CN114621390A - pH敏感的聚甲基丙烯酸酯类高分子化合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种具有式(I)所示结构的聚甲基丙烯酸酯类高分子化合物及其应用，式(I)中，L选自：亚烷基；R1选自：‑N(R3R4)；R2选自：C1‑C15烷基、C6‑C14芳基、C6‑C14芳基取代的C1‑C15烷基；R3、R4分别独立地选自：烷基，或者R3、R4和与其相连的氮原子一起形成杂环烷基；n和m均大于0。该高分子在正常组织(pH＝7.40)中呈疏水结构，细胞毒性低；在微酸性环境中，呈两亲性构象，具有高抗菌活性，从而可以实现在感染部位选择性杀伤细菌，降低对正常组织的毒性，可作为植入材料的抗菌涂层，体内毒性低，具有良好的体内酸响应杀菌活性，具有很好的临床应用前景。
Figure DDA0003395301630000011

Description

pH敏感的聚甲基丙烯酸酯类高分子化合物及其应用
技术领域
本发明涉及高分子材料和药物技术领域，具体涉及一种pH敏感的聚甲基丙烯酸酯类高分子化合物及其应用。
背景技术
细菌耐药问题是全球公共安全卫生问题，发展新的抗菌剂对抗耐药细菌迫在眉睫。抗菌肽是动植物体内分泌的具广谱抗菌活性的短肽，其通过破坏细胞膜杀伤细菌的方式使其不易引起细菌耐药，受到广泛关注。但抗菌肽临床应用面临细胞毒性大、易被蛋白酶降解等问题。
有研究者利用正电性的伯胺或季胺盐单体与疏水单体开发出模拟抗菌肽功能的抗菌高分子，如聚甲基丙烯酸酯、聚多肽等。这类抗菌高分子具有合成工艺简便，成本较低等优点，但将其推向临床应用仍需优化出高抗菌活性、低细胞毒性的材料。目前研究者们通过优化阳离子基团种类、疏水基团种类、两者比例或者空间分布等，来调节抗菌高分子的两亲性平衡。但仍需大量工作来优化抗菌高分子以满足临床需求。
抗菌高分子与细胞膜作用主要依靠静电和疏水相互作用，首先利用阳离子结构域通过静电相互作用结合到负电荷细胞膜上，然后其疏水结构域插入到细胞膜脂质层，在膜上形成不可修复的膜损伤，从而杀伤细菌。由阳离子基团和疏水基团组成的两亲性构象是抗菌高分子与细胞膜作用的关键结构。理论上，单纯阳离子高分子易与细胞膜结合但不易插入细胞膜，而疏水结构聚合物难以结合到细胞膜表面，无法有效破坏细胞膜(图1)。因此，设计抗菌高分子使其在正常组织呈现疏水结构，而在感染部位转变为阳离子结构域和疏水结构域组成的两亲性构象，以解决抗菌高分子毒性大的问题，具有重要意义。
当组织被细菌感染时，会形成特殊的感染微环境(如偏酸、高浓度活性氧等)，其中酸性微环境是很多感染存在的典型特征。细菌感染可通过产生有机酸(包括乳酸和乙酸)导致局部pH降低，并且炎症部位会因细菌被吞噬作用期间乳酸的产生导致酸度加剧。此外，许多感染是在酸性条件下发生的，例如胃(pH 1.0～3.0)，十二指肠(pH 5.0～6.0)，皮肤(pH4.0～5.5)等。这些感染微环境有望作为抗菌高分子构象转变的响应因子。
发明内容
基于此，本发明提供了一种pH敏感的聚甲基丙烯酸酯类高分子化合物，该类高分子化合物是含有三级胺与疏水烷基链侧基的聚甲基丙烯酸酯，具有pH敏感性以及酸性环境激活型抗菌活性，在正常组织(pH＝7.4)中，由于三级胺非质子化下呈疏水电中性，该高分子化合物呈疏水构象，与细胞膜相互作用弱，细胞毒性低；在感染微酸环境中，高分子化合物中的部分三级胺质子化并带正电性，三级胺链段由疏水转为阳离子结构域，高分子链存在正电荷基团和疏水基团，使高分子化合物呈两亲性构象，与细胞膜相互作用力强，能够对细菌细胞膜构成不可逆损伤，显示高抗菌活性(图2)。
具体技术方案如下：
具有式(I)所示结构的聚甲基丙烯酸酯类高分子化合物：
Figure BDA0003395301610000021
其中，L选自：亚烷基；
R1选自：-N(R3R4)；
R2选自：C1-C15烷基、C6-C14芳基、C6-C14芳基取代的C1-C15烷基；
R3、R4分别独立地选自：烷基，或者R3、R4和与其相连的氮原子一起形成杂环烷基；
n和m均大于0。
在其中一些实施例中，L选自：C1-C6亚烷基。
在其中一些实施例中，L选自：亚甲基、亚乙基、亚丙基。
在其中一些实施例中，R2选自：C1-C8烷基。
在其中一些实施例中，R2选自：C4-C6烷基。
在其中一些实施例中，所述聚甲基丙烯酸酯类高分子化合物具有式(II)所示结构：
Figure BDA0003395301610000022
其中，p选自：1、2、3、4、5。
在其中一些实施例中，R3、R4分别独立地选自C1-C12烷基，或者R3、R4和与其相连的氮原子一起形成5-12元杂环烷基。
在其中一些实施例中，R3、R4分别独立地选自C1-C6烷基，或者R3、R4和与其相连的氮原子一起形成5-10元杂环烷基。
在其中一些实施例中，R3、R4分别独立地选自C3-C6烷基，或者R3、R4和与其相连的氮原子一起形成6-8元杂环烷基。
在其中一些实施例中，R1选自如下基团：
Figure BDA0003395301610000031
在其中一些实施例中，n+m不小于10。
在其中一些实施例中，n+m不小于20。
在其中一些实施例中，n+m不小于30。
在其中一些实施例中，n+m为30-100。
在其中一些实施例中，m为n+m的15-50％。
在其中一些实施例中，m为n+m的18-39％。
在其中一些实施例中，m为n+m的20-38％。
在其中一些实施例中，m为n+m的24-32％。
在其中一些实施例中，所述聚甲基丙烯酸酯类高分子化合物选自如下化合物：
Figure BDA0003395301610000032
Figure BDA0003395301610000041
本发明还公开了上述的聚甲基丙烯酸酯类高分子化合物的应用。
具体技术方案如下：
上述的聚甲基丙烯酸酯类高分子化合物在制备抗菌药物中的应用。
上述的聚甲基丙烯酸酯类高分子化合物在制备抗菌材料中的应用。
在其中一些实施例中，所述菌为金黄色葡萄球菌、溶血葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、绿脓杆菌。
在其中一些实施例中，所述金黄色葡萄球菌为金黄色葡萄球菌(S.aureus)ATCC6538、甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌MSSA 201896、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA ATCC43300。
在其中一些实施例中，所述溶血葡萄球菌为溶血葡萄球菌(S.haemolyticus)201897。
在其中一些实施例中，所述大肠杆菌为大肠杆菌(E.coli)ATCC 35218。
在其中一些实施例中，所述肺炎克雷伯菌为肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)Kpn190949、耐药肺炎克雷伯杆菌Kpn-ESBL+201232。
在其中一些实施例中，所述绿脓杆菌为绿脓杆菌(P.aeruginosa)Pae 190836。
本发明还提供了一种抗菌药物。
具体技术方案如下：
一种抗菌药物，由活性成分和药物中可接受的辅料和/或载体制备而成，所述活性成分包括所述聚甲基丙烯酸酯类高分子化合物。
本发明还提供了一种抗菌材料。
具体技术方案如下：
一种抗菌材料，其为涂覆有所述聚甲基丙烯酸酯类高分子化合物涂层的钛片。
在其中一些实施例中，所述聚甲基丙烯酸酯类高分子化合物在每平方厘米钛片上的涂覆量为30μg-300μg。
在其中一些实施例中，所述聚甲基丙烯酸酯类高分子化合物在每平方厘米钛片上的涂覆量为51.6μg-256μg。
现有抗菌高分子材料的研究主要是通过调整抗菌高分子的两亲性平衡来优化其抗菌活性和细胞毒性，这种策略往往以牺牲抗菌活性为代价来保证低细胞毒性。本发明以感染微环境偏酸的特殊生理条件为刺激因子，提供了一种酸性环境激活型抗菌高分子，其是由带有pH敏感的三级胺和疏水链侧基单体组成的聚甲基丙烯酸酯无规共聚物，是由含三级胺的甲基丙烯酸酯单体和含疏水链基的甲基丙烯酸酯单体经共聚得到。该抗菌高分子在正常组织(pH＝7.40)中，呈疏水结构，与细胞膜的相互作用力弱，细胞毒性低；在微酸性环境中，抗菌高分子中的三级胺质子化后，抗菌高分子链存在正电荷基团和疏水基团，分子链变为与细胞膜有强相互作用能力的两亲性构象，具有高抗菌活性。这类在正常组织中呈现疏水构象而在感染微环境中转变为两亲性构象的抗菌高分子化合物可以实现在感染部位选择性杀伤细菌，从而降低对正常组织的毒性，可作为植入材料的抗菌涂层，体内毒性低，具有良好的体内酸响应杀菌活性，具有很好的临床应用前景。
进一步地，该抗菌高分子可应用于钛植入材料表面制备抗菌涂层，解决植入材料面临的细菌感染及抗菌涂层细胞毒性大等问题。
附图说明
图1为不同构象的高分子材料与细菌细胞膜的相互作用情况图；其中，(A)为两亲性高分子与细菌细胞膜相互作用示意图；(B)为阳离子高分子与细菌细胞膜相互作用示意图；(C)为疏水性高分子与细菌细胞膜相互作用示意图。
图2为酸性环境激活型抗菌高分子构建示意图；其中，(A)为侧基为三级胺与疏水烷基链的聚甲基丙烯酸酯高分子C628Bu9质子化前后的化学结构式；(B)为抗菌高分子构象转变示意图。
图3为实施例1中制备的抗菌高分子C628Bu9的结构及性能表征结果图；其中，(A)为未质子化及部分质子化后的C628Bu9化学结构式；(B)为C628Bu9的GPC及1H NMR结果图；(C)为C628Bu9滴定曲线结果图；(D)为不同pH下时C628Bu9溶液的电势结果及C628Bu9在不同pH下时油水分配系数结果图；(E)为C628Bu9不同浓度下的溶血率结果；(F)为C628Bu9在pH 7.40和6.25时，不同浓度的C628Bu9对革兰氏阴性菌大肠杆菌(E.coli，ATCC 35218)的杀伤结果图；(G)为C628Bu9在不同pH值下，对E.coli ATCC 35218和S.aureus ATCC 6538的杀菌活性(4μg/mL，37℃，孵育1h)；(H)为C628Bu9对耐药菌株和临床分离耐药菌株的杀菌活性结果图(pH7.40和6.25，抗菌高分子浓度为8μg/mL)。
图4为实施例2中抗菌高分子C628Bu9杀菌机制研究结果图；其中，(A)为与E.coliATCC 35218共孵育后的死活染色结果(抗菌高分子浓度128μg/mL，孵育1h，比例尺为20μm)；(B)为模拟细菌细胞膜脂质体染料泄露结果图(作用时间10min)；(C)细菌形貌TEM和SEM结果图(抗菌高分子浓度128μg/mL，细菌浓度5×108CFU/mL，孵育1h)。
图5为实施例3中制备的抗菌高分子的表征结果图；其中，(A)为C630的GPC及1H NMR谱图；(B)为C627Bu6的GPC及1H NMR谱图；(C)为C623Bu14的GPC及1H NMR谱图。
图6为单体占比对抗菌高分子性能影响结果图；其中(A)为不同单体比例六元环三级胺抗菌高分子结构示意图；(B)为该系列高分子材料质子化程度与pH关系结果图；(C)为该系列抗菌高分子pKa与分子链中Bu侧基单元占比的关系图；(D)为高分子材料浓度与溶血率关系结果图；(E)和(F)分别为不同pH下时，高分子材料溶液电势及抗菌高分子的油水分配系数结果图；(G)为抗菌高分子材料在不同质子化程度下细菌杀菌活性结果图。
图7为实施例4中制备的抗菌高分子的表征结果图；其中，(A)为C722Bu8的GPC及1HNMR谱图；(B)为C526Bu9 GPC及1H NMR谱图；(C)为DM28Bu13 GPC及1H NMR谱图。
图8三级胺侧基种类对抗菌高分子性能影响结果图；其中(A)为不同三级胺侧基抗菌高分子结构示意图；(B)为该系列高分子材料质子化程度与pH关系结果图；(C)为该系列抗菌高分子pKa与三级胺侧基种类的关系图；(D)为高分子材料浓度与溶血率关系结果图；(E)和(F)分别为不同pH下时，高分子材料溶液电势及抗菌高分子的油水分配系数结果图；(G)为抗菌高分子材料在不同质子化程度下细菌杀菌活性结果图。
图9为实施例5中制备的抗菌高分子的表征结果图；其中，(A)为C629E10的GPC及1HNMR谱图；(B)为C624H10的GPC及1H NMR谱图。
图10疏水结构单元烷基链种类对抗菌高分子活性的影响；其中(A)为不同疏水碳链侧基抗菌高分子结构示意图；(B)为该系列高分子材料质子化程度与pH关系结果图；(C)为该系列抗菌高分子pKa与疏水侧基种类的关系图；(D)为高分子材料浓度与溶血率关系结果图；(E)和(F)分别为不同pH下时，高分子材料溶液电势及抗菌高分子材料油水分配系数结果图；(G)为抗菌高分子材料在不同质子化程度下细菌杀菌活性结果图。
图11为实施例6中制备的抗菌高分子的1H NMR表征结果图；从上至下分别为C67Bu3，C623Bu9，C663Bu27的1H NMR图谱，其中这三种高分子材料疏水单元占分子链结构单元均接近30％。
图12为分子链聚合度对抗菌高分子活性的影响；其中(A)为不同聚合度抗菌高分子结构示意图；(B)为该系列高分子材料质子化程度与pH关系结果图；(C)为该系列抗菌高分子pKa与分子链聚合度大小的关系图；(D)为高分子材料浓度与溶血率关系结果图；(G)为抗菌高分子材料在不同质子化程度下细菌杀菌活性结果图。
图13为本发明制备的抗菌高分子的相关性能图；其中，(A)为制备的抗菌高分子的HC10结果图；(B)为抗菌高分子在不同pH下对E.coli ATCC 35218的杀菌活性热图(聚合物浓度8μg/mL，孵育1h)；(C)为抗菌高分子在不同pH下质子化程度结果热图。
图14为C628Bu9在小鼠体内酸响应杀菌结果图；其中，(A)为小鼠皮下酸响应杀菌或模型实验示意图；(B)为皮下感染24h后，取感染组织匀浆涂板计数结果图，P<0.01(**)，P<0.001(***)。
图15为实施例8中制备的抗菌涂层的制备过程及性能表征结果图；其中，(A)为抗菌涂层的构建过程示意图；(B)为钛片及抗菌涂层表面形貌SEM拍摄结果图；(C)为空白钛片(a)及不同浓度(b-c)抗菌涂层表面红外图谱；(D)为空白钛片及(E)为Ti-C628Bu9-256XPS全谱图；空白钛片及Ti-C628Bu9-256抗菌涂层Ti 2p(F)及N1s(G)高分辨率分峰扫描结果图谱；(H)为不同pH下涂层的亲疏水性验证，水接触角测试结果图(n＝3)。
图16为实施例8中抗菌涂层性能表征结果图；其中，(A)为抗菌涂层溶血率结果；(B)为空白钛片，Ti-C628Bu9-256和Ti-C629E10-256涂层在pH 7.40和6.80时对红细胞形貌影响SEM拍摄结果图，比例尺为4μm；(C)为不同含量Ti-C628Bu9涂层对NIH-3T3细胞毒性结果图；(D)为Ti-C628Bu9-256对E.coli ATCC 35218的杀菌活性结果图；(E)为Ti-C628Bu9-256对S.aureus ATCC 6538的杀菌活性结果图，其中“*”标记表示值为0；(F)为Ti-C628Bu9-256在pH 7.40和6.50时对E.coli ATCC 35218形貌影响SEM拍摄结果图；(G)为Ti-C628Bu9-256在pH 7.40和6.50时对S.aureus ATCC 6538形貌影响SEM拍摄结果图，比例尺为800nm(钛片样品尺寸为5×5mm2，滴加10μL 108CFU/mL菌液,孵育2h)。
图17为Ti-C628Bu9-256体内抗感染效果结果图；其中，(A)为实验用小鼠图片，将E.coli ATCC 35218 1×106CFU/10μL PBS，滴加到5×5mm2的钛片样品上，溶液稍稍晾干后植入小鼠皮下(C57雌鼠，7-10周龄)；(B)为取出钛片及其周围感染组织涂板菌落图；(C)和(D)分别为钛片样品周围感染组织和钛片样品表面中细菌数量统计结果图，P<0.01(**)，P<0.001(***)。
图18为抗菌高分子涂层植入小鼠皮下后肝、肾、心脏毒性结果图；其中(A)，(B)和(C)分别为植入第1，7和14天后，小鼠血清中各个血生化指标统计情况，从左到右依次为丙氨酸氨基转移酶、门冬氨酸氨基转移酶、尿素氮、尿酸、心肌酶。
图19为空白钛片、含抗菌高分子涂层钛片样品植入小鼠第1、7、14天后，小鼠主要脏器切片H&E染色结果图；其中，(A)、(B)、(C)分别为植入第1、7、14天后，小鼠心、肝、脾、肺、肾组织切片H&E染色结果图。
具体实施方式
本发明下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。
本发明的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。
在本发明中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
本发明所述化合物中，当任何变量(例如R1、R2等)在任何组分中出现超过一次，则其每次出现的定义独立于其它每次出现的定义。同样，允许取代基及变量的组合，只要这种组合使化合物稳定。自取代基划入环系统的线表示所指的键可连接到任何能取代的环原子上。如果环系统为多环，其意味着这种键仅连接到邻近环的任何适当的碳原子上。要理解本领域普通技术人员可选择本发明化合物的取代基及取代型式而提供化学上稳定的并可通过本领域技术和下列提出的方法自可容易获得的原料容易合成的化合物。如果取代基自身被超过一个基团取代，应理解这些基团可在相同碳原子上或不同碳原子上，只要使结构稳定。
本文所用术语“烷基”意指包括具有特定碳原子数目的支链的和直链的饱和脂肪烃基。例如，“C1-C6烷基”中“C1-C6”的定义包括以直链或支链排列的具有1、2、3、4、5或6个碳原子的基团。例如，“C1-C6烷基”具体包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、戊基、己基。
术语“杂环烷基”为饱和的单环环状取代基，其中一个或多个环原子选自N、O或S(O)m(其中m是0-2的整数)的杂原子，其余环原子为碳，例如：哌啶基、吡咯烷基等。
以下为具体实施例。
实施例1：抗菌高分子C628Bu9的制备及性能表征
本实施例制备得到了侧基带有哌啶及丁基的聚甲基丙烯酸酯抗菌高分子C628Bu9，其结构式如下：
Figure BDA0003395301610000091
其制备方法如下：
(1)制备单体1-(氮杂环己烷-1-基)乙基甲基丙烯酸酯(C6-MA)
Figure BDA0003395301610000092
将N-(2-羟乙基)哌啶(3.88g，30mmol)、三乙胺(3.67g，36mmol)、对苯二酚(33mg，0.3mmol)溶解于四氢呋喃(32g)中，然后将甲基丙烯酰氯(3.45g，30mmol)逐滴加入上述溶液中。在冰水浴中磁力搅拌避光回流反应过夜，反应溶液经过滤后，通过减压蒸馏得到1-(氮杂环己烷-1-基)乙基甲基丙烯酸酯(C6-MA)。
(2)制备高分子C628Bu9
Figure BDA0003395301610000101
将1-(氮杂环己烷-1-基)乙基甲基丙烯酸酯(C6-MA，1.38g，7mmol)，甲基丙烯酸丁酯(BMA，0.43g，3mmol)，偶氮二异丁腈(AIBN，18.25mg，0.11mmol)，4-氰基-4-(硫代苯甲酰)戊酸(CPDB，93.13mg，0.33mmol)溶解于2mL干燥的二氧六环溶液中，以N2为保护气，密闭反复冻融除氧气，循环5次后，在75℃反应。反应24h后，冷却降至室温后在液氮中终止反应，浓缩反应溶液，在冷正己烷中沉淀产物、提纯，真空干燥过夜，得到橙色聚合物。
GPC及1H NMR测试：
将10mg上述样品溶解在1mL THF或DMF中，取20μL溶液，通过凝胶渗透色谱仪(GPC，1515 Isocratic HPLC Pump,2414 refractive index detector,Waters Corporation,USA)测试其分子量及分子量分布；将10mg P(C6-BMA)7溶解在0.6mL氘代氯仿中，通过核磁共振波谱仪(400’54 Ascend spectroscopy 400/600MHz,Bruker,Germany)测试其1H NMR。
根据1H NMR结果分析(图3中的(A)和(B))，1H NMR(600MHz，Chloroform-d)δ7.28(2H)，4.09(49H)，3.95(25H)，2.62(68H)，2.47(99H)，1.92(34H)，1.61(124H)，1.44(84H)，1.06(37H)，0.98(41H)，0.89(56H)，可知C628Bu9分子链中Bu侧基单元个数为9，三级胺单元个数为28。从GPC测试可知，其分子量分布为1.17(图3中的(B))。
酸度系数(pKa)测试：
将15mg高分子溶解在15mL 0.01mol/LHCl(含150mM NaCl)溶液中，用1mol/L NaOH溶液滴定，每次滴加1μL并通过梅特勒-托勒多台式pH计测试溶液pH变化情况。经计算得到高分子链中三级胺质子化程度与pH变化情况如图3中的(C)所示，其pKa为6.64。
不同pH下溶液电势测试：
在滴定过程中，取1mL测试溶液，通过Zeta电位仪测试滴定过程中高分子溶液的电势，如图3中的(D)所示，可知其在酸性条件下，电势约为18mV，这是由于此时三级胺被质子化，分子链呈正电性；在pH 7.44时，电势为3.12mV，这是由于随着pH增加，三级胺去质子化后，分子链正电性变弱；随着溶液碱性逐渐增强，如达到pH 8.45时，分子链中三级胺完全去质子化，溶液电势为负值(-16.7mV)。
不同pH下正辛醇/水分配系数(log([C]oct/[C]aq)，log P)测试：
将聚合物溶液(20mL，1.5mg/mL)溶解在0.01M HCl溶液中(含150mM NaCl)，分别用1M NaOH溶液调节pH至5.00，5.50，6.25，6.50，6.80，7.00，7.40，8.10等，分别取出600μL，然后加入等体积正辛醇。涡旋10min后静置过夜后，离心(8000rpm，5min)，分别记录各pH下对应的UV-Vis吸光度(紫外可见分光光度计，日本岛津，UV-2600)，通过测量高分子在不同相中的UV-Vis光谱得到的标准曲线，从而确定各相中聚合物浓度。分配系数通过以下公式进行计算：log P＝log([C]oct/[C]aq)，其中[C]oct和[C]aq分别代表聚合物在正辛醇和等渗钠盐溶液中的浓度。当log P小于0时，说明此时聚合物是相对亲水的，log P大于0时，说明聚合物此时是相对亲油的。每个测试重复三次。
从图3中的(D)可知，在pH低于6.50时，log P小于0，说明聚合物相对亲水，随着pH下降，聚合物亲水性逐渐增强，此时分子链中亲水结构域增加，这是由于聚合物链上三级胺单元质子化程度增加，正电荷链段比例增加，聚合物变得更加亲水；在pH为6.50时，log P为0.04，说明此时聚合物中亲水链段与疏水链段比例接近一半；随着pH增加，分子链上三级胺侧基逐渐被去质子化后，分子链疏水性增强。这些结果表明，C628Bu9随着质子化程度不同时，表现出不同的亲疏水性与带电性，在酸性条件下(pH小于7时)，分子链相对亲水，表现出正电两亲性；在在碱性条件下，分子链更加疏水。
抗菌高分子C628Bu9溶血率测试：
将抗凝羊血(含EDTA，广州鸿泉生物科技有限公司)与1×PBS(pH＝7.4)。按1:5体积比混合均匀，3000rpm离心10min(Eppendorf 5430小型台式高速冷冻离心机)，弃上清，重复4次，最后将洗后的红细胞用PBS稀释25倍。将100μL稀释25倍后的红细胞溶液，与等体积浓度分别为6400、3200、1600、800、400、200、100、50、25μg/mL的高分子溶液混合，37℃下孵育1h后，3000rpm离心3min，取100μL上清至96孔板，通过酶标仪(Tecan Infinite 200 Pro)测试576nm下吸光度。其中，阳性对照为0.2％Triton X-100溶液，阴性对照为PBS溶液。通过下列公式(1)计算溶血率(Hemolysis ratio)。
Figure BDA0003395301610000111
其中，ODsample代表高分子溶液样品的OD值；
ODpositive代表阳性对照样的OD值；
ODnegative代表阴性对照样的OD值；
所得结果为平行样的平均值，n＝3。
实验结果如图3中的(E)所示，C628Bu9在生理pH条件下时，对红细胞毒性很低，材料浓度低于200μg/mL时，溶血率低于1％，其HC10(溶血率为10％时聚合物的浓度)为1600μg/mL。这是由于在生理pH(约7.40)时，高分子构象呈疏水态，与哺乳动物细胞的细胞膜相互作用力很弱，对红细胞毒性很低。
抗菌高分子C628Bu9不同质子化程度(PD)下杀菌活性测试：
C628Bu9在正常生理条件下对红细胞具有较低的毒性，根据其结构特性，分子链上三级胺基团在不同pH下时，分子链构象不同，会对其抗菌活性产生不同的影响。本实施例首先研究了该高分子C628Bu9在pH 7.40和6.25时对革兰氏阴性菌大肠杆菌(E.coli，ATCC35218)的杀伤情况；然后进一步研究了其在不同pH(7.40，6.80，6.50，6.25，6.00，5.75，5.50，5.25，5.00)下对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(S.aureus，ATCC 6538)和革兰氏阴性菌大肠杆菌(E.coli，ATCC 35218)的杀菌活性。实验方法如下：
挑取单克隆菌落于2mL LB肉汤中，37℃下震荡(200rpm)培养过夜。然后吸取2μL细菌悬浮液接种到1mL新鲜LB肉汤中，并在37℃下震荡培养过夜后，将菌液在10000rpm下离心1min，倾去上层清液后，加入1mLPBS重悬清洗，再离心，重复清洗步骤三次后用PBS重悬。将菌液用pH 7.40的M9培养基稀释至1×106CFU/mL，然后将稀释后的菌液与等体积的浓度分别为256、128、64、32、16和8μg/mL的高分子溶液(pH 7.40M9培养基配制)混合，37℃下孵育1h后，通过平板计数法对其杀菌性能进行评价。pH 6.25时的杀菌性能也通过类似的方法测试，高分子溶液初始浓度分别为32、16、8、4、2和1μg/mL。其中，以未加入抗菌高分子溶液的样品作为对照组，每个pH下均设对照组。细菌存活率(Survival)通过公式(2)计算。
Figure BDA0003395301610000121
其中，Nexperiment和Ncontrol分别是实验组和对照组中存活的菌落数(CFU)；
所得结果为平行样的平均值，n＝3。
如图3中的(F)所示，聚合物C628Bu9在7.40时几乎没有杀菌效果，在酸性条件下，C628Bu9浓度在大于4μg/mL时具有高抗菌活性，杀菌率为100％(n＝3)。这表明该高分子C628Bu9在具有pH激活型杀菌活性。
如图3中的(G)所示，对于革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(S.aureus，ATCC 6538)和革兰氏阴性菌大肠杆菌(E.coli，ATCC 35218)而言，当聚合物浓度为4μg/mL时，在7.40和6.80时，几乎无杀菌活性，在pH 6.50～5.25间具有高杀菌活性，细菌存活率低于20％(将细菌存活率低于20％的pH范围定义为pHBS20，细菌存活率低于20％对应的抗菌高分子的质子化率区间定义为PDBS20)，从结果可知，C628Bu9的PDBS20为50～95％；进一步分析可知，高分子C628Bu9在PD为85.5％(pH 6.25)时具有最高杀菌活性，细菌存活率接近0，这可能是由于此时呈两亲性构象的分子链具有最集中的电荷密度，有效增强了高分子与细菌细胞膜的相互作用；而随着质子化程度增加至96.2％(pH 5.00)，杀菌率下降至75％，此时，分子链中正电荷数增加，同种电荷相互排斥作用力增强，分子链更加舒展，此时链段中亲水比例增加，与细菌细胞膜的疏水相互作用力下降，因此杀菌活性下降。
用同样的实验方法进一步测试了该高分子C628Bu9对几种耐药菌株(耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，MRSA ATCC 43300，临床分离耐药肺炎克雷伯杆菌菌株Kpn-ESBL+201232，甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌MSSA 201896)和几种临床分离的菌株(绿脓杆菌Pae 190836，溶血葡萄球菌S.haemolyticus 201897，肺炎克雷伯菌Kpn 190948)的杀菌活性。
如图4中的(H)所示，结果表明在pH 6.25时(高分子C628Bu9的浓度是8μg/mL)，该高分子对这几种耐药菌株都具有很强的杀菌活性，MASR ATCC 43300，Kpn 190949，Pae190836，MSSA 201896，溶血葡萄球菌S.haemolyticus 201897，Kpn-ESBL+201232的存活率分别为0.41％，0，0，0.19％，4.94％，0.02％。
从上述研究结果来看，C628Bu9在中性条件下，分子链呈疏水构象，对红细胞毒性低，在酸性条件下，三级胺侧基部分质子化后，分子链呈两亲性构象时，具有抗菌活性，当分子链中的疏水结构单元与正电性结构单元比例达到某种平衡，即三级胺侧基在一定的质子化率(85.5％)时，具有最强的杀菌活性。
实施例2：C628Bu9杀菌机理的研究
细菌死活染色测试：
为研究C628Bu9的杀菌机理，本实施例通过死活染色法研究该高分子在pH 7.40和6.25时对大肠杆菌(E.coli，ATCC 35218)的杀伤情况。将3×109CFU(1mL在LB肉汤中)对数期的E.coli悬浮液(细菌按照1:200(v/v)传代摇菌3h)加入共聚焦皿中，37℃下静置孵育2h后，轻轻吸去上层细菌悬浮液，用1mL PBS轻轻润洗残留的细菌2次后，再分别加入1mL浓度为256μg/mL的聚合物溶液(pH 7.40或6.25M9培养基中)，对照组只分别加入pH 7.40或6.25的M9培养基溶液，接着，37℃下共孵育4h后吸走上层溶液，分别加入1mL含有SYTO 9(3μL/mL，Thermo Fisher Scientific)和碘化丙啶(PI，3μL/mL，Thermo Fisher Scientific)的染料溶液。避光孵育15min后吸走染料溶液，用PBS轻轻润洗2次残留的细菌，最后分别加入1％的琼脂糖溶液固定细菌。染色后的细菌样品分别用激光共聚焦显微镜(ZEISS LSM 880)观察，使用63×油镜进行观察。
实验结果如图4中的(A)所示，从图4中的(A)可知，高分子C628Bu9在pH 7.40时，只有极少数的细菌被染上红色，在pH 6.25时，绝大部分的细菌都被PI染成红色，说明细菌在酸性条件下与高分子C628Bu9孵育后，其细胞膜被破坏，PI进入细胞内。
模拟细菌膜成分脂质体染料泄漏测试：
用磷酸盐缓冲液A(10mM Na2HPO4+90mM NaCl，pH 7.40)配制ANTS染料(12.5mM)和DPX(45mM)拮抗剂。在一个干净的圆底烧瓶中加入含有脂质体的溶液(3:1，POPE(1-棕榈酰-3-油酰-sn-甘油-2-磷酸乙醇胺)/POPG(1-棕榈酰-3-油酰-sn-甘油-3-磷酸-(1'-rac-甘油)钠盐脂质体囊泡，其中POPE(130μL，25mg/mL CHCl3)，POPG(115μL，10mg/mL CHCl3)，用CHCl3定容到1mL)；37℃下减压旋蒸除去氯仿，在烧瓶内壁形成脂质体薄膜，真空干燥过夜除去残留溶剂后，在烧瓶中预先配好的1mLANTS/DPX溶液，37℃℃下水化处理1h后，冻融10次(液氮中冷冻，37℃水中溶解)。然后用脂质体挤出器(1μm的聚碳酸酯薄膜)将该溶液挤压20次；随后，用Sephadex G-50凝胶柱洗脱去除溶液中未包载入脂质体的染料，将得到的包载了染料的脂质体溶液用磷酸盐缓冲液A稀释20倍。将50μL的脂质体溶液分别与浓度为64，32，16，8μg/mL高分子C628Bu9溶液(50μL，pH 7.40或6.25)在96孔黑孔板中混合，其中磷酸盐缓冲液(50μL，pH 7.40或6.25)和Triton X-100(50μL，0.2％，v/v，pH 7.40或6.25)分别作为对应pH条件下的阴性对照组和阳性对照组。用酶标仪测试共孵育10min后在380/520nm激发/发射光下的荧光强度。根据下面的公式计算染料泄露的比例：Dye leakage(％)＝[(Fs-Fn)/(Fp-Fn)]×100，其中Fs是实验组样品的荧光强度，Fp和Fn分别代表阳性对照和阴性对照组的荧光强度(n＝2)。
模拟细菌细胞膜的脂质体染料泄漏实验进一步验证了高分子C628Bu9的酸响应杀菌活性，如图4中的(B)所示，在pH 7.40时，染料泄漏比例可忽略不计，在pH 6.25时，随着C628Bu9浓度从8μg/mL增加至64μg/mL，染料泄漏的比例从0增加至100％，该实验表明C628Bu9可以选择性的在酸性条件下破坏模拟细菌细胞膜的脂质体，这可能是由于在酸性条件下，分子链上的三级胺被质子化使得分子链呈两亲性状态，通过静电与疏水相互作用增强了与表面带负电的细菌细胞膜结构相互作用，破坏膜的稳定性，导致染料泄漏。
细菌形貌SEM拍摄：
通过场发射扫描显微镜观察不同pH(7.40和6.25)下细菌与高分子C628Bu9溶液共孵育后细胞膜形貌的变化情况，研究其杀菌机理。将对数期的E.coli(ATCC 35218，5×108CFU，在5mL pH 7.40或6.25的M9培养基)与高分子溶液(浓度为128μg/mL)在37℃下共孵育1h后，5000rpm下离心5min，倾去上层清液，加入电镜固定液在4℃下固定过夜，随后离心弃去上层溶液后，用去离子水洗细菌2次，再用梯度酒精(30％，50％，70％，80％，90％和100％)脱水，每次20min，再用叔丁醇/乙醇(1:1，v/v)处理20min，最后用叔丁醇置换3次，冷冻干燥过夜。最后将干燥后的细菌贴到导电胶表面，喷铂金后，通过场发射电子显微镜(Carl Zeiss AG，Merlin)观察细菌的形貌。
细菌断面形貌TEM拍摄：
TEM测试中，C628Bu9溶液与细菌共孵育处理的条件相同，离心后用电镜固定液在4℃下固定过夜后，用PBS洗3次，每次10min，再用1％四氧化锇在4℃下固定2h，PBS清洗3次，再依次用50％，70％，80％，90％酒精梯度脱水，每次15min，100％的酒精脱水2次，用丙酮脱水2次，每次15min。接着用100％丙酮:包埋液＝3:1(v/v)在室温下浸泡0.5h，100％丙酮:包埋液＝1:1(v/v)室温下浸泡4h，最后用纯包埋液4℃浸泡过夜。用包埋剂将样品包埋在包埋板里，放在37℃烤箱固化24h，60℃烤箱固化48h，用超薄切片机将样品切成厚约100nm的超薄切片，用醋酸双氧铀染色20min，柠檬酸铅染色12min，用透射电镜(FEI捷克有限公司，Tecnai G2 Spirit)进行拍摄。
如图4中的(C)所示，从SEM的结果可以看出，在pH 7.40时，给药处理的细菌与未给药处理的细菌形貌几乎没有差别，细菌形态饱满，细菌夹膜呈褶皱状；在pH 6.25时，与高分子C628Bu9共孵育后的细菌，其褶皱状的夹膜被破坏，细菌表面被磨平，部分细菌塌缩；通过TEM拍摄的细菌断面图可以更直观的观察到给药处理前后细菌内部形态变化(图4中的(C))，在pH 7.40时，给药处理的细菌细胞截面形貌与对照组类似，细菌细胞壁细胞膜结构完整，在pH 6.25时，与未给药处理的细菌相比，给药处理后的细菌细胞膜被破坏，细菌内容物流出。SEM和TEM的结果进一步表明，C628Bu9是通过破坏细菌细胞膜，细菌内容物流出，导致细菌死亡，这种破坏细菌膜起到杀菌作用的方式，不易产生耐药性。
实施例3：酸性环境激活型抗菌高分子中单体比例改变与其活性关系的探究
对酸性环境激活型抗菌高分子
Figure BDA0003395301610000151
中，通过改变这两种甲基丙烯酸酯单体
Figure BDA0003395301610000152
的投料比例(n:m＝10:0，8:2，6:4)制备抗菌高分子C630，C627Bu6，C623Bu14。
其制备方法如下：
分别将C6-MA和BMA以摩尔比例C6A:BMA＝10:0，8:2，6:4(即10mmol C6-MA、8mmolC6-MA+2mmol BMA、6mmol C6-MA+4mmol BMA)的投料量加入三个圆底烧瓶中，再分别依次加入偶氮二异丁腈(AIBN，18.25mg，0.11mmol)，4-氰基-4-(硫代苯甲酰)戊酸(CPDB，93.13mg，0.33mmol)，2mL干燥的二氧六环溶液，充分溶解后，以N2为保护气，密闭反复冻融除氧气，循环5次后，在75℃反应24h后，冷却降至室温后在液氮中终止反应，浓缩反应溶液，在冷正己烷中沉淀产物、提纯，真空干燥过夜。分别得到橙色聚合物C630，C627Bu6，C623Bu14。
本实施例高分子材料的GPC及1H NMR表征：
C630，C627Bu6和C623Bu14的GPC及1H NMR的测试方法与实施例1中C628Bu9的测试方法相同。其中，GPC测试得到C630，C627Bu6和C623Bu14的分子量分布系数分别为1.19，1.11和1.13。1H NMR结果如图5所示。
经核磁分析(图5中的(A))，C630中含C6侧基结构单元个数为30。其中，1H NMR(400MHz，Chloroform-d)：δ7.28(2H)，4.11(54H)，2.82-2.57(61H)，2.47(119H)，1.91(49H)，1.61(109H)，1.47(56H)，1.06(31H)，0.89(43H)。
经核磁分析(图5中的(B))，C627Bu6中含C6侧基结构单元个数为27，BMA的个数为6。1HNMR(400MHz，Chloroform-d)：δ7.28(m，2H)，4.26-4.03(49H)，3.96(s，17H)，2.69-2.56(63H)，2.47(99H)，1.92(25H)，1.63(121H)，1.44(80H)，1.05(35H)，0.98(28H)，0.89(54H)。
经核磁分析(图5中的(C))，C623Bu14中含C6侧基结构单元个数为23，Bu侧基单元个数为14。1H NMR(600MHz，Chloroform-d)：δ7.28(2H)，4.09(43H)，3.96(30H)，2.61(56H)，2.47(82H)，1.92(33H)，1.82(31H)，1.44(84H)，1.11-0.83(143H)。
本实施例制备的高分子材料的性能表征：
C630，C627Bu6和C623Bu14酸度系数测试、溶血率测试、不同pH下油水分配系数、不同pH下溶液的电势、抗菌活性的测试方法参考实施例1中的方法进行。
图6中的(A)为不同单体比例的六元环三级胺抗菌高分子化学结构示意图。图6中的(B)为通过滴定曲线测得溶液pH转变曲线后计算得到的高分子质子化程度随着pH改变的曲线。从图中可知，这些高分子的质子化程度随着pH的增加会有一个迅速转变，随着分子链中疏水结构单元占比增加9时，对应高分子发生突跃转变的pH下降。从图6中的(C)可知，该系列高分子C630，C627Bu6，C628Bu9，C623Bu14，随着高分子中Bu侧基单元比例从0增加到37％时，pKa逐渐变小，分别为7.25，6.82，6.64，6.32。从图6中的(D)中可知，抗菌高分子的溶血率随着浓度的增加而增大。其中，当浓度为800μg/mL时，C630，C627Bu6，C628Bu9和C623Bu14溶血率分别52.39％，10.72％，4.77％和2.85％。对比曲线增强趋势可知，C630的溶血率随浓度增加而增大的幅度较其它高分子C627Bu6、C628Bu9、C623Bu14的明显，说明C630对红细胞的破坏能力更强。C630，C627Bu6，C628Bu9，C623Bu14的HC10分别为25μg/mL，400μg/mL，1600μg/mL，3200μg/mL。
图6中的(E)是该系列高分子材料溶液滴定过程中测试得到其电势随pH变化的结果图。高分子溶液在酸性溶液中呈澄清透明态，随着NaOH滴加量增加时，溶液pH逐渐从5增加到7.0时，高分子溶液浊度逐渐增加；pH继续增加到9时，最后溶液中有絮状沉淀析出。从图6中的(E)可知，在pH<7.4时，该系列高分子材料溶液电势为正值，约为15～20mV，此时材料的质子化程度100％>PD>0；当pH>7.40时，PD接近0时，即分子链上的三级胺基团上的去质子化程度接近100％时，溶液电势迅速下降，变为负值。
图6中的(F)为高分子溶液log P与pH关系图。当log P大于0时，代表着高分子此时相对亲水，反之，log P大于0时，代表高分子链此时相对疏水。从图中可知，随着pH从8下降到5时，log P从正值转变为0，再继续下降至小于0，说明在高分子三级胺基团去质子化过程中，高分子链从相对亲水态，转变为可组装成纳米颗粒的正电两亲性态，最后在质子化程度为0时，变为完全疏水态。这些结果表明，这些高分子具有正电两亲性转变的性质。
图6中的(G)中给出了该系列高分子在不同质子化程度下的杀菌活性。从图中可知，细菌存活率随着质子化程度从0增加至100％时，细菌存活率先下降后增加，在PD约为85％时，存活率最低。这是由于分子链构象随着PD从0增加到100％时，当质子化程度达到一定的值时，此时分子链中正电荷结构域与疏水结构域达到某种平衡时，高分子具有最高抗菌活性，有的高分子杀菌率可高达100％(图中标*所示)，随着质子化程度进一步增大时，分子链中正电荷比例增加，分子链更加亲水时，分子链与细菌细胞膜疏水相互作用力变弱，聚合物的抗菌活性下降。除C623Bu14外，其余三种高分子在PD≈85％时具有很强的杀菌活性，细菌存活率接近0，而C623Bu14的细菌存活率则约为15％～20％。
实施例4：酸性环境激活型抗菌高分子中三级胺侧基的结构对其活性的影响
对酸性环境激活型抗菌高分子
Figure BDA0003395301610000171
中，通过调整R1侧基的种类，侧基分别为
Figure BDA0003395301610000172
的甲基丙烯酸酯单体(C5-MA、DMA、C7-MA：
Figure BDA0003395301610000181
与BMA单体
Figure BDA0003395301610000182
以摩尔投料比例为7:3的比例合成抗菌高分子C526Bu9，DM28Bu13，C722Bu8。合成方法如下：
取三只圆底烧瓶，分别加入N-羟乙基吡咯烷(C5，3.46g，30mmol)、N,N-二乙基乙醇胺(DM，3.51g，30mmol)N-(2-羟乙基)六亚甲二胺(C7-OH，4.30g，30mmol)，再往反应瓶中分别依次加入三乙胺(3.67g，36mmol)、对苯二酚(33mg，0.3mmol)、四氢呋喃(32g)，充分溶解后，然后将甲基丙烯酰氯(3.45g，30mmol)分别逐滴加入上述溶液中。在冰水浴中磁力搅拌避光回流反应过夜，反应溶液经过滤后，减压蒸馏提纯得到N-(2-羟乙基吡咯烷基)乙基甲基丙烯酸酯(C5-MA)、2-(二异乙基氨基)甲基丙烯酸乙酯(DMA)和2-(氮杂环庚烷-1-基)乙基甲基丙烯酸酯(C7-MA)。
然后在3只10mL圆底烧瓶中分别加入7mmol C5-MA、DMA和C7-MA，并分别依次加入3mmol BMA，偶氮二异丁腈(AIBN，18.25mg，0.11mmol)，4-氰基-4-(硫代苯甲酰)戊酸(CPDB，93.13mg，0.33mmol)，2mL干燥的二氧六环溶液，充分溶解后，以N2为保护气，密闭反复冻融除氧气，循环5次后，在75℃反应24h后，冷却降至室温后在液氮中终止反应，浓缩反应溶液，在冷正己烷中沉淀产物、提纯，真空干燥过夜。分别得到橙色聚合物C526Bu9，DM28Bu13，C722Bu8。
本实施例高分子材料的GPC及1H NMR表征：
C526Bu9，DM28Bu13，C722Bu8的GPC及1H NMR的测试方法与实施例1中C628Bu9的相同。
GPC测试得到C526Bu9，DM28Bu13，C722Bu8的分子量分布系数分别为1.07，1.67和1.25。1H NMR结果如图7所示。
经核磁分析(图7中的(A))，C722Bu8中带C7侧基单元的个数为22，带Bu侧基疏水单元的个数为8。其中，1H NMR(400MHz，Chloroform-d)：δ7.29(2H)，δ4.05(35H)，4.00-3.82(24H)，2.90-2.64(131H)，2.03-1.89(24H)，1.82(26H)，1.69(199H)，1.41(31H)，1.05(28H)，0.98(43H)，0.89(41H).
经核磁分析(图7中的(B))，C526Bu9中带C5侧基单元的个数为26，带Bu侧基疏水单元的个数为9。其中，1H NMR(600MHz，Chloroform-d)：δ7.40(2H)，4.11(45H)，3.95(24H)，2.94-2.50(154H)，2.00-1.87(42H)，1.84-1.78(100H)，1.45-1.39(26H)，1.09-0.84(120H)。
经核磁分析(图7中的(C))，DM28Bu13中带DM侧基单元的个数为28，带Bu侧基疏水单元的个数为13。1H NMR(600MHz，Chloroform-d)：δ7.39(2H)，3.98(80H)，2.86-2.52(166H)，1.83(42H)，1.62(30H)，1.41(36H)，1.18-1.02(206H)，1.00-0.87(108H)。
本实施例高分子材料的性能表征：
C526Bu9，DM28Bu13，C722Bu8酸度系数测试、溶血率测试、不同pH下油水分配系数、不同pH下溶液的电势、抗菌活性的测试方法参考实施例1中的方法进行。
图8中的(A)为不同三级胺侧基种类的抗菌高分子化学结构示意图，其中三级胺侧基的疏水性大小为C5<DM<C6<C7。从图8中的(B)可知，滴定过程中，高分子质子化程度随着pH的改变有一个突变点，发生突变的pH值随着三级胺侧基疏水性的增加而减小。从图8中的(C)可知，C526Bu9，DM28Bu13，C628Bu9和C722Bu8的pKa，随着分子链中三级胺侧基的疏水性增加(C5-MA，DMA，C6-MA，C7-MA的log P分别为1.5，1.77，1.83，2.24)而下降，pKa分别为7.26，6.87，6.64和6.46。从溶血率与浓度关系曲线图中可知，C526Bu9和DM28Bu13对红细胞膜破坏性较另两种高分子C628Bu9和C722Bu8大，例如，在浓度为800μg/mL时，C526Bu9，DM28Bu13，C628Bu9和C722Bu8的溶血率分别为98％，100％，4.78％和4.91％。随着分子链中三级胺侧基的疏水性增加，HC10从6μg/mL增加至大于3200μg/mL。图8中的(E)为溶液电势与pH关系图，图8中的(F)为油水分配系数与pH的关系结果图，由图可知，随着pH从9下降至4时，该系列高分子的分子链构象从相对疏水态依次转变为正电两亲性态、正电亲水态。进一步，该系列高分子随着质子化程度从0增加至100％时，其对细菌的杀菌活性表现出与实施例3中制备的高分子类似的规律，细菌存活率先下降后增加，在PD约为85％时，存活率最低(图8中的(G))。
实施例5：酸性环境激活型抗菌高分子的烷基链侧基的长度对其活性的影响
对酸性环境激活型抗菌高分子
Figure BDA0003395301610000191
中，烷基链长度分别为p＝1或5(即EMA:
Figure BDA0003395301610000192
或HMA:
Figure BDA0003395301610000193
)时，分别以投料比例(摩尔比)为C6A:EMA(或HMA)＝7:3时，制备抗菌高分子C629E10和C624H10。制备方法如下：
取两只10mL圆底烧瓶，分别加入3mmol的EMA和HMA，然后再依次加入C6-MA(1.38g，7mmol)，偶氮二异丁腈(AIBN，18.25mg，0.11mmol)，4-氰基-4-(硫代苯甲酰)戊酸(CPDB，93.13mg，0.33mmol)，2mL干燥的二氧六环溶液，充分溶解后，以N2为保护气，密闭反复冻融除氧气，循环5次后，在75℃反应24h后，分别冷却降至室温后在液氮中终止反应，浓缩反应溶液，在冷正己烷中沉淀产物、提纯，真空干燥过夜。分别得到橙色固体高分子C629E10和C624H10。
本实施例高分子材料的GPC及1H NMR表征：
C629E10和C624H10的GPC及1H NMR的测试方法与实施例1中C628Bu9的相同。
GPC测试得到C629E10和C624H10的分子量分布系数分别为1.34和1.59。1H NMR结果如图9所示。
经核磁分析(图9中的(A))，C629E10中C6侧基单元个数为29，乙基侧基单元个数为10。1H NMR(600MHz，Chloroform-d)δ7.29(2H)，δ4.09(77H)，2.69-2.58(66H)，2.47(108H)，1.92(36H)，1.82(34H)，1.47(59H)，1.34-1.21(59H)，1.10-1.02(40H)，0.90(74H)。
经核磁分析(图9中的(B))，C624H10中C6侧基单元个数为24，己基侧基单元的个数为10。1H NMR(400MHz，Chloroform-d)δ7.28(2H)，4.09(45H)，3.95(22H)，2.83-2.56(54H)，2.47(89H)，1.71-1.56(114H)，1.47(43H)，1.34(73H)，1.05(34H)，0.90(91H)。
本实施例高分子材料的性能表征：
C629E10和C624H10酸度系数测试、溶血率测试、不同pH下油水分配系数、不同pH下溶液的电势、抗菌活性的测试方法参考实施例1中的方法进行。
图10中的(A)为不同种类烷基链侧基的抗菌高分子化学结构示意图，其中烷基链侧基的疏水性大小为E<Bu<H。从图10中的(B)中可知，滴定过程中，高分子质子化程度随着pH的改变有一个突变点，发生突变的pH值随着烷基链侧基疏水性的增加而减小。从图10中的(C)可知，C629E10，C628Bu9和C624H10的pKa，随着分子链中烷基链侧基疏水性的增加(EMA，C6-MA，HMA的log P分别为1.33，2.03，3.07)而下降，pKa分别为7.07，6.64和6.46。从溶血率与浓度关系曲线图中可知，C629E10对红细胞膜破坏性较另两种高分子C628Bu9和C624H10大，例如，在浓度为800μg/mL时，C629E10，C628Bu9和C624H10的溶血率分别为17.94％，4.78％和5.25％。对C628Bu9和C624H10而言，疏水烷基链长度过长时，反而会使得聚合物毒性会略增大，可能是由于碳链过长时，增加了高分子与红细胞膜的相互作用力。C629E10，C628Bu9和C624H10的HC10分别为200μg/mL，1600μg/mL和1600μg/mL。从图10中的(E)为溶液电势与pH关系图，图10中的(F)为油水分配系数与pH的关系结果图，由图可知，随着pH从9下降至4时，该系列高分子也表现出分子链构象从相对疏水态依次转变为正电两亲性态、正电亲水态。进一步，该系列高分子随着质子化程度从0增加至100％时，其对细菌的杀菌活性表现出与实施例3中制备的高分子类似的规律，细菌存活率先下降后增加，在PD约为85％时，存活率最低(图10中的(G))。
实施例6：酸性环境激活型抗菌高分子的分子量大小对其性能影响
对酸性环境激活型抗菌高分子
Figure BDA0003395301610000211
中，甲基丙烯酸酯C6-MA单体
Figure BDA0003395301610000212
与BMA单体
Figure BDA0003395301610000213
以摩尔投料比例为7:3的比例合成低分子量(聚合度为10，即m+n＝10)、中低分子量(聚合度为32，即m+n＝32)、高分子量(聚合度为90，即m+n＝90)的抗菌高分子，合成方法如下：
取3只10mL圆底烧瓶，每个烧瓶中均加入BMA(3mmol，426.6mg)和C6-MA(7mmol，1381.1mg)，然后再分别加入1mmol(279.38mg)，0.33mmol(93.13mg)，0.11mmol(31.01mg)的4-氰基-4-(硫代苯甲酰)戊酸(CPDB)，再依次加入偶氮二异丁腈(AIBN，18.25mg，0.11mmol)，2mL干燥的二氧六环溶液，充分溶解后，以N2为保护气，密闭反复冻融除氧气，循环5次后，在75℃反应24h后，分别冷却降至室温后在液氮中终止反应，浓缩反应溶液，在冷正己烷中沉淀产物、提纯，真空干燥过夜。分别得到橙色固体产物C67Bu3，C623Bu9，C663Bu27。
本实施例高分子材料的GPC及1H NMR表征：
C67Bu3，C623Bu9，C663Bu27的GPC及1H NMR的测试方法与实施例中C628Bu9的相同。1HNMR结果如图11所示。
经核磁分析(图11)，C67Bu3中，含C6侧基单元的个数为7，含Bu侧基单元的个数为3，符合预期投料。1H NMR(400MHz，Chloroform-d)：δ7.39(2H)，4.22(14H)，3.96(7H)，2.69(41H)，1.82(42H)，1.52(13H)，1.41(12H)，1.34-1.18(8H)，1.06(9H)，0.96(11H)，0.94-0.78(17H)。
经核磁分析(图11)，C623Bu9中，含C6侧基单元的个数为23，含Bu侧基单元的个数为9。1H NMR(400MHz，Chloroform-d)：δ4.10(43H)，3.96(22H)，2.63(51H)，2.47(87H)，1.82(30H)，1.61(114H)，1.52-1.35(79H)，1.05(31H)，0.98(38H)，0.89(54H)。
经核磁分析(图11)，C663Bu27中，含C6侧基单元的个数为63，含Bu侧基单元的个数为27，符合预期投料。(400MHz，Chloroform-d):δ7.39(2H)，δ4.18(115H)，4.08-3.84(65H)，2.65(379H)，1.82(93H)，1.69(332H)，1.52(139H)，1.41(108H)，1.05(90H)，0.98(127H)，0.94-0.79(197H)。
本实施例高分子材料的性能表征：
C67Bu3，C623Bu9，C663Bu27酸度系数测试、溶血率测试、杀菌活性的测试方法参考实施例1中的方法进行。
图12中的(A)给出了不同分子量大小的三种抗菌高分子C67Bu3，C623Bu9，C663Bu27的化学结构示意图。从核磁结果可知，这三种高分子分子链中Bu侧基单元占比均接近30％。从图12中的(B)中可知，滴定过程中，高分子质子化程度随着pH的改变有一个突变点，该突变点的pH相近。从图12中的(C)可知，聚合物的pKa随着聚合度的增加(分别为10，32，90)变化不大，pKa分别为6.55，6.49，6.41，说明分子量的大小对该系列高分子的pKa的影响不大，随着聚合度的增加略有下降。
从溶血率与浓度关系曲线图中可知，分子量最小的C67Bu3对红细胞膜破坏性较另两种C623Bu9，C663Bu27大，例如，在浓度为800μg/mL时，C67Bu3，C623Bu9，C663Bu27的溶血率分别为20.97％，3.88％和0.95％，由此可知，随着分子量增加，该系列高分子对红细胞膜的破坏性变弱。C67Bu3，C623Bu9，C663Bu27的HC10分别为100μg/mL，1600μg/mL和1600μg/mL。从图12中的(E)中可以看出，进一步，该系列高分子随着质子化程度从0增加至100％时，其对细菌的杀菌活性表现出与实施例1中制备的高分子类似的规律，细菌存活率先下降后增加，在PD约为90％时，存活率最低。其中，最小分子量的C67Bu3随PD变化时，其具有较强杀菌活性的PD区间较其它两种分子量的窄。
将实施例1，3，4，5和6中制备的高分子的结构组成、pKa及HC10结果汇总，如下表1所示。综合分析可知，分子链中疏水性成分增加时，高分子的pKa会下降，其对红细胞膜的破坏性能也会变弱。值得注意的是，当高分子的分子量过小时(聚合度为10)，对比同类型的更高聚合度(32，37或90)的材料，其对红细胞毒性较大，HC10低至100μg/mL。图13中的(B)给出了聚合物在不同pH值下对大肠杆菌的杀菌活性(左图)，颜色越深代表杀菌活性越强，结合图13中的(C)，不同pH时高分子质子化程度结果可知，高分子杀菌活性与其分子链中三级胺的质子化程度有关，它们呈现出较高抗菌活性时pH的区间范围(pHBS20)各不相同，当高分子中的Bu侧基单元比例增加时，范围向pH更酸的一侧移动，其中，Bu侧基单元比例为40％时，高分子的杀菌活性整体下降；三级胺侧基的疏水性增加或者疏水烷基链疏水性增加时，pHBS20表现也呈现出这样的规律，其中C526Bu9的pHBS20最窄，仅在pH 6.80附近细菌存活率低于20％；而分子量过小的高分子C67Bu3的pHBS20范围较同类型分子量更大的高分子的窄，在pH6.50-5.75，分子量更大的C623Bu9和C663Bu27的pHBS20在pH 6.50-5.25间。
结合不同pH时高分子质子化程度的热图(图13中的(C))可知，这些高分子普遍表现出在PD为50％～93％间具有高抗菌活性。当质子化程度从0开始增加时，分子链从疏水构象向两亲性构象转变，抗菌活性增强，当质子化程度达到一定值时，此时分子链中正电荷结构域与疏水结构域达到某种平衡时，高分子具有最高抗菌活性，有的高分子杀菌率可高达100％；随着质子化程度进一步增大时，分子链中正电荷比例增加，分子链更加亲水时，分子链与细菌细胞膜疏水相互作用力变弱，高分子的抗菌活性下降。其中，这些高分子表现出在质子化程度为85％附近时，具有最高的杀菌活性。总的来说，可以通过调控这类三级胺抗菌高分子的结构组成，来实现其在特定pH范围内具有高效的抗菌活性。
表1酸性响应抗菌高分子的结构组成、pKa及HC10结果。
Figure BDA0003395301610000231
(备注：“NT”表示未测试)
实施例7：高分子C628Bu9的体内酸响应杀菌活性研究
无菌的C57小鼠(雌性，7～8周龄，体重约为19g)，用1％戊巴比妥钠(150μL)经腹腔麻醉后，除去背部的毛，在小鼠背部左右侧皮下注射菌液(ATCC 35218，2.5×106CFU/50μLPBS)、菌液及C628Bu9混合液(ATCC 35218，2.5×106CFU/50μL PBS，药物浓度分别为256μg/mL和128μg/mL)。治疗24h后，处死小鼠，取下感染组织，称重，剪碎，加入1mL无菌水，匀浆，用PBS梯度稀释1/103，1/104，1/105倍，涂板计数。
由图14中的(B)感染组织细菌计数结果可知，C628Bu9具有体内感染酸度响应杀菌活性，对比未给药的对照组，给药治疗组具有显著抑制细菌生长的效果，其中高剂量给药组的抑制效果更加显著，高剂量给药治疗组中组织样品的细菌量比PBS组的细菌量存在约一个数量级的差异，具有非常显著性的差异(P值小于0.001)，低剂量给药组的菌量也比对照组少约0.5个数量级，具有显著性差异(P值小于0.05)。这一结果初步证实了C628Bu9具有体内酸响应杀菌活性。当细菌在体内增殖时，由于代谢分泌的酸性产物，使得感染部位的组织pH变酸，在酸性条件下，诱发了C628Bu9聚合物的酸激活性抗菌性能，从而起到杀灭细菌的作用。
实施例8：抗菌涂层的制备及性能表征
将抗菌高分子C628Bu9作为植入材料的抗菌涂层，进行制备及性能表征，制备流程及性能表征结果如图15中的(A)所示。具体操作如下：
将钛片(1×1cm2，厚度0.1mm)分别依次用丙酮、乙醇、去离子水超声清洗3次，每次10min后，用N2吹干。分别取20μL 2.58mg/mL，3.2mg/mL，6.4mg/mL，12.8mg/mL的C628Bu9溶液(溶解于二氯甲烷中)，均匀平铺在干燥的钛片上，在空气中晾干后，抽真空干燥过夜。分别将样品命名为Ti-C628Bu9-51.6，Ti-C628Bu9-64，Ti-C628Bu9-128，Ti-C628Bu9-256。其它抗菌高分子涂层采用类似的方法制备。(命名示范为Ti-高分子名称-含量/μg)
涂层表面形貌及组成表征：
将原钛片，含有抗菌高分子涂层的钛片样品贴在有导电胶的样品台上，真空条件下喷镀铂金60秒，在场发射扫描电子显微镜下观察样品的形貌。此外，通过表面傅里叶变换红外仪测试原钛片及抗菌高分子涂层的表面红外图谱。同时，使用X射线光电子能谱仪分析抗菌高分子涂层表面的元素组成。
如图15中的(B)所示，在放大1万倍和2万倍的图片中，均可清晰地观察到，原钛片表面呈粗糙状态，而含有C628Bu9涂层的样品在放大2万倍时，可观察到其表面呈平整状态。从红外图谱图15中的(C)中可观察到，对比原空白钛片，含有抗菌高分子涂层的样品可观察到明显官能团特征吸收峰。其中，1723cm-1的强峰为高分子链上酯基上的羰基(C＝O)的伸缩振动吸收峰，1147cm-1和1239cm-1的出峰为C＝O的反对称吸收峰(νas C＝O)；3000～2700cm-1处的为分子链上C-H的伸缩振动吸收峰，其中，2932cm-1和2852cm-1为-CH2-的伸缩振动吸收峰；1384cm-1的出峰为-CH3的反对称伸缩振动吸收峰；1444cm-1的出峰为苯环骨架上双键的伸缩振动吸收峰；1000～650cm-1区域为C-H的面外弯曲振动吸收区。从图中可知，随着涂层含量的增加，特征官能团出峰的强度逐渐增强。此外，结合原钛片与Ti-C628Bu9-256的XPS全谱图(D)和(E)可知，原空白钛片上可观察到在458eV处有明显的Ti 2p出峰，而抗菌涂层表面未观察到该出峰，这是由于致密的涂层将原钛片表面覆盖。空白钛片及抗菌涂层样品的Ti 2p高分辨扫描对比图(图15中的(F))进一步验证了这一结果，表明抗菌高分子涂层构建成功。从空白钛片及抗菌涂层样品N1s的高分辨扫描对比图(图15中的(G))可知，抗菌涂层的N1s出峰强度比钛片的强度大。此外，通过对C、N、O、S出峰积分面积进行计算，可知，对比空白钛片，Ti-C628Bu9-256中N的相对含量更加高，为4.28％。这一结果进一步证明了涂层成功的构建在钛片表面。
涂层表面静态水接触角表征：
以Ti-C628Bu9-64为例，测试其不同pH时的水接触角，分别将不同pH的M9培养基2μL轻轻滴加到钛片表面，稳定10min后，通过水接触角仪测试接触角，每个样品随机选择三个点进行测试。从图15中的(H)所示的结果来看，该抗菌涂层在不同pH值下呈现不同亲疏水性，在pH 7.4下，该涂层为疏水表面，其水接触角为48.91°，而随着pH下降，表面水接触角降低，表现出更加亲水的性质。
涂层溶血活性及对红细胞形貌的SEM拍摄：
羊血预处理方式如实施例1所述，简言之，先分别用pH 7.40和6.80的PBS清洗血细胞，最后分别将红细胞稀释至1/50倍。分别取160μL 1/50血细胞滴加到空白钛片、含抗菌涂层钛片上，37℃下静置孵育1h，将钛片上的细胞悬浮液转至1.5mL离心管，3000rpm下离心3min，取上层清液100μL至96孔板，测试576nm下OD值。其中阳性对照为160μL 1/25羊血细胞与等体积的1％Triton X-100混合。通过公式计算溶血率。对于抗菌涂层对红细胞形貌影响的检测，将30μL 1/50的血细胞溶液滴加到含抗菌涂层钛片上，37℃下孵育1h后，加入300μL电镜固定液室温下固定过夜后，吸走固定液，用PBS轻轻润洗3次样品，分别用30％，50％，70％，80％，90％的乙醇梯度浸泡脱水，每次15min，再用100％的乙醇浸泡脱水3次，每次15min，最后吸走酒精，空气中晾干。将样品贴在有导电胶的样品台上，真空下喷镀铂金60秒，通过场发射电子显微镜拍摄细胞形貌。
从图16中的(A)可知，C628Bu9涂层在pH 7.40和6.80时对红细胞的溶血活性都非常低，均低于5％；C629E10涂层在pH 7.40时溶血率低于5％，而在pH 6.80时溶血率为14～17％，对红细胞毒性较大。结合钛片样品表面红细胞的SEM图(图16中的(B))也可以看出，对于Ti-C628Bu9-256涂层，pH 7.40时，与涂层表面接触的红细胞形貌与阴性对照样品上的红细胞类似，呈完整的凹饼状，而在pH 6.80时，与该涂层接触的部分红细胞形貌改变，有的紧紧贴在涂层上，这可能是由于涂层在微酸条件下，分子链上的三级胺被部分质子化后带正电荷，与表面带负电荷的红细胞相互作用力增强。对于Ti-C629E10-256涂层，pH 7.40时，涂层表面附近的红细胞形貌呈完整的凹饼状，而在pH 6.80时，涂层表面红细胞体积变小，膜上可观察到明显孔洞，大部分细胞破碎，残留的红细胞膜黏附在涂层表面。另两种抗菌高分子C630和C526Bu9涂层在pH 7.40和6.80时溶血率均超过5％，其中C526Bu9涂层的溶血率接近100％，即使是在正常生理条件下，亦表现出很强的红细胞毒性。
细胞毒性测试：
分别将钛片样品放在24孔板中，样品正反面充分紫外光照灭菌4h。然后分别加入300μL PBS润洗，吸走PBS后，每孔加入200μl培养基(DMEM:FBS＝9:1，v/v)润洗，然后再每孔加入NIH 3T3细胞2×104(1mL)，在37℃、5％CO2中培养。分别测试培养1，2，3天后，将钛片转至新孔中，每孔加入300μL CCK-8稀释溶液(CCK-8试剂：DMEM培养基＝1:10，v/v)，在37℃、5％CO2培养箱中孵育3h后，每孔取出100μL溶液至96孔板，利用酶标仪测试450nm下的OD值。其中，未涂敷高分子的钛片作为对照组，每个实验独立重复四次。从图16中的(C)所示的结果来看，涂有聚合物C628Bu9的钛片与空白钛片OD值几乎没有太大差别，表明C628Bu9涂层对NIH-3T3细胞几乎没有毒性。
涂层体外抗菌活性测试：
E.coli ATCC 35218和S.aureus ATCC 6538的培养方式如实施例1所述，分别用pH7.40，6.80，6.50的M9培养基将菌液稀释至1×106和1×105CFU/mL,将涂有聚合物C628Bu9的钛片样品(尺寸5×5mm2)放在48孔板中，在钛片上滴加10μL细菌悬浮液，在孔板周围间隙中加入无菌PBS，以防止水分挥发。37℃下孵育2h后，将菌液和钛片都置于LB肉汤中，超声5min，涡旋，取稀释液涂板，37℃下培养过夜后计数，根据公式(2)计算其杀菌活性。其中对照组为未涂敷抗菌高分子的空白钛片(n＝3)。从图16中的(D)所示的结果来看，在pH 7.40时，C628Bu9涂层对ATCC 35218几乎没有杀菌效果，在感染酸度条件(pH 6.80和6.50)下对革兰氏阴性菌E.coli ATCC 35218具有很强的杀菌效果，其中在pH 6.50时杀菌率为100％。从图16中的(E)可知，在pH 7.40时，抗菌涂层C628Bu9对革兰氏阳性菌ATCC 6538几乎没有杀菌效果，随着pH下降，其杀菌活性增强。对比pH 6.50时对两种不同细菌的杀菌活性可知，抗菌涂层C628Bu9对ATCC 35218的杀菌活性较ATCC 6538强。
涂层对细菌形貌的影响：
分别用pH 7.40和6.50的M9培养基将菌液稀释至1×108CFU/mL，取10μL菌液分别滴加到钛片样品(尺寸5×5mm2)上，37℃下孵育2h后，加入300μL电镜固定液室温下固定过夜后，吸走固定液，用PBS轻轻润洗3次样品。细菌梯度脱水及干燥的方法参考实施例2中的方法。最后通过场发射电子扫描显微镜拍摄细菌形貌。
从图16中的(F)和(G)能直观的观察到，在空白钛片表面的细菌，形貌完整饱满；在酸性条件下，可观察到C628Bu9涂层表面团聚的金葡菌部分细菌形态变瘪，细菌内容物流出；C628Bu9涂层上黏附的大肠杆菌形态也发生改变，菌体形态变瘪。
综上，可知Ti-C628Bu9-256涂层在pH 7.40时表现出对哺乳动物细胞低毒性的优点，在微酸条件下(pH 6.80)时，对红细胞毒性较低，但对细菌具有一定杀菌活性，随着酸性降低至6.50时，杀菌活性增强。
实施例9：抗菌高分子涂层皮下植入抗感染效果评价
无菌的C57小鼠(雌性，8周龄，体重约为20g)，用1％戊巴比妥钠(150μL)经腹腔麻醉后，除去背部的毛，然后再分别将均匀滴加了10μL 1×108CFU/mL的E.coli ATCC 35218的空白钛片和涂敷抗菌高分子的钛片(5×5mm2,Ti-C628Bu9-256)植入到小鼠背部左右侧皮下。植入1天后将小鼠安乐死，取下钛片以及钛片周围的组织。将钛片置于含有LB肉汤的离心管中，超声5min，稀释菌液涂板计数。此外，将钛片样品周围的组织，加入无菌水匀浆，将组织液用无菌水梯度稀释后，涂板计数。
从图17中的(D)所示结果可知，空白钛片上细菌残留量为含涂层钛片的6.02倍；空白钛片周围感染部位组织中细菌的负载量为含涂层钛片样品的1.71倍(图17中的(C))。证明含有C628Bu9涂层的钛片样品在体内具有一定的抗感染效果，结果具有统计学上的显著性差异。
实施例10：涂层体内毒性评价
无菌的C57小鼠(雌性，11周龄，体重约为20g)，用1％戊巴比妥钠(190μL)经腹腔麻醉后，除去背部的毛，分别将空白钛片和涂有抗菌高分子的钛片Ti-C628Bu9-256，Ti-C526Bu9-256(尺寸为5×5mm2)植入到小鼠背部左右侧皮下。每天定期观察小鼠的状态，如伤口愈合状况、行动力、监测体重变化等。植入1，7，14天后，将小鼠摘眼球取血，血液收集到1.5mL离心管，静置，待凝固后，3000rmp下离心15min，取上清200μL，-20℃保存，用于测试血生化测试，评价样品的肝肾毒性。取下钛片周围的组织，进行组织学分析，将取出的组织用4％的多聚甲醛浸泡固定24h，然后用酒精梯度脱水后，石蜡包埋切片，利用苏木精/伊红染料染色，组织切片用数字病理扫描显微镜观察。最后，取下小鼠的主要脏器(心、肝、脾、肺、肾)，转入装有40mL 4％多聚甲醛溶液的离心管中，室温固定，待1天后，更换一次固定液。然后经酒精梯度脱水后，石蜡包埋切片，利用苏木精/伊红染料染色，组织切片用数字病理扫描显微镜观察。
从图18的结果可知，C628Bu9及C526Bu9涂层植入小鼠皮下1天后，血清中丙氨酸氨基转移酶含量与对照组无显著性差异，C628Bu9涂层中门冬氨酸氨基转移酶的含量较对照组有显著的提高(P<0.05)，可能在植入第一天后会产生一定的肝毒性；而血清中尿素氮、尿酸、肌酸激酶的含量与对照组相比，无显著性差异，说明两种涂层对小鼠均不会产生明显的肾毒性，心脏毒性；抗菌涂层植入第7和14天后，血清中丙氨酸氨基转移酶，门冬氨酸氨基转移酶的含量与对照组相比无显著性差异，说明两种涂层均不会对小鼠产生明显的肝毒性；此外，血清中尿素氮、尿酸的含量与对照组相比，无显著性差异，说明两种涂层均不会对小鼠产生明显的肾毒性；血清中肌酸激酶的含量与对照组相比，无显著性差异，说明两种涂层均不会对小鼠心脏产生显著性影响。结合图19中小鼠各个脏器切片H&E染色图片来看，抗菌涂层组中小鼠的心、肝、脾、肺、肾细胞的状态与空白对照组差异不大，表面植入涂层后第1、7、14天，对小鼠的主要脏器不会产生明显的毒性。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对以下实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (18)

1.具有式(I)所示结构的聚甲基丙烯酸酯类高分子化合物：
Figure FDA0003395301600000011
其中，L选自：亚烷基；
R1选自：-N(R3R4)；
R2选自：C1-C15烷基、C6-C14芳基、C6-C14芳基取代的C1-C15烷基；
R3、R4分别独立地选自：烷基，或者R3、R4和与其相连的氮原子一起形成杂环烷基；
n和m均大于0。
2.根据权利要求1所述的聚甲基丙烯酸酯类高分子化合物，其特征在于，L选自：C1-C6亚烷基。
3.根据权利要求2所述的聚甲基丙烯酸酯类高分子化合物，其特征在于，L选自：亚甲基、亚乙基、亚丙基。
4.根据权利要求1所述的聚甲基丙烯酸酯类高分子化合物，其特征在于，R2选自：C1-C8烷基。
5.根据权利要求4所述的聚甲基丙烯酸酯类高分子化合物，其特征在于，R2选自：C4-C6烷基。
6.根据权利要求1所述的聚甲基丙烯酸酯类高分子化合物，其特征在于，所述聚甲基丙烯酸酯类高分子化合物具有式(II)所示结构：
Figure FDA0003395301600000012
其中，p选自：1、2、3、4、5。
7.根据权利要求1-6任一项所述的聚甲基丙烯酸酯类高分子化合物，其特征在于，R3、R4分别独立地选自C1-C6烷基，或者R3、R4和与其相连的氮原子一起形成5-10元杂环烷基。
8.根据权利要求7所述的聚甲基丙烯酸酯类高分子化合物，其特征在于，R3、R4分别独立地选自C3-C6烷基，或者R3、R4和与其相连的氮原子一起形成6-8元杂环烷基。
9.根据权利要求8所述的聚甲基丙烯酸酯类高分子化合物，其特征在于，R1选自如下基团：
Figure FDA0003395301600000021
10.根据权利要求1-6任一项所述的聚甲基丙烯酸酯类高分子化合物，其特征在于，n+m不小于10，更优选为不小于20，更优选为不小于30。
11.根据权利要求10所述的聚甲基丙烯酸酯类高分子化合物，其特征在于，n+m为30-100。
12.根据权利要求1-6任一项所述的聚甲基丙烯酸酯类高分子化合物，其特征在于，m为n+m的15-50％；更优选地，m为n+m的18-39％；更优选地，m为n+m的20-38％；更优选地，m为n+m的24-32％。
13.根据权利要求1所述的聚甲基丙烯酸酯类高分子化合物，其特征在于，选自如下高分子化合物：
Figure FDA0003395301600000022
Figure FDA0003395301600000031
14.权利要求1-13任一项所述的聚甲基丙烯酸酯类高分子化合物在制备抗菌药物或者抗菌材料中的应用。
15.根据权利要求14所述的应用，其特征在于，所述菌为金黄色葡萄球菌、溶血葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、耐药肺炎克雷伯杆菌、绿脓杆菌。
16.一种抗菌药物，其特征在于，由活性成分和药物中可接受的辅料和/或载体制备而成，所述活性成分包括权利要求1-13任一项所述的聚甲基丙烯酸酯类高分子化合物。
17.一种抗菌材料，其特征在于，其为涂覆有权利要求1-13任一项所述的聚甲基丙烯酸酯类高分子化合物涂层的钛片。
18.根据权利要求17所述的抗菌材料，其特征在于，所述聚甲基丙烯酸酯类高分子化合物在每平方厘米钛片上的涂覆量为30μg-300μg，优选为51.6μg-256μg。
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