CN114656551A - 一种去除双特异性或复杂构型抗体宿主细胞蛋白残留的亲和纯化工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种降低双特异性抗体(含有Fc功能结构域)生产宿主细胞蛋白(HCP)含量的亲和纯化工艺。本发明的工艺能够有效地、显著地降低HCP含量，且适用范围广，还可用于含Fc域(IgG‑like)双特异性或复杂构型抗体类蛋白质，从而为有效降低抗体类药物中HCP的含量提供技术支持。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种有效去除含Fc功能结构域双特异性或复杂构型抗体宿主细胞蛋白的亲和纯化工艺。
背景技术
双特异性抗体(bispecific antibody，BsAb)是指含有两种特异性抗原结合位点的人工抗体(不同类型双特异性抗体示意图见图1)，可以同时与靶细胞和功能细胞进行相互作用，进而增强肿瘤细胞杀伤功能。来源于宿主细胞的内源性蛋白称为宿主细胞蛋白(HCP)。宿主蛋白的存在会诱发机体的免疫反应，除了安全问题，宿主蛋白的存在对抗体蛋白样品的稳定性带来不利影响，如HCP的存在可以触发治疗蛋白的聚集或分裂。因此，在抗体类药物制备过程中，必须严格控制HCP的含量。
在双特异性抗体纯化工艺中蛋白A亲和层析是去除HCP的重要手段。传统亲和工艺通过降低pH(如pH 4.5-5.5)并增加NaCl浓度等方法来进行中间洗杂，这种方式能有效去除与亲和填料非特异性结合的HCP，但是这种条件下的中间洗杂很难打破Ab-HCP的结合作用。而且继续降低pH的洗杂方式会使一部分目的蛋白一同被清洗下去，从而影响整体纯化收率。因此，有待开发一种去有效除双特异性构型抗体宿主细胞蛋白残留的亲和纯化工艺。
发明内容
本发明提供了一种去除双特异性或复杂构型抗体宿主细胞蛋白(HCP)残留的亲和纯化工艺。
本发明的发明人发现：1)通过在淋洗步骤中提高淋洗缓冲液pH，与传统工艺相比去除HCP的效果提高8％；2)此外，在淋洗步骤中进一步添加清洗添加剂，如尿素、异丙醇、吐温20、吐温80或精氨酸中的至少一种作为淋洗过程中的添加剂，可以进一步加强HCP的分离去除效果，并提高亲和纯化工艺对HCP去除效率50％以上，同时将洗杂步骤对收率的影响仅降低3～5％。
本发明的亲和纯化工艺能够在提高抗体类药物制备过程中亲和层析工艺去除HCP的效率的同时提高亲和层析样品回收率。这为含有Fc功能结构域的双特异性分子或复杂构型抗体类药物亲和纯化工艺提供更加可靠的选择。
具体地，本发明的亲和纯化工艺，包括以下步骤：
任选地，用平衡缓冲液预处理层析柱(步骤1)；
将抗体原液(包含抗体和宿主细胞蛋白的物料)加载到层析柱上(步骤2)；
任选地，用平衡缓冲液淋洗层析柱(步骤3)；
用pH值比抗体等电点高的第一淋洗缓冲液淋洗层析柱(步骤4a)；
任选地，用pH值在3.0～9.0之间的第二淋洗缓冲液淋洗层析柱(步骤4b)；
用pH值在3.0～4.0之间的洗脱缓冲液洗脱层析柱，并收集洗脱的抗体产品(步骤5)；
任选地，用再生缓冲液对层析柱进行再生处理(步骤6)。
在一些具体实施方案中，所述步骤4a的第一淋洗缓冲液的pH比抗体等电点高0.5～1.5。
在一些具体实施方案中，所述步骤4a的第一淋洗缓冲液的pH范围为8.0～10.6，优选8.0～10.6，更优选8.0～9.5，再优选8.6～9.5。
在一些具体实施方案中，所述步骤4a的第一淋洗缓冲液为Tris-盐酸缓冲液(pH范围为7.1～8.9)或甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH范围为8.6～10.6，甘氨酸摩尔浓度为20-50mM)。
在一些具体的实施方案中，所述步骤4a中的第一淋洗缓冲液还可以进一步添加清洗添加剂，其中所述清洗添加剂选自表面活性剂、变性剂或有机溶剂中的任意一种或多种。在一些具体的实施方案中，所述清洗添加剂独立地选自尿素、异丙醇、吐温20、吐温80或精氨酸盐酸中的的一种或多种。在一些具体的实施方案中，所述清洗添加剂在第一淋洗缓冲液中的最终浓度为：尿素的浓度为1-6M、异丙醇的体积百分比为10％-25％，吐温20或吐温80的体积百分比为0.5％-5％，和/或精氨酸-盐酸的浓度为0.1-0.5M。在一些具体的实施方案中，所述第一淋洗缓冲液的pH优选为8.5～9.5。
在一些具体实施方案中，所述步骤4b的第二淋洗缓冲液的pH范围为3.0～8.0，优选3.5～6.0。
在一些具体实施方案中，所述步骤4b的第二淋洗缓冲液是醋酸盐缓冲液(pH为3.6-5.8)、磷酸盐缓冲液(pH为5.8-8.0)或Tris-盐酸缓冲液(pH为7.1-8.9，盐浓度为25mM)。优选地，所述步骤4b的第二淋洗缓冲液是醋酸盐缓冲液(pH为3.6-5.8)。
在一些具体实施方案中，所述步骤4的操作步骤可以包括下述步骤：
步骤4a，用3-5倍柱体积的第一淋洗缓冲液淋洗层析柱；和，
步骤4b，用3-5倍柱体积的第二淋洗缓冲液淋洗层析柱。
在一些具体实施方案中，所述步骤1的操作步骤可以包括下述一个或多个步骤：
步骤1a、亲和填料装柱，用2-5倍柱体积的平衡缓冲液漂洗层析柱；
步骤1b、用3-5倍柱体积的消毒剂层析柱；或，
步骤1c、用5-8倍柱体积的平衡缓冲液平衡层析柱。
在一些具体实施方案中，步骤1a中所述亲和填料配基为ProteinA配基，可交联到包括但不限于琼脂糖、羟基化聚醚树脂、聚丙烯酸树脂、聚苯乙烯二乙烯苯基树脂、聚甲基丙烯酸树脂、聚苯乙烯树脂、羟基磷灰石、玻璃等基质上的层析介质，优选基质为琼脂糖。所述亲和填料包括但不限于Cytiva的MabSelect SuRe或MabSelect SuRe LX，MabSelectPrismA和Praesto的Jetted A50、AP或AP+。
在一些具体实施方案中，所述步骤2的操作步骤包括下述步骤：
步骤2a，将抗体原液(包含抗体和宿主细胞蛋白的物料)加载到层析柱上，让样品在柱上保留2-10分钟。
在一些具体实施方案中，所述步骤3的操作步骤包括下述步骤：
步骤3a，用3-5倍平衡缓冲液淋洗层析柱。
在一些具体实施方案中，所述步骤5的操作步骤可以包括下述步骤：
步骤5a，用2-10倍(优选2-5倍)柱体积的洗脱缓冲液洗脱层析柱，并收集洗脱的抗体产品。
在一些具体实施方案中，所述步骤6的操作步骤可以包括下述步骤：
步骤6a，用2-5倍柱体积的再生缓冲液对层析柱进行再生处理。
在一些具体实施方案中，优选采用2-5倍柱体积的0.1-1M醋酸对层析柱进行再生处理。
在一些具体实施方案中，所述亲和纯化工艺还进一步包括步骤7：对层析柱进行平衡和保存。在一些具体实施方案中，步骤7的操作步骤可以包括下述一个或多个步骤：
步骤7a、用2-5倍柱体积的平衡缓冲液漂洗层析柱；
步骤7b、用3-5倍柱体积的消毒剂消毒层析柱；
步骤7c、用2-5倍柱体积的平衡缓冲液漂洗层析柱；或，
步骤7d、用2-5倍柱体积保存液保存层析柱。
在一些具体的实施方案中，所述在步骤1a、步骤1c、步骤3a、步骤7a和步骤7c中所用的平衡缓冲液，以及步骤步骤4b中所用的第二淋洗缓冲液是醋酸盐缓冲液(pH为3.6-5.8)、磷酸盐缓冲液(pH为5.8-8.0)或Tris-盐酸缓冲液(pH为7.1-8.9，盐浓度为25mM)。
在一些具体的实施方案中，所述步骤1b和步骤7b中的消毒剂是浓度为0.1M的NaOH溶液。
在一些具体的实施方案中，所述步骤步骤5a中的洗脱缓冲液是醋酸-醋酸钠缓冲液(pH值为3.0～4.0)。
在一些具体的实施方案中，所述步骤7d中的保存液为20％乙醇(体积百分比)。
本发明的亲和纯化工艺去除HCP去除效果与传统工艺相比提高50％以上，适用范围广，广泛适用于含Fc域(IgG-like)双特异性或复杂构型抗体类蛋白质亲和纯化工艺中，从而为提高纯化回收率同时有效控制抗体类药物中HCP的含量提供技术支持。
附图说明
图1是不同类型双特异性抗体结构示意图。
图2是实施例1中pH值为9.5、7.1和5.5的第一淋洗缓冲液淋洗的HCP亲和层析图谱。
图3为图2的局部放大图。
图4为实施例2中高pH(pH＝9.5)添加或不添加尿素、异丙醇和吐温20的第一淋洗缓冲液的HCP亲和层析图谱。
图5为图4的局部放大图。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，均属于本发明保护的范围。
为了对本发明的亲和纯化工艺进行进一步阐述，现结合双特异性抗体抗体类药物制备过程中实施的亲和层析实施例进行详细说明。
亲和层析在Cytiva的AKTAAvant仪器上完成，涉及的各项检测包括：
(1)蛋白质浓度：通过UV280的吸收值来检测；(2)单体纯度：通过分子排阻高效液相色谱法(SEC-HPLC)检测；(3)HCP含量：通过酶联免疫检测。
本发明所用的亲和介质是Protein A配基可交联到包括但不限于琼脂糖、羟基化聚醚树脂、聚丙烯酸树脂、聚苯乙烯二乙烯苯基树脂、聚甲基丙烯酸树脂、聚苯乙烯树脂、羟基磷灰石、玻璃等基质上的层析介质，优选基质为琼脂糖。优选的亲和填料有Cytiva的MabSelect SuRe和MabSelect SuRe LX，MabSelect PrismA和Praesto的Jetted A50、AP、AP+。
本发明的亲和纯化工艺包括下述步骤：
将抗体原液(包含抗体和宿主细胞蛋白的物料)加载到层析柱上；
用pH值比抗体等电点高的第一淋洗缓冲液淋洗层析柱；和
用洗脱缓冲液洗脱层析柱，并收集洗脱的抗体产品。
更进一步地，本发明的亲和纯化工艺包括下述步骤：
步骤1、用平衡缓冲液预处理层析柱；
步骤2、将抗体原液(包含抗体和宿主细胞蛋白的物料)加载到层析柱上；
步骤3、用平衡缓冲液淋洗层析柱；
步骤4、用pH值比抗体等电点高的第一淋洗缓冲液、第二淋洗缓冲液淋洗层析柱；和
步骤5、用洗脱缓冲液洗脱层析柱，并收集洗脱的抗体产品。
本发明的亲和纯化工艺还包括下述一个或多个步骤：
步骤6：用再生缓冲液对层析柱进行再生处理；和/或，
步骤7：对层析柱进行平衡和保存。
本发明的亲和纯化工艺中，一些实施例所采用的具体步骤如下。
其中，步骤1的操作步骤具体包括下述步骤：
步骤1a，亲和填料装柱，用2-5倍柱体积的平衡缓冲液漂洗层析柱；
步骤1b，用3-5倍柱体积的消毒剂层析柱；和，
步骤1c，用5-8倍柱体积的平衡缓冲液平衡层析柱。
其中，步骤2的操作步骤具体包括下述步骤：
步骤2a，将抗体原液(包含抗体和宿主细胞蛋白的物料)加载到层析柱上，让样品在柱上保留2-10分钟。
其中，步骤3的操作步骤具体包括下述步骤：
步骤3a，用3-5倍平衡缓冲液淋洗层析柱。
其中，步骤4的操作步骤具体包括下述步骤：
步骤4a，用3-5倍柱体积的第一淋洗缓冲液淋洗层析柱；和，
步骤4b，用3-5倍柱体积的第二淋洗缓冲液淋洗层析柱。
其中，第一淋洗缓冲液的pH值比抗体等电点高，优选高0.5～1.5。
其中，步骤5的操作步骤具体包括下述步骤：
步骤5a，用2-10倍柱体积的洗脱缓冲液洗脱层析柱，并收集洗脱的抗体产品。
其中，步骤6的操作步骤具体包括下述步骤：
步骤6a，用2-5倍柱体积的再生缓冲液对层析柱进行再生处理。
其中，步骤7的操作步骤具体包括下述步骤：
步骤7a，用2-5倍柱体积的平衡缓冲液漂洗层析柱；
步骤7b，用3-5倍柱体积的消毒剂消毒层析柱；
步骤7c，用2-5倍柱体积的平衡缓冲液漂洗层析柱；和
步骤7d，用2-5倍柱体积保存液保存层析柱。
本发明的亲和纯化工艺中，一些实施例所采用的具体试剂如下。
在步骤1a、步骤1c、步骤3a、步骤7a和步骤7c中所用的平衡缓冲液，以及步骤步骤4b中所用的第二淋洗缓冲液是醋酸盐缓冲液(pH为3.6-5.8)、磷酸盐缓冲液(pH为5.8-8.0)或Tris-盐酸缓冲液(pH为7.1-8.9，盐浓度为25mM)。
在步骤1b和步骤7b中，所用的消毒剂是浓度为0.1M的NaOH溶液。
在步骤4a中，所用的第一淋洗缓冲液是Tris-盐酸缓冲液(pH范围为7.1～8.9)或甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH范围为8.6～10.6，甘氨酸摩尔浓度为20-50mM)。
在步骤4a中，所用的第一淋洗缓冲液还可以进一步加入尿素、异丙醇、吐温20、吐温80或精氨酸盐酸作为添加剂，其中：所述添加剂在第一淋洗缓冲液中的最终浓度为：尿素的摩尔浓度为1-6M、异丙醇的体积百分比为10％-25％、吐温20或吐温80的体积百分比为0.5％-5％、精氨酸的浓度为0.1-0.5M；所述第一淋洗缓冲液的pH值为8.5～9.5。
在步骤5a中，所用的洗脱缓冲液是醋酸-醋酸钠缓冲液(pH值为3.0～4.0)。
在步骤7d中，所用的保存液是体积百分比为20％的乙醇。
无特别说明，本发明中的各类溶液是水溶液，如NaOH溶液。
一些具体实施例举例说明如下。
实施例1：高pH第一淋洗缓冲液在双特异性抗体蛋白亲和层析工艺中的作用
方法：
步骤1：用2倍柱体积的25mM Tris-HCl/25mM NaCl的混和溶液(pH值为7.1)漂洗ProteinA层析柱(JettedA50，1.963ml)(步骤1a)；用3倍柱体积的0.1M的NaOH溶液消毒层析柱(步骤1b)；用5倍柱体积的25mM Tris-HCl/25mM NaCl的混和溶液(pH值为7.1)平衡层析柱(步骤1c)。
步骤2：将IgG1型双特性抗体A的抗体原液加载到加载到层析柱，上样载量为35mg/mL，柱上保留时间为5分钟(步骤2a)。
步骤3：用5倍柱体积的25mM Tris-HCl/25mM NaCl的混和溶液(pH值为7.1)淋洗层析柱，冲洗出未结合的细胞杂质和碎片(步骤3a)。
步骤4：用3倍柱体积的第一淋洗缓冲液淋洗层析柱(步骤4a)，其中，第一淋洗缓冲液pH分别为5.5/7.1/9.5的缓冲溶液(见表1)；用3倍柱体积的第二淋洗缓冲液淋洗层析柱(步骤4b)，其中，第二淋洗缓冲液是醋酸盐缓冲液(pH为3.6-5.8)。
步骤5：用3倍柱体积的醋酸-醋酸钠缓冲液(pH值为3.0～4.0)洗脱层析柱，并基于紫外吸收峰收集洗脱的抗体产品(步骤5a)。
步骤6：用3倍柱体积的1M醋酸对层析柱进行再生处理(步骤6)。
步骤7：用5倍柱体积的25mM Tris-HCl/25mM NaCl的混和溶液(pH值为7.1)漂洗层析柱(步骤7a)；用5倍柱体积的0.1M的NaOH溶液消毒层析柱(步骤7b)；用3倍柱体积的25mMTris-HCl/25mM NaCl的混和溶液(pH值为7.1)漂洗层析柱(步骤7c)；用3倍柱体积百分比为20％的乙醇保存层析柱(步骤7d)。
结果：
将基于紫外吸收峰收集洗脱液样品和洗脱后的抗体产品，测定HCP浓度，计算抗体产品收率，检测抗体产品质量(SEC-HPLC法)。其结果见表1、图2和图3。
图2和3表明，在步骤4a的淋洗去除HCP步骤，较pH值为5.5的醋酸-醋酸钠缓冲液，pH值为9.5的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液洗杂的紫外吸收峰面积更大，说明更多的HCP杂质蛋白被洗脱下来。
表1表明，较pH值为pH5.5的醋酸-醋酸钠缓冲液，pH值为9.5的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液洗杂后，洗脱收集的双特异性抗体产品的HCP含量与传统工艺相比降低8％，同时抗体产品的纯度并没有受到显著影响。在步骤4a中使用较高pH值，尤其是pH值为8.6-10.6的第一淋洗缓冲液如甘氨酸-氢氧化钠缓冲液能够有效地降低抗体中HCP的含量，而且能够提高产品收率，从而更为有效提高层析的效率。
表1：不同pH值缓冲溶液洗杂条件下收集洗脱样品HCP及产品检测结果(HCP残留数据以pH7.1条件为对照组进行归一化处理)
实施例2：添加剂在双特异性抗体蛋白亲和层析工艺中的作用
方法：
按照类似实施例1的步骤和方法进行操作，其中步骤4a替换为如下步骤：用3倍柱体积的第一淋洗缓冲液淋洗层析柱(步骤4a)，其中，第一淋洗缓冲液是pH值为9.5、摩尔浓度为25mM的甘氨酸-氢氧化钠水溶液作为缓冲液，进一步添加或不添尿素、异丙醇或吐温20作为添加剂。所述添加剂在淋洗缓冲液中的最终浓度为尿素的摩尔浓度为3M、异丙醇的体积百分比为10％、吐温20的体积百分比为1％。
结果：
将基于紫外吸收峰收集洗脱液样品和洗脱后的抗体样品，测定HCP浓度，计算抗体产品收率，检测抗体产品质量(SEC-HPLC法)。其结果见表2、图4和图5。
图4和图5，及表2表明：在不显著影响抗体产品收率以及质量的前提下，洗涤添加剂的加入可以有效提高HCP的去除效果，特别是尿素的添加去除效果相对更好，HCP的含量降低了64％。这说明变性剂和有机溶剂作为洗涤添加剂也可以一定程度上进一步去除HCP，可以作为双特异性抗体亲和层析优化的一个选择。
表2：高pH、不同洗涤添加剂体系下HCP及产品检测结果(HCP残留数据以pH9.5条件为对照组进行归一化处理)
*：对照组不添加任何添加剂。
本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明中。本发明的方法及应用已经通过较佳实例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明。
Claims (10)
1.一种去除宿主细胞蛋白的亲和纯化工艺，其特征在于，包括以下步骤：
任选地，用平衡缓冲液预处理层析柱(步骤1)；
将抗体原液(包含抗体和宿主细胞蛋白的物料)加载到层析柱上(步骤2)；
任选地，用平衡缓冲液淋洗层析柱(步骤3)；
用pH值比抗体等电点高的第一淋洗缓冲液淋洗层析柱(步骤4a)；
任选地，用pH值在3.0～9.0之间的第二淋洗缓冲液淋洗层析柱(步骤4b)；
用pH值在3.0～4.0之间的洗脱缓冲液洗脱层析柱，并收集洗脱的抗体产品(步骤5)；
任选地，用再生缓冲液对层析柱进行再生处理(步骤6)。
2.如权利要求1所述的亲和纯化工艺，其特征在于，所述第一淋洗缓冲液的pH比抗体等电点高0.5～1.5。
3.如权利要求2所述的亲和纯化工艺，其特征在于，所述第一淋洗缓冲液的pH范围为8.0～10.6，优选8.0～10.6，更优选8.0～9.5，再优选8.6～9.5。
4.如权利要求2或3所述的亲和纯化工艺，其特征在于，所述第一淋洗缓冲液为Tris-盐酸缓冲液(pH范围为7.1～8.9)，或甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH范围为8.6～10.6，甘氨酸摩尔浓度为20-50mM)，优选甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH范围为8.6～10.6，甘氨酸摩尔浓度为20-50mM)。
5.如权利要求1-4中任一项所述的亲和纯化工艺，其特征在于，所述第一淋洗缓冲液进一步添加清洗添加剂，其中所述清洗添加剂选自表面活性剂、变性剂或有机溶剂中的任意一种或多种。
6.如权利要求5所述的亲和纯化工艺，其特征在于，所述清洗添加剂独立地选自尿素、异丙醇、吐温20、吐温80或精氨酸-盐酸中的一种或多种。
7.如权利要求5所述的亲和纯化工艺，其特征在于，所述清洗添加剂独立地选自尿素、异丙醇、吐温20、吐温80或精氨酸-盐酸。
8.如权利要求7所述的亲和纯化工艺，其特征在于，所述添加剂添加在第一淋洗缓冲液中的最终浓度为：尿素的浓度为1-6M、异丙醇的体积百分比为10％-25％，吐温20或吐温80的体积百分比为0.5％-5％，和/或精氨酸-盐酸的浓度为0.1-0.5M。
9.如权利要求1-8中任一项所述的亲和纯化工艺，其特征在于，所述层析柱使用Protein A填料。
10.如权利要求9所述的亲和纯化工艺，其特征在于，所述Protein A填料选自Cytiva的MabSelect SuRe、MabSelect SuRe LX或MabSelect PrismA，或Praesto的JettedA50、AP或AP+。
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