CN114657118A - 一种2bs细胞在生物反应器内的多倍放大方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种2BS细胞在生物反应器内的多倍放大方法。包括：S01，种子细胞的制备：用转瓶培养2BS种子细胞，长成致密单层后消化并做成细胞悬浮液，接种到一级生物反应器内贴壁培养，获得2BS种子细胞；S02，在线多倍数放大：2BS种子细胞在生物反应器的微载体上长成致密单层，用灭菌PBS清洗微载体，将载体洗透白，去除培养液和血清；调节pH值和温度，加入胰酶与微载体充分混合，消化后加入含血清培养基终止消化，接种到二级生物反应物器中，补加培养液进行细胞培养以放大2BS细胞。通过上述培养方法使2BS的贴壁率高达95%以上，突破了2BS细胞在Cytodex1微载体上贴壁率不高容易脱落的技术门槛。
Description
技术领域
本发明涉及护肤领域，尤其是涉及一种2BS细胞在生物反应器内的多倍放大方法。
背景技术
人二倍体细胞是世界卫生组织认可的更安全的疫苗生产用细胞基质，已成为全世界疫苗生产首选的细胞基质。由于人二倍体细胞与人类基因组相同、无外源因子、对多种病毒易感性、无潜在致瘤性、所制备的人二倍体疫苗( human diploid cell vaccine，HDCV)具有良好的免疫原性和安全性，适合于疫苗的工业化生产。当前，人群中使用的灭活疫苗、减毒疫苗或亚单位疫苗等均依赖于原代细胞、传代细胞和人二倍体细胞，其中用于疫苗制备的人二倍体细胞主要有 WI-38、MＲC-5、2BS 和KMB-17 等细胞系。
由于2BS细胞对多种病毒具有敏感性，因此也作为细胞基质被应用于许多病毒性疫苗的研究开发。我国自主研制的二倍体细胞2BS株来源于人胚肺细胞，因其无致癌性、无外源因子污染，且细胞性状比较稳定，越来越多地在人用疫苗研发与生产中使用。目前，用这两种人二倍体细胞生产的疫苗，包括甲型肝炎疫苗、脊髓灰质炎疫苗和肠道病毒71型灭活疫苗等，已在我国广泛上市。
传统的细胞大规模培养方法大多是利用不同容量的玻璃转瓶，其缺点是单位体积提供细胞生长的表面积小、细胞生长密度低、瓶间差异较难控制、易于污染、劳动强度高、占用空间和能源消耗大。因此，还需进一步改进。
发明内容
一种2BS细胞在生物反应器内的多倍放大方法，利用生物反应器，以细胞微载体悬浮培养，包括以下步骤：
S01，种子细胞的制备：用转瓶培养2BS种子细胞，长成致密单层后消化并做成细胞悬浮液，之后接种到含有培养液与微载体的一级生物反应器内贴壁培养，获得2BS种子细胞；
其中，贴壁培养参数：溶氧值D0：40-60、pH值6.8-7.0、温度30-40℃、O2的通入量0.1-0.3L/min、CO2的通入量0.1-0.3L/min和Air的通入量0.1-0.3L/min；
持续24h后，改成细胞培养参数：DO溶氧值40-60、pH值7.2-7.5、温度30-40℃、O2的通入量0.1-0.3L/min、CO2的通入量0.1-0.3L/min、Air的通入量0.1-0.3L/min、灌流换液量为4000-6000mL/day；
S02，在线多倍数放大：2BS种子细胞在生物反应器的微载体上长成致密单层，用灭菌PBS清洗微载体，所述无菌PBS的pH值为7.6-7.8。
将载体洗透白，去除培养液和血清；
所述在线放大的参数：溶氧值DO50、pH值7.6-7.8、温度30-40℃、转速50-100r/min、O2的通入量0.1-0.3L/min、CO2的通入量0.1-0.3L/min、Air的通入量0.1-0.3L/min。
调节pH值7.0-7.5、温度35-40℃，开启搅拌，加入胰酶，所述胰酶在2BS细胞液中的质量浓度为0.01%-0.025%，与微载体充分混合，消化3-5min后加入含血清培养基终止消化，将消化后的2BS细胞接种到二级生物反应物器中，补加培养液到生物反应器的培养体积进行细胞培养以放大2BS细胞。
在使用生物反应器内对2BS放大时方法时发现，2BS细胞在Cytodex1微载体上的贴壁率不高，容易脱落，不容易培养，在生物反应器里培养没有在方瓶上培养好。细胞从微载体上消化下来后，很难重新在微载体上贴壁，即使在微载体上贴壁了，细胞也几乎不生长，几天后细胞便出现凋亡，2BS细胞在微载体上放大存在技术门槛。
通过本申请的完整方案，用转瓶培养种子细胞，长成致密单层后，消化下来做成细胞悬浮液接种到含有培养液与微载体的生物反应器内。调节培养参数，通过反应器自动控制，给予细胞足够的养分和适宜的气体环境使到细胞在最适合的环境中生长达到最佳状态，让细胞数不断增加达到增殖峰值。从传代到消化最后到放大，调配合适的参数、pH值来消化微载体上的细胞，同时能够在短时间内将微载体上的细胞消化，减少了对细胞膜的损伤，有利于2BS细胞的贴附、实现高密度生长。另外，胰酶的浓度对细胞的消化十分重要，浓度如果太低，2BS细胞不能得到充分的消化，但高的浓度对于细胞本身也造成很大的损坏，造成贴壁效果不好的问题。在本申请的培养体系中，调配0.01%-0.025%的胰酶浓度来消化微载体上的细胞，能够在短时间（3-5min）将微载体上的细胞消化下来，减少了对细胞膜的损伤，不影响细胞的贴壁生长，加上利用上述贴壁工艺培养技术使细胞能在微载体消化后能够再次贴壁生长，提高了2BS细胞在Cytodex1微载体上的贴壁率。如此解决在Cytodex1微载体上贴壁率不高容易脱落的问题。
优选的，所述S01中，生物反应器调好贴壁培养参数，在30-40r/min的转速下搅拌24h以上，前3-5h搅拌3-6min，停10-15min；24h之后调整成细胞培养参数，转速50-60r/min，培养45-48h。
利用贴壁过程中动态和静态反复交替培养技术使细胞能在微载体消化后能够再次贴壁生长，接种后又通过合适的搅拌速度让细胞微载体和细胞充分接触，停止搅拌让细胞静止状态下更容易吸附在微载体上，进一步提高了细胞在生物反应器中的贴壁率。
优选的，所述S02中，当微载体上的2BS细胞的脱落80-90%且密度达到200-260cells/球时，用灭菌PBS清洗微载体进行后续的在线放大操作。
选择合适的细胞接种密度，能够最大化利用微载体与培养基中的营养物质实现细胞的较优生长。
优选的，所述生物反应器是通过搅拌桨叶进行搅拌，所述搅拌桨叶是由2个以上的斜面度数为40-50°的斜桨叶组成。
配备的低剪切力搅拌桨叶，能够在不损伤细胞的情况下对培养物进行柔和混匀，减少了细胞的受损率，降低了细胞放大的成本。
优选的，将2BS细胞接种到所述二级生物反应器中，贴壁培养参数和细胞培养参数与在所述一级生物反应器中参数一致，调整所述二级生物反应器的灌流换液量为20000-30000mL/day。
通过控制灌流换液量有助于带走代谢废物，改善细胞培养环境，增加细胞生长所需营养，使2BS细胞贴壁得生长更好。
优选的，所述培养液为有效成分为90-99%的MEM培养基，所述血清为在2BS细胞液中质量浓度为1-10%的牛血清，加在2BS细胞液中质量浓度为0.2-0.5%谷氨酰胺，pH值为6.5-8.0。
在细胞培养中，谷氨酰胺缺乏会导致细胞生长不良甚至死亡。在本申请的2BS细胞液中加入pH值为6.5-8.0，在2BS细胞液中质量浓度为0.2-0.5%谷氨酰胺，再配合有效成分为90-99%的MEM培养基、在2BS细胞液中质量浓度为1-10%的牛血清使得2BS在培养过程中更有活力地增殖生长，从而进一步提高了2BS细胞的贴壁率。
优选的，所述S01中的微载体上的2BS种子细胞接种量为0.65-1.29×108cells/g，每1L培养培养液添加5-8g微载体。
优选的，所述S01中的2BS细胞在一级生物反应器内多倍放大时微载体上的细胞密度为1-2.61×108cells/g。
控制细胞贴壁的基本因素是电荷密度而不是电荷性质。微载体的表面电荷电荷密度太低，细胞贴附不充分，但电荷密度过大，反而会产生“毒性”效应。通过发明人深入研究发现，选择上述特定的微载体上的细胞密度，不同时期的细胞密度进行调整，使2BS细胞能够更好地贴壁生长，提高了2BS细胞的贴壁率。
优选的，所述S02中加入血清中止胰酶消化作用后，提升搅拌的转速至70-80r/min。
2BS细胞在传代消化后很容易成团，通过提升转速同时又不破坏细胞，控制在70-80r/min，让细胞充分分散，减少团块的出现，进一步提高了细胞的贴壁率。
优选的，所述二级生物反应器包括罐体和安装在罐体内部的吸液器，所述吸液器伸出所述二级生物反应器的一端连接有观察器，所述观察器结合电子显微镜以观察到细胞形态。
由于细胞消化过程很快，不及时观察会使2BS细胞超出消化程度而凋亡，凋亡后的2BS细胞不能再进行后续的实验，因此，2BS细胞的消化过程的观察显得尤为重要。本申请通过生物反应器中的2BS细胞通过吸液器运输至透明细胞观察器中，结合电子显微镜，可以轻松地观察到细胞形态，从而指导整个微载体消化过程。观察完成后，细胞可原路返回。整个过程细胞无需脱离无菌环境，极大地增加了细胞观察的安全性和便利性。
综上所述，通过本申请的完整方案，用转瓶培养种子细胞，长成致密单层后，消化下来做成细胞悬浮液接种到含有培养液与微载体的生物反应器内。调节培养参数，通过反应器自动控制，给予细胞足够的养分和适宜的气体环境使到细胞在最适合的环境中生长达到最佳状态，让细胞数不断增加达到增殖峰值。从传代到消化最后到放大，调配合适的参数、pH值来消化微载体上的细胞，同时能够在短时间内将微载体上的细胞消化，减少了对细胞膜的损伤，如此解决在Cytodex1微载体上贴壁率不高容易脱落的问题。
附图说明
图1是用于展示实施例1中具有在线细胞观测功能的细胞罐的整体结构示意图。
图2是用于展示实施例2中的搅拌桨叶的俯视图。
图3是实施例2中的种子细胞图。
图4（a）是实施例2中2BS细胞在Cytodex1微载体上生长24h的生长状态图。
图4（b）是实施例2中2BS细胞在Cytodex1微载体上生长72h的生长状态图。
图5是实施例2中2BS细胞在7L细胞罐原罐放大细胞消化情况状态图。
图6（a）是实施例2中2BS细胞在7L细胞罐原罐细胞贴壁生长24h的状态。
图6（b）是实施例2中2BS细胞在7L细胞罐原罐细胞贴壁生长72h的状态。
图7是实施例2中2BS细胞在7L细胞罐原罐的增殖曲线图，横坐标代表细胞生长时间h，纵坐标代表2BS细胞的个数。
附图标记说明：1、罐体；12、搅拌装置；121、搅拌轴；122、搅拌桨叶；123、电机；13、吸液器；14、观察器；15、电子显微镜。
具体实施方式
实施例1
本实施例公开一种具有在线细胞观测功能的细胞罐（生物反应器），参照图1，包括密封的罐体1和安装在罐体1内部的搅拌装置12，搅拌装置12包括垂直于罐体1底部的搅拌轴121和靠近罐体1底部的搅拌桨叶122，搅拌轴121远离罐底的一端与电机123的转轴固定连接。搅拌桨叶122为两个对称分布的斜桨叶，其他实施例也可为3个、4个……等，斜桨叶远离罐体1底部的平面与搅拌轴121呈45°角。罐体1内部还安装有吸液器13，吸液器13的动力源为一微型泵，吸液器13伸出细胞罐的一端与导管相连接，导管的另一端连接有观察器14。观察器14为圆柱体，观察器14安装于电子显微镜15的底座上，观察器14的侧壁和底部均为不锈钢材质，导管连接于观察器14的侧壁上的进液端，观察器14远离电子显微镜15底座的端为透明玻璃且物镜连接以观察细胞形态。观察完细胞状态后成后，控制吸液器13使细胞原路返回细胞罐中。
实施例2
本实施例公开一种2BS细胞在生物反应器内的多倍放大方法，利用实施例1的细胞罐，以细胞微载体悬浮培养：
S01，种子细胞的制备：用5L的转瓶，培养体积为2L，接种细胞密度为3-5x105个/mL培养2BS种子细胞（2BS种子细胞状态见图1），长成致密单层后加入100mL质量浓度为0.25%胰酶，在37℃的温度下消化3min做成2BS细胞悬浮液。之后接种入含有培养液（日本MEM培养基）和微载体（美国GE Healthcare公司的Cytodex1微载体）的7L细胞罐（一级生物反应器）中，培养体积5L，载体量为3g/L。灌流换液量为5000mL/day，设置贴壁培养参数：DO溶氧值50、pH值7.2、温度37℃、转速：40r/min、O2通入流量0.2L/min、CO2通入流量0.2L/min、Air通入流量0.2L/min。
前4个小时，搅拌开5分钟，停10分钟，24h后搅拌改为50r/min。在进行后续实验前，确认细胞能在微载体贴壁生长、细胞状态较好、细胞膜透亮、上清液无明显细胞碎片且细胞生长曲线（见图7）正常。细胞培养24h后，取样观察细胞贴壁情况，见图4（a）。
收集到的培养上清做细胞计数，按以下公式计算细胞贴壁率：
细胞贴壁率= 
经测试培养24小时细胞贴壁率达到95%以上。
细胞培养48h后，取样观察细胞状态，见图4（b），并用结晶紫染色计数，然后再取样品进行消化放大前预实验：根据自身需求，将样品分成N等份，每一份体积为20mL，用PBS清洗3次（注：清洗时微载体上的细胞是否有脱落），加入胰酶后（胰酶在细胞液中的质量浓度为0.02%，加入前先将胰酶配置成液体以便于更好地溶解在细胞液中）开始计时，并立即放在37℃水浴锅中摇匀，每隔1分钟左右取样观察细胞消化状态。当载体上的细胞有60%左右脱落后，立即加入10%牛血清的培养液终止，把消化后的细胞接入方瓶培养，发现细胞能够正常贴壁生长，图5中7L细胞罐原罐放大细胞加入胰酶后细胞正常皱缩变圆，说明胰酶的添加比例适合用于消化放大。
S02：待细胞长满单层，并且细胞数量能够达到要求的放大倍数，本实施例中的放大倍数为3倍，则可以进行正式在线放大。先停搅拌，待长满2BS细胞的微载体沉在罐体底部后，把上清液排走。加入3L无菌PBS(pH7.7±0.1)，开搅拌60r/min，将微载体搅拌均匀后，停搅拌。待长满2BS细胞的微载体都沉在罐体底部后，把上清液排走，重复上述操作清洗3次。
第3次排液前，先把温度调到37℃左右，pH值调到7.6左右。把无菌的在线细胞观察装置连到细胞罐的吸液器的出液管道上，然后将预热到37℃的无菌胰蛋白酶（浓度为0.25%不含EDTA）按照1：2的浓度加入到7L细胞罐里，同时开启搅拌速度为50r/min，每隔1分钟，使用在线细胞观察装置观察细胞消化情况。5分钟后，微载体上有90%的细胞已径脱落，2BS细胞密度达到密度达到200cells/球时，加入1L含10%FBS的培养液终止胰蛋白酶的消化作用，同时把转速调到80r/min，让细胞充分分散，避免团块的出现。
将消化后的2BS细胞液接种至75L的细胞罐（二级生物反应器）中，按照3倍放大系数，加入30g美国GE Healthcare公司的Cytodex1微载体同时补培养液到25L的培养体积。75L细胞罐的灌流换液量为25000mL/day，设置培养参数：DO溶氧值50、pH值7.7、温度37℃、转速40r/min、O2通入流量0.2L/min、CO2通入流量0.2L/min、Air通入流量0.2L/min，前4个小时，搅拌开5分钟，停10分钟，24h后搅拌改为50r/min。
细胞培养24h后，取样观察2BS细胞贴壁情况见图6（a），48h后，取样观察2BS细胞贴壁情况见图6（b）。
同时收集到的培养上清做细胞计数，按以下公式计算细胞贴壁率：
细胞贴壁率=
。
经测试培养24小时细胞贴壁率达到95%，48h后的贴壁率为95%。
实施例3
与实施例2的区别在于：
S01中，贴壁培养参数： D0溶氧值40、pH值6.8、温度30℃、O2的通入流量0.1L/min、CO2的通入流量0.1 L/min和Air的通入流量 0.1 L/min。
细胞培养参数：DO溶氧值40、pH值7.2、温度30℃、O2的通入流量0.1L/min、CO2的通入流量0.1 L/min和Air的通入流量 0.1 L/min、灌流换液量为4000mL/day。
生物反应器调好贴壁培养参数，在30r/min的转速下搅拌24h，前3h搅拌3min，停10min；24h之后调整成细胞培养参数，转速50r/min，培养48h。
S02中，胰酶在细胞液中的质量浓度为0.01%，当微载体上的2BS细胞的脱落80%且密度达到200cells/球后放大培养，75L细胞罐的灌流换液量为20000mL/day。
在线放大的参数：溶氧值DO50、pH值7.6、温度30℃、转速50r/min， O2的通入流量0.1L/min、CO2的通入流量0.1 L/min和Air的通入流量 0.1 L/min。
实施例3中2BS细胞在7L细胞罐中24h后的贴壁率为95%，在75L细胞罐中48h后的贴壁率为95%。
实施例4
与实施例2的区别在于：
S01中，贴壁培养参数： D0溶氧值60、pH值7.0、温度40℃、O2的通入流量0.3L/min、CO2的通入流量0.3L/min和Air的通入流量 0.3L/min。
细胞培养参数：DO溶氧值60、pH值7.5、温度30℃、O2的通入流量0.3L/min、CO2的通入流量0.3 L/min和Air的通入流量 0.3/min、灌流换液量为6000mL/day。
生物反应器调好贴壁培养参数，在40r/min的转速下搅拌24h，前5h搅拌6min，停15min；24h之后调整成细胞培养参数，转速60r/min，培养48h。
S02中，胰酶在细胞液中的质量浓度为0.025%，当微载体上的2BS细胞的脱落90%且密度达到260cells/球后放大培养，75L细胞罐的灌流换液量为30000mL/day。
在线放大的参数：DO溶氧值60、pH值7.8、温度40℃、转速100r/min， O2的通入流量0.3L/min、CO2的通入流量0.3 L/min和Air的通入流量 0.3 L/min。
培养液中加培养液总量0.3%谷氨酰胺，pH值为7.5。
实施例4中2BS细胞在7L细胞罐中24h后的贴壁率为95%，在75L细胞罐中24h后的贴壁率为95%。
本具体实施例仅仅是对本申请的较佳效果的方案举例说明，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。
Claims (10)
1.一种2BS细胞在生物反应器内的多倍放大方法，其特征在于：利用生物反应器，以细胞微载体悬浮培养，包括以下步骤：
S01，种子细胞的制备：用转瓶培养2BS种子细胞，长成致密单层后消化并做成细胞悬浮液，之后接种到含有培养液与微载体的一级生物反应器内贴壁培养，获得2BS种子细胞；
其中，贴壁培养参数：溶氧值D0：40-60、pH值6.8-7.0、温度30-40℃、O2的通入量0.1-0.3L/min、CO2的通入量0.1-0.3L/min和Air的通入量0.1-0.3L/min；
持续24h后，改成细胞培养参数：DO溶氧值40-60、pH值7.2-7.5、温度30-40℃、O2的通入量0.1-0.3L/min、CO2的通入量0.1-0.3L/min、Air的通入量0.1-0.3L/min、灌流换液量为4000-6000mL/day；
S02，在线多倍数放大：2BS种子细胞在生物反应器的微载体上长成致密单层，用灭菌PBS清洗微载体，将载体洗透白，去除培养液和血清；
所述在线放大的参数：溶氧值DO40-60、pH值7.6-7.8、温度30-40℃、转速50-100r/min、O2的通入量0.1-0.3L/min、CO2的通入量0.1-0.3L/min、Air的通入量0.1-0.3L/min；
调节pH值7.0-7.5、温度35-40℃，开启搅拌，加入胰酶，所述胰酶在2BS细胞液中的质量浓度为0.01%-0.025%，与微载体充分混合，消化3-5min后加入含血清培养基终止消化，将消化后的2BS细胞接种到二级生物反应物器中，补加培养液到生物反应器的培养体积进行细胞培养以放大2BS细胞。
2.根据权利要求1所述的一种2BS细胞在生物反应器内的多倍放大方法，其特征在于：所述S01和SO2中，生物反应器调好贴壁培养参数，在30-40r/min的转速下搅拌24h以上，前3-5h搅拌3-6min，停10-15min；24h之后调整成细胞培养参数，转速50-60r/min，培养45-48h。
3.根据权利要求1所述的一种2BS细胞在生物反应器内的多倍放大方法，其特征在于：所述S02中，当微载体上的2BS细胞的脱落80-90%且密度达到200-260cells/球时，用灭菌PBS清洗微载体进行后续的在线放大操作，所述无菌PBS的pH值为7.6-7.8。
4.根据权利要求1-3任一所述的一种2BS细胞在生物反应器内的多倍放大方法，其特征在于：所述搅拌桨叶是由2个以上的斜面度数为40-50°的斜桨叶组成。
5.根据权利要求1-3任一所述的一种2BS细胞在生物反应器内的多倍放大方法，其特征在于：将2BS细胞接种到所述二级生物反应器中，贴壁培养参数和细胞培养参数与在所述一级生物反应器中参数一致，调整所述二级生物反应器的灌流换液量为20000-30000mL/day。
6.根据权利要求1-3任一所述的一种2BS细胞在生物反应器内的多倍放大方法，其特征在于：所述培养液为有效成分为90-99%的MEM培养基，所述血清为在2BS细胞液中质量浓度为1-10%的牛血清，所述微载体为葡聚糖，加在2BS细胞液中质量浓度为0.2-0.5%谷氨酰胺，pH值为6.5-8.0。
7.根据权利要求1-3任一所述的一种2BS细胞在生物反应器内的多倍放大方法，其特征在于：所述S01中的微载体上的2BS种子细胞接种量为0.65-1.29×108cells/g，每1L培养培养液添加5-8g微载体。
8.根据权利要求1-3任一所述的一种2BS细胞在生物反应器内的多倍放大方法，其特征在于：所述S02中的2BS细胞在一级生物反应器内多倍放大时微载体上的细胞密度为1-2.61×108cells/g。
9.根据权利要求1-3任一所述的一种2BS细胞在生物反应器内的多倍放大方法，其特征在于：所述S02中加入血清中止胰酶消化作用后，提升搅拌的转速至70-80r/min。
10.根据权利要求1-3任一所述的一种2BS细胞在生物反应器内的多倍放大方法，其特征在于：所述二级生物反应器包括罐体(1)和安装在罐体(1)内部的吸液器(13)，所述吸液器(13)伸出所述二级生物反应器的一端连接有观察器(14)，所述观察器(14)结合电子显微镜(15)以观察到细胞形态。
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