CN114617884B - Pfk-158在制备抗冠状病毒药物中的应用及药物 - Google Patents

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Abstract

本发明属于药物化学技术领域，具体涉及PFK‑158在制备抗冠状病毒感染药物中的应用。本发明所述的PFK‑158对冠状病毒尤其是新型冠状病毒的靶点主蛋白酶3Clpro的酶活性有较强抑制作用，可用于制备抗冠状病毒尤其是抗新型冠状病毒感染的药物。

Description

PFK-158在制备抗冠状病毒药物中的应用及药物
技术领域
本发明属于药物化学技术领域，具体涉及PFK-158在制备抗冠状病毒感染药物中的应用
背景技术
冠状病毒属于单正链RNA病毒，冠状病毒家族主要包括新型冠状病毒(SARS-CoV-2)，SARS冠状病毒(SARS-CoV)，中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)，HCoV-229E，HCoV-OC43，HCoV-NL63、HCoV-HKU。冠状病毒通常导致呼吸道和肠道疾病、神经系统症状和心肌炎。这些疾病的感染严重影响了人们的健康。冠状病毒的反复发作，提示人类对于其研究知之甚少，开发治疗新冠病毒的药物迫在眉睫。
冠状病毒的主蛋白酶，又叫3C样蛋白酶(3CLpro)，是表达在冠状病毒5’末端基因组nsp5上的水解酶，主要功能为切割多聚蛋白pp1a和pp1ab上至少11个位点，该多聚蛋白被水解后需要被加工成成熟的功能蛋白；3C样蛋白酶(3CLpro)是一种半胱氨酸蛋白酶，在P2位和P1位分别识别带Leu和Glin的序列。另外，3C样蛋白酶(3CLpro)底物结合位点高度保守，在介导病毒复制和转录方面起着关键作用，因此，3CL蛋白酶可以作为抗冠状病毒药物设计筛选的理想靶点。
PFK-158是典型的迈克尔受体结构，可以与半胱氨酸巯基反应，可以充当自由基清除剂，可以保护过氧化氢酶，谷胱甘肽过氧化物酶和谷胱甘肽S-转移酶的酶活性不受损害。我们敏锐的觉察到，PFK-158的迈克尔受体结构可能会抑制半胱氨酸蛋白酶的活性，在这里我们证实了PFK-158可以抑制冠状病毒尤其是新型冠状病毒的主蛋白酶3Clpro的酶活性。经查阅相关资料，未见PFK-158作为冠状病毒主蛋白酶3Clpro抑制剂的相关报道。
发明内容
本发明针对冠状病毒引起的肺部，呼吸道和肠道疾病、神经系统症状和心肌炎等相关炎症疾病缺乏有效防治药物的问题，指出PFK-158在制备抗冠状病毒炎症药物中的应用。
本发明的目的在于提供一类PFK-158作为冠状病毒3C样蛋白酶(3CLpro)的抑制剂，及其在制备预防和/或治疗新型冠状病毒感染药物中的应用。本发明技术是基于新型冠状病毒3CLpro的三维结构进行药物设计，对包括天然产物库、临床化合物库、抗病毒药物库在内的数千个化合物进行虚拟筛选，得到可能对新型冠状病毒3CLpro有抑制作用的化合物。然后，我们用市售3CLpro荧光探针构建方法来进行酶活性测试，并且用来进行抑制剂筛选。
经按上述方案进行药物筛选，本发明发现了如下所示〈通式为式1)的一类化合物对SARS-CoV-2 3CL蛋白酶有抑制作用：
Figure SMS_1
上述化合物对新型冠状病毒3C样蛋白酶(3CLpro)的抑制效果明显，IC50＝0.5127μM。表明这类化合物能够有效的抑制新型冠状病毒3C样蛋白酶的活性。并且，鉴于文献报道的冠状病毒主蛋白酶具有高度相似性，我们推理该类化合物也能够有效抑制其它冠状病毒主蛋白酶的活性，尤其是对于SARS-CoV，MERS-CoV，HCoV-229E，HCoV-OC43，HCoV-NL63和HCoV-HKU。优选地，具有抑制效果的PFK-158还包括各种旋光异构体、其水合物及其与酸形成的可药用的盐。将式Ⅰ化合物与药学上可接受的辅剂结合，可以制备治疗和预防新型冠状病毒感染的药物。所述辅剂包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂、增效剂。该药物可以制成注射剂、片剂、丸剂、胶囊、悬浮剂或乳剂使用。其给药途径可为口服、经皮、静脉或肌肉注射。
附图说明
图1为实施例1抑制剂PFK-158不同浓度下底物肽荧光强度在3C样蛋白酶代谢下随时间变化趋势
图2为实施例2抑制剂PFK-158对新型冠状病毒3C样蛋白酶的抑制曲线。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，列举以下实施例，这仅用于更加清楚的说明本发明，而不能视为对本发明的限制。
进行实验时，所有的操作方法和操作步骤以及底物的反应条件等，都是根据本技术领域的普通技术人员熟知的方法设计、实施的。
在以下实施例中，我们所用的抑制剂分子，购自MCE(MedChemExpress)或其他普通商业途径。
本发明所用的SARS-Cov-2 3C样蛋白酶购自CrystalO Biopharma，底物Dabcyl-KTSAVLQ↓SGFRKM-E(Edans)-NH2购自GL biochem，硼酸硼砂缓冲液购自雷根生物。
优选地，SARS-Cov-2 3C样蛋白酶(浓度为0.1mg/mL)、底物肽Dabcyl-KTSAVLQ↓SGFRKM-E(Edans)-NH2(浓度为0.1mM-5mM)、硼酸硼砂缓冲液(PH＝5-8)，所述硼酸硼砂缓冲液的浓度为10-100毫摩尔/升。
本发明需要用荧光酶标仪进行荧光检测。
实施例1：PFK-158对SARS-Cov-2 3C样蛋白酶抑制活性的测定
具体实施过程为：
1)SARS-Cov-2 3C样蛋白酶和底物肽储液均保存于-80℃冰箱中；
2)将SARS-Cov-2 3C样蛋白酶(浓度为0.1mg/mL)在冻存板(-4至4℃)里室温下融化，取1μL稀释于98μL硼酸硼砂缓冲液(PH＝7.4)中，加入检测板中；
3)将不同浓度的抑制剂(PFK-158，浓度分别为0，0.025mM，0.125mM，0.25mM，0.5mM，1mM，2.5mM)分别取1μL加入上述步骤(2)获得的溶液中；
4)将相同浓度的底物肽(0.5mM)1μL加入上述步骤(3)获得的溶液中，使用荧光酶标仪37℃孵育，并使用荧光酶标仪监测342nm激发，496nm处的荧光发射值，边孵育边检测，每1分钟采一点；
5)不同浓度的抑制剂存在的条件下，底物肽在酶代谢下荧光强度随时间缓慢增强效果如图1所示，结果表明，底物肽被酶代谢的荧光增强可以被抑制剂PFK-158所抑制，并且这种抑制作用随抑制剂浓度增加而增强。
实施例2：PFK-158对SARS-Cov-2 3C样蛋白酶抑制能力的测定
具体实施过程如下：
1)SARS-Cov-2 3C样蛋白酶和底物肽储液均保存于-80℃冰箱中；
2)将SARS-Cov-2 3C样蛋白酶(浓度为0.1mg/mL)在冻存板(-4至4℃)里室温下融化，取1μL稀释于98μL硼酸硼砂缓冲液(PH＝7.4)中，加入检测板中；
3)将不同浓度的抑制剂(PFK-158，浓度分别为0，0.025mM，0.125mM，0.25mM，0.5mM，1mM，2.5mM)分别取1μL加入上述步骤(2)获得的溶液中；
4)将相同浓度的底物肽(0.5mM)1μL加入上述步骤(3)获得的溶液中，使用荧光酶标仪37℃孵育，并使用荧光酶标仪监测342nm激发，496nm处的荧光发射值，边孵育边检测，孵育1h；
5)统计各组孵育前后342nm激发，496nm处的荧光发射值。以control组(抑制剂浓度为0组)孵育前后的荧光变化值作为100，不同抑制组的孵育前后荧光变化值与之相比得到剩余活性值(ResidualActivity)。使用GraphPad Prism6软件，以抑制剂浓度的对数值(logC(Inhibitor))为横坐标，对应的剩余活性值(Residual Activity)为纵坐标作图，结果如图2所示，得到抑制剂的IC50值。表1列举了化合物1对SARS-Cov-2 3CLpro抑制的活性数据。IC50计算的公式为Y＝100/(1+10^((X-LogIC50)))，其中Y代表剩余活性分数,X代表抑制剂化合物浓度的常用对数,∧指的是幂算法。图2所示为所示为不同抑制剂浓度对抑制酶活性比例作图，可以得到该化合物的抑制能力，用抑制酶活性一半时的抑制剂浓度来表示。
表1：PFK-158结构以及抑制新型冠状病毒3C样蛋白酶(3CLpro)的IC50值
Figure SMS_2
/>
可以看出，上述化合物对新型冠状病毒3C样蛋白酶的抑制效果十分明显，IC50值为0.513μM，表明PFK-158能够有效的抑制新型冠状病毒3C样蛋白酶的活性。并且，基于序列分析表明冠状病毒3C样蛋白酶具有高度相似性，因此，该类化合物也能够有效抑制其它冠状病毒3C样蛋白酶的活性，尤其是对于SARS-CoV，MERS-CoV，HCoV-229E，HCoV-OC43，HCoV-NL63和HCoV-HKU1。
此外，对具有与PFK-158相似结构的如下化合物执行实施例1-2(操作过程和条件同上述实施例，与其不同之处在于采用以下化合物分别替换所述抑制剂)，发现这些化合物对新型冠状病毒3C样蛋白酶无抑制。
Figure SMS_3
Figure SMS_4
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (2)

1.式1化合物PFK-158在制备抗冠状病毒药物中的应用，所述的冠状病毒为新型冠状病毒SARS-CoV-2；所述PFK-158包括具有式1所示结构化合物，
Figure FDA0004166143240000011
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述PFK-158可以抑制冠状病毒主蛋白酶3Clpro的酶活性。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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