CN114617862A

CN114617862A - Vilanterol在制备抗冠状病毒药物中的应用及药物

Info

Publication number: CN114617862A
Application number: CN202011456112.XA
Authority: CN
Inventors: 韩克利; 贾燕; 王艺颖
Original assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Current assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority date: 2020-12-10
Filing date: 2020-12-10
Publication date: 2022-06-14

Abstract

本发明属于药物化学技术领域，具体涉及Vilanterol在制备抗冠状病毒感染药物中的应用。本发明发现了Vilanterol一个新功能，所述的Vilanterol对冠状病毒尤其是新型冠状病毒的靶点木瓜样蛋白酶Plpro的酶活性有较强抑制作用，具有发展为治疗和预防冠状病毒尤其是抗新冠病毒的药物的潜力。

Description

Vilanterol在制备抗冠状病毒药物中的应用及药物

技术领域

本发明涉及一类药物化学技术领域，具体涉及的是Vilanterol或其药学上可接受的盐在制备抗冠状病毒炎症药物中的用途，更详细地说Vilanterol或可作为冠状病毒木瓜样蛋白酶PLPro的有效抑制剂。

背景技术

冠状病毒属于套式病毒目、冠状病毒科、冠状病毒属，是自然界广泛存在的一大类病毒，也是在目前已知的正链RNA病毒中基因组是最大的。同时冠状病毒是一类具有囊膜、基因组为单节段正链RNA病毒的RNA病毒，简单来说就是冠状病毒的基因组只由一条RNA链构成，遗传信息是由RNA来承载的，在病毒进入宿主细胞之后，不需要经过转录过程可直接利用宿主的核糖体来生产病毒复制所需的蛋白质。

冠状病毒根据宿主、血清型基因序列以及结构的不同可分为四类：α类、β类、γ类和δ类，不同类别之间无抗原交叉反应。在这四类中α类、β类只会感染哺乳动物，γ类和δ类主要感染鸟类；α属代表病毒如猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PDE)等；β属代表病毒如新型冠状病毒(SARS-CoV-2)、SARS冠状病毒(SARS-CoV)，中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)等；γ类代表病毒如禽冠状病毒如鸡传染性支气管炎病毒(IBV)、土耳其冠状病毒(TCoV)等；δ属代表病毒如夜莺冠状病毒(BuCoV HKU11)、绣眼鸟冠状病毒(WECoV)等。

冠状病毒主要侵害呼吸道，胃肠道和神经系统等，往往会造成呼吸道和肠道疾病、神经系统症状和心肌炎。2003年，严重的上呼吸道疾病(SARS)暴发，全世界约8000人感染，死亡率高达10％。2014年，中东呼吸综合征(MERS)在全世界多个国家暴发，死亡率比SARS更高，约达40％。新型冠状病毒(SARS-CoV-2)是一种以前从未在人类中发现的冠状病毒新毒株，这种新毒株引起了新型冠状病毒肺炎(COVID-19)，有比2003年SARS病毒有更强的感染能力，致死力约为5％。自从疫情爆发以来至今，全球累计感染人数已经超过三千万，死亡人数多达上百万，并且疫情还在继续发酵，目前欧洲地区已经爆发第二波疫情。上述所述的这些由冠状病毒感染引起的疾病严重影响了人们的健康，甚至夺取人们的生命。近些年冠状病毒的反复发作，提示人类对于其研究知之甚少，开发治疗冠状病毒的药物迫在眉睫。

木瓜样蛋白酶(PLPro)是表达在冠状病毒5’末端基因组nsp3上的水解酶，主要功能为酶切多聚蛋白pp1a上nsp1-2，nsp2-3，nsp3-4之间特异性四肽结构LXGG，该多聚蛋白需要被水解后成为成熟的功能蛋白；另外，木瓜样蛋白酶具有从宿主细胞里脱离泛素的附加功能，该功能保护冠状病毒进而规避宿主固有的免疫反应。因此，木瓜样蛋白酶对于病毒的生命周期至关重要，可以作为抗冠状病毒药物设计筛选的理想靶点。

Vilanterol(CCNU；NSC 79037)是一种抗癌药物，更具体的说是一种具有抗肿瘤活性的DNA烷基化剂，通过损坏DNA和阻止细胞分裂来抑制癌细胞的生长并减缓其在体内的扩散。因此Vilanterol可用于已经接受手术或放射治疗的人的脑瘤，有时可以与其他抗癌药物同时使用。一些报道指出Vilanterol还被用于治疗霍奇金氏病。当然Vilanterol也可用于上述未提到的其他方面，在这里我们发现，Vilanterol会抑制SARS-CoV-2木瓜样蛋白酶的活性。不同冠状病毒的序列分析表明，冠状病毒的木瓜样蛋白酶具有高度相似性，这种抑制能力普适于冠状病毒木瓜样蛋白酶。经查阅相关资料，未发现Vilanterol化合物作为冠状病毒木瓜样蛋白酶PLPro抑制剂的相关报道。

发明内容

本发明针对冠状病毒引起的肺部，呼吸道和肠道疾病、神经系统症状和心肌炎等相关炎症疾病缺乏有效防治药物的问题，指出Vilanterol及其药学上可以接受的盐在制备抗冠状病毒炎症药物中的应用。

本发明技术是以新型冠状病毒(SARS-CoV-2)为模型，基于新型冠状病毒木瓜样蛋白酶(SARS-CoV-2 PLPro)的三维结构进行药物设计，对包括天然产物库，临床化合物库，抗病毒药物库的数千个化合物进行理论筛选，得到可能对新型冠状病毒PLPro有抑制的化合物。然后，我们利用前期构建的SARS-CoV-2木瓜样蛋白酶抑制剂筛选试剂盒，通过酶活性测试对这些化合物进行实验筛选。

经按上述方案进行药物筛选，本发明发现了如下式I所示的Vilanterol及其药学上可以接受的盐对新型冠状病毒PLPro具有抑制作用。

式I

上述化合物对新型冠状病毒木瓜样蛋白酶(PLPro)的抑制效果十分明

显，其在25μM浓度下对SARS-CoV-2木瓜样蛋白酶的抑制率都达到90％以上,IC₅₀值为8.013μM，表明Vilanterol能够有效的抑制新型冠状病毒木瓜样蛋白酶的活性。并且，基于序列分析表明冠状病毒木瓜样蛋白酶具有高度相似性，我们推理该类化合物也能够有效抑制其它冠状病毒木瓜样蛋白酶的活性，尤其是对于SARS-CoV，MERS-CoV，HCoV-229E，HCoV-OC43，HCoV-NL63和HCoV-HKU1。

优选地，具有抑制效果的Vilanterol还包括各种旋光异构体、其水合物及其与酸形成的可药用的盐。将式I化合物与药学上可接受的辅剂结合，可以制备治疗和预防新型冠状病毒感染的药物。所述辅剂包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂、增效剂。该药物可以制成注射剂、片剂、丸剂、胶囊、悬浮剂或乳剂的形式使用。其给药途径可为口服、经皮、静脉或肌肉注射。

附图说明

图1为实施例1在不同浓度的Vilanterol作用下底物肽在木瓜样蛋白酶代谢下荧光强度随时间变化

图2为实施例2化合物Vilanterol对新型冠状病毒木瓜样蛋白酶的抑制曲线。

具体实施方式

下面将详细描述本发明的具体实施方式，这仅用于更加清楚的说明本发明，而不能视为对本发明的限制。

整个实验过程中，所有的操作方法和操作步骤以及底物的反应条件等，都是根据该技术领域的普通技术人员熟知的方法设计、实施的。

下述实施例中所用的抑制剂分子，均购自MCE(MedChemExpress)或其他普通商业途径。

本发明所用的抑制剂筛选试剂盒为本实验室发明的(申请专利号为202010674650.X)，包括以下组分：

SARS-CoV-2木瓜样蛋白酶、

底物肽Dabcyl-FTLKGGAPTKVT-E(Edans)、

硼酸硼砂缓冲液。

所述SARS-CoV-2木瓜样蛋白酶浓度为0.01-1mg/mL；

优选地，所述底物肽Dabcyl-FTLKGGAPTKVT-E(Edans)的浓度为0.1mM-5mM；其中Dabcyl是猝灭剂4-二甲胺偶氮苯4’-羧酸，Edans是荧光团5-(2-氨基乙氨基)-1-萘磺酸；

优选地，所述硼酸硼砂缓冲液的浓度为10-100毫摩尔/升；所述硼酸硼砂缓冲液的PH为7-9。

其中采用的SARS-Cov2木瓜样蛋白酶购自CrystalO Biopharma，底物Dabcyl-FTLKGGAPTKVT-E(Edans)委托GL biochem定制合成，硼酸硼砂缓冲液购自雷根生物。优选地，SARS-Cov-2木瓜样蛋白酶(浓度为0.1mg/mL)、底物肽Dabcyl-FTLKGGAPTKVT-E(Edans)(浓度为0.1mM-5mM)、硼酸硼砂缓冲液(PH＝7-9)。本发明所述的试剂盒需要用荧光酶标仪进行荧光检测。

实施例1：在不同浓度的Vilanterol作用下底物肽在木瓜样蛋白酶代谢下荧光强度随时间变化

具体实施过程为：

1)SARS-CoV-2木瓜样蛋白酶和底物肽储液均保存于-80℃冰箱中；

2)将SARS-CoV-2木瓜样蛋白酶在冻存板(-4至4℃)里室温下融化，取1uL稀释于98uL硼酸硼砂缓冲液(PH＝7.4)中，加入检测板中；

3)将不同浓度的抑制剂(化合物1-3，浓度为0，0.025mM，0.25mM，1mM，2.5mM)分别取1uL加入上述步骤(2)获得的溶液中；

4)将相同浓度的底物肽(0.5mM)1uL加入上述步骤(3)获得的溶液中，使用荧光酶标仪37℃孵育，并使用荧光酶标仪监测342nm激发，496nm处的荧光发射值，边孵育边检测，每1分钟采一点；

5)抑制剂存在的条件下，底物肽在酶代谢下荧光强度随时间缓慢增强效果如下图1，其结果显示，该底物肽被酶催化产生的荧光增强可以被抑制剂Vilanterol抑制，并且这种抑制现象是浓度相关的。

实施例2：化合物Vilanterol对新型冠状病毒木瓜样蛋白酶的抑制能力具体实施过程如下：

1)SARS-CoV-2木瓜样蛋白酶和底物肽储液均保存于-80℃冰箱中；

3)将不同浓度的抑制剂(化合物1，浓度为0，0.025mM，0.1mM，0.25mM，0.5mM，1mM，2.5mM)分别取1uL加入上述步骤(2)获得的溶液中；

4)将相同浓度的底物肽(0.5mM)1uL加入上述步骤(3)获得的溶液中，使用荧光酶标仪37℃孵育，并使用荧光酶标仪监测342nm激发，496nm处的荧光发射值，边孵育边检测，孵育1h；

5)统计各组孵育前后342nm激发，496nm处的荧光发射值。以control组(抑制剂浓度为0组)孵育前后的荧光变化值作为100，不同抑制组的荧光变化值与之相比得到剩余活性值(Residual activity)。使用GraphPad Prism6软件，以抑制剂浓度的对数值(logC(Inhibitor))为横坐标，对应的剩余活性值(Residual activity)为纵坐标。结果如图2所示，得到抑制剂的IC₅₀值。表1列举了化合物1对SARS-CoV-2PLpro抑制的活性数据。IC₅₀计算的公式为Y＝100/(1+10^((X-LogIC₅₀)))，其中Y代表剩余活性分数,X代表抑制剂化合物浓度的常用对数,∧指的是幂算法。图2所示为所示为不同抑制剂浓度对抑制酶活性比例作图，可以得到该化合物的抑制能力，用抑制酶活性一半时的抑制剂浓度来表示。

表一：化合物Vilanterol结构和抑制新型冠状病毒木瓜样蛋白酶(PLPro)IC₅₀值

可以看出，上述化合物Vilanterol对新型冠状病毒木瓜样蛋白酶的抑制效果十分明显，IC50值为8.013μM，表明Vilanterol能够有效的抑制新型冠状病毒木瓜样蛋白酶的活性。并且，基于序列分析表明冠状病毒木瓜样蛋白酶具有高度相似性，因此，该类化合物也能够有效抑制其它冠状病毒木瓜样蛋白酶的活性，尤其是对于SARS-CoV，MERS-CoV，HCoV-229E，HCoV-OC43，HCoV-NL63和HCoV-HKU1。

此外，对具有与Vilanterol相似结构的以下化合物，执行实施例1-2的操作(操作过程和条件同上述实施例，与其不同之处在于采用以下化合物分别替换所述抑制剂)，显示如下化合物对新冠病毒的3cl及plpro蛋白酶无抑制或微弱抑制。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims

1.Vilanterol在制备抗冠状病毒药物中的应用。

2.按照权利要求1所述的应用途，其特征在于，所述Vilanterol包括具有式I所示结构及其药学上可以接受的盐中的一种或两种以上。

式I

3.如权利要求1或2所述用途，其特征在于，所述Vilanterol可以抑制冠状病毒木瓜样蛋白酶PLPro的酶活性。

4.如权利要求1或2所述用途，其特征在于，所述Vilanterol在制备冠状病毒木瓜样蛋白酶PLPro抑制剂药物中的应用。

5.如权利要求1或2所述用途，其特征在于，所述冠状病毒可以是HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU、SARS-CoV、MERS-CoV、或者新型冠状病毒(SARS-CoV-2)。

6.如权利要求5所述冠状病毒，其特征在于，可优选为新型冠状病毒(SARS-CoV-2)。

7.如权力要求2所述的式I化合物，其中式I化合物包括其旋光异构体、其水合物，以及其与酸形成的可药用的盐；所述水合物的结晶水数目为0-16中的任意实数，所述的酸优选盐酸、硫酸、氢溴酸、磷酸、乙酸、柠檬酸、草酸、酒石酸、苯甲酸、苹果酸、三苯基乙酸。

8.一种冠状病毒木瓜样蛋白酶抑制剂，其特征在于，包含Vilanterol或其药学上可接受的盐。

9.一种冠状病毒木瓜样蛋白酶抑制剂药物，其特征在于，包含Vilanterol或其药学上可接受的盐。

10.如权利要求4或9所述药物，其特征在于，它是所述化合物的注射剂、片剂、丸剂、胶囊、悬浮剂或乳剂。