CN114642649A - 一种耐冷热处理的益生菌肠溶颗粒剂的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种耐冷热处理的益生菌肠溶颗粒剂的制备方法，涉及益生菌制剂技术领域，本发明提出使用秸秆、淀粉和低聚木糖制备肠溶益生菌颗粒，其制备工艺简单，所用材料为来源广泛、价格低廉的农作物秸秆，很大程度上降低了成本，且实现了生物质秸秆的高值化利用；由于所用秸秆为具有管束或孔洞结构的秸秆，因此所制备的益生菌颗粒剂中负载有非常可观的益生菌量，且对益生菌具有良好的保护效果；该方法制备的益生菌颗粒不仅适用于低温冷冻加工，也适合于较高温加工。

Description

一种耐冷热处理的益生菌肠溶颗粒剂的制备方法
技术领域：
本发明涉及益生菌制剂技术领域，具体涉及一种耐冷热处理的益生菌肠溶颗粒剂的制备方法。
背景技术：
益生菌是一类对宿主有益的活性微生物，是定植于宿主肠道内，能产生确切健康功效从而改善宿主微生态平衡、发挥有益作用的活性有益微生物的总称。益生菌制剂因其无毒、绿色安全、能提高抗病能力和能长期稳定保存等优点逐步成为替代抗生素的首选。
研究表明，益生菌产品发挥益生作用的技术要求是其到达肠道的活菌数≥106CFU/g，然而游离益生菌在宿主的胃中会因受胃液和胃蠕动剪切作用失活而无法再提供健康益处，为此需借助微囊或肠溶包衣颗粒剂等递送系统实现。
用于制造微胶囊的材料通常是生物聚合物，如海藻酸盐、角叉菜胶、明胶、黄原胶、蛋白质和淀粉等(Ding等，2009；Anal等，2007)。使用较为广泛的为海藻酸盐，海藻酸盐凝胶珠能在胃环境和储存过程中有保护作用，但其捕集不稳定且耐热效果较差(Malmo等，2021；Gbassi等，2009；Willaert等，1996)；在海藻酸盐凝胶中加入多孔淀粉虽然可以很好地解决海藻酸盐凝胶捕集不稳定的问题(Li等，2016)，但不适用于较高温度的热加工，因此这类微囊化颗粒剂不得不采用高能耗的低温(冷冻)真空干燥工艺加工(Tripathi等，2014)，致使制剂成本过高。
肠溶包衣颗粒剂是采用湿法或干法制粒后接干燥和喷液(喷雾)包衣加工而成的，其中包衣也是在加热条件下进行的；但是多数益生菌因本身耐热性差而难以耐受颗粒干燥和包衣所需要的加热加工过程，因此制剂中的活菌量显著下降(Mokhtari等，2017；Picot等2014；Estevinho等，2013)。
目前虽然报道了许多益生菌产品制备方法，但益生菌在制作加工过程中受外界温度、氧气、光照、湿度等因素的影响可能会丧失活性，存在存活率低、成本高、不适用于大批量生产的问题。
发明内容：
本发明所要解决的技术问题在于提供一种耐冷热处理的益生菌肠溶颗粒剂的制备方法，采用秸秆、淀粉和低聚木糖作为益生菌的负载和耐冷热处理的保护材料，使制得的益生菌肠溶颗粒具有耐高温和低温冷冻特性以及耐酸性能。
本发明所要解决的技术问题采用以下的技术方案来实现：
一种耐冷热处理的益生菌肠溶颗粒剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、配制MRS培养基，在培养基中加入秸秆，或者加入秸秆和淀粉，然后将培养基放入高温灭菌锅中进行灭菌处理，待冷却后接种益生菌，孵育培养，培养结束后离心，得到负载有益生菌的秸秆；
步骤二、向上述负载有益生菌的秸秆中加入低聚木糖和粘合剂进行制粒，干燥，得到益生菌颗粒；
步骤三、对上述益生菌颗粒使用肠溶乳胶液或肠溶树脂进行包衣，得到益生菌肠溶颗粒。
所述益生菌肠溶颗粒中的秸秆含量为1-90％(w/w)，益生菌含量1×106-1×1010CFU/g。
所述秸秆包括玉米秸秆、玉米芯、麦秸秆、稻草、油菜秸秆、青稞秸秆和甘蔗渣等农作物秸秆，也包括牧草和其他杂草。优选具有管束或囊腔结构的秸秆，或是经过物理、化学或生物酶预处理制备的多孔秸秆。
所述多孔秸秆是将秸秆经过粉碎、过筛后先使用稀盐酸进行固态酸解处理，处理结束后用水清洗至中性，再使用纤维素酶进行酶解处理，处理结束后洗涤，即得多孔秸秆。
所述秸秆为经过粉碎、过筛后的秸秆粉。
所述低聚木糖是通过秸秆固态酸解制得，以木二糖为主。低聚木糖既作为益生菌生长所需的碳源，又起到保护剂的作用。
所述粘合剂为羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸钠或其他水溶性粘合剂。
所述干燥为低温(真空)冷冻干燥或加热烘干，温度范围为-60～121℃。
所述包衣温度不超过121℃，包衣增重为5～20％。
本发明的有益效果是：本发明提出使用秸秆、淀粉和低聚木糖制备肠溶益生菌颗粒，其制备工艺简单，所用材料为来源广泛、价格低廉的农作物秸秆，很大程度上降低了成本，且实现了生物质秸秆的高值化利用；由于所用秸秆为具有管束或孔洞结构的秸秆，因此所制备的益生菌颗粒剂中负载有非常可观的益生菌量，且对益生菌具有良好的保护效果；该方法制备的益生菌颗粒不仅适用于低温冷冻加工，也适合于较高温加工。
附图说明：
图1为本发明制备的秸秆负载罗伊式乳杆菌的扫描电镜图；
图2为本发明制备的多孔秸秆的扫描电镜图。
具体实施方式：
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例和图示，进一步阐述本发明。
以下实施例1-4中的低聚木糖是通过秸秆固态酸解制得，其制备方法依照专利CN111321182A，所制低聚木糖的组成为：木二糖79.61％，木三糖5.82％，木四糖3.38％，木五糖1.02％，余量为水。
以下实施例3和实施例4中的多孔秸秆是由麦秸秆通过固态酸解联合酶解制得，其制备方法为：将麦秸秆经过粉碎、过80目筛后先使用1.5mol/L稀盐酸在80℃下进行固态酸解处理0.5h，处理结束后用水清洗至中性，再按照酸解秸秆绝干重量的10％使用纤维素酶在45℃下进行酶解处理18h，处理结束后洗涤，即得多孔秸秆。多孔秸秆的孔隙率为87％，总孔面积为2.994m2/g，总孔容为4.880mL/g，平均孔径为6.9μm。
实施例1
将100g经过粉碎、过80目筛的麦秸秆加入1500mL MRS培养基(购自北京索莱宝科技有限责任公司)中，在121℃下灭菌处理20min，待冷却后按1％接种量接种罗伊式乳杆菌(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)，在37℃厌氧条件下培养48h，培养结束后离心，得负载有罗伊式乳杆菌的秸秆。在此秸秆中加入5g低聚木糖和1g羧甲基纤维素钠(采用上述离心所得的滤液进行配置添加)，混合均匀，使用YK-60摇摆颗粒机进行造粒，造粒结束后在50℃下烘干1h，再用尤特奇L30D-55肠溶乳胶液对含有罗伊式乳杆菌的颗粒在60℃下进行包衣，增重20％，制得益生菌肠溶颗粒。益生菌肠溶颗粒中的活菌量达4.3×108CFU/g。
制备的益生菌肠溶颗粒在进行人工胃肠液模拟释放时，在胃液中依然可以保持完整，活菌量未发生变化，而在肠液中才开始分散释放，具有良好的耐酸性能。
将未经过包衣的益生菌颗粒(活菌量为7.3×108CFU/g)在60℃和130℃下热处理1h，罗伊式乳杆菌的活菌量分别保持在3.2×108CFU/g和4.7×107CFU/g。将未经过包衣的益生菌颗粒在-60℃真空冷冻处理24h，罗伊式乳杆菌的存活率达到87％以上。
实施例2
将50g经过粉碎、过80目筛的秸秆和50g淀粉加入1500mL MRS培养基(购自北京索莱宝科技有限责任公司)中，在121℃下灭菌处理20min，待冷却后按1％接种量接种罗伊式乳杆菌(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)，在37℃厌氧条件下培养48h，培养结束后离心，得负载有罗伊式乳杆菌的秸秆和淀粉的混合物。在此混合物中加入8g低聚木糖和0.5g羧甲基纤维素钠(采用水进行配置添加)，混合均匀，使用YK-60摇摆颗粒机进行造粒，造粒结束后在60℃下烘干30min，再用尤特奇L30D-55肠溶乳胶液对含有罗伊式乳杆菌的颗粒在60℃下进行包衣，增重20％，制得益生菌肠溶颗粒。益生菌肠溶颗粒中的活菌量达2.9×108CFU/g。
制备的益生菌肠溶颗粒在进行人工胃肠液模拟释放时，在胃液中依然可以保持完整，活菌量未发生变化，而在肠液中才开始分散释放，具有良好的耐酸性能。
将未经过包衣的益生菌颗粒(活菌量为4.5×108CFU/g)在60℃和130℃下热处理1h，罗伊式乳杆菌的活菌量分别保持在1.4×108CFU/g和2.5×107CFU/g。将未经过包衣的益生菌颗粒在-60℃真空冷冻处理24h，罗伊式乳杆菌的存活率达到80％以上。
实施例3
将100g多孔秸秆加入1500mL MRS培养基(购自北京索莱宝科技有限责任公司)中，在121℃下灭菌处理20min，待冷却后按1％接种量接种罗伊式乳杆菌(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)，在37℃厌氧条件下培养48h，培养结束后离心，得负载有罗伊式乳杆菌的多孔秸秆。将5g低聚木糖加入到上述离心所得滤液经真空浓缩后的浓液中，混合均匀，再加入负载有罗伊式乳杆菌的多孔秸秆中，使用YK-60摇摆颗粒机进行造粒，造粒结束后在50℃下烘干1h，再用尤特奇L30D-55肠溶乳胶液对含有罗伊式乳杆菌的颗粒在60℃下进行包衣，增重20％，制得益生菌肠溶颗粒。益生菌肠溶颗粒中的活菌量达8.5×108CFU/g。
制备的益生菌肠溶颗粒在进行人工胃肠液模拟释放时，在胃液中依然可以保持完整，活菌量未发生变化，而在肠液中才开始分散释放，具有良好的耐酸性能。
将未经过包衣的含有罗伊式乳杆菌的颗粒(活菌量大于2.3×109CFU/g)在60℃和130℃下热处理1h，罗伊式乳杆菌的活菌量分别保持在6.0×108CFU/g和2.6×108CFU/g。将未经过包衣的益生菌颗粒在-60℃真空冷冻处理24h，罗伊式乳杆菌存活率达到92％以上。
实施例4
将100g多孔秸秆加入1500mL MRS培养基(购自北京索莱宝科技有限责任公司)中，在121℃下灭菌处理20min，待冷却后按1％接种量接种粪肠球菌(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)，在37℃厌氧条件下培养48h，培养结束后离心，得负载有粪肠球菌的多孔秸秆。在此多孔秸秆中加入4g低聚木糖和0.5g羧甲基纤维素钠(采用上述离心所得滤液经真空浓缩后进行配制添加)，混合均匀，使用YK-60摇摆颗粒机进行造粒，造粒结束后在65℃下烘干20min，再用尤特奇L30D-55肠溶乳胶液对含有粪肠球菌的颗粒在70℃下进行包衣，增重20％，制得益生菌肠溶颗粒。益生菌肠溶颗粒中的活菌量达7.2×109CFU/g。
制备的益生菌肠溶颗粒在进行人工胃肠液模拟释放时，在胃液中依然可以保持完整，活菌量未发生变化，而在肠液中才开始分散释放，具有良好的耐酸性能。
将未经过包衣的益生菌颗粒(活菌量为5.1×109CFU/g)在70℃和130℃下热处理1h，粪肠球菌的活菌量分别保持在4.1×109CFU/g和8.3×108CFU/g。将未经过包衣的益生菌颗粒在-60℃真空冷冻处理24h，粪肠球菌的存活率达到95％以上。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (10)

1.一种耐冷热处理的益生菌肠溶颗粒剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、配制MRS培养基，在培养基中加入秸秆，或者加入秸秆和淀粉，然后将培养基放入高温灭菌锅中进行灭菌处理，待冷却后接种益生菌，孵育培养，培养结束后离心，得到负载有益生菌的秸秆；
步骤二、向上述负载有益生菌的秸秆中加入低聚木糖和粘合剂进行制粒，干燥，得到益生菌颗粒；
步骤三、对上述益生菌颗粒使用肠溶乳胶液或肠溶树脂进行包衣，得到益生菌肠溶颗粒。
2.根据权利要求1所述的耐冷热处理的益生菌肠溶颗粒剂的制备方法，其特征在于：所述益生菌肠溶颗粒中的秸秆含量为1-90％(w/w)，益生菌含量1×106-1×1010CFU/g。
3.根据权利要求1所述的耐冷热处理的益生菌肠溶颗粒剂的制备方法，其特征在于：所述秸秆包括农作物秸秆，也包括牧草和其他杂草。
4.根据权利要求3所述的耐冷热处理的益生菌肠溶颗粒剂的制备方法，其特征在于：所述秸秆为具有管束或囊腔结构的秸秆，或是经过物理、化学或生物酶预处理制备的多孔秸秆。
5.根据权利要求4所述的耐冷热处理的益生菌肠溶颗粒剂的制备方法，其特征在于：所述多孔秸秆是将秸秆经过粉碎、过筛后先使用稀盐酸进行固态酸解处理，处理结束后用水清洗至中性，再使用纤维素酶进行酶解处理，处理结束后洗涤，即得多孔秸秆。
6.根据权利要求1所述的耐冷热处理的益生菌肠溶颗粒剂的制备方法，其特征在于：所述秸秆为经过粉碎、过筛后的秸秆粉。
7.根据权利要求1所述的耐冷热处理的益生菌肠溶颗粒剂的制备方法，其特征在于：所述低聚木糖是通过秸秆固态酸解制得，以木二糖为主。
8.根据权利要求1所述的耐冷热处理的益生菌肠溶颗粒剂的制备方法，其特征在于：所述粘合剂为羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸钠或其他水溶性粘合剂。
9.根据权利要求1所述的耐冷热处理的益生菌肠溶颗粒剂的制备方法，其特征在于：所述干燥为低温冷冻干燥或加热烘干，温度范围为-60～121℃。
10.根据权利要求1所述的耐冷热处理的益生菌肠溶颗粒剂的制备方法，其特征在于：所述包衣温度不超过121℃，包衣增重为5～20％。
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