CN114653346A - 一种改进的聚合氯化铝改性壳聚糖包覆的磁珠及其制备方法 - Google Patents

一种改进的聚合氯化铝改性壳聚糖包覆的磁珠及其制备方法 Download PDF

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CN114653346A CN202210441826.6A CN202210441826A CN114653346A CN 114653346 A CN114653346 A CN 114653346A CN 202210441826 A CN202210441826 A CN 202210441826A CN 114653346 A CN114653346 A CN 114653346A
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Abstract

本发明公开了一种改进的聚合氯化铝改性壳聚糖包覆的磁珠及其制备方法，属于分析化学技术领域。所述制备方法包括制备改进的聚合氯化铝改性壳聚糖和制备改进的聚合氯化铝改性壳聚糖包覆的磁珠的步骤，制备改进的聚合氯化铝改性壳聚糖的步骤中包括加入季铵盐的步骤。本发明的改进的聚合氯化铝改性壳聚糖包覆的磁珠的制备方法，将季铵盐用于聚合氯化铝改性壳聚糖，可以显著提高磁珠对人全血基因组DNA的吸附性能和吸附特异性。

Description

一种改进的聚合氯化铝改性壳聚糖包覆的磁珠及其制备方法
技术领域
本发明属于分析化学技术领域，具体涉及一种改进的聚合氯化铝改性壳聚糖包覆的磁珠及其制备方法。
背景技术
磁珠法提取核酸中，磁珠吸附核酸后，可以在磁场的作用下快速的分离，大大加快了提取的步骤。在此过程中提取液，特别是其中的磁珠，是核酸提取的过程中的关键因素。
本发明的研究人员的专利CN112646802A(一种磁珠法核酸提取液及其制备方法)研究了聚合氯化铝改性的壳聚糖包覆的磁珠的吸附性能，考察了该改性磁珠对人全血基因组DNA的提取得率和纯度的影响。对磁珠吸附的评价包括两个方面，一个是单位吸附量，反映的是吸附的能力，可以考察核酸的得率，另一个是吸附的特异性，反应的是对核酸和其他杂质的特异性能力差异，可以考察A260/A280。该专利的磁珠法核酸提取液的DNA特异性吸附性能不强，有待改进。
季铵盐，有正电性，可与水中悬浮物呈负电性物质结合，作为有机阳离子絮凝剂广泛应用于水的净化。专利CN106732425A公开了季铵盐壳聚糖改性的膨润土吸附材料及其制备和在吸附废水中铅离子的应用，发现该膨润土吸附材料有较大的比表面积，对废水中的铅离子具有很好的吸附性能。
发明内容
本发明尝试将应用于膨润土吸附铅离子的季铵盐用于聚合氯化铝改性壳聚糖。本发明的研究人员在改进提取液在人全血基因组DNA体系中的特异性吸附性能中，出乎意料的发现在一些条件下中添加季铵盐可以显著提高磁珠对人全血基因组DNA的特异性吸附。
本发明的第一方面在于公开了改进的聚合氯化铝改性壳聚糖包覆的磁珠的制备方法，包括制备改进的聚合氯化铝改性壳聚糖和制备改进的聚合氯化铝改性壳聚糖包覆的磁珠的步骤，制备改进的聚合氯化铝改性壳聚糖的步骤中包括加入季铵盐的步骤。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述加入季铵盐的步骤在壳聚糖吸附聚合氯化铝步骤之前。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述包括制备改进的聚合氯化铝改性壳聚糖的步骤包括以下步骤：
S11，水、氯化钙和季铵盐混合；
S12，壳聚糖和乙酸混合；
S13，将S12的溶液和S11的混合液混合；
S14，与聚合氯化铝，混合，吸附；
S15，干燥。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述制备改进的聚合氯化铝改性壳聚糖包覆的磁珠的步骤包括以下步骤：
S21，四氧化三铁和水混合；
S22，得到的改进的聚合氯化铝改性壳聚糖与乙酸水溶液、乙二醛水溶液混合；
S23，步骤S21和步骤S22得到的混合液混合，干燥，得到改进的聚合氯化铝改性壳聚糖包覆的磁珠。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述季铵盐选自四丁基氯化铵、双癸基二甲基氯化铵、辛基癸基二甲基氯化铵和2,3-环氧丙基三甲基氯化铵中的一种或多种。
在本发明的一些优选的实施方式中，制备改进的聚合氯化铝改性壳聚糖中的原料中，水、氯化钙、季铵盐、壳聚糖、乙酸和聚合氯化铝的重量比为(700-900)：(0.5-2)：(0.5-15)：(5-15)：(5-15)：(5-15)，优选为(750-850)：(0.5-1.5)：(1-10)：(5-10)：(5-10)：(5-10)，进一步优选为(780-820)：(0.8-1.2)：(3-7)：(7-9)：(7-9)：(7-9)，更进一步优选为(780-820)：(0.8-1.2)：(4-6)：(7-9)：(7-9)：(7-9)。
在本发明的一些优选的实施方式中，S12中所述混合为振荡混合；
和/或，S14中，所述吸附为室温
和/或，S21中，所述混合为超声处理。
在本发明的一些优选的实施方式中，S14中，所述吸附为20-35℃吸附2-3h；
和/或，S21中，所述超声处理为150-250W超声处理15-30min。
和/或，S22中，所述乙酸水溶液的浓度为0.5-2％(v/v)，所述乙二醛水溶液的3-8％(v/v)；
和/或，S23中，所述混合为20-35℃搅拌5-10h；
和/或，S23中，所述干燥为45-55℃干燥20-60min。
在本发明的一些优选的实施方式中，S21和S22在体系中通入氮气，S23中在氮气气氛下进行干燥。
在本发明的一些优选的实施方式中，在通入氮气时，通过以下算法进行PID氮气流量控制：
Figure BDA0003614263070000031
其中，Δu(c)对应两次测试气体时间间隔内流速的变化量；Kc为常数，5-10；f(C)为第C次采样时偏差，f(C-1)为第C-1次采样时偏差，f(C-2)为第C-2次采样时偏差；TI为积分时间，1.0-1.5min；TD为微分时间，1.0-1.5min；TS为采样周期，1.5-2.0s。
本发明的第二方面在于公开所述的制备方法得到的改进的聚合氯化铝改性壳聚糖包覆的磁珠。
本发明的有益技术效果是：
本发明的改进的聚合氯化铝改性壳聚糖包覆的磁珠的制备方法，将应用于膨润土吸附铅离子的季铵盐用于聚合氯化铝改性壳聚糖，可以显著提高磁珠对人全血基因组DNA的吸附性能和吸附特异性。
本发明的改进的聚合氯化铝改性壳聚糖包覆的磁珠的制备方法，不同的季铵盐及其含量对于聚合氯化铝改性壳聚糖的吸附性能和吸附特异性的影响趋势并不相同。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。除非特别指出，本发明中所用的试剂同CN112646802A。
S21和S22在体系中通入氮气，S23中在氮气气氛下进行干燥。若非特别指出，实施例和对比例为组分、组分含量、制备步骤、制备参数相同的平行试验。
实施例1
一种改进的磁珠法核酸提取液的其制备方法：
(1)制备改进的聚合氯化铝改性壳聚糖：
S11，烧杯中加入800重量份的水、1重量份的氯化钙和3重量份的季铵盐，搅拌溶解；
S12，试管中加入8重量份的壳聚糖和8重量份的乙酸，振荡混合；
S13，将S12的溶液加入到S11的混合液中，搅拌混合；；
S14，加入8重量份的聚合氯化铝，混合，搅拌，室温吸附2.5h；
S15，喷雾干燥，得到固体粉末，即为经过改进的聚合氯化铝改性壳聚糖。
所述季铵盐为四丁基氯化铵。
(2)制备改进的聚合氯化铝改性壳聚糖包覆的磁珠：
S21，取1g四氧化三铁加入5ml水，200W超声20min；
S22，取步骤(1)得到的改进的聚合氯化铝改性壳聚糖1g，加入99ml 1％(v/v)的乙酸水溶液，加入5ml的5％(v/v)的乙二醛水溶液，混合，搅拌；
S23，将S21得到的混合液加入到S22得到的混合液中，混合，室温搅拌7h，50±2℃干燥30min。得到改进的聚合氯化铝改性壳聚糖包覆的磁珠。
实施例2
一种改进的磁珠法核酸提取液的其制备方法：
(1)制备改进的聚合氯化铝改性壳聚糖：
S11，烧杯中加入800重量份的水、1重量份的氯化钙和5重量份的季铵盐，搅拌溶解；
S12，试管中加入8重量份的壳聚糖和8重量份的乙酸，振荡混合；
S13，将S12的溶液加入到S11的混合液中，搅拌混合；
S14，加入8重量份的聚合氯化铝，混合，搅拌，室温吸附2.5h；
S15，喷雾干燥，得到固体粉末，即为经过改进的聚合氯化铝改性壳聚糖。
所述季铵盐为四丁基氯化铵。
(2)制备改进的聚合氯化铝改性壳聚糖包覆的磁珠：
S21，取1g四氧化三铁加入5ml水，200W超声20min；
S22，取步骤(1)得到的改进的聚合氯化铝改性壳聚糖1g，加入99ml 1％(v/v)的乙酸水溶液，加入5ml的5％(v/v)的乙二醛水溶液，混合，搅拌；
S23，将S21得到的混合液加入到S22得到的混合液中，混合，室温搅拌7h，50±2℃干燥30min。得到改进的聚合氯化铝改性壳聚糖包覆的磁珠。
实施例3
一种改进的磁珠法核酸提取液的其制备方法：
(1)制备改进的聚合氯化铝改性壳聚糖：
S11，烧杯中加入800重量份的水、1重量份的氯化钙和7重量份的季铵盐，搅拌溶解；
S12，试管中加入8重量份的壳聚糖和8重量份的乙酸，振荡混合；
S13，将S12的溶液加入到S11的混合液中，搅拌混合；
S14，加入8重量份的聚合氯化铝，混合，搅拌，室温吸附2.5h；
S15，喷雾干燥，得到固体粉末，即为经过改进的聚合氯化铝改性壳聚糖。
所述季铵盐为四丁基氯化铵。
(2)制备改进的聚合氯化铝改性壳聚糖包覆的磁珠：
S21，取1g四氧化三铁加入5ml水，200W超声20min；
S22，取步骤(1)得到的改进的聚合氯化铝改性壳聚糖1g，加入99ml 1％(v/v)的乙酸水溶液，加入5ml的5％(v/v)的乙二醛水溶液，混合，搅拌；
S23，将S21得到的混合液加入到S22得到的混合液中，混合，室温搅拌7h，50±2℃干燥30min。得到改进的聚合氯化铝改性壳聚糖包覆的磁珠。
实施例4
一种改进的磁珠法核酸提取液的其制备方法：
(1)制备改进的聚合氯化铝改性壳聚糖：
S11，烧杯中加入800重量份的水、1重量份的氯化钙和1重量份的季铵盐，搅拌溶解；
S12，试管中加入8重量份的壳聚糖和8重量份的乙酸，振荡混合；
S13，将S12的溶液加入到S11的混合液中，搅拌混合；
S14，加入8重量份的聚合氯化铝，混合，搅拌，室温吸附2.5h；
S15，喷雾干燥，得到固体粉末，即为经过改进的聚合氯化铝改性壳聚糖。
所述季铵盐为四丁基氯化铵。
(2)制备改进的聚合氯化铝改性壳聚糖包覆的磁珠：
S21，取1g四氧化三铁加入5ml水，200W超声20min；
S22，取步骤(1)得到的改进的聚合氯化铝改性壳聚糖1g，加入99ml 1％(v/v)的乙酸水溶液，加入5ml的5％(v/v)的乙二醛水溶液，混合，搅拌；
S23，将S21得到的混合液加入到S22得到的混合液中，混合，室温搅拌7h，50±2℃干燥30min。得到改进的聚合氯化铝改性壳聚糖包覆的磁珠。
实施例5
一种改进的磁珠法核酸提取液的其制备方法：
(1)制备改进的聚合氯化铝改性壳聚糖：
S11，烧杯中加入800重量份的水、1重量份的氯化钙和10重量份的季铵盐，搅拌溶解；
S12，试管中加入8重量份的壳聚糖和8重量份的乙酸，振荡混合；
S13，将S12的溶液加入到S11的混合液中，搅拌混合；
S14，加入8重量份的聚合氯化铝，混合，搅拌，室温吸附2.5h；
S15，喷雾干燥，得到固体粉末，即为经过改进的聚合氯化铝改性壳聚糖。
所述季铵盐为四丁基氯化铵。
(2)制备改进的聚合氯化铝改性壳聚糖包覆的磁珠：
S21，取1g四氧化三铁加入5ml水，200W超声20min；
S22，取步骤(1)得到的改进的聚合氯化铝改性壳聚糖1g，加入99ml 1％(v/v)的乙酸水溶液，加入5ml的5％(v/v)的乙二醛水溶液，混合，搅拌；
S23，将S21得到的混合液加入到S22得到的混合液中，混合，室温搅拌7h，50±2℃干燥30min。得到改进的聚合氯化铝改性壳聚糖包覆的磁珠。
实施例6
一种改进的磁珠法核酸提取液的其制备方法：
(1)制备改进的聚合氯化铝改性壳聚糖：
S11，烧杯中加入800重量份的水、1重量份的氯化钙和5重量份四丁基氯化铵当量的双癸基二甲基氯化铵，搅拌溶解；
S12，试管中加入8重量份的壳聚糖和8重量份的乙酸振荡混合；
S13，将S12的溶液加入到S11的混合液中，搅拌混合；
S14，加入8重量份的聚合氯化铝，混合，搅拌，室温吸附2.5h；
S15，喷雾干燥，得到固体粉末，即为经过改进的聚合氯化铝改性壳聚糖。
(2)制备改进的聚合氯化铝改性壳聚糖包覆的磁珠：
S21，取1g四氧化三铁加入5ml水，200W超声20min；
S22，取步骤(1)得到的改进的聚合氯化铝改性壳聚糖1g，加入99ml 1％(v/v)的乙酸水溶液，加入5ml的5％(v/v)的乙二醛水溶液，混合，搅拌；
S23，将S21得到的混合液加入到S22得到的混合液中，混合，室温搅拌7h，50±2℃干燥30min。得到改进的聚合氯化铝改性壳聚糖包覆的磁珠。
实施例7
一种改进的磁珠法核酸提取液的其制备方法：
(1)制备改进的聚合氯化铝改性壳聚糖：
S11，烧杯中加入800重量份的水、1重量份的氯化钙和5重量份四丁基氯化铵当量的辛基癸基二甲基氯化铵，搅拌溶解；
S12，试管中加入8重量份的壳聚糖和8重量份的乙酸，振荡混合；
S13，将S12的溶液加入到S11的混合液中，搅拌混合；
S14，加入8重量份的聚合氯化铝，混合，搅拌，室温吸附2.5h；
S15，喷雾干燥，得到固体粉末，即为经过改进的聚合氯化铝改性壳聚糖。
(2)制备改进的聚合氯化铝改性壳聚糖包覆的磁珠：
S21，取1g四氧化三铁加入5ml水，200W超声20min；
S22，取步骤(1)得到的改进的聚合氯化铝改性壳聚糖1g，加入99ml 1％(v/v)的乙酸水溶液，加入5ml的5％(v/v)的乙二醛水溶液，混合，搅拌；
S23，将S21得到的混合液加入到S22得到的混合液中，混合，室温搅拌7h，50±2℃干燥30min。得到改进的聚合氯化铝改性壳聚糖包覆的磁珠。
实施例8
一种改进的磁珠法核酸提取液的其制备方法：
(1)制备经过聚合氯化铝改性的壳聚糖：
S11，烧杯中加入800重量份的水、1重量份的氯化钙和5重量份四丁基氯化铵当量的2,3-环氧丙基三甲基氯化铵，搅拌溶解；
S12，试管中加入8重量份的壳聚糖和8重量份的乙酸，振荡混合；
S13，将S12的溶液加入到S11的混合液中，搅拌混合；
S14，加入8重量份的聚合氯化铝，混合，搅拌，室温吸附2.5h；
S15，喷雾干燥，得到固体粉末，即为经过改进的聚合氯化铝改性壳聚糖。
(2)制备改进的聚合氯化铝改性壳聚糖包覆的磁珠：
S21，取1g四氧化三铁加入5ml水，200W超声20min；
S22，取步骤(1)得到的改进的聚合氯化铝改性壳聚糖1g，加入99ml 1％(v/v)的乙酸水溶液，加入5ml的5％(v/v)的乙二醛水溶液，混合，搅拌；
S23，将S21得到的混合液加入到S22得到的混合液中，混合，室温搅拌7h，50±2℃干燥30min。得到改进的聚合氯化铝改性壳聚糖包覆的磁珠。
实施例9
与实施例1的区别在于，在通入氮气时，通过以下算法进行PID氮气流量控制：
Figure BDA0003614263070000101
其中，Δu(c)对应两次测试气体流速时间间隔内流速的变化量；Kc为常数，5-10；f(C)为第C次采样时偏差，f(C-1)为第C-1次采样时偏差，f(C-2)为第C-2次采样时偏差；TI为积分时间，1.0-1.5min；TD为微分时间，1.0-1.5min；TS为采样周期，1.5-2.0s。
通过本实施例的算法来控制氮气气体流速，氮气流量变化幅度小，更接近控制目标，因此而带来的扰动少，避免了空气氧化的不好影响。
对比例1
与实施例1的区别在于，S11中，不加入季铵盐。
对比例2
与实施例1的区别在于，(1)制备经过聚合氯化铝改性的壳聚糖中：
S11，烧杯中加入800重量份的水和1重量份的氯化钙，搅拌溶解；
S12，试管中加入8重量份的壳聚糖和8重量份的乙酸，振荡混合；
S13，将S12的溶液加入到S11的混合液中，搅拌混合；
S14，加入8重量份的聚合氯化铝和3重量份的季铵盐，混合，搅拌，室温吸附2.5h；
S15，喷雾干燥，得到固体粉末，即为经过改进的聚合氯化铝改性壳聚糖。
所述季铵盐为四丁基氯化铵。
性能考察：
取实施例和对比例制备的经过聚合氯化铝改性的壳聚糖包覆的磁珠，平行条件下进行人全血基因组DNA的提取。以抗凝的外周静脉血的细胞裂解液为样品。所述结合液为氯化钠和PEG6000的水溶液；所述结合液中氯化钠的浓度为2.0M，PEG6000的浓度为10wt％。所述洗涤液为60v/v％的乙醇水溶液。所述洗脱液为TE缓冲液，其中Tris盐酸的浓度为15mM，EDTA的浓度为1mM，pH为8.2。以对比例1为对照，比较全血基因组DNA的得率和纯度，结果见表1。
表1对人全血基因组DNA的提取的影响
核酸得率/％ A260/A280
实施例1 127d 1.33b
实施例2 129d 1.48c
实施例3 128d 1.38b
实施例4 117c 1.32b
实施例5 114c 1.37b
实施例6 124d 1.57d
实施例7 126d 1.35b
实施例8 127d 1.32b
对比例1 100a 1.14a
对比例2 107b 1.18a
同一列数据中，不同的小写字母表示差异显著，P＜0.05
结果显示，添加了季铵盐的实施例1-8和对比例2的核酸得率显著优于没有添加季铵盐的对比例1，表明了季铵盐对于改进的聚合氯化铝改性壳聚糖包覆的磁珠吸附能力的显著影响。在壳聚糖吸附聚合氯化铝步骤之前加入季铵盐的实施例1-8的吸附性能显著优于在聚合氯化铝吸附聚合氯化铝步骤中加入季铵盐的对比例2，表明了季铵盐的添加步骤顺序的显著影响。实施例1-8中，除了实施例4和5外，不同重量比例和不同种类季铵盐对于吸附的影响不具统计学意义。
吸附特异性方面，在聚合氯化铝吸附聚合氯化铝步骤中加入季铵盐的对比例2与没有添加季铵盐的对比例1之间没有显著差异。在壳聚糖吸附聚合氯化铝步骤之前加入季铵盐的实施例1-8显著优于没有添加季铵盐的对比例1。与吸附能力不同的是，实施例1-5中，除了实施例2具有显著优势外，其余实施例没有显著差异，表明了特定的季铵盐浓度对于吸附特异性的影响。实施例1、6、7、8中，实施例6具有显著优势，表明了不同的季铵盐对于吸附特异性的影响。
以上对本发明优选的具体实施方式和实施例作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式和实施例，在本领域技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明构思的前提下作出各种变化。

Claims (10)

1.一种改进的聚合氯化铝改性壳聚糖包覆的磁珠的制备方法，其特征在于，包括制备改进的聚合氯化铝改性壳聚糖和制备改进的聚合氯化铝改性壳聚糖包覆的磁珠的步骤，制备改进的聚合氯化铝改性壳聚糖的步骤中包括加入季铵盐的步骤。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述加入季铵盐的步骤在壳聚糖吸附聚合氯化铝步骤之前。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述包括制备改进的聚合氯化铝改性壳聚糖的步骤包括以下步骤：
S11，水、氯化钙和季铵盐混合；
S12，壳聚糖和乙酸混合；
S13，将S12的溶液和S11的混合液混合；
S14，与聚合氯化铝，混合，吸附；
S15，干燥。
4.根据权利要求1-3任一所述的制备方法，其特征在于，所述制备改进的聚合氯化铝改性壳聚糖包覆的磁珠的步骤包括以下步骤：
S21，四氧化三铁和水混合；
S22，得到的改进的聚合氯化铝改性壳聚糖与乙酸水溶液、乙二醛水溶液混合；
S23，步骤S21和步骤S22得到的混合液混合，干燥，得到改进的聚合氯化铝改性壳聚糖包覆的磁珠。
5.根据权利要求1-4任一所述的制备方法，其特征在于，所述季铵盐选自四丁基氯化铵、双癸基二甲基氯化铵、辛基癸基二甲基氯化铵和2,3-环氧丙基三甲基氯化铵中的一种或多种。
6.根据权利要求1-5任一所述的制备方法，其特征在于，制备改进的聚合氯化铝改性壳聚糖中的原料中，水、氯化钙、季铵盐、壳聚糖、乙酸和聚合氯化铝的重量比为(700-900)：(0.5-2)：(0.5-15)：(5-15)：(5-15)：(5-15)，优选为(750-850)：(0.5-1.5)：(1-10)：(5-10)：(5-10)：(5-10)，进一步优选为(780-820)：(0.8-1.2)：(3-7)：(7-9)：(7-9)：(7-9)。
7.根据权利要求1-6任一所述的制备方法，其特征在于，S12中所述混合为振荡混合；
和/或，S14中，所述吸附为室温
和/或，S21中，所述混合为超声处理。
8.根据权利要求1-7任一所述的制备方法，其特征在于，S14中，所述吸附为20-35℃吸附2-3h；
和/或，S21中，所述超声处理为150-250W超声处理15-30min。
和/或，S22中，所述乙酸水溶液的浓度为0.5-2％(v/v)，所述乙二醛水溶液的3-8％(v/v)；
和/或，S23中，所述混合为20-35℃搅拌5-10h；
和/或，S23中，所述干燥为45-55℃干燥20-60min。
9.根据权利要求1-8任一所述的制备方法，其特征在于，S21和S22在体系中通入氮气，S23中在氮气气氛下进行干燥。
10.一种根据权利要求1-9任一所述的制备方法得到的改进的聚合氯化铝改性壳聚糖包覆的磁珠。
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