CN114606272B - 一种粗糙脉孢菌发酵提取物的制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种粗糙脉孢菌发酵提取物的制备方法及应用。属于微生物加工技术领域。利用粗糙脉孢菌孢子悬液对黑色谷物进行固态发酵，得到粗糙脉孢菌发酵提取物。本发明利用粗糙脉孢菌发酵黑色谷物，并优化控制发酵工艺，制备了富含膳食纤维、花色苷、β‑胡萝卜素、番茄红素、总酚和黄酮等多种活性成分的粗糙脉孢菌发酵提取物。其中，可溶性膳食纤维和β‑胡萝卜素的含量显著提升，并且降低了黑色谷物中淀粉的含量，使得到的粗糙脉孢菌发酵提取物具有良好的降血脂、降血糖和抗氧化的作用，适合作为降血脂、抗氧化原料进行生产应用，为降脂、降糖产品提供了一种生产工艺简单，成本低廉的生产原料。

Description

一种粗糙脉孢菌发酵提取物的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及微生物加工技术领域，更具体的说是涉及一种粗糙脉孢菌发酵提取物的制备方法及应用。
背景技术
粗糙脉孢菌对培养环境需求低、生长速度快，在生长过程中会产番茄红素、类胡萝卜素和较高活性的纤维素酶等，可将谷物中的不溶性膳食纤维分解可溶性膳食纤维，提升谷物的营养价值和功能性。
黑色谷物含有丰富的膳食纤维、维生素及花色苷，具有降低血脂、降低血糖及抗氧化等功效。
但是，现有工艺发酵制备的提取物中，可溶性膳食纤维和β-胡萝卜素的含量低，活性成分少。
因此，如何利用粗糙脉孢菌提高谷物的营养价值和功能性是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种粗糙脉孢菌发酵提取物的制备方法及应用。为了解决上述问题，本发明提供了一种粗糙脉孢菌发酵提取物的制备方法和应用。可以显著提高发酵提取物中膳食纤维及类胡萝卜素的含量，得到的粗糙脉孢菌发酵提取物具有良好的降血脂和抗氧化作用，可作为降血脂、抗氧化食品原料进行生产应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种粗糙脉孢菌发酵提取物的制备方法，包括如下步骤：利用粗糙脉孢菌制备孢子悬液对黑色谷物进行固态发酵,得到粗糙脉孢菌发酵提取物。
优选的：包括如下步骤：
(1)制备粗糙脉孢菌孢子悬液：
(2)制备黑色谷物培养基：将黑色谷物杀菌处理；
(3)接菌：在杀菌处理后的黑色谷物中，加入粗糙脉孢菌孢子悬液；
(4)发酵：利用粗糙脉孢菌孢子悬液对黑色谷物进行固态发酵,得发酵产物；
(5)除杂：依次用α-淀粉酶溶液、淀粉葡萄糖苷酶溶液对发酵产物进行处理，得到粗糙脉孢菌发酵液；
(6)提取：经过滤、离心、冷冻干燥得粗糙脉孢菌发酵提取物。
优选的：步骤(1)具体为：
向水中加入粗糙脉孢菌菌丝淋洗液；
其中，水：无菌水；
粗糙脉孢菌菌丝淋洗液：使用无菌水5～10mL，冲洗粗糙脉孢菌培养基表面菌丝3次；
加入粗糙脉孢菌菌丝淋洗液的程度：使孢子悬液终浓度OD600＝0.04～0.08。
优选的：步骤(2)黑色谷物包括黑米、黑麦、黑玉米和黑燕麦；
杀菌处理：紫外辐照3～7h。
优选的：步骤(3)黑色谷物与粗糙脉孢菌孢子悬液的质量体积比为1g：(0.5～3)mL。
优选的：步骤(4)发酵的温度为25～28℃，发酵的时间为5～10天。
优选的：步骤(5)发酵产物与10×103U/mLα-淀粉酶溶液质量体积比为1g：(40～70)μL；
发酵产物与10×104U/mL淀粉葡萄糖苷酶溶液质量体积比为1g：(80～140)μL；
发酵产物与α-淀粉酶溶液反应的pH5～6，温度65～90℃，时间3～4h；
将α-淀粉酶溶液处理后的粗糙脉孢菌发酵物，与淀粉葡萄糖苷酶溶液反应的pH8～8.5，温度50～65℃，时间0.5～1h。
优选的：步骤(6)具体为：粗糙脉孢菌发酵液过滤后5000r/min离心15min，弃上清液，冷冻干燥下层沉淀，得到粗糙脉孢菌发酵提取物。
本发明还提供了一种粗糙脉孢菌发酵提取物，采用上述的制备方法得到。
本发明还提供了上述的制备方法得到的粗糙脉孢菌发酵物作为降血脂、抗氧化食品原料进行生产的应用。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种粗糙脉孢菌发酵提取物的制备方法及应用，取得的技术效果为本发明利用粗糙脉孢菌孢子悬液对黑色谷物进行固态发酵，得到粗糙脉孢菌发酵提取物。本发明利用粗糙脉孢菌发酵黑色谷物，并优化控制发酵工艺，制备了富含膳食纤维、花色苷、β-胡萝卜素、番茄红素、总酚和黄酮等多种活性成分的粗糙脉孢菌发酵提取物。其中，可溶性膳食纤维和β-胡萝卜素的含量显著提升，并且降低了黑色谷物中淀粉的含量，使得到的粗糙脉孢菌发酵提取物具有良好的降血脂、降血糖和抗氧化的作用，适合作为降血脂、抗氧化原料进行生产应用，为降脂、降糖产品提供了一种生产工艺简单，成本低廉的生产原料。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明提供的粗糙脉孢菌发酵提取物的制备流程图。
图2附图为本发明提供的粗糙脉孢菌发酵提取物对C57BL/6J小鼠体重影响图。
图3附图为本发明提供的粗糙脉孢菌发酵提取物对C57BL/6J小鼠血清血脂四项影响图。
图4附图为本发明提供的粗糙脉孢菌发酵提取物对C57BL/6J小鼠肝脏的影响图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例公开了一种粗糙脉孢菌发酵提取物的制备方法及应用。
实施例中未提及的原料、设备均为常规市售购买，在此不再赘述。例如，粗糙脉孢菌来源于上海保藏生物技术中心AS.3.1603，常规市售培养基培养(瑞楚生物，货号T1715)。
本发明制备流程参见图1。
实施例1
一种粗糙脉孢菌发酵提取物，制备方法如下：
(1)制备粗糙脉孢菌孢子悬液：在250mL锥形瓶装入50mL无菌水，接入适当体积的粗糙脉孢菌菌丝淋洗液，使孢子悬液终浓度OD600＝0.04；
(2)制备黑色谷物培养基：取黑米粉于灭菌的培养皿中分散均匀，超净工作台中紫外辐照3h，进行杀菌；
(3)接菌：在杀菌后的黑米粉中加入粗糙脉孢菌孢子悬液，质量体积比为1g：1mL；
(4)发酵：在27℃恒温培养箱中，发酵7天；
(5)除杂：在粗糙脉孢菌发酵物中加入α-淀粉酶溶液，质量体积比为1g：50μL，反应pH 5.5，温度为80℃，时长为3h；再加入淀粉葡萄糖苷酶溶液，质量体积比为1g：100μL,反应pH 8，温度为60℃，时长为0.5h；
(6)提取：发酵液过滤后5000r/min离心15min，弃上清液，冷冻干燥下层沉淀。
实施例2
一种粗糙脉孢菌发酵提取物，制备方法如下：
(1)制备粗糙脉孢菌孢子悬液：在250mL锥形瓶装入50mL无菌水，接入适当体积的粗糙脉孢菌菌丝淋洗液，使孢子悬液终浓度OD600＝0.05；
(2)制备黑色谷物培养基：取黑米粉于灭菌的培养皿中分散均匀，超净工作台中紫外辐照3h，进行杀菌；
(3)接菌：在杀菌后的黑米粉中加入粗糙脉孢菌孢子悬液，质量体积比为1g：0.9mL；
(4)发酵：在26℃恒温培养箱中，发酵6天；
(5)除杂：在粗糙脉孢菌发酵物中加入α-淀粉酶溶液，质量体积比为1g：45μL，反应pH 5.5，温度为70℃，时长为3.5h；再加入淀粉葡萄糖苷酶溶液，质量体积比为1g：90μL,反应pH 8，温度为55℃，时长为0.8h；
(6)提取：同实施例1。
实施例3
一种粗糙脉孢菌发酵提取物，制备方法如下：
(1)制备粗糙脉孢菌孢子悬液：在250mL锥形瓶装入50mL无菌水，接入适当体积的粗糙脉孢菌菌丝淋洗液，使孢子悬液终浓度OD600＝0.06；
(2)制备黑色谷物培养基：取黑米粉于灭菌的培养皿中分散均匀，超净工作台中紫外辐照3h，进行杀菌；
(3)接菌：在杀菌后的黑米粉中加入粗糙脉孢菌孢子悬液，质量体积比为1g：0.8mL；
(4)发酵：在25℃恒温培养箱中，发酵5天；
(5)除杂：在粗糙脉孢菌发酵物中加入α-淀粉酶溶液，质量体积比为1g：40μL，反应pH 5，温度为65℃，时长为3h；再加入淀粉葡萄糖苷酶溶液，质量体积比为1g：80μL,反应pH8，温度为50℃，时长为1h；
(6)提取：发酵液过滤后5000r/min离心15min，弃上清液，冷冻干燥下层沉淀。
实验效果：
粗糙脉孢菌发酵提取物各组分测定
(1)膳食纤维按照GB 5009.88-2014的测定方法测定；
(2)花色苷按照NY/T 3164-2017的测定方法测定；
(3)类胡萝卜素按照GB 5009.83-2016的测定方法测定；
(4)番茄红素按照GB/T 22249-2008的测定方法测定。
实施例1结果见下表1。
表1
膳食纤维 花色苷 类胡萝卜素 番茄红素
含量(mg/g) 6.4 2.8 3.5 3.3
对照实验
粗糙脉孢菌发酵提取物降血脂功效评价
(1)实验试剂：血脂四项试剂盒、无水乙醇、甲醇、多聚甲醛、二甲苯、石蜡、苏木精-伊红染液、中性树胶、总胆固醇试剂盒、三油甘酯试剂盒、高密度脂蛋白胆固醇试剂盒和低密度脂蛋白胆固醇试剂盒；
(2)实验设备：SPF级动物房、酶标仪
(3)动物：40只4周龄雄性C57BL/6小鼠；
(4)实验分组：空白组；高脂模型组；粗糙脉孢菌发酵提取物低剂量组；粗糙脉孢菌发酵提取物高剂量组；
(5)试验过程：对高脂模型组、粗糙脉孢菌发酵提取物低剂量组、粗糙脉孢菌发酵提取物高剂量组喂养6周高脂饲料，建立高脂模型；6周后，对空白组、高脂模型组灌胃无菌水，剂量为10mL/kg·bw，粗糙脉孢菌发酵提取物低剂量组按照2.5g/kg·bw灌胃粗糙脉孢菌发酵提取物，粗糙脉孢菌发酵提取物高剂量组按照5g/kg·bw灌胃粗糙脉孢菌发酵提取物；灌胃5周后，禁食10小时。
采用眼球取血法取血，完成取血后取出肝脏收容于组织收容器内备用。将血浆置于4℃冰箱2h后，置于离心机中3000r/min离心15min，取血清使用试剂盒测定总胆固醇、三油甘酯、高密度脂蛋白胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇。
取肝脏组织，生理盐水冲洗，滤纸吸取多余水分，选择其最大叶，切割2～3g固定于4％多聚甲醛中。进行乙醇梯度脱水，蜡液包埋，制作组织切片。组织切片进行常规脱蜡，二甲苯，乙醇梯度水化，蒸馏水冲洗5min；苏木精染液浸染1min；用0.2％的盐酸和酒精溶液分化15s，蒸馏水冲洗返蓝10min。蒸馏水洗后，伊红染液浸染30s，蒸馏水洗2次后用80％乙醇分化伊红染液20s后90％和100％乙醇梯度脱水各1.5min，二甲苯使组织透明，滴加中性树胶封片。
2.332mg/g/d
(6)样本采集：每周测定小鼠体重；采集小鼠眼眶血、肝脏。
(7)检测结果：检测结果见图3、图4。
结果表明：
如图2所示，试验初各组小鼠体重基本一致，在喂食高脂饲料或普通饲料后，随着喂养时间的延长，在建模成功时(即第6周)，各组小鼠体重发生差异，其中空白组平均体重低于其他喂养高脂饲料的组，各建模组体重平稳上升。之后，进入灌胃给药期(即第7周～第12周)，模型组小鼠体重持上升趋势，而高剂量组和低剂量组小鼠的体重不再上升，灌胃粗糙脉孢菌发酵提取物抑制了高脂饲料的致肥胖作用。
如图3所示，与模型组相比，灌胃粗糙脉孢菌发酵提取物小鼠的胆固醇及低密度脂蛋白胆固醇水平都显著降低，高密度脂蛋白胆固醇水平显著升高，但甘油三酯水平效果不显著，表明粗糙脉孢菌发酵提取物可能通过调控胆固醇水平从而调控小鼠的体重，最终实现对小鼠机体有益的作用。
如图4所示，空白组肝细胞形态正常且排列紧密整齐，无脂肪空泡、肝细胞脂肪变性等现象；高脂饲料饲喂组肝小叶结构不清晰，肝索排列紊乱，肝细胞肿大，中央静脉周围的肝细胞出现不同程度的脂肪变性，细胞质内出现脂肪空泡；低剂量组肝细胞的脂肪变性及肝索排列均有一定程度的改善，但仍有脂肪空泡出现；高剂量组肝小叶结构较清晰，肝索排列较模型组有很大的改善，脂肪空泡基本消失。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (4)

1.一种粗糙脉孢菌发酵提取物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：利用粗糙脉孢菌制备孢子悬液对黑色谷物进行固态发酵,得到粗糙脉孢菌发酵提取物；
包括如下步骤：
(1)制备粗糙脉孢菌孢子悬液：
(2)制备黑色谷物培养基：将黑色谷物杀菌处理；
(3)接菌：在杀菌处理后的黑色谷物中，加入粗糙脉孢菌孢子悬液；
(4)发酵：利用粗糙脉孢菌孢子悬液对黑色谷物进行固态发酵,得发酵产物；
(5)除杂：依次用α-淀粉酶溶液、淀粉葡萄糖苷酶溶液对所述发酵产物进行处理，得到粗糙脉孢菌发酵液；
(6)提取：经过滤、离心、冷冻干燥得粗糙脉孢菌发酵提取物；
步骤(1)具体为：向水中加入粗糙脉孢菌菌丝淋洗液；
其中，所述水：无菌水；
所述粗糙脉孢菌菌丝淋洗液：使用无菌水5～10mL，冲洗粗糙脉孢菌培养基表面菌丝3次；
加入粗糙脉孢菌菌丝淋洗液的程度：使孢子悬液终浓度OD600＝0.04～0.08；
步骤(2)所述黑色谷物包括黑米、黑麦、黑玉米和黑燕麦；
所述杀菌处理：紫外辐照3～7h；
步骤(3)所述黑色谷物与粗糙脉孢菌孢子悬液的质量体积比为1g：(0.5～3)mL；
步骤(4)所述发酵的温度为25～28℃，发酵的时间为5～10天；
步骤(5)所述发酵产物与10×103U/mLα-淀粉酶溶液质量体积比为1g：(40～70)μL；
所述发酵产物与10×104U/mL淀粉葡萄糖苷酶溶液质量体积比为1g：(80～140)μL；
所述发酵产物与α-淀粉酶溶液反应的pH5～6，温度65～90℃，时间3～4h；
将α-淀粉酶溶液处理后的粗糙脉孢菌发酵物，与淀粉葡萄糖苷酶溶液反应的pH8～8.5，温度50～65℃，时间0.5～1h；
步骤(6)具体为：粗糙脉孢菌发酵液过滤后5000r/min离心15min，弃上清液，冷冻干燥下层沉淀，得到粗糙脉孢菌发酵提取物。
2.一种粗糙脉孢菌发酵提取物，其特征在于，采用权利1所述的制备方法得到。
3.权利要求1所述的制备方法得到的粗糙脉孢菌发酵物在制备降血脂药物中的应用。
4.权利要求1所述的制备方法得到的粗糙脉孢菌发酵物在制备抗氧化食品原料中的应用。
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李静等.粗壮脉纹孢菌固态发酵产类胡萝卜素的条件优化及其抗氧化活性.《中国食品学报》.2017,第17卷(第5期),第55-63页. *
粗壮脉纹孢菌发酵前后豆渣多糖理化性质和结构特性;黄文利等;《食品工业科技》;第43卷(第3期);第27-33页 *
粗壮脉纹孢菌固态发酵产类胡萝卜素的条件优化及其抗氧化活性;李静等;《中国食品学报》;第17卷(第5期);第55-63页 *

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