上设置有微流道。
9.根据权利要求8所述的用于酶固定化的微型生物反应器的制备方法,其特征在于,所述聚二甲基硅氧烷模块上的微流道管径为50~100μm,通过改变内外相流速或内外相毛细管管径调节单分散性乳液液滴的粒径。
10.一种用于酶固定化的微型生物反应器,其特征在于,采用权利要求1~8任一项所述的制备方法制备得到。
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