CN114642653B - 氧化纤维素凝胶微球及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了氧化纤维素凝胶微球及其制备方法和应用,所述氧化纤维素凝胶微球包含若干个相互交联的氧化纤维素纳米体。本发明的氧化纤维素凝胶微球包埋率高,具有较好的缓释效果,且可以提高益生菌载肠黏液的黏附定植效果,应用前景好。制备氧化纤维素凝胶微球的方法操作简便,用时短,适于规模化生产。
Description
技术领域
本发明涉及生物领域。具体地,本发明涉及氧化纤维素凝胶微球及其制备方法和应用。
背景技术
纤维素是一种线性生物聚合物,天然存在于植物细胞中,如木材和棉花。它是世界上最丰富的聚合物,具有良好的生物相容性,低成本,低密度,高强度和良好的机械性能等特性,是膳食纤维的一种。人体消化道内不存在纤维素酶,只有结肠中存在的微生物才能使纤维素被分解利用,因此将纤维素作为材料进行各类活性物质或细胞的递送可以避免消化酶对载体的破坏,是具有良好应用前景的一类生物材料。除此之外,通过机械或化学处理(如TEMPO氧化处理)纤维素纤维可以转化为纤维素纳米纤维或纤维素纳米球,分子量更小,且经验证具有表面活性剂的性质,可以调控脂肪的分解。
氧化纤维素是指通过对纤维素进行氧化处理,以使其中的羟基转化为羧基,从而提高纤维素的溶解度、降低水溶胶黏度、提高稳定性等,从而提高其应用价值。引入大量羧基后可作为功能基团与阳离子(如Fe3+、Ca2+、Mn2+、Al3+、Ag+等阳离子)通过配位作用交联。利用反向乳液法,可以在油包水乳液中通过阳离子交联氧化纤维素制成带有可控负电荷的微球实现对带正/负电荷活性物质(如花色苷、姜黄素、辣椒素和槲皮素等)的吸附、对细胞(如益生菌)的包埋。
然而,目前的氧化纤维素微球及其制备方法仍有待研究。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题。
在本发明的一个方面,本发明提出了一种氧化纤维素凝胶微球。根据本发明的实施例,所述氧化纤维素凝胶微球包含若干个相互交联的氧化纤维素纳米体。
发明人在前期研究中以氧化魔芋葡甘露聚糖制备微球载体,但是其包埋率仅为10~20%。进而,发明人对微球载体进行深入研究,发现制备原料的不同会影响微球载体的包埋率,进而影响其包埋活性物质的作用效果,也增加了生产和使用成本。进一步地,发明人发现,采用氧化纤维素形成的微球具有较好的包埋效果,包埋率不低于50%。
另外,发明人发现,若以氧化魔芋葡甘露聚糖制备微球载体,载物微球在肠道中存在1小时后便会破裂,在此条件下微球只能到达肠道前端,无法到达后端的结肠部位,而结肠部位的微环境又非常重要,到达结肠部位可以更好地发挥作用。以氧化纤维素制备微球载体,微球载体在胃液环境下非常稳定,不会破裂。微球载体在肠液环境下会发生溶胀现象,但仅溶胀不崩解,消化4h后微球尺寸变大,结构较之前更疏松,且仍能保持球形结构,从而使大部分活性物质(包括益生菌)在微球内部实现缓慢释放,微球的框架起到很好的承载作用,进而达到缓释效果,且可以提高益生菌载肠黏液的黏附定植效果。由此,根据本发明实施例的氧化纤维素凝胶微球具有较好的包埋效果,包埋率高,且具有较好的缓释效果,应用前景好。
根据本发明的实施例,上述氧化纤维素凝胶微球还可以具有下列附加技术特征:
根据本发明的实施例,所述氧化纤维素纳米体呈球状,粒径为30~100nm;或者所述氧化纤维素纳米体呈纤维状,长度为100~1000nm。
氧化纤维素凝胶微球具有两种结构,一种是表面和内部都是由球状氧化纤维素纳米体(简称纳米球)构成的,并且纳米球会包裹在微生物表面,形成coating的结构,即使之后微球解体微生物表面也会有纳米球包裹,提高微生物与肠道的黏附性。另一种是表面和内部由纵横交错的纤维状氧化纤维素纳米体构成,这种类型的微球内部空间更大,有助于微生物在微球中原位生长,形成一个菌团微球体。
在本发明的另一方面,本发明提出了一种载物微球。根据本发明的实施例,所述载体微球包括:前面所述氧化纤维素凝胶微球;活性物质,所述活性物质包埋于所述氧化纤维素凝胶微球中。由此,根据本发明实施例的载物微球可以有效地包埋活性物质,包埋率高。并且,可在胃液中稳定存在,在肠道内缓慢释放活性物质,更好地发挥药效,且可以提高益生菌载肠黏液的黏附定植效果。尤其是可在结肠部位释放,从而有效地治疗结肠疾病。
根据本发明的实施例,所述活性物质选自微生物、小分子化合物、蛋白质和核酸的至少之一;所述小分子化合物选自花色苷、姜黄素、辣椒素和槲皮素的至少之一;所述载物微球的活性物质包埋率不低于50%,例如不低于65%。
本发明的氧化纤维素凝胶微球能够包埋益生菌,如实现对厌氧菌(如BB12、A6)和兼性厌氧菌(如WCFS1和LGG)的包埋,包埋率为60~90%,包埋稳定性高,并且显著提高益生菌耐胃酸的稳定性和存活率,与未包埋的游离菌相比,包埋后的益生菌在模拟胃肠液中的存活率能提高30~60%。另外,本发明的氧化纤维素凝胶微球可以增强益生菌在肠道黏附定植的能力,与益生菌之间的作用力强,且微球与肠黏液的相互作用力较大,可以提高益生菌在肠道的黏附性,调控肠道的菌群平衡,提高了有益菌在肠道的定植和繁殖,抑制了有害菌的生长。
本发明的氧化纤维素凝胶微球能够包埋水溶性小分子,如花色苷,包埋率为60~90%,包埋稳定性高,提高花色苷应对食品加工和储藏过程的稳定性,包括pH值、温度、光照和酶等,从而提高花色苷在肠道的吸收利用率。
本发明的氧化纤维素凝胶微球可以包埋脂溶性生物活性物质,如姜黄素、虾青素、β-胡萝卜素、辣椒素和槲皮素等,包埋率为65~85%,包埋稳定性高,显著提高活性物质的水溶性、耐胃酸稳定性和生物利用率,使脂溶性活性物质可以更好的被机体吸收利用。
本发明的氧化纤维素凝胶微球可以用来包埋蛋白类大分子物质,如酶类(过氧化物酶、溶菌酶和免疫球蛋白等)等,包埋率为70~85%,包埋稳定性高,可以提高蛋白质类分子的耐胃酸和耐蛋白酶的能力,提高其被小肠吸收的能力。
在本发明的又一方面,本发明提出了一种药物、食品和保健品。根据本发明的实施例,所述药物、食品或保健品含有前面所述载物微球。如前所述,载物微球能够包埋大量活性物质,从而可使活性物质更好地发挥作用,同时可以减少药物、食品和保健品的使用,降低使用成本。
在本发明的又一方面,本发明提出了前面所述氧化纤维素凝胶微球或载物微球在制备食品或药品中的应用。根据本发明的实施例,所述食品或药品用于治疗肠道疾病。如前所述,氧化纤维素凝胶微球包埋活性物质的能力较好,包埋率高,并具有缓释作用,且可以提高益生菌载肠黏液的黏附定植效果,由此,可以有效地治疗肠道疾病,减少食品或药品的使用量。
根据本发明的实施例,所述肠道为结肠。该载物微球在胃液环境下非常稳定,不会破裂。微球载体在肠液环境下会发生溶胀现象,但仅溶胀不崩解,消化4h后仍能保持球形结构,并可以使大部分活性物质存在微球内部实现缓慢释放,从而可在结肠内释放活性物质,发挥作用。
在本发明的又一方面,本发明提出了一种制备前面所述氧化纤维素凝胶微球的方法。根据本发明的实施例,所述方法包括:步骤1:将氧化纤维素溶液加入到含有第一乳化剂的油相中,搅拌,得到油包水乳液;步骤2:将含有交联剂和第二乳化剂的溶液加入到所述油包水乳液中,搅拌,得到氧化纤维素凝胶微球。
发明人最初将氧化纤维素与强氧化物(铁离子化合物)制成水相,将水相加入到油相中,搅拌制备氧化纤维素微球。但是,由于铁离子的氧化性较强,直接与氧化纤维素混合会形成块状凝胶而无法加入油相中分散为均匀的乳液,所以只能先将氧化纤维素和亚铁离子混合之后,再逐渐氧化为三价铁进行交联,故耗时时间更久,载体内的活性物质收到的损伤更严重。
有鉴于此,发明人对制备方法进行改进,分别将氧化纤维素和阳离子(由交联剂提供)分别在油相中形成液滴,避免了二者的直接接触,可以适用于各种类型的离子型交联剂,尤其是可以采用如铁离子等的强交联能力的交联剂,故整个过程耗时更短(只需30分钟左右),有利于活性物质或细胞保持活性。另外,该方法形成的微球质构紧密,包埋效果更佳,微生物的包埋率更高,并且可以耐受肠道pH的影响实现包埋物质的缓释,方便药物或微生物在肠道后部如结肠部分释放。
根据本发明的实施例,所述交联剂为离子化合物,优选地,所述离子化合物中阳离子选自Fe3+、Ca2+、Mn2+、Al3+、Ag+,更优选Fe3+。由于Fe3+的氧化能力强,缩短交联时间。
根据本发明的实施例,所述含有交联剂和第二乳化剂的溶液与所述油包水乳液的混合液中,油相与水相的体积比为5:1~20:1。由此,可以使交联剂在油相中形成稳定的油包水乳液,从而有利于交联剂逐渐向多糖(氧化纤维素)液滴迁移交联。如比值偏大会导致交联剂所形成的乳液不够稳定,比值偏小会导致整体乳液中水相比例过大,形成不稳定乳液产生大块的多糖凝胶。
根据本发明的实施例,所述氧化纤维素在水相中的含量为5~10质量体积%,单位为mg/mL。由此,可以使氧化纤维素在油相中形成大小适中、粒径均一且状态稳定的液滴。若氧化纤维素含量过高,会导致偏大液滴的产生,从而易造成液滴间的聚集和沉降,产生大块多糖凝胶或沉淀聚集物;若含量过低,则无法形成足量的微球体实现活性物质尤其是微生物的包封,导致包埋率偏低,保护效果不佳的情况。
根据本发明的实施例,所述交联剂与所述氧化纤维素的质量比为1:2~10:1,优选1:2~2:1。由此,会形成交联度适中、密封性好的氧化纤维素微球体。若比值过高,会导致交联剂量偏大,多余的交联剂会影响所包封的活性物质的活性,尤其是微生物的活性,导致微生物存活率降低;若比值过低,则无法形成交联稳定的微球体,使微球体结构松散难以保护微球体内部的活性成分。
根据本发明的实施例,所述油相选自石蜡油、大豆油、葵花籽油和橄榄油的至少之一。
根据本发明的实施例,所述第一乳化剂选自span80,所述第二乳化剂选自Tween80或Tween20。Span80的亲水亲油平衡值(HLB值)为4.3,适合作为油包水型乳剂的乳化剂,且相比其他的油包水型乳化剂如硬脂酸锌和聚醚等更适合应用于食品药品中,且乳化效果更佳。Tween80的HLB值为15,Tween20的HLB值为16.7,这两类乳化剂均可与第一步加入的span80可以形成混合乳化剂,从而使整体的乳化剂形成更稳定的油包水乳液,这种复配的乳化剂相较于单一的乳化剂稳定性更佳。
根据本发明的实施例,所述第一乳化剂的添加量为1~2g/20g所述油相,所述第二乳化剂的添加量为5~10mg/20g所述油相。若乳化剂添加量过高会产生一定的生物毒性,提高成本且不能产生更优的效果,若乳化剂添加量不足则无法形成均一稳定的乳液,导致微球体形态不规则,容易破损。
根据本发明的实施例,步骤1中,所述搅拌的转速为500~1500rpm,时间为5~10min;步骤2中,所述搅拌的转速为500~1500rpm,时间为10~30min。在此条件下,可以短时间形成微球。
根据本发明的实施例,所述方法进一步包括:步骤3:将所述搅拌所得含有氧化纤维素凝胶微球的溶液进行离心,收集沉淀,用含有所述第二乳化剂的溶液洗涤,收集沉淀并保存于水中。
根据本发明的实施例,所述氧化纤维素是通过将纤维素上C6位的伯醇基团转化为羧基而获得的。引入大量羧基后可作为功能集团与阳离子通过配位作用交联。利用反向乳液法,可以在油包水乳液中通过阳离子交联氧化纤维素制成带有可控负电荷的微球实现对带正/负电荷活性物质(如花色苷、姜黄素、辣椒素和槲皮素等)的吸附、对细胞(如益生菌)的包埋。
根据本发明的实施例,所述氧化纤维素是通过TEMPO法氧化纤维素获得的。2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧自由基(2,2,6,6-tetramethyl-piperidine-1-oxyl,TEMPO)氧化法是近年来新起的一种具有高活性和高选择性绿色环保氧化方法。TEMPO是一种有机小分子催化剂。TEMPO氧化法反应条件温和,催化剂用量少(0.1%),可通过固载化的方法避免残留于原料中,并可循环使用。TEMPO氧化的优点是高选择性和氧化度可控。可以选择性地氧化多糖的单糖单元(葡萄糖、甘露糖)上C6位上的伯醇基团为羧基,且氧化度精确可控,最高可达90%。通过TEMPO氧化处理后的纤维素溶解度提高、水溶胶黏度降低、稳定性增强。
需要说明的是,本发明对于TEMPO法的具体操作方式不做严格限定,可以采用本领域常规技术手段实施,并根据实际情况灵活选择。
根据本发明的实施例,所述氧化纤维素具有巯基修饰。引入巯基对纤维素进行修饰,如使用氧化纤维素与半胱氨酸反应而获得,或者通过美拉德反应等其他途径获得具有巯基修饰的氧化纤维素。如此便可在制备过程中形成二硫键,实现双交联,使得微球载体的结构更加稳定。
根据本发明的实施例,所述纤维素选自玉米芯纤维素、棉花纤维素或木纤维素,优选玉米芯纤维素。上述纤维素均可以氧化为氧化纤维素,进而制备成微球,其中,玉米芯作为农业废弃物,是环境友好的再利用资源,效果较佳。
根据本发明的实施例,进行TEMPO法氧化纤维素之前,将所述纤维素在氢氧化钠溶液中溶胀1~4小时。不进行溶胀处理,得到的微球中氧化纤维素纳米体呈纤维状,经过上述溶胀处理,得到的微球中氧化纤维素纳米体呈球状。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出,部分将从下面的描述中变得明显,或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解,其中:
图1显示了由球状氧化纤维素纳米体构成的氧化纤维素凝胶微球的形态以及微球表面放大后的微观形态;
图2显示了由纤维状氧化纤维素纳米体构成的氧化纤维素凝胶微球的形态以及微球表面放大后的微观形态;
图3显示了由球状氧化纤维素纳米体构成的氧化纤维素凝胶微球包埋益生菌(LGG)的形态;
图4显示了由纤维状氧化纤维素纳米体构成的氧化纤维素凝胶微球包埋益生菌(LGG)的形态;
图5显示了益生菌(LGG)在氧化纤维素微球中的装载和分布情况;
图6显示了益生菌(LGG)在氧化纤维素微球中的3D分布情况;
图7显示了氧化纤维凝胶微球在模拟胃肠液中的消化情况;
图8显示了氧化魔芋凝胶微球在模拟胃肠液中的消化情况;
图9显示了载益生菌氧化纤维素凝胶微球在模拟肠液中4h的消化情况;
图10显示了球状氧化纤维素纳米体与益生菌(LGG)之间的相互作用情况;
图11显示了益生菌(LGG)在氧化纤维素方形膜上的黏附情况;
图12显示了由球状氧化纤维素纳米体构成的载益生菌氧化纤维素凝胶微球内部,益生菌(LGG)与氧化纤维素之间的相互作用情况;
图13显示了载菌(NZ9000)氧化纤维素凝胶微球在肠黏液中的黏附和渗透情况;
图14显示了益生菌(WCFS1)被氧化纤维素凝胶微球包埋前后在小鼠胃肠道中的分布情况。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解,下面的实施例仅用于说明本发明,而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的,按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
在该实施例中,按照下列方法制备包含若干个相互交联的球状氧化纤维素纳米体的氧化纤维素凝胶微球:
1、TEMPO氧化纤维素的制备
(1)称取5g NaOH溶于250ml去离子水中,即浓度为0.5mol/L。
(2)用浓盐酸标定10ml NaClO至pH为10。
(3)将玉米芯纤维素在4M的NaOH溶液中溶胀4小时,然后称取1g溶胀后的玉米芯纤维素溶解到100ml的沸水中,用冰块降温至8~10℃。
(4)分别称取0.008g TEMPO(2,2,6,6-四甲基哌啶-氮-氧化物)和NaBr 0.4g,少量水(约1ml)溶解,加入到上述溶液中,用2mol/L的NaOH调pH至10,保持温度在10℃左右。
(5)向上述溶液中加入pH为10的NaClO溶液,氧化开始发生,当溶液的pH开始降低时,向溶液中逐滴加入0.5mol/L的NaOH溶液,使溶液pH维持在10。
(6)当NaOH加入量为6.25ml时,加入2ml乙醇终止反应。5min后加入0.05g NaBH,搅拌1h。
(7)用4mol/L的盐酸将pH调至3,并搅拌1h。
(8)用1mol/L的NaOH将pH调至7,并搅拌1h。
(9)搅拌状态下加入1~1.5倍体积的乙醇,有絮状物产生,静置1h,抽滤,乙醇洗三次,丙酮洗一次,将所得滤饼放在通风橱,使丙酮完全挥发。
(10)将干燥的滤饼碾碎,烘干或晾干,所得粉末即为TEMPO氧化纤维素。
2、氧化纤维素凝胶微球的制备
(1)将上述制备的氧化纤维素纳米球配制成50mg/mL的多糖溶液。
(2)配制10%(质量分数)的氯化铁溶解在去离子水中,充分溶解。配制1%(质量分数)的Tween80水溶液,将等体积的阳离子溶液和Tween80水溶液混合备用。
(3)将1g的Span80溶解到20g石蜡油中,搅拌均匀。
(4)将0.5mL的多糖溶液加入油相中,在1000rpm的速度下搅拌10min,形成均一乳液。
(5)将1mL的氯化铁-Tween80混合溶液逐滴加入油相中,继续在1000rpm的速度下搅拌30min,使得氧化纤维素在水相液滴中形成稳固交联的水凝胶微球。
(6)交联结束后,在3000rpm,2min的离心条件下,用pH=3~5 1%的Tween80水溶液洗涤2次,最后一步洗涤出来的微球沉淀溶于2mL pH=3~5的超纯水中。样品储存于4℃。
实施例2
在该实施例中,按照下列方法制备包含若干个相互交联的纤维状氧化纤维素纳米体的氧化纤维素凝胶微球:
1、TEMPO氧化纤维素的制备
(1)称取5g NaOH溶于250ml去离子水中,即浓度为0.5mol/L。
(2)用浓盐酸标定10ml NaClO至pH为10。
(3)称取1g玉米芯纤维素溶解到100ml的沸水中,用冰块降温至8~10℃。
(4)分别称取0.008g TEMPO(2,2,6,6-四甲基哌啶-氮-氧化物)和NaBr 0.4g,少量水(约1ml)溶解,加入到上述溶液中,用2mol/L的NaOH调pH至10,保持温度在10℃左右。
(5)向上述溶液中加入pH为10的NaClO溶液,氧化开始发生,当溶液的pH开始降低时,向溶液中逐滴加入0.5mol/L的NaOH溶液,使溶液pH维持在10。
(6)当NaOH加入量为6.25ml时,加入2ml乙醇终止反应。5min后加入0.05g NaBH,搅拌1h。
(7)用4mol/L的盐酸将pH调至3,并搅拌1h。
(8)用1mol/L的NaOH将pH调至7,并搅拌1h。
(9)搅拌状态下加入1~1.5倍体积的乙醇,有絮状物产生,静置1h,抽滤,乙醇洗三次,丙酮洗一次,将所得滤饼放在通风橱,使丙酮完全挥发。
(10)将干燥的滤饼碾碎,烘干或晾干,所得粉末即为TEMPO氧化纤维素。
2、氧化纤维素凝胶微球的制备
(1)将上述制备的氧化纤维素纳米球配制成50mg/mL的多糖溶液。
(2)配制10%(质量分数)的氯化铁溶解在去离子水中,充分溶解。配制1%(质量分数)的Tween80水溶液,将等体积的阳离子溶液和Tween80水溶液混合备用。
(3)将1g的Span80溶解到20g石蜡油中,搅拌均匀。
(4)将0.5mL的多糖溶液加入油相中,在1000rpm的速度下搅拌10min,形成均一乳液。
(5)将1mL的阳离子-Tween80混合液逐滴加入油相中,继续在1000rpm的速度下搅拌30min,使得氧化纤维素在水相液滴中形成稳固交联的水凝胶微球。
(6)交联结束后,在3000rpm,2min的离心条件下,用pH=3~5 1%的Tween80水溶液洗涤2次,最后一步洗涤出来的微球沉淀溶于2mL pH=3~5的超纯水中。样品储存于4℃。
实施例3
在该实施例中,实施实施例1的方法,其中步骤2的(1)为:将上述制备的氧化纤维素纳米球配制成50mg/mL的多糖溶液,将1mL 109~1010CFU/mL菌液离心得到的菌泥(鼠李糖乳杆菌LGG)重悬于0.5~4mL的上述多糖溶液,并将所得到的多糖溶液进行后续实验。由此,得到载益生菌微球。
实施例4
在该实施例中,实施实施例2的方法,其中步骤2的(1)为:将上述制备的氧化纤维素纳米球配制成50mg/mL的多糖溶液,将1mL 109~1010CFU/mL菌液离心得到的菌泥(鼠李糖乳杆菌LGG)重悬于0.5~4mL的上述多糖溶液,并将所得到的多糖溶液进行后续实验。由此,得到载益生菌微球。
实施例5
在该实施例中,实施实施例2的方法,其中步骤2的(1)为将上述制备的氧化纤维素纳米球配制成50mg/mL的多糖溶液,将10mg的水溶性小分子,如花色苷加入上述多糖溶液,并将得到的多糖、水溶性小分子混合溶液进行后续实验,由此,得到载水溶性小分子微球。
实施例6
在该实施例中,实施实施例2的方法,其中步骤2的(1)为将上述制备的氧化纤维素纳米球配制成50mg/mL的多糖溶液,将10mg的脂溶性小分子姜黄素加入0.5mL无水乙醇溶解后与上述多糖溶液混合,并将得到的多糖、脂溶性小分子混合溶液进行后续实验,由此,得到载脂溶性小分子微球。
实施例7
在该实施例中,实施实施例2的方法,其中步骤2的(1)为将上述制备的氧化纤维素纳米球配制成50mg/mL的多糖溶液,将10mg的蛋白类大分子,乳清蛋白加入上述多糖溶液,并将得到的多糖、蛋白的混合溶液进行后续实验,由此,得到载蛋白类大分子微球。
对比例1
按照实施例1的方法制备氧化纤维素凝胶微球,区别在于,将玉米芯纤维素替换为魔芋葡甘露聚糖。
对比例2
在该对比例中,实施对比例1的方法,其中步骤2的(1)为:将上述制备的氧化魔芋葡甘露聚糖配制成50mg/mL的多糖溶液,将1mL 109~1010CFU/mL菌液离心得到的菌泥(鼠李糖乳杆菌LGG)重悬于0.5~4mL的上述多糖溶液,并将所得到的多糖溶液进行后续实验。由此,得到载益生菌微球。
实施例8
1、通过SEM对实施例1和实施例2制备的纤维素微球的表面形态进行表征,结果如图1和图2所示。
通过图1可以看出该氧化纤维素微球的表面是由包含若干个相互交联的球状氧化纤维素纳米体构成的,所述球状氧化纤维素纳米体的粒径为30~100nm。
通过图2可以看出该氧化纤维素微球的表面是由包含若干个相互交联的纤维状氧化纤维素纳米体构成的,所述的纤维状氧化纤维素纳米体的长度为100~1000nm。
2、测定实施例3、实施例4和对比例2制备的载益生菌微球(简称OCEL/LGG微球)中益生菌的包埋率,具体步骤如下:
通过平板计数法确定OCEL/LGG微球中LGG的包埋率。具体地,将OCEL/LGG微球用灭菌的MRS培养基在37℃条件下孵育5-10min,然后将释放的LGG铺在MRS琼脂上,并在37℃下培养两天,然后进行计数。通过以下公式计算OCEL/LGG微球中LGG的包埋率,得到实施例3、实施例4制备的微球中益生菌的包埋率分别为90%和85%,对比例2制备的微球中益生菌的包埋率约为55%。可以看出,相比于采用魔芋葡甘露聚糖构建的微球,采用纤维素构建的微球的包埋效果更佳。
3、通过以下公式计算实施例5、实施例6和实施例7分别制备的载水溶性小分子微球、载脂溶性小分子微球和载蛋白类大分子微球中活性成分的包埋率,得到实施例5、实施例6和实施例7中活性成分的包埋率分别为86%、70%和80%。
4、通过SEM对实施例3和实施例4制备的载益生菌微球的表面形态进行表征,结果如图3和图4。
通过图3可以看出由球状氧化纤维素纳米体构成的氧化纤维素微球可以实现益生菌(LGG)的包埋,微球的整体结构仍为球形,微球的尺寸相较于包埋益生菌之前增大了,直径由5~20μm增加至10~50μm。
通过图4可以看出纤维状氧化纤维素纳米体构成的氧化纤维素微球可以实现益生菌(LGG)的包埋,微球的整体结构仍为球形,微球的尺寸相较于包埋益生菌之前增大了,直径由5~10μm增加至8~40μm。
5、通过共聚焦显微镜对实施例3制备的载益生菌微球的结果进行表征,结果如图5,图6。
通过图5可以看出氧化纤维素微球成功装载了益生菌(LGG,Syto-9染色)。
通过图6共聚焦的3D扫描模式可以看出益生菌在氧化纤维素微球中呈立体分布。
6、分别对实施例1制备的氧化纤维素凝胶微球、对比例1制备的氧化魔芋凝胶微球、实施例3制备的载益生菌微球在模拟胃肠液进行稳定性分析实验,具体操作如下:
向1L超纯水中添加1g胃蛋白酶来制备模拟胃液(Simulated gastric fluid,SGF),并用浓盐酸将pH值调节至1.2。通过将1g胰酶加入1L 0.05M磷酸二氢钾缓冲液中以制备模拟肠液(Simulated intestinal fluid,SIF),并用0.5M氢氧化钠将pH值调节至6.8。将200μL氧化纤维素凝胶微球、氧化魔芋凝胶微球或载益生菌微球添加到800μL模拟胃液中,并在37℃下以60rpm的温和震荡进行孵育。然后,将悬浮液以14000g离心3min,弃去上清液,向沉淀物中加入1mL模拟肠液,然后在37℃60rpm下再孵育4个小时。在模拟胃液消化过程中,以0.5h的间隔取出10μL溶液在荧光显微镜下观察氧化纤维素微球的形态;在模拟肠液消化过程中,以1h的间隔取出10μL溶液在荧光显微镜下观察三种微球的形态。
氧化纤维素凝胶微球结果如图7所示,通过图7可以看出,氧化纤维素凝胶微球在模拟胃液中未发生破解,微球形状完整。在模拟肠液中,微球尺寸变大,发生溶胀,结构变疏松,原因是碱性条件下阳离子和多糖的连接变弱导致的,不过这种连接的减弱没有直接使微球破裂,氧化纤维素微球可以在模拟肠液中维持4h以上的球形,从而可以使微球较为完整的在肠道内运输活性物质,使活性物质可以达到肠后段(结肠部位)。
氧化魔芋凝胶微球结果如图8所示,通过图8可以看出,氧化魔芋凝胶微球在模拟胃液中也未发生破解,微球形状完整。然而该微球在模拟肠液中保留1h之后就会破解,只能在肠道前部分释放活性物质,无法到达结肠部位。
载益生菌微球结果如图9所示,通过图9可以看出,氧化纤维素凝胶微球载菌后仍具有肠道缓释,靶向结肠的效果,可以在肠液里维持4h球形而不崩解,微球尺寸稍有增大,部分微球内部益生菌可以通过微球内扩大的缝隙进入肠液中。
7、通过TEM和SEM对实施例1制备的球状氧化纤维素纳米体和益生菌的相互作用进行表征。二者相互作用的情况由图10所示,通过图10可以看出,氧化纤维素和益生菌混合后会在益生菌细胞壁外形成一层保护壳(coating),这体现了氧化纤维素和益生菌之间的较强相互作用力,有利于微球崩解后氧化纤维素继续附着在益生菌外部,起到增强益生菌和肠黏液之间黏附性的作用。
8、通过冲刷实验对实施例1制备的球状氧化纤维素纳米体和益生菌(LGG)的相互作用进行表征。实验过程如下:
1)制备氧化纤维素多糖薄膜
将300~1000mg的氧化纤维素凝胶微球溶解于10mL去离子水中,并在室温下搅拌1~5h,随后向溶液中添加150~300mg甘油,超声处理5~20min去除气泡,加入40mL去离子水,将溶液倒入塑料模具(D=9cm)中,并在60℃的烘箱中干燥6h之后,将膜取出并在50%湿度和25℃的条件下在干燥器中放置48h,制得多糖薄膜。
2)冲刷实验
通过定性和定量的方法,验证益生菌与氧化纤维素多糖膜之间的黏附效果。
(1)定性实验:使用Syto9荧光染料标记LGG,将裁剪好的1cm2的氧化纤维素方形膜浸没在1mL约109CFU/mL已标记的LGG溶液中,在37℃下孵育30min。孵育结束后使用无菌的生理盐水冲洗3次多糖膜,将膜置于荧光显微镜下观察,结果如图11所示。从图中可以看到有大量的益生菌附着在多糖膜上,且可以清晰看出菌的分布和形态,说明益生菌和氧化纤维素之间存在较强的相互作用,可以黏附在多糖上。
(2)定量实验:不使用荧光染料标记LGG,其余步骤重复(1)的操作,将未黏附的LGG进行平板计数,由下列公式计算出附着于多糖膜上的LGG的附着率达到30~80%,膜上可黏附5~9×109CFU/mL的菌。由此表明球状氧化纤维素纳米体与益生菌之间具有较好的黏附作用。
9、通过SEM对实施例3制备的载益生菌(LGG)微球内部氧化纤维素和益生菌的分布情况进行表征。益生菌在氧化纤维素微球内部的分布情况由图12所示,通过图12可以看出,在微球内部益生菌和球状氧化纤维素纳米体之间仍存在结合的现象,氧化纤维素可以包裹在益生菌外部,氧化纤维素之间再通过阳离子实现交联从而形成一种载菌的纳米微球体。
10、按照实施例3的方法,制备载益生菌(NZ9000)氧化纤维素微球,使用共聚焦荧光显微镜表征益生菌被微球包埋前后载小肠粘液的3D渗透情况。从雄性的SD大鼠中取一段长约3cm的小肠,使用手术线将肠段一侧扎紧。向肠段中加入Alexa Fluor 488 WGA(最大激发和发射波长是495和519nm,绿色)对肠黏液进行荧光标记,然后向其中注入100μL含106CFU/mL的未包埋和氧化纤维素微球包埋后的NZ9000(最大激发和发射波长是525和565nm,红色)悬浊液。使用手术线固定肠段的另一侧,然后将肠段浸没于PBS缓冲液中,在37℃60rpm温和孵育1h。孵育完成后,沿小肠纵断面剪开,并将其展开固定在载玻片上,使用共聚焦显微镜观察得到的结果如图13所示。可以看到,经微球载体包埋后的NZ9000在粘液中的荧光强度远高于未包埋的NZ9000,并且可以观察到聚集的NZ9000,说明氧化纤维素载体可以提高益生菌在肠黏液上的黏附定植效果。
11、按照实施例3的方法,制备载益生菌(WCFS1)氧化纤维素微球,并使用Syto9对微球中的益生菌进行标记,作为样品组。将标记好的WCFS1稀释至106CFU/mL作为未包埋组(对照组)。将42只小鼠随机分为对照组和样品组,给每组小鼠多次灌胃500μL未包埋和包埋的WCFS1悬浊液,在灌胃后的1、2、4、8、12、24、48h时,每组处死3只小鼠,取出小鼠的肠胃组织并将其置于小动物活体荧光仪观察。如图14所示,未包埋的WCFS1在灌胃后荧光迅速减弱,于24h时荧光基本完全消失。然而使用氧化纤维素微球包埋的WCFS1顺利进入肠道,并在肠道中广泛分布,从小肠到结肠部位均有荧光分布,即使在灌胃后48h时,肠道内仍可以检测到WCFS1的荧光,表明OCNS微球可以有效延长益生菌在肠道的停留时间,有助于益生菌在肠道的黏附定植。
在本说明书的描述中,参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中,对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且,描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外,在不相互矛盾的情况下,本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例,可以理解的是,上述实施例是示例性的,不能理解为对本发明的限制,本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (14)
1.一种载物微球,其特征在于,包括:
氧化纤维素凝胶微球;
活性物质,所述活性物质包埋于所述氧化纤维素凝胶微球中,所述活性物质为鼠李糖乳杆菌;
所述氧化纤维素凝胶微球包含若干个相互交联的氧化纤维素纳米体;
所述氧化纤维素纳米体呈球状,粒径为30~100 nm;或者
所述氧化纤维素纳米体呈纤维状,长度为100~1000 nm;
所述氧化纤维素凝胶微球通过下述方法制备获得:
步骤1:将氧化纤维素溶液加入到含有第一乳化剂的油相中,搅拌,得到油包水乳液;
步骤2:将含有交联剂和第二乳化剂的溶液加入到所述油包水乳液中,搅拌,得到氧化纤维素凝胶微球。
2.根据权利要求1所述的载物微球,其特征在于,
所述载物微球的活性物质包埋率不低于50%。
3.根据权利要求1所述的载物微球,其特征在于,所述交联剂为离子化合物。
4.根据权利要求3所述的载物微球,其特征在于,所述离子化合物中阳离子选自Fe3+、Ca2+、Mn2+、Al3+、Ag+;
所述含有交联剂和第二乳化剂的溶液与所述油包水乳液的混合液中,油相与水相的体积比为5:1~20:1;
所述氧化纤维素在水相中的含量为5~10质量体积%,单位为mg/mL;
所述交联剂与所述氧化纤维素的质量比为1:2~10:1;
所述油相选自石蜡油、大豆油、葵花籽油和橄榄油的至少之一;
所述第一乳化剂选自span80,所述第二乳化剂选自Tween80或Tween20;
所述第一乳化剂的添加量为1~2 g/20 g所述油相,所述第二乳化剂的添加量为5~10mg/20 g所述油相。
5.根据权利要求4所述的载物微球,其特征在于,所述离子化合物中阳离子为Fe3+。
6.根据权利要求4所述的载物微球,其特征在于,所述交联剂与所述氧化纤维素的质量比为1:2~2:1。
7.根据权利要求1所述的载物微球,其特征在于,步骤1中,所述搅拌的转速为500~1500rpm,时间为5~10 min;
步骤2中,所述搅拌的转速为500~1500 rpm,时间为10~30 min。
8.根据权利要求1所述的载物微球,其特征在于,所述方法进一步包括:
步骤3:将所述搅拌所得含有氧化纤维素凝胶微球的溶液进行离心,收集沉淀,用含有所述第二乳化剂的溶液洗涤,收集沉淀并保存于水中。
9.根据权利要求1所述的载物微球,其特征在于,所述氧化纤维素是通过将纤维素上C6位的伯醇基团转化为羧基而获得的。
10.根据权利要求1所述的载物微球,其特征在于,所述氧化纤维素是通过TEMPO法氧化纤维素获得的;
所述氧化纤维素具有巯基修饰;
所述纤维素选自玉米芯纤维素、棉花纤维素或木纤维素;
进行TEMPO法氧化纤维素之前,将所述纤维素在氢氧化钠溶液中溶胀1~4小时。
11.根据权利要求10所述的载物微球,其特征在于,所述纤维素为玉米芯纤维素。
12.一种药物,其特征在于,含有权利要求1~11中任一项所述载物微球。
13.权利要求1~11中任一项所述载物微球在制备药品中的应用,其特征在于,所述药品用于治疗肠道疾病。
14.根据权利要求13所述的应用,其特征在于,所述肠道为结肠。
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