CN114652832B - 一种有机金属纳米粒子及其制备方法与应用 - Google Patents

一种有机金属纳米粒子及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种有机金属纳米粒子及其制备方法与应用，属于光热免疫抗肿瘤医药技术领域。本发明所述的有机金属纳米粒子，包括电子给体和电子受体。本发明通过改变电子给体和电子受体的组合方式，利用电子给体与电子受体配位形成有机金属纳米粒子，并通过表面活性剂的保护来增强其水溶性和稳定性，获得不同光学性质的有机金属纳米粒子，吸收甚至可以达到近红外二区。本发明的有机金属纳米粒子可以消耗肿瘤细胞的谷胱甘肽和半胱氨酸，不仅能破坏体内氧化还原平衡增强活性氧的产生，加强光热治疗介导的免疫原性死亡，同时也能促进树突状细胞的熟化，增强T细胞的浸润，进一步增强免疫治疗活性，实现了原位瘤和远端瘤的显著抑制。

Description

一种有机金属纳米粒子及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于光热免疫抗肿瘤医药技术领域，具体涉及一种有机金属纳米粒子及其制备方法与应用。
背景技术
光热免疫治疗是一种结合光热治疗和免疫治疗的新型肿瘤治疗方式，其中具有良好光吸收性能的光热试剂在特定波长的激光照射下产生热能，局部提高肿瘤温度，导致肿瘤细胞免疫原性死亡；光热治疗产生的肿瘤相关抗原，可以和免疫试剂相结合激活机体免疫功能，增强免疫治疗效果。然而，目前光热免疫治疗的效果主要受限于肿瘤细胞有限的免疫原性和其较低的免疫响应。发展具有多功能的光热试剂来增强肿瘤细胞的免疫原性并增强免疫响应仍然具有较大挑战。
目前的光热试剂主要分为无机光热试剂和有机光热试剂。其中无机光热试剂，主要包括非金属材料，贵金属材料，过渡金属材料，具有优异的光热性能，可调节和可控的形貌，但这些无机材料通常具有降解性差，有一定的金属泄露诱发毒性等的缺点；有机光热试剂，通常包括小分子光敏剂，半导体聚合物，有机自由基材料等，通常具有较低的毒性，优异的生物相容性，可灵活调节等性能，但是有机材料通常需要复杂的设计，冗杂的合成。
有机金属是一种具有金属的电学，磁学及光学性能，同时也保留着有机材料可降解性，生物相容性，可调节性等性质的有机材料。有机金属主要分为两类，一类是聚碳氢化合物，如聚吡咯，聚苯胺等；另一类是电子转移复合物。其中电子转移复合物由电子给体和电子受体经过配位形成，通常具有可调节的光物理和光化学性质，已被用在有机发光二极管，有机光伏，生物领域等。截止目前，将有机金属用于光热免疫治疗领域的研究尚未有公开的报道。
发明内容
针对以上现有技术存在的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种有机金属纳米粒子。
本发明的另一目的在于提供上述有机金属纳米粒子的制备方法。
本发明的再一目的在于提供上述有机金属纳米粒子的应用。
本发明目的通过以下技术方案实现：
一种有机金属纳米粒子，包括电子给体和电子受体。
所述的电子给体优选包括但不限于四硫富瓦烯(TTF)、二苯并四硫富瓦烯(DBTTF)、3,3',5,5'-四甲基联苯胺、苯胺、芘、苝、晕苯和双(四溴乙基)连四硫酸盐(BETTF)中的至少一种；更优选为二苯并四硫富瓦烯(DBTTF)、双(四溴乙基)连四硫酸盐(BETTF)和四硫富瓦烯(TTF)中的至少一种。
所述的电子受体优选包括但不限于7,7,8,8-四氰基对苯二醌二甲烷(TCNQ)、2,3,5,6-四氟-7,7',8,8'-四氰二甲基对苯醌(F4TCNQ)、1,2,4,5-苯四甲腈和1,2-二氰基苯中的至少一种；更优选为7,7,8,8-四氰基对苯二醌二甲烷(TCNQ)和2,3,5,6-四氟-7,7',8,8'-四氰二甲基对苯醌(F4TCNQ)中的至少一种。
所述的有机金属纳米粒子还包括表面活性剂。
所述的表面活性剂优选包括但不限于泊洛沙姆188(F127)、聚乙二醇和DSPE-PEG2000中的至少一种；更优选为泊洛沙姆188(F127)。
所述的有机金属纳米粒子的制备方法，包括如下步骤：
将电子给体、电子受体混匀后再加入表面活性剂，混匀，得到混合液，然后将混合液在搅拌条件下滴加入水中，透析，干燥，即得有机金属纳米粒子。
所述的电子给体和电子受体优选按摩尔比1:0.1～10计算；更优选按摩尔比1:1计算。
所述的电子给体和表面活性剂优选按摩尔比50～1:1～2计算；更优选按摩尔比5:1计算。
所述的搅拌的条件优选为：200～1000rpm搅拌0.1～24h；更优选为500rpm搅拌4h。
所述的透析优选通过2～20kDa的透析袋透析；更优选通过10kDa的透析袋透析。
所述的有机金属纳米粒子在制备体内外光声成像试剂或光热治疗试剂中的应用。
所述的光热治疗的激光波长优选为630nm、660nm、680nm、730nm、808nm、980nm和1064nm中的至少一种；更优选为808nm或1064nm。
所述的光热治疗的激光强度优选为0.05～2W/cm2；更优选为0.2～2W/cm2。
所述的有机金属纳米粒子在制备治疗和/或预防肿瘤药物中的应用。
所述的肿瘤包括但不限于肺癌、胰腺癌、膀胱癌、乳腺癌、胃癌、食管癌、肠癌和黑色素瘤中的至少一种。
所述的治疗和/或预防肿瘤药物优选为治疗和/或预防肿瘤转移和复发的药物。
相对于现有技术，本发明具有如下优点及有益效果：
(1)本发明的有机金属纳米粒子具有以下优势：1)底物可选范围广；2)底物易于获得，通常可以直接购买；3)制备简单；4)获得的有机金属纳米粒子光学性质可调；5)实现肿瘤的光声成像及光热治疗；6)能够消耗肿瘤细胞中的谷胱甘肽及半胱氨酸，不仅能破坏体内氧化还原平衡增强活性氧的产生，加强光热治疗介导的免疫原性死亡，同时也能促进树突状细胞的熟化，进一步增强免疫治疗活性。本发明的有机金属纳米粒子对于推动光热治疗在临床上的发展具有重要意义。
(2)本发明的有机金属纳米粒子可以消耗肿瘤细胞的谷胱甘肽和半胱氨酸，不仅能破坏体内氧化还原平衡增强活性氧的产生，加强光热治疗介导的免疫原性死亡，同时也能促进树突状细胞的熟化，增强T细胞的浸润，进一步增强免疫治疗活性，实现了原位瘤和远端瘤的显著抑制。
(3)本发明通过改变电子给体和电子受体的组合方式，利用电子给体与电子受体配位形成有机金属纳米粒子，并通过表面活性剂的保护来增强其水溶性和稳定性，获得不同光学性质的有机金属纳米粒子，吸收甚至可以达到近红外二区(1000～1350nm)。所得有机金属纳米粒子可以用作体内外光声成像试剂和光热治疗试剂，还具有与谷胱甘肽和半胱氨酸反应的活性。半胱氨酸作为体内合成谷胱甘肽的原料，消耗半胱氨酸将会导致谷胱甘肽的进一步消耗，体内消耗半胱氨酸和谷胱甘肽可以破坏氧化还原平衡，导致活性氧的增加，活性氧的增加不仅有利于增加光热治疗诱发免疫原性死亡产生肿瘤相关抗原，增强肿瘤细胞的免疫原性，而且有利于促进树突状细胞的熟化，增强免疫响应，从而协同增加免疫治疗效果。
附图说明
图1为有机金属纳米粒子的制备示意图。
图2为不同摩尔比的电子给体和电子受体制得的有机金属纳米粒子溶液的紫外可见近红外吸收图。
图3为不同有机金属纳米粒子的紫外可见近红外吸收图；其中，a)为TTF-TCNQ、DBTTF-TCNQ、BETTF-TCNQ纳米粒子的紫外可见近红外吸收图；b)为TTF-F4TCNQ、DBTTF-F4TCNQ、BETTF-F4TCNQ纳米粒子的紫外可见近红外吸收图。
图4为TTF溶液、DBTTF溶液、BETTF溶液、TCNQ溶液、F4TCNQ溶液的紫外可见近红外吸收图。
图5为TTF-F4TCNQ纳米粒子的粒径和电镜图；其中，a)为TTF-F4TCNQ纳米粒子的粒径分布结果图；b)为TTF-F4TCNQ纳米粒子的电镜结果图。
图6为TTF-F4TCNQ纳米粒子的光热曲线图；其中，a)为TTF纳米粒子溶液、F4TCNQ纳米粒子溶液和TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液经1064nm激光照射10min后的温度变化结果图；b)为激光照射10min不同浓度的TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液的温度变化结果图；c)为不同功率的激光照射TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液的温度变化结果图；d)为先激光照射10min再降温15min重复4次TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液的温度变化结果图。
图7为TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液与不同氨基酸混合后的紫外吸收图；其中，a)为TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液与谷胱甘肽混合后随时间变化的紫外吸收图；b)为TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液与半胱氨酸混合后随时间变化的紫外吸收图；c)为TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液与天冬氨酸混合后随时间变化的紫外吸收图；d)为TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液与丝氨酸混合后随时间变化的紫外吸收图；e)为不加任何氨基酸的TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液随时间变化的紫外吸收图。
图8为谷胱甘肽的质谱图。
图9为F4TCNQ溶液与谷胱甘肽反应后的产物质谱图。
图10为半胱氨酸的质谱图。
图11为F4TCNQ溶液与半胱氨酸反应后的产物质谱图。
图12为TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液与肿瘤细胞孵育后，肿瘤细胞的谷胱甘肽激光共聚焦显微结果及肿瘤细胞中谷胱甘肽强度结果图；其中，a)为肿瘤细胞经不同条件孵育后肿瘤细胞的激光共聚焦显微结果图；b)为肿瘤细胞经不同条件孵育后肿瘤细胞中的谷胱甘肽强度结果图；其中，1代表非光照条件下，未经TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液处理的肿瘤细胞组；2代表光照条件下，未经TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液处理的肿瘤细胞组；3代表非光照条件下，经TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液处理的肿瘤细胞组；4代表光照条件下，经TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液处理的肿瘤细胞组。
图13为TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液与肿瘤细胞孵育后，肿瘤细胞活性氧染色的激光共聚焦显微结果及肿瘤细胞中活性氧强度结果图；其中，图a)为肿瘤细胞经不同条件孵育后肿瘤细胞的激光共聚焦显微结果图；图b)为肿瘤细胞经不同条件孵育后肿瘤细胞中活性氧强度结果图；其中，1代表非光照条件下，未经TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液处理的肿瘤细胞组；2代表光照条件下，未经TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液处理的肿瘤细胞组；3代表非光照条件下，经TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液处理的肿瘤细胞组；4代表光照条件下，经TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液处理的肿瘤细胞组。
图14为不同终浓度的TTF-F4TCNQ纳米粒子对正常细胞和肿瘤细胞的细胞存活率影响及光照对经TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液处理的肿瘤细胞的细胞存活率影响结果图；其中，a)为不同终浓度的TTF-F4TCNQ纳米粒子对正常细胞和肿瘤细胞的细胞存活率影响结果图；b)为光照对经TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液处理的肿瘤细胞的细胞存活率影响结果图。
图15为不同方法处理的肿瘤细胞诱发免疫原性死亡的三种标志物(钙网蛋白，高迁移率族蛋白，三磷酸腺苷)变化结果图；其中，a)为不同方法处理的肿瘤细胞中钙网蛋白迁移的激光共聚焦结果图；b)为不同方法处理的肿瘤细胞中高迁移率族蛋白释放的激光共聚焦结果图；c)为不同方法处理的肿瘤细胞上清液中三磷酸腺苷含量结果图；其中，1代表非光照条件下，未经TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液处理的肿瘤细胞组；2代表光照条件下，未经TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液处理的肿瘤细胞组；3代表非光照条件下，经TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液处理的肿瘤细胞组；4代表光照条件下，经TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液处理的肿瘤细胞组。
图16为TTF-F4TCNQ纳米粒子与DCs细胞孵育后的活性氧染色激光共聚焦显微结果及经TTF-F4TCNQ纳米粒子孵育后的DCs细胞的成熟度检测流式图；其中，a)为TTF-F4TCNQ纳米粒子与DCs细胞孵育后的活性氧染色激光共聚焦显微结果图；b)为经TTF-F4TCNQ纳米粒子孵育后的DCs细胞的成熟度检测流式图。
图17为TTF-F4TCNQ纳米粒子与肿瘤细胞共孵育后促进DCs细胞成熟的流式图和定量分析图；其中，a)为TTF-F4TCNQ纳米粒子与肿瘤细胞共孵育后促进DCs细胞成熟的流式图；b)为TTF-F4TCNQ纳米粒子与肿瘤细胞共孵育后促进DCs细胞成熟的定量分析图；其中，1代表非光照条件下，未经TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液处理的肿瘤细胞组；2代表光照条件下，未经TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液处理的肿瘤细胞组；3代表非光照条件下，经TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液处理的肿瘤细胞组；4代表光照条件下，经TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液处理的肿瘤细胞组。
图18为TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液的光声成像性能结果图；其中，a)为不同浓度TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液的光声强度结果图；b)为尾静脉注射TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液后肿瘤处的光声成像图；c)为尾静脉注射TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液后肿瘤处的光声信号强度图。
图19为TTF-F4TCNQ纳米粒子在光照过程中小鼠热成像结果图；其中，a)为TTF-F4TCNQ光照组和PBS光照组的小鼠热成像结果图；b)为TTF-F4TCNQ光照组和PBS光照组的小鼠肿瘤处温度变化结果图。
图20为不同处理组的原位瘤和远端瘤的体积变化结果图；其中，a)为不同处理组的原位瘤的体积变化结果图；b)不同处理组的远端瘤的体积变化结果图。
图21为不同处理组小鼠的体重变化结果图。
图22为不同处理组小鼠的心，肝，脾，肺，肾器官进行苏木精-伊红染色结果图。
图23为PBS组、TTF-F4TCNQ组和TTF-F4TCNQ光照组小鼠的原位瘤钙网蛋白的染色效果及荧光定量图；其中，a)为PBS组、TTF-F4TCNQ组和TTF-F4TCNQ光照组小鼠的原位瘤钙网蛋白染色效果图；b)为PBS组、TTF-F4TCNQ组和TTF-F4TCNQ光照组小鼠的原位瘤钙网蛋白染色荧光定量图。
图24为不同处理组小鼠脾脏中的DCs细胞流式及成熟度定量图；其中，a)为不同处理组小鼠脾脏中的DCs细胞成熟度检测流式图；b)为不同处理组小鼠脾脏中的DCs细胞成熟度定量图；其中，1代表PBS组，2代表TTF-F4TCNQ组，3代表TTF-F4TCNQ光照组，4代表TTF-F4TCNQ+aPD-1组，5代表TTF-F4TCNQ光照+aPD-1组。
图25为不同处理组小鼠的原位瘤中CD8阳性T细胞的流式及定量图；其中，a)为不同处理组小鼠的原位瘤中CD8阳性T细胞的流式图；b)为不同处理组小鼠的原位瘤中CD8阳性T细胞的定量图；其中，1代表PBS组，2代表TTF-F4TCNQ组，3代表TTF-F4TCNQ光照组，4代表TTF-F4TCNQ+aPD-1组，5代表TTF-F4TCNQ光照+aPD-1组。
图26为不同处理组小鼠的远端瘤中CD8阳性T细胞的流式及定量图；其中，a)为不同处理组小鼠的远端瘤中CD8阳性T细胞的流式图；b)为不同处理组小鼠的远端瘤中CD8阳性T细胞的定量图；其中，1代表PBS组，2代表TTF-F4TCNQ组，3代表TTF-F4TCNQ光照组，4代表TTF-F4TCNQ+aPD-1组，5代表TTF-F4TCNQ光照+aPD-1组。
图27为不同处理组小鼠脾脏中CD8阳性T细胞和CD4阳性T细胞的流式及定量图；其中，a)为不同处理组小鼠脾脏中CD8阳性T细胞和CD4阳性T细胞的流式图；b)为不同处理组小鼠脾脏中CD8阳性T细胞和CD4阳性T细胞的定量图；其中，1代表PBS组，2代表TTF-F4TCNQ组，3代表TTF-F4TCNQ光照组，4代表TF-F4TCNQ+aPD-1组，5代表TTF-F4TCNQ光照+aPD-1组。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1：TTF-F4TCNQ纳米粒子的制备
一种有机金属纳米粒子的制备方法，包括如下步骤：
将100μL电子给体(40mM四硫富瓦烯溶液，通过将四硫富瓦烯(TTF)溶于四氢呋喃中得到)与100μL电子受体(40mM 2,3,5,6-四氟-7,7',8,8'-四氰二甲基对苯醌溶液，通过将2,3,5,6-四氟-7,7',8,8'-四氰二甲基对苯醌(F4TCNQ)溶于二甲基亚砜中得到)混匀后，再加入100μL表面活性剂(8mM泊洛沙姆188(F127)溶液，通过将泊洛沙姆188(F127)溶于四氢呋喃中得到)混合均匀后，得到混合液；将混合液在剧烈搅拌(500rpm)的条件下滴加到4mL纯净水中，搅拌4h后，用10kDa的透析袋透析后，干燥，即得有机金属(TTF-F4TCNQ)纳米粒子。具体制备流程如图1所示。
实施例2：
本实施例与实施例1基本相同，不同之处在于，本实施例的电子给体为100μL 40mM四硫富瓦烯溶液，电子受体为10μL 40mM 2,3,5,6-四氟-7,7',8,8'-四氰二甲基对苯醌溶液，即电子给体:电子受体＝1:0.1，最终制得有机金属(TTF-F4TCNQ)纳米粒子；
本实施例与实施例1基本相同，不同之处在于，本实施例的电子给体为100μL 40mM四硫富瓦烯溶液，电子受体为1000μL 40mM 2,3,5,6-四氟-7,7',8,8'-四氰二甲基对苯醌溶液，即电子给体:电子受体＝1:10，最终制得有机金属(TTF-F4TCNQ)纳米粒子；
将实施例1和实施例2制得的TTF-F4TCNQ纳米粒子(电子给体与电子受体摩尔比分别为1:1，1:0.1，1:10)分别制成50μg/mL TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液，通过测定吸光度，判断不同摩尔比的电子给体与电子受体制得的有机金属纳米粒子溶液的紫外可见近红外吸收情况。
从图2可以看出，电子给体与电子受体摩尔比为1:1时所得TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液在近红外二区的吸收更高。
实施例3：有机金属纳米粒子溶液的制备
本实施例与实施例1制备有机金属纳米粒子的方法基本相同，不同之处在于，本实施例所用的电子给体和电子受体分别如下表1所示：
表1：
经实验发现，A-E组可以获得如实施例1所述的有机金属(DBTTF-F4TCNQ、BETTF-F4TCNQ、TTF-TCNQ、DBTTF-TCNQ、BETTF-TCNQ)纳米粒子。
性能检测：
通过紫外-可见-近红外光谱分析系统对实施例1和实施例3制备得到的有机金属(TTF-F4TCNQ、DBTTF-F4TCNQ、BETTF-F4TCNQ、TTF-TCNQ、DBTTF-TCNQ、BETTF-TCNQ)纳米粒子进行表征，结果如图3所示。
从图3可以看出，以7,7,8,8-四氰基对苯二醌二甲烷(TCNQ)为电子受体的有机金属纳米粒子的紫外吸收主要集中在紫外可见光区域，而以2,3,5,6-四氟-7,7',8,8'-四氰二甲基对苯醌(F4TCNQ)为电子受体的有机金属纳米粒子的紫外吸收可以达到近红外二区，TTF-F4TCNQ纳米粒子的紫外吸收达到了1165nm，DBTTF-F4TCNQ纳米粒子的紫外吸收达到了980nm，BETTF-F4TCNQ纳米粒子的紫外吸收达到了1125nm。
同时，测定了四硫富瓦烯(TTF)溶液、二苯并四硫富瓦烯(DBTTF)溶液、双(四溴乙基)连四硫酸盐(BETTF)溶液、7,7,8,8-四氰基对苯二醌二甲烷(TCNQ)溶液、2,3,5,6-四氟-7,7',8,8'-四氰二甲基对苯醌(F4TCNQ)溶液的紫外可见近红外吸收情况；
TTF溶液：将TTF溶于四氢呋喃中得到浓度为1mM的TTF溶液；
DBTTF溶液、BETTF溶液、TCNQ溶液、F4TCNQ溶液的制备方法与TTF溶液的制备方法基本相同，不同之处在于，溶质分别为DBTTF、BETTF、TNCQ、F4TCNQ。
结果如图4所示，从图4可以看出TTF溶液、DBTTF溶液、BETTF溶液、TCNQ溶液、F4TCNQ溶液在近红外区域没有发现明显紫外吸收峰。
以上结果说明：在形成有机金属纳米粒子时，电子给体TTF、DBTTF、BETTF与电子受体TNCQ、F4TCNQ之间形成了相互作用。
实施例4：以实施例1制备的TTF-F4TCNQ纳米粒子为例，对其性状进行检测
将实施例1制备得到的TTF-F4TCNQ纳米粒子制备成50μg/mL TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液。取50μg/mL TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液，通过马尔文粒度仪测定TTF-F4TCNQ纳米粒子的粒径为25.8nm(图5a))。
吸取一滴50μg/mL TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液滴于铜网上，滤纸吸去多余液体，室温干燥后置于透射电子显微镜下观察其形貌，电镜结果如图5b)。
结果显示TTF-F4TCNQ纳米粒子在水中形状规则，分散性良好，圆整，粒径约为20-30nm。
实施例5：以实施例1制备的TTF-F4TCNQ纳米粒子为例，对其光热性能进行检测
TTF纳米粒子的制备：将100μL电子给体(40mM四硫富瓦烯溶液，通过将四硫富瓦烯(TTF)溶于四氢呋喃中得到)、100μL表面活性剂(8mM泊洛沙姆188(F127)溶液，通过将泊洛沙姆188(F127)溶于四氢呋喃中得到)混合均匀后，得到混合液；将混合液在剧烈搅拌(500rpm)的条件下滴加到4mL纯净水中，搅拌4h后，用10kDa的透析袋透析后，干燥，即得TTF纳米粒子；
F4TCNQ纳米粒子的制备：将100μL电子受体(40mM 2,3,5,6-四氟-7,7',8,8'-四氰二甲基对苯醌溶液，通过将2,3,5,6-四氟-7,7',8,8'-四氰二甲基对苯醌(F4TCNQ)溶于二甲基亚砜中得到)、100μL表面活性剂(8mM泊洛沙姆188(F127)溶液，通过将泊洛沙姆188(F127)溶于四氢呋喃中得到)混合均匀后，得到混合液；将混合液在剧烈搅拌(500rpm)的条件下滴加到4mL纯净水中，搅拌4h后，用10kDa的透析袋透析后，干燥，即得F4TCNQ纳米粒子。
将TTF纳米粒子、F4TCNQ纳米粒子和实施例1制得的TTF-F4TCNQ纳米粒子分别制备成50μg/mL TTF纳米粒子溶液、F4TCNQ纳米粒子溶液和TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液。分别取50μg/mL TTF纳米粒子溶液、F4TCNQ纳米粒子溶液和TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液，用1W/cm21064nm激光照射10min，观察25min内TTF纳米粒子溶液、F4TCNQ纳米粒子溶液和TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液的温度变化。
结果如图6a)所示。TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液经激光照射10min后温度上升到70℃，而TTF纳米粒子溶液和F4TCNQ纳米粒子溶液仅上升到30℃。
改变TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液的浓度(0、20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL、100μg/mL)，分别用1W/cm2 1064nm激光照射10min，TTF-F4TCNQ纳米粒子表现出了浓度依赖的温度上升(如图6b))。
取50μg/mL TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液，改变激光器的功率(0.05W/cm2，0.3W/cm2，0.55W/cm2，0.75W/cm2，1W/cm2，2W/cm2)，用1064nm激光照射10min，观察TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液的温度变化。
结果如图6c)所示，TTF-F4TCNQ纳米粒子表现出了功率依赖的温度上升。
取50μg/mL TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液，用1W/cm2 1064nm激光照射10min，再撤去激光器，记录温度随时间的变化，降温记录15min，再使用1W/cm2 1064nm激光照射10min后再撤去激光器，如此重复4次。
结果如图6d)所示，TTF-F4TCNQ纳米粒子表现出良好的光热稳定性。同时光热转换效率计算为47.0％。
实施例6：以实施例1制备的TTF-F4TCNQ纳米粒子为例，检测其与谷胱甘肽和半胱氨酸的反应
取500μL TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液(400μg/mL)，40μL 0.01mol/L氨基酸(谷胱甘肽)溶液加入到1460μL纯净水中，得到混合溶液，然后将该混合溶液放在37℃孵育，测定其紫外吸收光谱随时间的变化。另外分别以半胱氨酸、天冬氨酸和丝氨酸替代谷胱甘肽进行上述实验，并以不加任何氨基酸的500μL 400μg/mL TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液加入到1500μL纯净水中，得到的混合溶液作为对照。
结果如图7所示。在含有谷胱甘肽和半胱氨酸的混合溶液中，混合溶液的紫外吸收逐渐降低，而在含有天冬氨酸和丝氨酸的混合溶液中，混合溶液的紫外吸收没有明显变化，说明TTF-F4TCNQ纳米粒子可以与谷胱甘肽和半胱氨酸反应。
取500μL 400μg/mL F4TCNQ溶液、40μL 0.01mol/L氨基酸(谷胱甘肽)溶液加入到1460μL纯净水中，得到混合溶液，然后将该混合溶液放在37℃孵育，得到F4TCNQ溶液与谷胱甘肽反应后的产物。另外采用上述同样方法制备F4TCNQ溶液与半胱氨酸反应后的产物。分别对谷胱甘肽、半胱氨酸、F4TCNQ溶液与谷胱甘肽反应后的产物和F4TCNQ溶液与半胱氨酸反应后的产物进行质谱分析。
进一步的质谱表明，如图8所示，谷胱甘肽的分子量[M+1]为308.10，当与F4TCNQ溶液孵育后，如图9所示，发现了氧化型谷胱甘肽的分子量[M+1]613.19，说明F4TCNQ可以氧化谷胱甘肽变为氧化型谷胱甘肽。同时，如图10所示，半胱氨酸的分子量为[M+1]为121.87，当与F4TCNQ溶液孵育后，如图11所示，发现了氧化型半胱氨酸的分子量[M+1]241.02，同时也发现了半胱氨酸与F4TCNQ偶联产物，分子量[M+1]为589.08，说明F4TCNQ也可以氧化半胱氨酸变为氧化型半胱氨酸，同时还可以与半胱氨酸发生偶联反应。
进一步，将TTF-F4TCNQ纳米粒子与肿瘤细胞培养，观察其是否降低细胞内谷胱甘肽的含量。具体为：选择处于生成活跃期的乳腺癌4T1肿瘤细胞(购于ATCC，下同)1×106个/mL接种于6孔板，培养24小时后，加入TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液与1640培养基混合使TTF-F4TCNQ纳米粒子的终浓度为40μg/mL，并设置光照组(1064nm，1W/cm2，5分钟)与非光照组，同时，未经TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液处理的4T1细胞也同样设置光照组(1064nm，1W/cm2，5分钟)与非光照组，每个样品设置3个平行样。孵育12小时后，细胞内谷胱甘肽的浓度通过谷胱甘肽试剂盒(购于上海碧云天生物技术有限公司)测定，同时通过检测巯基的荧光染料染色(购于艾博抗(上海)贸易有限公司)，通过激光共聚焦显微镜观察谷胱甘肽含量降低情况。
如图12所示，非光照条件下，相较于未经TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液处理的肿瘤细胞(见图12a)和12b)中的1)，经TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液处理的肿瘤细胞内谷胱甘肽的含量降低52.1％(见图12a)和12b)中的3)。而在光照条件下，相较于未经TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液处理的肿瘤细胞(见图12a)和12b)中的2)，经TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液处理的肿瘤细胞由于温度的上升，进一步的降低了细胞内谷胱甘肽的含量，达到了56.6％(见图12a)和12b)中的4)。
由于细胞内氧化还原平衡的破坏，进一步考察了细胞内活性氧水平，具体为：选择处于生成活跃期的乳腺癌4T1肿瘤细胞1×106个/mL接种于6孔板，培养24小时后，加入TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液使TTF-F4TCNQ纳米粒子的终浓度为40μg/mL，并设置光照组(1064nm，1W/cm2，5分钟)与非光照组，同时，未经TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液处理的4T1细胞也同样设置光照组(1064nm，1W/cm2，5分钟)与非光照组，每个样品设置3个平行样。孵育12小时后，细胞内活性氧水平通过活性氧检测试剂盒(购于上海碧云天生物技术有限公司)测定。
结果如图13所示，非光照条件下，相较于未经TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液处理的肿瘤细胞(见图13a)和13b)中的1)，经TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液处理的肿瘤细胞内活性氧强度可以提高约20.1倍(见图13a)和13b)中的3)。而在光照条件下，相较于未经TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液处理的肿瘤细胞(见图13a)和13b)中的2)，经TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液处理的肿瘤细胞内活性氧的含量提高了23.5倍(见图13a)和13b)中的4)。
实施例7：以实施例1制备的TTF-F4TCNQ纳米粒子为例，检测其生物安全性和体外抗肿瘤活性
选择处于生长活跃期的人胚胎肾细胞293正常细胞(购于ATCC公司，下同)与乳腺癌4T1肿瘤细胞约5000个细胞/100μL分别接种于96孔板，培养24小时后，加入TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液使TTF-F4TCNQ纳米粒子终浓度分别为10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL和100μg/mL，每个浓度设置5个平行样。继续培养24小时后，移除培养基，更换含有MTT的培养基(购于上海碧云天生物技术有限公司)，继续培养2小时；移除培养基后，加入150μL二甲基亚砜溶液，用酶标仪测定490nm处的吸光度，计算细胞存活率。
结果如图14a)所示，TTF-F4TCNQ纳米粒子浓度高达100μg/mL时，也未对正常细胞表现出明显毒性。对于肿瘤细胞，TTF-F4TCNQ纳米粒子表现出了浓度依赖的毒性，其半数抑制浓度达到了61.8μg/mL。
将乳腺癌4T1肿瘤细胞分别接种于96孔板，使细胞浓度约为5000个/100μL，培养24小时后，加入TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液使TTF-F4TCNQ纳米粒子终浓度分别为0μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL，施加近红外二区光照(1064nm，1W/cm2，5分钟)后，继续培养24小时后，移除培养基，更换含有MTT的培养基，继续培养2小时；移除培养基后，加入150μL二甲基亚砜溶液，用酶标仪测定490nm处的吸光度，计算细胞存活率。
施加近红外二区光照时(1064nm，1W/cm2，5分钟)，TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液表现出更强的毒性，比如TTF-F4TCNQ纳米粒子浓度为40μg/mL时，就能导致87.3％的肿瘤细胞死亡(图14b))。
实施例8：以实施例1制备的TTF-F4TCNQ纳米粒子为例，检测其体外激活免疫性能
光热治疗诱发肿瘤细胞免疫原性死亡，主要有三种标志物产生：钙网蛋白、高迁移率族蛋白、三磷酸腺苷。具体地，选择处于生长活跃期的乳腺癌4T1肿瘤细胞接种于直径35mm玻底皿中，使细胞浓度为1×106个/mL，培养24小时后，加入TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液使TTF-F4TCNQ纳米粒子浓度为40μg/mL，设置光照组(1064nm，1W/cm2，5分钟)与非光照组，同时未经TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液处理的4T1细胞也设置光照组(1064nm，1W/cm2，5分钟)与非光照组，孵育6小时后，吸取细胞上清液根据三磷酸酰胺试剂盒(购于上海碧云天生物技术有限公司)测定三磷酸腺苷含量，贴壁的细胞用PBS缓冲液(pH值7.4，浓度为10mM，购于上海碧云天生物技术有限公司，下同)洗3次，然后用4％多聚甲醛(购于上海碧云天生物技术有限公司)固定10分钟，用0.1％PBST缓冲液(通过向pH7.4、10mM PBS缓冲液中加入0.1％的Tween20得到)通透10分钟，然后用3％的血清蛋白封闭30分钟。
将上述不同方法处理的4T1细胞分别与钙网蛋白抗体(购于艾博抗(上海)贸易有限公司)，高迁移率族蛋白抗体(购于艾博抗(上海)贸易有限公司)在4℃的条件下孵育过夜，然后用PBS缓冲液洗涤3遍，再用带荧光分子的二抗(其中钙网蛋白抗体使用AlexaFluor 568荧光二抗，Alexa Fluor 568荧光二抗购于艾博抗(上海)贸易有限公司；高迁移率族蛋白抗体使用FITC荧光二抗，FITC荧光二抗购于艾博抗(上海)贸易有限公司)室温孵育2小时，PBS缓冲液洗涤后加入染细胞核的试剂(Hoechst 33342，购于艾博抗(上海)贸易有限公司)后，用激光共聚焦显微镜观察。
图15a)所示，非光照条件下，经TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液处理的肿瘤细胞有部分钙网蛋白迁移到细胞膜上(见图15a)中的3)，且有高迁移率族蛋白从细胞核释放出(见图15b)中的3)；当施加光照后，有更多的钙网蛋白迁移到细胞膜(见图15a)中的4)，高迁移率族蛋白的释放也进一步增加(见图15b)中的4)，而未经TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液处理的4T1细胞在光照后没有发现明显变化(见图15a)和15b)中的2)，说明单纯的光照本身不会激活免疫反应。
同时通过三磷酸酰胺试剂盒测定上述经不同方法处理后的肿瘤细胞上清液中三磷酸腺苷的含量显示，如图15c)所示，光照条件下，经TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液处理的肿瘤细胞上清液中三磷酸腺苷的含量比非光照条件下，经TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液处理的肿瘤细胞上清和非光照条件下，未经TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液处理的肿瘤细胞上清中的三磷酸腺苷含量分别高出了1.3倍和1.9倍，证明了TTF-F4TCNQ纳米粒子通过破坏细胞内氧化平衡而表现出一定的免疫激活能力，当施加光照后，能进一步促进免疫效果。
树突状细胞(DCs)是重要的抗原递呈细胞，将抗原递送到淋巴结进一步促进免疫的发生。DCs细胞是从六周龄Balb/c小鼠(购于InVivos公司，下同)的骨髓中新鲜提取出的，将新提取的1×106个/mL DCs细胞接种于6孔板中，加入TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液使TTF-F4TCNQ纳米粒子终浓度为40μg/mL，未加入TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液设置为空白组，每个样品设置3个平行样。孵育6小时后，DCs细胞内活性氧水平通过活性氧检测试剂盒(购于上海碧云天生物技术有限公司)测定。结果显示TTF-F4TCNQ纳米粒子孵育后的DCs细胞的荧光强度增加，证明TTF-F4TCNQ纳米粒子能够增加DCs细胞的活性氧水平(见图16a))。
同时，将新提取的1×106个/mL DCs细胞接种于6孔板中，加入TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液使TTF-F4TCNQ纳米粒子终浓度为40μg/mL，未加入TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液设置为空白组，每个样品设置3个平行样。将上述孵育后的DCs细胞用带不同荧光的抗体APC-CD11c，FITC-CD80，PE-CD86抗体染色，发现CD11c+CD80+CD86+的比例增加，证明TTF-F4TCNQ纳米粒子自身能够促进DCs细胞成熟(见图16b))。
为了考察免疫原性死亡诱导的DCs熟化，采用transwell板(孔径为3μm，12孔板，购于康宁公司)进行研究。其中transwell板的小室中放入1×106个/mL 4T1肿瘤细胞，下层的孔板中放入1×106个/0.5mL DCs细胞。培养过夜后，再取出上室的培养基，加入TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液1mL，使TTF-F4TCNQ纳米粒子终浓度为40μg/mL，未加入TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液设置为空白组，每个样品设置3个平行样；并对TTF-F4TCNQ纳米粒子处理的4T1细胞和空白组4T1细胞分别设置光照组(1064nm，1W/cm2，5分钟)与非光照组，孵育6小时后，将下层的DCs细胞收集起来，用带不同荧光的抗体APC-CD11c，FITC-CD80，PE-CD86抗体染色。
发现光照条件下，经TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液处理的肿瘤细胞与DCs细胞共孵育后，DCs细胞的CD11c+CD80+CD86+的比例增加(46.6％)，分别是非光照条件下，经TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液处理的肿瘤细胞(36.2％)和非光照条件下，未经TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液处理的肿瘤细胞(25.6％)的1.3倍和1.8倍(见图17)，说明TTF-F4TCNQ纳米粒子可诱导肿瘤细胞免疫原性死亡并促进DCs细胞熟化。
实施例9：以实施例1制备的TTF-F4TCNQ纳米粒子为例，考察其光声成像性能
首先考察了TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液的光声成像性能。将不同浓度的TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液(0μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、400μg/mL、500μg/mL)在1064nm条件下置于LOIS-3D 3D光声成像仪中检测得到。
图18a)发现在1064nm条件下，随着TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液浓度的上升，光声强度成线性上升，说明TTF-F4TCNQ具有随浓度依赖的光声信号。
在6周龄Balb/c小鼠(约20g，购于InVivos公司)右侧皮下注射5×106个/100μL乳腺癌4T1肿瘤细胞，待肿瘤长至100mm3时，在尾静脉按5mg/kg的剂量注射TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液，分别在不同的时间点(0h，2h，4h，6h，12h，24h)条件下将小鼠放入LOIS-3D 3D光声成像仪中，获得不同时间点的小鼠光声成像图像及光声强度值。
如图18b)和图18c)所示，发现在0～6h内，肿瘤处的光声信号逐渐增强，且在6小时时达到最高，证明TTF-F4TCNQ纳米粒子在体内外均具有良好的光声成像性能，且在6小时时在肿瘤处富集最高。
实施例10：以实施例1制备的TTF-F4TCNQ纳米粒子为例，考察其体内抗肿瘤性能
在6周龄Balb/c小鼠(约20g，购于InVivos公司)建立单侧肿瘤模型，即在小鼠右侧皮下注射5×106/100μL个乳腺癌4T1肿瘤细胞，待肿瘤长至100mm3时，将小鼠随机分为2组，每组5只，分别为PBS光照组和TTF-F4TCNQ光照组；
TTF-F4TCNQ光照组：尾静脉注射TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液(5mg/kg)，在光声成像数据的指导下，在注射后的第6小时，给予肿瘤光照(1064nm，1W/cm2，时间分别为0min、1min、2min、3min、4min、5min)。
同时以PBS缓冲液替代上述TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液对小鼠尾静脉注射，在注射后的第6小时，给予肿瘤光照(1064nm，1W/cm2，时间分别为0min、1min、2min、3min、4min、5min)，记为PBS光照组；
如图19所示，随着光照时间的增加，TTF-F4TCNQ光照组的温度逐渐从34℃上升到47.9℃，而PBS光照组仅增长到38℃左右。
在6周龄Balb/c小鼠(约20g，购于InVivos公司)建立双侧肿瘤模型，即先在小鼠右侧皮下先注射5×106个/100μL乳腺癌4T1肿瘤细胞，记为原位瘤；5天后，在左侧皮下注射1×107个/100μL乳腺癌4T1肿瘤细胞，记为远端瘤；待右侧肿瘤长至50mm3时，将小鼠随机分组，每组5只，分组为：PBS组，TTF-F4TCNQ组，TTF-F4TCNQ光照组，TTF-F4TCNQ+aPD-1组，TTF-F4TCNQ光照+aPD-1组；每两天记录一次体重，用游标卡尺记录左右两侧瘤长度与宽度，并计算出肿瘤体积(1/2×长×长×宽)，共观察14天。
TTF-F4TCNQ光照组：尾静脉注射TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液(5mg/kg)，在光声成像数据的指导下，在注射TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液后的第6小时，给予右侧肿瘤光照(1064nm，1W/cm2，5min)。同时以PBS缓冲液替代上述TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液对小鼠尾静脉注射，记为PBS组；
以尾静脉注射TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液(5mg/kg)不经光照处理的小鼠，记为TTF-F4TCNQ组。
aPD-1作为免疫检查点抑制剂，是用来降低肿瘤细胞对于免疫系统的逃逸，分别于注射TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液后的第2天、5天、8天尾静脉给予aPD-1(1mg/kg)治疗。具体地，
TTF-F4TCNQ+aPD-1组：当右侧肿瘤长至50mm3时，尾静脉注射TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液(5mg/kg)，分别于注射TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液后的第2天、5天、8天尾静脉给予aPD-1(1mg/kg)治疗，记为TTF-F4TCNQ+aPD-1组。
TTF-F4TCNQ光照+aPD-1组：当右侧肿瘤长至50mm3时，尾静脉注射TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液(5mg/kg)，在注射TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液后的第6小时，给予右侧肿瘤光照(1064nm，1W/cm2，5min)，然后分别于注射TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液后的第2天、5天、8天尾静脉给予aPD-1(1mg/kg)治疗，记为TTF-F4TCNQ光照+aPD-1组。
PBS组、TTF-F4TCNQ组、TTF-F4TCNQ光照组、TTF-F4TCNQ+aPD-1组和TTF-F4TCNQ光照+aPD-1组的小鼠的双侧肿瘤体积变化如图20所示，TTF-F4TCNQ组表现出了轻微的肿瘤抑制，对于原位瘤抑制率为20.5％，远端瘤抑制率为18.9％。
当赋予光照后，TTF-F4TCNQ光照组对于原位瘤的抑制率达到了80.1％，对远端瘤的抑制率也到达了63.9％。
当进一步添加aPD-1后，TTF-F4TCNQ光照+aPD-1组对于原位瘤的抑制率进一步增加到了86.8％，对远端瘤的抑制率也增加到了83.8％。
小鼠的体重变化如图21所示，在这14天的治疗周期内，小鼠体重几乎没有明显的变化，说明TTF-F4TCNQ纳米粒子具有良好的生物安全性。同时，通过对各处理组(PBS组、TTF-F4TCNQ组、TTF-F4TCNQ光照组、TTF-F4TCNQ+aPD-1组和TTF-F4TCNQ光照+aPD-1组)小鼠主要的心，肝，脾，肺，肾器官进行苏木精-伊红染色及组织学分析(图22)，未发现有明显的组织损伤，进一步证明了TTF-F4TCNQ纳米粒子良好的生物安全性。
实施例11：以实施例1制备的TTF-F4TCNQ纳米粒子为例，考察其体内免疫激活性能
在6周龄小鼠(约20g，购于InVivos公司)建立双侧肿瘤模型，右侧皮下先注射5×106个/100μL肿瘤细胞，5天后，在左侧皮下注射1×107个/100μL肿瘤细胞，待右侧肿瘤长至50mm3时，将小鼠随机分为5组，每组5只，分组为：PBS组，TTF-F4TCNQ组，TTF-F4TCNQ光照组，TTF-F4TCNQ+aPD-1组，TTF-F4TCNQ光照+aPD-1组。
TTF-F4TCNQ光照组：尾静脉注射TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液(5mg/kg)，在注射后的第6小时，给予右侧肿瘤光照(1064nm，1W/cm2，5min)。第7天时处死小鼠，收集血液，肿瘤，脾脏。
同时以PBS缓冲液替代上述TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液对小鼠尾静脉注射，记为PBS组；
以尾静脉注射TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液(5mg/kg)不经光照处理的小鼠，记为TTF-F4TCNQ组。
TTF-F4TCNQ+aPD-1组：当右侧肿瘤长至50mm3时，尾静脉注射TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液(5mg/kg)，然后于注射TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液后的第2天尾静脉给予aPD-1(1mg/kg)治疗，记为TTF-F4TCNQ+aPD-1组。
TTF-F4TCNQ光照+aPD-1组：当右侧肿瘤长至50mm3时，尾静脉注射TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液(5mg/kg)，在注射TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液后的第6小时，给予右侧肿瘤光照(1064nm，1W/cm2，5min)，然后于注射TTF-F4TCNQ纳米粒子溶液后的第2天尾静脉给予aPD-1(1mg/kg)治疗，记为TTF-F4TCNQ光照+aPD-1组。
首先对考察了PBS组、TTF-F4TCNQ组和TTF-F4TCNQ光照组小鼠体内诱导免疫原性死亡的效果，将原位瘤组织切片后，用钙网蛋白抗体(购于艾博抗(上海)贸易有限公司，1:200)进行一抗染色4℃过夜，PBS缓冲液洗涤3遍后，加入CY3连接的二抗(购于艾博抗(上海)贸易有限公司)进行染色50min，再进行细胞核(DAPI)染色(购于武汉塞维尔生物科技有限公司)后进行显微镜观察。
如图23所示，发现TTF-F4TCNQ光照组表现出了最高的钙网蛋白荧光强度，分别是TTF-F4TCNQ组和PBS组的3.2倍和6.3倍。
然后分析了PBS组，TTF-F4TCNQ组，TTF-F4TCNQ光照组，TTF-F4TCNQ+aPD-1组，TTF-F4TCNQ光照+aPD-1组的小鼠脾脏中DCs细胞成熟情况。
如图24所示，TTF-F4TCNQ组的DCs成熟度从PBS组的15.2％上升到了21.8％，在1064nm激光光照后(即：TTF-F4TCNQ光照组)DCs成熟度进一步上升到了36.3％，当既施加1064nm光照，又加入aPD-1后(即TTF-F4TCNQ光照+aPD-1组)，小鼠表现出了最高的DCs成熟度(49.9％)。
接着考察了PBS组，TTF-F4TCNQ组，TTF-F4TCNQ光照组，TTF-F4TCNQ+aPD-1组，TTF-F4TCNQ光照+aPD-1组小鼠原位瘤和远端瘤组织中CD8阳性T细胞的表达。另外分析了PBS组，TTF-F4TCNQ组，TTF-F4TCNQ光照组，TTF-F4TCNQ+aPD-1组，TTF-F4TCNQ光照+aPD-1组小鼠脾脏中CD4阳性T细胞的表达。
如图25和图26所示，TTF-F4TCNQ光照组分别在原位瘤和远端瘤中表现出了17.5％和12.9％的CD8阳性T细胞表达，分别是TTF-F4TCNQ组原位瘤和远端瘤的1.9和1.8倍。当加入aPD-L1(即TTF-F4TCNQ+aPD-1组)后，CD8阳性细胞在原位瘤和远端瘤中的表达进一步增加到25.6％和15.7％。在脾脏中也观察到了类似的CD8阳性T细胞情况，同时脾脏中的CD4阳性T细胞也表现出了相同的趋势，即TTF-F4TCNQ光照+aPD-1组脾脏中的CD4阳性T细胞分别是TTF-F4TCNQ光照组，TTF-F4TCNQ组和PBS组的1.1倍，1.7倍和2.2倍(见图27)。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种有机金属纳米粒子在制备体内外光声成像试剂或光热治疗试剂中的应用，其特征在于，包括如下步骤：将电子给体、电子受体混匀后再加入表面活性剂，混匀，得到混合液，然后将混合液在搅拌条件下加入水中，透析，干燥，即得有机金属纳米粒子；
所述的电子给体为四硫富瓦烯；
所述的电子受体为2,3,5,6-四氟-7,7',8,8'-四氰二甲基对苯醌；
所述的电子给体与电子受体摩尔比为1:1。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，
所述的表面活性剂包括泊洛沙姆188、聚乙二醇和DSPE-PEG2000中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，
所述的电子给体和表面活性剂按摩尔比50～1:1～2计算；
所述的搅拌的条件为：200～1000 rpm搅拌0.1～24h；
所述的透析通过2～20 kDa的透析袋透析。
4. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的光热治疗的激光波长为630 nm、660 nm、680 nm、730 nm、808 nm、980 nm和1064 nm中的至少一种；
所述的光热治疗的激光强度为0.05～2W/cm2。
5.一种有机金属纳米粒子在制备治疗肿瘤药物中的应用，其特征在于，包括如下步骤：将电子给体、电子受体混匀后再加入表面活性剂，混匀，得到混合液，然后将混合液在搅拌条件下加入水中，透析，干燥，即得有机金属纳米粒子；
所述的电子给体为四硫富瓦烯；
所述的电子受体为2,3,5,6-四氟-7,7',8,8'-四氰二甲基对苯醌；
所述的电子给体与电子受体摩尔比为1:1。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，
所述的表面活性剂包括泊洛沙姆188、聚乙二醇和DSPE-PEG2000中的至少一种。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，
所述的电子给体和表面活性剂按摩尔比50～1:1～2计算；
所述的搅拌的条件为：200～1000 rpm搅拌0.1～24h；
所述的透析通过2～20 kDa的透析袋透析。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤包括肺癌、胰腺癌、膀胱癌、乳腺癌、胃癌、食管癌、肠癌和黑色素瘤中的至少一种。
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