CN114605578A - 一种通过孔形成介导的直接易位方式进入细胞的透膜刷状聚合物的制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
一种通过孔形成介导的直接易位方式进入细胞的透膜刷状聚合物的制备方法和应用。为解决进入细胞的药物分子被束缚在囊泡中无法发挥实际功能的问题，合成了富含精氨酸的透膜刷状聚合物PTn‑R2‑C6，PT15‑R2‑C2和PT15‑R4‑C6，该聚合物能通过孔形成介导的直接易位方式进入细胞，从根本上解决了囊泡束缚的问题。通过构效关系筛选,PTn‑R2‑C6可通过孔形成介导的非内吞途径有效进入细胞。PTn‑R2‑C6显示出比PEI 25K更高的转染效率和更低的细胞毒性。PTn‑R2‑C6聚合物的发明为细胞质中高效、快速的药物递送提供了一个有价值的平台。其制备方法工艺简单，易于操作，成本较低，易于推广应用。
Description
技术领域
本发明属于高分子生物材料领域，涉及一种通过孔形成介导的直接易位方式进入细胞的新型富含精氨酸的透膜刷状聚合物的制备方法和应用。
背景技术
药物分子的细胞内转导是药物投递系统中非常重要的一环。生物大分子或亲水药物的透膜递送仍然是一个重大挑战。一种高效的运输载体将从某个层面应对这一挑战。细胞透膜肽(cell penetrating peptides,CPPs)是一类阳离子短肽，可以有效地透过细胞膜并携带生物活性物质进入细胞。一般认为CPPs可以通过一种或多种途径进入细胞，大多数情况下，内吞是主要的摄取途径。通过内吞途径递送的局限性包括不可避免的内涵体/溶酶体的滞留和降解，这些局限性成为了降低细胞内递送效率的主要因素。另外，当内吞作用被抑制或浓度超过阈值时，CPPs可通过直接转导作用进入细胞。直接转导方式可以直接将药物分子递送至细胞质，避免内涵体/溶酶体滞留，从而使细胞内递送更高效。然而，随着药物剂量和浓度的增加而增加的毒性；以及由于全身稀释，静脉注射后CPPs到达靶细胞的实际浓度较低，这些因素均使通过直接转导机制的递送途径变得难以实现。因此，开发能够通过直接转导方式进入细胞的载体是非常迫切的。
通过直接转导的细胞内化涉及到能量和温度非依赖性的细胞膜的失稳，现有报道的膜失稳机制包括反胶束模型、孔形成模型和“地毯”模型。近些年来，孔形成介导的直接转导机制以快速高效的穿膜优势成为了研究热点，具体包括五个主要步骤，包括细胞膜外侧多肽的吸附与聚集引起膜的局部大扰动、磷脂双分子层厚度的减小、精氨酸和远端磷酸基团之间的强相互作用、瞬时孔的形成，以及多肽在孔表面扩散进入细胞内部。人们在探索孔形成的影响因素方面做出了许多努力，研究表明肽处于捆绑状态时形成水孔的临界浓度低于单一肽，且捆绑数与摄取效率呈线性相关。精氨酸侧链的长度对于胍基到达远端磷酸基团非常重要。了解影响孔形成的因素不仅有助于阐明孔形成机制，而且有助于为合理设计直接易位载体提供新的思路。
发明内容
本发明目的是解决现有递送载体会使进入细胞的药物分子被束缚在囊泡中无法发挥实际功能甚至被降解而失活的问题，提供一种通过孔形成介导的直接易位方式进入细胞的新型富含精氨酸的透膜刷状聚合物的制备方法和应用。
本发明的技术方案
一种通过孔形成介导的直接易位方式进入细胞的透膜刷状聚合物，所述透膜刷状聚合物为降冰片烯聚合骨架，侧链包含两个精氨酸残基短肽R2或四个精氨酸残基短肽R4，和一个柔性己酸连接臂C6或非柔性丙酸连接臂C2，化学式为PTn-R2-C6，或PTn-R2-C2或PTn-R4-C6，n为聚合度，为小于等于100的任何自然数(优选10，15和25)；其中短肽R2或R4羧基端为酰胺键；R2或R4氨基端的氨基和C6或C2的羧基通过酰胺键连接；聚合物为均聚物，只含有一种侧链结构。
本发明同时提供了一种通过孔形成介导的直接易位方式进入细胞的透膜刷状聚合物的制备方法，制备流程如图1所示，包括如下步骤：
1)多肽序列R2和R4的合成；
1.1)多肽序列R2的合成；
根据R2的氨基酸序列，Ac-Arg-Arg-NH2，以Rink-酰胺树脂为固相载体，以HBTU-HOBt为缩合剂，采取标准Fmoc策略，固相多肽合成方法合成目标多肽序列NH2-Arg-Arg-COOH，简称为R2；
1.2)多肽序列R4的合成；
根据R4的氨基酸序列，Ac-Arg-Arg-Arg-Arg-NH2，以Rink-酰胺树脂为固相载体，以HBTU-HOBT为缩合剂，采取标准Fmoc策略，固相多肽合成方法合成目标多肽序列NH2-Arg-Arg-Arg-Arg-COOH，简称为R4；
2)富含精氨酸多肽单体的合成；
2.1)NorAha-R2多肽单体的合成；
将三倍物质的量的降冰片烯基团N-(6-己酸)-5-降冰片烯-外-2,3-二甲酰亚胺通过羧基和氨基的缩合反应连接到步骤1.1)合成的多肽R2氨基端得到连接在树脂上的多肽单体NorAha-R2；
多肽单体与树脂的切割：在反应器中用无水乙醚冲洗树脂三次，使树脂尽可能干燥，称重后将树脂转移到圆底烧瓶(规格为250毫升)中，冰浴条件下加入切割液(水/三氟乙酸/间甲酚/苯甲醚/＝0.5％/82.5％/5％/5％，体积比)，搅拌15-30min，于室温下继续搅拌2.5-4h；按切割液与乙醚1:20的体积比例加入无水乙醚，室温下剧烈搅拌0.5-1.5h，停止搅拌后静置使沉淀能够充分析出，无水乙醚多次洗涤沉淀，将沉淀充分溶解于去离子水中，G4砂芯漏斗抽滤并收集滤液，所得粗肽溶液于冷冻干燥机进行抽干处理，最终得到干燥固体多肽单体；经RP-HPLC纯化，可得纯NorAha-R2多肽单体；
2.2)NorGly-R2多肽单体的合成；
将三倍物质的量的N-(甘氨酸)-5-降冰片烯-外-2,3-二甲酰亚胺通过羧基和氨基的缩合反应连接到步骤1.1)合成的多肽R2的N端得到连接在树脂上的多肽单体NorGly-R2；
多肽单体与树脂的切割：在反应器中用无水乙醚冲洗树脂三次，使树脂尽可能干燥。称重后将树脂转移到圆底烧瓶(规格为250毫升)中，冰浴条件下加入同步骤2.1)中的切割液，冰浴条件下搅拌15-30min，于室温下继续搅拌2.5-4h；按切割液与乙醚1:20的体积比例加入无水乙醚，室温下剧烈搅拌0.5-1.5h，停止搅拌后静置使沉淀能够充分析出，无水乙醚多次洗涤沉淀。将粉末状沉淀充分溶解于去离子水中，G4砂芯漏斗抽滤并收集滤液，所得粗肽溶液冷冻干燥，最终得到干燥固体多肽单体；经RP-HPLC纯化，可得纯NorGly-R2多肽单体；
2.3)NorAha-R4多肽单体的合成；
将三倍物质的量的N-(6-己酸)-5-降冰片烯-外-2,3-二甲酰亚胺通过羧基和氨基的缩合反应连接到步骤1.2)合成的多肽R4的N端得到连接在树脂上的多肽单体NorAha-R4；
多肽单体与树脂的切割：在反应器中用无水乙醚冲洗树脂三次，使树脂尽可能干燥；称重后将树脂转移到圆底烧瓶(规格为250毫升)中，冰浴条件下加入同步骤2.1)中的切割液，冰浴条件下搅拌15-30min，于室温下继续搅拌2.5-4h；按切割液与乙醚1:20的体积比例加入无水乙醚，室温下剧烈搅拌0.5-1.5h，停止搅拌后静置使沉淀能够充分析出，无水乙醚多次洗涤沉淀；将粉末状沉淀充分溶解于去离子水中，G4砂芯漏斗抽滤并收集滤液，所得粗肽溶液冷冻干燥，最终得到干燥固体多肽单体；经RP-HPLC纯化，可得纯NorAha-R4多肽单体；
3)富含精氨酸的透膜刷状聚合物的制备；
3.1)树枝状聚合物PTn-R2-C6的制备；
按照摩尔比为n:1的比例精确称取步骤2.1)得到的NorAha-R2单体和1当量催化剂Grubbs 3st，并在氮气保护下置于Schlenk瓶中；所需DMF溶剂经冻抽三循环处理后通过注射器转移到Schlenk瓶中，氮气保护下室温搅拌3-5h，然后将反应液等分为两份，一份样品中加入乙基乙烯基醚淬灭；为了追踪细胞摄取，用FITC-链转移剂1.1当量标记聚合物，然后用乙基乙烯基醚终止反应；用冰乙醚沉淀产物，得到黄褐色固体PTn-R2-C6；
通过1H-NMR中δ＝6.61处的单峰到δ＝5.3～5.9处双峰的位移面积比可得单体转化率；根据δ＝5.3～5.9处双峰的峰面积与δ＝7～7.75处端基苯环1H的积分面积来计算聚合度；
3.2)树枝状聚合物PTn-R2-C2的制备；
按照摩尔比为n:1的比例精确称取步骤2.2)得到的NorGly-R2多肽单体和催化剂Grubbs 3st，并在氮气保护下置于Schlenk瓶中；所需DMF溶剂经冻抽处理后通过注射器转移到Schlenk瓶中，氮气保护下室温搅拌3-5h，然后将反应液等分为两份，一份样品中加入乙基乙烯基醚淬灭；为了追踪细胞摄取，用FITC-链转移剂1.1当量标记聚合物，然后用乙基乙烯基醚终止反应；用冰乙醚沉淀产物，得到FITC标记的PTn-R2-C2；
3.3)树枝状聚合物PTn-R4-C6的制备；
按照摩尔比为n:1的比例精确称取步骤2.3)得到的NorAha-R4多肽单体和催化剂Grubbs 3st，并在氮气保护下置于Schlenk瓶中；所需DMF溶剂经冻抽处理后通过注射器转移到Schlenk瓶中，氮气保护下室温搅拌3-5h，然后将反应液等分为两份，一份样品中加入乙基乙烯基醚淬灭；为了追踪细胞摄取，用FITC-链转移剂1.1当量标记聚合物，然后用乙基乙烯基醚终止反应；用冰乙醚沉淀产物，得到FITC标记的PTn-R4-C6。
通过1H-NMR中化学位移在δ＝6.61处的单峰移到δ＝5.3～5.9处双峰的位移面积比可得单体转化率；根据δ＝5.3～5.9处双峰的峰面积与δ＝7～7.75处端基苯环1H的积分面积来计算聚合度。
本发明还提供了通过孔形成介导的直接易位方式进入细胞的透膜刷状聚合物的应用，包括聚合物本身的非内吞依赖的细胞摄取，聚合物对基因的负载和压缩，聚合物通过孔形成介导的直接易位方式对基因的快速有效递送。
本发明从孔形成介导的直接易位机制的基本原理出发，设计并合成了一系列新型富含精氨酸的透膜刷状聚合物(PTn-R2-C6，PTn-R2-C2和PTn-R4-C6)，能够通过孔形成介导的直接易位途径进入细胞。通过构效关系的筛选，确定了PTn-R2-C6载体(侧链包含两个精氨酸残基和一个柔性己酸连接臂)通过直接易位方式进入细胞的三个关键结构因素：(1)树枝状聚合物结构是跨膜的主要决定因素，因为聚集的阳离子残基会引起膜的局部扰动，适当的侧链电荷分散也避免了在细胞膜上的强吸附；(2)降冰片烯和精氨酸之间的柔性碳链连接臂有助于精氨酸插入磷脂双分子层的疏水区域，并与远端层的磷酸基团相互作用；(3)侧链中适量的精氨酸对于确保有效的孔隙形成非常重要，但是过量的精氨酸将导致不可避免的细胞毒性。模型膜和细胞实验分别证实了其中的PT15-R2-C6在孔形成和孔形成介导的直接易位方式进入细胞的明显优势。
此外，本发明还研究了PTn-R2-C6作为基因递送载体的潜力并通过调节聚合度来优化转染效率。结果显示，PT25-R2-C6可通过直接转导途径将质粒直接递送到细胞质中，并且显示出比金标准转染试剂PEI 25K更高的转染效率。此外，其制备方法工艺简单，易于操作，成本较低，易于推广应用。
本发明的优点和有益效果：
1.新型富含精氨酸的透膜刷状聚合物诱导细胞膜上孔的形成，通过孔形成介导的直接易位途径(内吞非依赖)进入细胞。
2.新型富含精氨酸的透膜刷状聚合物通过孔形成介导的直接易位途径将质粒DNA快速运输到细胞质中，从根本上避免了内涵体/溶酶体束缚。
3.与金标准转染试剂PEI 25K相比，新型富含精氨酸的透膜刷状聚合物具有更高的转染效率和更低的细胞毒性。
附图说明
图1为新型富含精氨酸的透膜刷状聚合物的合成示意图以及PTn-R2-C6通过孔形成方式进入细胞的示意图。
图2为PT15-R2-C6，PT15-R2-C2和PT15-R4-C6引起的荧光泄露结果。
图3为不同浓度的PT15-R2-C6，PT15-R2-C2和PT15-R4-C6的细胞毒性结果。
图4为FITC标记聚合物PT15-R2-C6，PT15-R2-C2和PT15-R4-C6的细胞摄取结果。
图5为FITC标记聚合物PT15-R2-C6的细胞摄取机制考察结果。
图6为FITC标记聚合物PT15-R2-C6，PT15-R2-C2和PT15-R4-C6在细胞内分布结果。
图7为R20，PTn-R2-C6(n＝10,15,25)和PEI 25K对质粒负载后的琼脂糖凝胶电泳阻滞成像图。
图8为R20/DNA和PTn-R2-C6/DNA(n＝10,15,25)复合物的粒径分布图和透射电镜图。
图9为R20/DNA和PTn-R2-C6/DNA(n＝10,15,25)复合物的电位图。
图10为R20/DNA和PTn-R2-C6/DNA(n＝10,15,25)复合物引起的荧光泄露结果。
图11为R20/DNA，PTn-R2-C6/DNA(n＝10,15,25)和PEI25K/DNA复合物的细胞摄取结果。
图12为PTn-R2-C6/DNA(n＝10,15,25)和PEI25K/DNA复合物的细胞内分布。
图13为PT25-R2-C6/DNA复合物细胞摄取的实时跟踪。
图14为R20/DNA，PTn-R2-C6/DNA(n＝10,15,25)和PEI25K/DNA和复合物的转染结果。
图15为R20/DNA，PT25-R2-C6/DNA和PEI25K/DNA复合物的细胞毒性结果。
具体实施方式：
聚合物的制备
实施例1.树枝状聚合物PT10-R2-C6的制备；
1)多肽序列R2的合成；
根据R2的氨基酸序列，Ac-Arg-Arg-NH2，以Rink-酰胺树脂为固相载体，以HBTU-HOBt为缩合剂，采取标准Fmoc策略，固相多肽合成方法合成目标多肽序列NH2-Arg-Arg-COOH，简称为R2；
2)富含精氨酸多肽单体NorAha-R2的合成；
将降冰片烯基团N-(6-己酸)-5-降冰片烯-外-2,3-二甲酰亚胺通过羧基和氨基的缩合反应连接到步骤1)得到的R2的N端得到连接在树脂上的多肽单体NorAha-R2。
多肽单体NorAha-R2与树脂的切割：在反应器中用无水乙醚冲洗树脂三次，使树脂尽可能干燥。称重后将树脂转移到圆底烧瓶(规格为250毫升)中，冰浴条件下加入切割液(水/三氟乙酸/间甲酚/苯甲醚/＝0.5％/82.5％/5％/5％，体积比)，反应30min，于室温下继续搅拌3.5h。按切割液与乙醚1:20的体积比例加入无水乙醚，室温下剧烈搅拌1h，停止搅拌后静置使沉淀能够充分析出，无水乙醚多次洗涤沉淀，将沉淀充分溶解于去离子水中，G4砂芯漏斗抽滤并收集滤液，所得粗肽溶液于冷冻干燥机进行抽干处理，最终得到干燥固体多肽单体NorAha-R2。经RP-HPLC纯化，可得纯多肽单体NorAha-R2；
3)富含精氨酸的透膜刷状聚合物PT10-R2-C6的制备；
精确称取步骤2)得到的NorAha-R2单体(0.0156mmol，10当量)和催化剂Grubbs3st(0.00156mmol，1当量)，并在氮气保护下置于Schlenk瓶中。所需DMF溶剂经冻抽三循环处理后通过注射器转移到Schlenk瓶中，氮气保护下反应5h，然后将反应液等分为两份，一份样品中加入乙基乙烯基醚淬灭。为了追踪细胞摄取，用FITC-链转移剂(1.1当量)标记聚合物，然后用乙基乙烯基醚终止反应。用冰乙醚沉淀产物，得到黄褐色固体聚合物PT10-R2-C6。通过1H-NMR中δ＝6.61处的单峰到δ＝5.3～5.9处双峰的位移面积比可得单体转化率。根据δ＝5.3～5.9处双峰的峰面积与δ＝7～7.75处端基苯环1H的积分面积来计算聚合度。
实施例2.树枝状聚合物PT15-R2-C6的制备；
1)多肽单体NorAha-R2的合成同实施例1；
2)树枝状聚合物PT15-R2-C6的合成；
精确称取步骤1)得到的NorAha-R2单体(0.0234mmol，15当量)和催化剂引发剂Grubbs 3st(0.00156mmol，1当量)并在氮气保护下置于Schlenk瓶中。所需DMF溶剂经冻抽三循环处理后通过注射器转移到Schlenk瓶中，氮气保护下反应5h，然后将反应液等分为两份，一份样品中加入乙基乙烯基醚淬灭。为了追踪细胞摄取，用FITC-链转移剂(1.1当量)标记聚合物，然后用乙基乙烯基醚终止反应。然后用冰乙醚沉淀反应，得到黄褐色固体的聚合物PT15-R2-C6。通过1H-NMR中化学位移在δ＝6.61处的单峰移到δ＝5.3～5.9处双峰的位移面积比可得单体转化率。根据δ＝5.3～5.9处双峰的峰面积与δ＝7～7.75处端基苯环1H的积分面积来计算聚合度。
实施例3.树枝状聚合物PT25-R2-C6的制备；
1)多肽单体NorAha-R2的合成同实施例1；
2)树枝状聚合物PT25-R2-C6的制备；
精确称取步骤1)得到的NorAha-R2单体(0.039mmol，25当量)和催化剂引发剂Grubbs 3st(0.00156mmol，1当量)，并在氮气保护下置于Schlenk瓶中。所需DMF溶剂经冻抽三循环处理后通过注射器转移到Schlenk瓶中，氮气保护下反应5h，然后将反应液等分为两份，一份样品中加入乙基乙烯基醚淬灭。为了追踪细胞摄取，用FITC-链转移剂(1.1当量)标记聚合物，然后在室温下用乙基乙烯基醚终止反应。然后用冰乙醚沉淀反应，得到黄褐色固体的聚合物PT25-R2-C6。通过1H-NMR中化学位移在δ＝6.61处的单峰移到δ＝5.3～5.9处双峰的位移面积比可得单体转化率。根据δ＝5.3～5.9处双峰的峰面积积分与δ＝7～7.75处端基苯环的峰面积积分来计算聚合度。
实施例4.树枝状聚合物PT15-R2-C2的制备；
1)多肽序列R2的合成同实施例1；
2)富含精氨酸多肽单体NorGly-R2的合成；
将N-(甘氨酸)-5-降冰片烯-外-2,3-二甲酰亚胺通过羧基和氨基的缩合反应连接到肽N端得到连接在树脂上的多肽单体NorGly-R2。
多肽单体NorGly-R2与树脂的切割：在反应器中用无水乙醚冲洗树脂三次，使树脂尽可能干燥。称重后将树脂转移到圆底烧瓶(规格为250毫升)中，冰浴条件下加入切割液(同实施例1)，反应30min，于室温下继续搅拌3.5h。按切割液与乙醚1:20的体积比例加入无水乙醚，室温下剧烈搅拌1h，停止搅拌后静置使沉淀能够充分析出，无水乙醚多次洗涤沉淀。将粉末状沉淀充分溶解于去离子水中，G4砂芯漏斗抽滤并收集滤液，所得粗肽溶液冷冻干燥，最终得到干燥固体多肽单体NorGly-R2。经RP-HPLC纯化，可得纯NorGly-R2多肽单体；
3)树枝状聚合物PT15-R2-C2的制备；
精确称取步骤2)得到的NorGly-R2单体(0.0234mmol，15当量)和催化剂引发剂Grubbs 3st(0.00156mmol，1当量)并在氮气保护下置于Schlenk瓶中。所需DMF溶剂经冻抽三循环处理后通过注射器转移到Schlenk瓶中，氮气保护下反应5h，然后将反应液等分为两份，一份样品中加入乙基乙烯基醚淬灭。为了追踪细胞摄取，用FITC-链转移剂(1.1当量)标记聚合物，用乙基乙烯基醚终止反应。然后用冰乙醚沉淀反应，得到黄褐色固体的聚合物PT15-R2-C2。通过1H-NMR中化学位移在δ＝6.61处的单峰移到δ＝5.3～5.9处双峰的位移面积比可得单体转化率。根据δ＝5.3～5.9处双峰的峰面积与δ＝7～7.75处端基苯环1H的积分面积来计算聚合度。
实施例5.树枝状聚合物PT15-R4-C6的制备；
1)多肽序列R4的合成；
根据R4的氨基酸序列，Ac-Arg-Arg-Arg-Arg-NH2，以Rink-酰胺树脂为固相载体，以HBTU-HOBt为缩合剂，采取标准Fmoc策略，固相多肽合成方法合成目标多肽序列NH2-Arg-Arg-Arg-Arg-COOH，简称为R4；
2)多肽单体NorAha-R4的合成；
将三倍物质的量的N-(6-己酸)-5-降冰片烯-外-2,3-二甲酰亚胺通过羧基和氨基的缩合反应连接到步骤1得到的肽R4的N端得到连接在树脂上的多肽单体NorAha-R4；
多肽单体NorAha-R4与树脂的切割：在反应器中用无水乙醚冲洗树脂三次，使树脂尽可能干燥。称重后将树脂转移到圆底烧瓶(规格为250毫升)中，冰浴条件下加入切割液(同实施例1)，反应30min，于室温下继续搅拌3.5h。按切割液与乙醚1:20的体积比例加入无水乙醚，室温下剧烈搅拌1h，停止搅拌后静置使沉淀能够充分析出，无水乙醚多次洗涤沉淀。将粉末状沉淀充分溶解于去离子水中，G4砂芯漏斗抽滤并收集滤液，所得粗肽溶液冷冻干燥，最终得到干燥固体多肽单体NorAha-R4。经RP-HPLC纯化，可得纯NorAha-R4多肽单体；
3)树枝状聚合物PT15-R4-C6的制备；
精确称取步骤2)得到的NorAha-R4单体(0.0234mmol，15当量)和催化剂引发剂Grubbs 3st(0.00156mmol，1当量)并在氮气保护下置于Schlenk瓶中。所需DMF溶剂经冻抽三循环处理后通过注射器转移到Schlenk瓶中，氮气保护下反应5h，然后将反应液等分为两份，一份样品中加入乙基乙烯基醚淬灭。为了追踪细胞摄取，用FITC-链转移剂(1.1当量)处理2h，用乙基乙烯基醚终止反应。然后用冰乙醚沉淀反应，得到黄褐色固体的聚合物。通过1H-NMR中化学位移在δ＝6.61处的单峰移到δ＝5.3～5.9处双峰的位移面积比可得单体转化率。根据δ＝5.3～5.9处双峰的峰面积与δ＝7～7.75处端基苯环1H的积分面积来计算聚合度。
聚合物的测试
实施例6.新型富含精氨酸的透膜刷状聚合物引起荧光泄露实验。
新型富含精氨酸的透膜刷状聚合物的成孔活性可通过荧光光谱法进行量化。钙黄绿素是一种亲水性荧光染料，一旦聚集在脂质体中，会导致染料荧光的自淬灭。聚合物在脂质体中打孔可导致钙黄绿素可以从脂质体中逃逸。当染料从囊泡中漏出时，它在水相中被稀释，钙黄绿素的荧光将被恢复，因此荧光值增加。采用薄膜水化法制备钙黄绿素脂质体(CL-LUV)。10mg 2-油酰-1-棕榈锡甘油-3-磷酸胆碱(POPC)溶于2mL氯仿中，反应液置于50mL茄形瓶中。通过减压旋转蒸发去除有机溶剂以形成干燥的脂质膜。将脂质膜置于真空干燥箱中过夜。然后将2mL 60mM钙黄绿素(PBS，pH 7.4)溶液加入脂质膜中，充分旋转并水化1h以获得脂质体悬浮液。将所得脂质体悬浮液通过聚碳酸酯膜(100nm)挤压7次可获得粒径均一的CL-LUV。反复超滤离心除去游离钙黄绿素。将190μL不同浓度的聚合物溶液与10μLCL-LUV(0.125mg/mL)混合后，立即监测由孔形成引起的荧光强度变化。使用酶标仪持续检测荧光光谱，每30秒测量一次，持续600秒。10μL15％Triton X-100溶液被认为可实现染料的完全释放，并将相应的荧光强度Imax视为100％荧光泄漏。使用以下公式计算在时间t检测到的钙黄绿素释放RF(t)：
RF(t)＝100*[(It-I0)/(Imax-10)]
式中，I0和It分别是在不添加聚合物的情况下和在引入聚合物后的时间t测得的荧光强度。
测试结果如图2所示，低浓度(1.25μM和6.25μM)的PT15-R2-C6与脂质体混合后，荧光泄露逐渐增加，而高浓度(12.5μM)的PT15-R2-C6会导致100％的瞬时荧光泄漏。侧链中含有双倍精氨酸数量的PT15-R4-C6在低浓度(1.25μM和6.25μM)下成孔能力降低，表明侧链精氨酸残基增多对孔形成没有促进作用。然而，对于具有相对不灵活且较短连接臂的PT15-R2-C2聚合物，其诱导LUV上孔形成的能力大大降低。即使以12.5μM的PT15-R2-C2处理，600s时荧光泄漏也仅达到70％，远低于PT15-R2-C6或PT15-R2-C4引起的荧光泄漏。这些结果表明，PT15-R2-C6在模型膜上具有最佳的打孔能力，强调了C6和R2组合的优越性。
实施例7.PT15-R2-C6，PT15-R2-C2和PT15-R4-C6的细胞毒性实验。
1、本发明所使用的细胞为人肾上皮细胞293T。培养条件为：高糖培养基DMEM，+10％FBS+1％青霉素链霉素。将293T细胞置于37℃、5％CO2细胞培养箱中孵育，每次在实验之前，将细胞预培养直至达到汇合。收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100μL，铺板使待测细胞密度调至10000/孔，边缘孔用无菌PBS填充。
2、在5％CO2，37℃下孵育，至细胞单层铺满孔底(96孔平底板)，加入浓度梯度的聚合物溶液(0.25μM,0.5μM,1μM,2μM,6.5μM)。
3、将96孔板置于5％CO2，37℃培养箱中培养24h。
4、小心吸去孔内培养液，每孔加入100μL新鲜配置的CCK-8工作液(1/9,v/v)，继续培养1.5h。
5、终止培养。在酶联免疫检测仪OD 450nm处测量各孔的吸光值。细胞存活率可以通过下面的公式计算得到：细胞存活率＝(OD450(samples)/(OD450(control)×100％。
从图3的CCK-8法细胞毒性结果看出，在测试浓度范围内，经PT15-R2-C6处理的细胞存活率均大于95％，表明其毒性水平较低。相对于PT15-R2-C6，PT15-R4-C6含有双倍数量的精氨酸残基，在2μM以上时即产生明显细胞毒性，在6.25μM时仅有约50％的细胞存活，这表明PT15-R4-C6作为药物载体的安全性较差。
实施例8.流式细胞仪定量观察不同浓度的PT15-R2-C6，PT15-R2-C2和PT15-R4-C6在细胞摄取方面的应用。
首先，我们将293T细胞均匀种到12孔板中，并在37℃、5％CO2环境中培养24h。将FITC标记的聚合物用无血清的DMEM培养基稀释至终浓度(0.25μM，0.5μM，1μM，2μM)，给药。给药后1h，将药品吸出，用PBS清洗三遍，胰蛋白酶消化并离心后，收集细胞并重悬于冷PBS中，然后用新鲜的4％多聚甲醛固定以进行流式细胞术分析。
实验结果如图4所示：为了定量评价浓度变化对细胞内传递效率的影响，采用流式细胞仪评价细胞的摄取能力。PT15-R2-C6表现出最高的细胞摄取，摄取量比PT15-R2-C2和PT15-R4-C6分别增加了约1.3倍和0.3倍。即使在较低浓度下，PT15-R2-C6也比其他化合物显示出更高的荧光强度。
实施例9.观察PT15-R2-C6的细胞摄取机制。
通过流式细胞仪分析PT15-R2-C6的细胞摄取机制。将293T细胞以2×105/孔的密度接种于6孔板中，在37℃、5％CO2培养箱中培养24h。在给药前0.5h，用不同的内吞抑制剂对细胞进行预处理。所用的内吞抑制剂浓度如下：15μg mL-1氯丙嗪(CPZ)，3mM甲基化-β-环糊精(MβCD)，50μM阿米洛利(Ami)，20μM制霉菌素(Nyr)，100mM叠氮化钠(NaN3)。细胞中加入2μM FITC标记的聚合物，并在37℃下共同孵育2h。最后用胰蛋白酶消化法收集细胞，流式细胞仪分析。对于低温实验，细胞给药前1h和给药后2h均在4℃培养，PBS洗涤细胞，收集细胞进行流式细胞仪分析。
实验结果如图5所示，4℃条件下PT15-R2-C6的细胞摄取水平降低70％。这是因为低温环境抑制了细胞膜的流动性，从而影响直接转导介导的细胞的摄取，因此能量依赖的细胞摄取途径不能简单地通过低温实验来推断。利用能量抑制剂NaN3研究了细胞摄取与细胞能量的关系。NaN3组显示出几乎不变的细胞摄取行为，表明PT15-R2-C6通过能量非依赖途径进入细胞。常见的内吞抑制剂CPZ、MβCD、Ami和Nyr对PT15-R2-C6的细胞摄取抑制作用可忽略不计，表明PT15-R2-C6可通过一种能量非依赖的直接转导途径进入细胞。
实施例10.激光共聚焦观察PT15-R2-C6，PT15-R2-C2和PT15-R4-C6聚合物在细胞内分布方面的应用。
首先，用多聚赖氨酸包被细胞爬片并将293T细胞均匀的种到孔板中，并在37℃、5％CO2环境中培养24h后给药。给药后1h，将药品吸出，用PBS清洗细胞爬片三遍，加入配制好的Lysotracker Red，37℃孵育30min，用PBS清洗细胞爬片三遍，加入4％多聚甲醛固定液室温固定10分钟，PBS清洗三遍，加入配制好的DAPI工作液，室温孵育15分钟，PBS清洗三遍。将爬片置于载玻片上，用防荧光淬灭剂封片。
实验结果如图6所示：采用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)对FITC标记聚合物的摄取途径和细胞内分布进行了评价。内涵体/溶酶体标记为红色，FITC标记聚合物显示为绿色信号。结果表明，PT15-R2-C6组绿色荧光均匀分布于胞浆中，且在细胞核区域出现强烈绿色荧光信号。与PT15-R2-C6相比，PT15-R2-C2组细胞内荧光几乎不可见，证实了较长、更灵活的连接臂对于细胞摄取起到了很重要的作用。研究发现，聚合物的绿色荧光与溶酶体的红色荧光几乎不可见重叠，表明当这些新型富含精氨酸的透膜刷状聚合物进入细胞时，均为非内吞途径。
实施例11.观察新型富含精氨酸的透膜刷状聚合物PTn-R2-C6在核酸负载方面的应用
通过琼脂糖凝胶电泳实验表征PTn-R2-C6聚合物对pDNA的负载效果。制备不同N/P的PTn-R2-C6/pDNA复合物，各取10μL复合物溶液加入2μL SYBR Green核酸染色工作液(含有6×DNA上样缓冲液)37℃孵育10min，然后在0.7％(w/w)的琼脂糖凝胶中进行电泳实验，恒定电压120V，时间为15min。实验结束后，使用凝胶成像系统观察凝胶并拍照。
实验结果如图7所示：琼脂糖凝胶电泳结果表明，PTn-R2-C6聚合物可以有效地负载质粒DNA，在N/P为2时实现完全负载。PTn-R2-C6聚合物对DNA负载能力随着聚合度提高而提升可归因于精氨酸密度的增加。
实施例12.观察新型富含精氨酸的透膜刷状聚合物PTn-R2-C6在核酸压缩方面的应用
用动态光散射法和透射电子显微镜测定了PTn-R2-C6/pDNA复合物的平均粒径和zeta电位。用超纯水制备PTn-R2-C6/pDNA复合物(2μg DNA，100μL)，测量粒径后用超纯水将这些样品稀释至900μL以测量zeta电位。
实验结果如图8和图9所示：作为对照组，线型多肽R20不能压缩DNA并形成约800nm大小的聚集体，zeta电位为+5mV。具有相同精氨酸数量的树枝状聚合物PT10-R2-C6可有效压缩DNA，形成直径约为55nm的纳米粒，zeta电位约为+25mV。此外，PTn-R2-C6在不同聚合度下的粒径和zeta电位主要分布在50nm和20mV左右。表明新型树枝状聚合物具有很好的负载和压缩质粒的效果。
实施例13.观察PTn-R2-C6/pDNA复合物引起的荧光泄露。
PTn-R2-C6/pDNA复合物的成孔活性可通过荧光光谱法进行量化。钙黄绿素是一种亲水性荧光染料，一旦聚集在脂质体中，会导致染料荧光的自淬灭。聚合物在脂质体中打孔可导致钙黄绿素可以从脂质体中逃逸。当染料从囊泡中漏出时，它在水相中被稀释，钙黄绿素的荧光将被恢复，因此荧光值增加。采用薄膜水化法制备钙黄绿素脂质体(CL-LUV)。10mg2-油酰-1-棕榈锡甘油-3-磷酸胆碱(POPC)溶于2mL氯仿中，反应液置于50mL茄形瓶中。通过减压旋转蒸发去除有机溶剂以形成干燥的脂质膜。将脂质膜置于真空干燥箱中过夜。然后将2mL 60mM钙黄绿素(PBS，pH 7.4)溶液加入脂质膜中，充分旋转并水合1h以获得脂质体悬浮液。所得脂质体悬浮液通过聚碳酸酯膜(100nm)挤压7次可获得粒径均一的CL-LUV。反复超滤离心除去游离钙黄绿素。将190μL不同浓度的PTn-R2-C6/pDNA复合物溶液与10μL CL-LUV(0.125mg/mL)混合后，立即监测由孔形成引起的荧光强度变化。使用酶标仪持续检测荧光光谱，每30秒测量一次，持续600秒。10μL 15％Triton X-100溶液被认为可实现染料的完全释放，并将相应的荧光强度Imax视为100％荧光泄漏。使用以下公式计算在时间t检测到的钙黄绿素释放RF(t)：
RF(t)＝100*[(It-I0)/(Imax-10)]
式中，I0和It分别是在不添加聚合物的情况下和在引入聚合物后的时间t测得的荧光强度。
测试结果如图10所示，PTn-R2-C6/pDNA复合物保持了和PTn-R2-C6相当的孔形成能力。与PT10-R2-C6/pDNA复合物相比，线性多肽R20/pDNA复合物引起荧光泄露能力相对PT10-R2-C6较差。
实施例14.观察PTn-R2-C6/DNA复合物在细胞摄取方面的应用
用流式细胞仪研究了聚合物PTn-R2-C6/pDNA复合物的细胞摄取。首先将pDNA与染料YOYO-1以1:100的染料-碱基比混合，并在室温下培养1h。将YOYO-1标记的pDNA与PTn-R2-C6(n＝10,15,25)聚合物混合形成复合物。293T细胞以每孔2×105细胞的密度接种于6孔板上，并培养过夜。将细胞暴露于含有YOYO-1标记的PTn-R2-C6/pDNA复合物中并培养2h。胰蛋白酶消化离心后，收集细胞，冷PBS洗涤，新鲜4％多聚甲醛固定，流式细胞仪分析。金标准转染试剂聚乙烯亚胺(PEI 25K，MW＝25000)用作阳性对照。
实验结果如图11所示：与PEI 25K相比，PTn-R2-C6/DNA表现出更有效的细胞摄取，并且随着聚合度的增加摄取效率得到了进一步的提高。
实施例15.观察PTn-R2-C6/DNA复合物的细胞内分布。
用激光共聚焦显微镜研究了PTn-R2-C6/pDNA复合物的内化途径和细胞内分布。将293T细胞以每孔3×104细胞的密度接种在35mm共聚焦培养皿(Ф＝15mm)中，并培养过夜。每个小皿加入YOYO-1标记的PTn-R2-C6/DNA的复合物并培养1h。孵育后，用冰PBS清洗三次，加入Lysotracker Red工作液，孵育30分钟。细胞用冰PBS清洗三次，室温下用4％多聚甲醛固定15min。细胞进一步用DAPI染细胞核。染色后，使用CLSM(Olympus，FV1000)观察细胞。
在活细胞成像实验中，YOYO-1标记的DNA与PT25-R2-C6共孵育30min，给药前用Hoechst33258(1μg/ml)孵育细胞10min对细胞核进行染色。用UltraVIEW VoX活细胞成像系统(PerkinElmer，USA)检测细胞，找到细胞视野后将PT25-R2-C6/YOYO-1-DNA复合物加入共聚焦小皿中，加样后立刻开始记录，开始以每隔1分钟记录一次的频率拍照，五分钟后以每隔两分钟的频率拍照，共记录40分钟。
实验结果如图12所示：通过CLSM评估PTn-R2-C6/YOYO-1-DNA复合物在293T细胞中的亚细胞分布。可以观察到PEI 25K和PTn-R2-C6聚合物在亚细胞定位上的一些差异。PEI25K组绿色荧光呈点状分布并与有溶酶体共定位，说明大多数被滞留在溶酶体中。复合物PT10-R2-C6主要聚集在细胞膜周围，少量分布在胞浆中。对于PT15-R2-C6，大部分的复合物均匀分布在胞浆中，并有一定量的复合物被转运到细胞核中。此外，PT25-R2-C6/YOYO-1-DNA复合物在细胞质中均匀分布，显示出最有效的细胞核递送，这是成功基因治疗的必要条件。由于没有观察到代表着溶酶体/内涵体分布的点状信号，PTn-R2-C6/YOYO-1-DNA复合物被认为是通过非内吞途径直接进入胞浆的。我们对PT25-R2-C6/YOYO-1-DNA的细胞摄取进行了实时跟踪。如图13所示，在最初的2分钟内，PT25-R2-C6/YOYO-1-DNA复合物表现出很强的膜表面聚集。胞浆内均匀分布着微弱的绿色荧光。随着培养时间的延长，复合物逐渐聚集在细胞膜周围。4分钟后，细胞内弥散的绿色荧光逐渐强烈，并有大量荧光定位于细胞核内。自始至终，未观察到明显的溶酶体捕获。此外，在细胞膜表面存在明亮的荧光点，复合物的快速内化和细胞内的荧光弥散分布都表明PT25-R2-C6/YOYO-1-DNA复合物主要通过孔形成介导的直接易位方式进入细胞。
实施例16.观察新型富含精氨酸的透膜刷状聚合物PTn-R2-C6在细胞转染方面的应用
293T细胞以3×104细胞/孔的密度接种于48孔平板上。细胞在37℃，5％CO2培养箱中培养24h。制备不同N/P的PTn-R2-C6/DNA复合物，用不含血清的培养基将每个样品稀释至300μL，得转染液。用PBS冲洗细胞一次，然后加入转染液。孵育4h后，用PBS洗涤细胞两次，用完整的细胞培养基再培养44h，用荧光素酶分析试剂盒对荧光素酶活性进行定量。用酶标仪测量生物发光发光强度10s。根据制造商的说明，通过BCA蛋白质分析试剂盒(ThermoScientific，Rockford，IL)测量每个孔中的总蛋白质含量，以便将荧光素酶活性标准化为每个孔中的总蛋白质含量。
实验结果如图14所示：我们首先比较了具有相同精氨酸数量的PT10-R2-C6和线性多肽R20的转染效率。PT10-R2-C6的转染效率比R20高3个数量级，说明我们所设计的聚合物结构在基因递送中具有绝对优势。与PEI 25K相比，PT25-R2-C6的转染效率提高了1倍。该结果表明PTn-R2-C6作为基因递送载体具有较高的应用价值。
实施例17.观察PTn-R2-C6/DNA复合物在细胞毒性方面的应用
用CCK-8活性测定法测定聚合物/pDNA复合物的细胞毒性。293T细胞以每孔5×103-1×104个细胞密度接种于96孔培养板中，并生长到70-80％的融合率，制备不同N/P的PTn-R2-C6/DNA复合物，给药后4h换液，继续培养24h。将CCK-8与DMEM以1/9的体积比混合以获得CCK-8工作溶液。给药孵育后，使用PBS缓冲液冲洗细胞，然后添加100μL CCK-8工作溶液混合物，再孵育1h。通过酶标仪读取(λ＝450nm)吸光度来量化细胞活力。参照未经任何处理的细胞活力计算细胞活力。
实验结果如图15所示：我们新设计的聚合物PTn-R2-C6与DNA形成的复合物没有明显的细胞毒性。
Claims (5)
1.一种通过孔形成介导的直接易位方式进入细胞的透膜刷状聚合物，所述透膜刷状聚合物为降冰片烯聚合骨架，侧链包含两个精氨酸残基短肽R2或四个精氨酸残基短肽R4，和一个柔性己酸连接臂C6或非柔性丙酸连接臂C2，化学式为PTn-R2-C6，或PTn-R2-C2，或PTn--R4-C6；其中聚合度n为小于等于100的任何自然数，短肽R2或R4羧基端为酰胺键；R2或R4氨基端氨基和C6或C2的羧基通过酰胺键连接；聚合物为均聚物，只含有一种侧链结构。
2.根据权利要求1所述的通过孔形成介导的直接易位方式进入细胞的透膜刷状聚合物，其特征在于，所述聚合度n的取值为10，15和25。
3.一种权利要求1所述的通过孔形成介导的直接易位方式进入细胞的透膜刷状聚合物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
1)多肽序列R2和R4的合成；
1.1)多肽序列R2的合成；
根据R2的氨基酸序列，Ac-Arg-Arg-NH2，以Rink-酰胺树脂为固相载体，以HBTU-HOBt为缩合剂，采取标准Fmoc策略，固相多肽合成方法合成目标多肽序列NH2-Arg-Arg-COOH，简称为R2；
1.2)多肽序列R4的合成；
根据R4的氨基酸序列，Ac-Arg-Arg-Arg-Arg-NH2，以Rink-酰胺树脂为固相载体，以HBTU-HOBt为缩合剂，采取标准Fmoc策略，固相多肽合成方法合成目标多肽序列NH2-Arg-Arg-Arg-Arg-COOH，简称为R4；
2)富含精氨酸多肽单体的合成；
2.1)NorAha-R2多肽单体的合成；
将三倍物质的量的降冰片烯基团N-(6-己酸)-5-降冰片烯-外-2,3-二甲酰亚胺通过羧基和氨基的缩合反应连接到步骤1.1)合成的多肽R2氨基端得到连接在树脂上的多肽单体NorAha-R2；
多肽单体与树脂的切割：将称重后的树脂转移到圆底烧瓶中，冰浴条件下加入切割液，冰浴条件下搅拌15-30min，于室温下继续搅拌2.5-4h，所述切割液为按体积比水:三氟乙酸:间甲酚:苯甲醚＝0.5％:82.5％:5％:5％的混合液；按切割液与乙醚为1:20的体积比例加入无水乙醚，室温下剧烈搅拌0.5-1.5h，停止搅拌后静置使沉淀能够充分析出，无水乙醚洗涤沉淀，将沉淀充分溶解于去离子水中，G4砂芯漏斗抽滤并收集滤液，所得粗肽溶液冷冻干燥处理，最终得到干燥固体多肽单体；经RP-HPLC纯化，可得纯NorAha-R2多肽单体；
2.2)NorGly-R2多肽单体的合成；
将三倍物质的量的N-(甘氨酸)-5-降冰片烯-外-2,3-二甲酰亚胺通过羧基和氨基的缩合反应连接到步骤1.1)合成的R2的N端得到连接在树脂上的多肽单体NorGly-R2；
多肽单体与树脂的切割：将称重后的树脂转移到圆底烧瓶中，冰浴条件下加入同步骤2.1)中的切割液，冰浴条件下搅拌15-30min，于室温下继续搅拌2.5-4h；按切割液与乙醚为1:20的体积比加入无水乙醚，室温下剧烈搅拌0.5-1.5h，停止搅拌后静置使沉淀能够充分析出，无水乙醚洗涤沉淀；将粉末状沉淀充分溶解于去离子水中，G4砂芯漏斗抽滤并收集滤液，所得粗肽溶液冷冻干燥，最终得到干燥固体多肽单体；经RP-HPLC纯化，可得纯NorGly-R2多肽单体；
2.3)NorAha-R4多肽单体的合成；
将三倍物质的量的N-(6-己酸)-5-降冰片烯-外-2,3-二甲酰亚胺通过羧基和氨基的缩合反应连接到步骤1.2)合成的R4的N端得到连接在树脂上的多肽单体NorAha-R4；
多肽单体与树脂的切割：在反应器中用无水乙醚冲洗树脂，使树脂尽可能干燥；称重后将树脂转移到圆底烧瓶中，冰浴条件下加入同步骤2.1)中的切割液，冰浴条件下搅拌15-30min，于室温下继续搅拌2.5-4h；按切割液与乙醚为1:20的体积比例加入无水乙醚，室温下剧烈搅拌0.5-1.5h，停止搅拌后静置使沉淀能够充分析出，无水乙醚洗涤沉淀；将粉末状沉淀充分溶解于去离子水中，G4砂芯漏斗抽滤并收集滤液，所得粗肽溶液冷冻干燥，最终得到干燥固体多肽单体；经RP-HPLC纯化，可得纯NorAha-R4多肽单体；
3)富含精氨酸的透膜刷状聚合物的制备；
3.1)树枝状聚合物PTn-R2-C6的制备；
按照摩尔比为n:1的比例精确称取步骤2.1)得到的NorAha-R2多肽单体和1当量催化剂Grubbs 3st，并在氮气保护下置于Schlenk瓶中；所需DMF溶剂经冻抽处理后通过注射器转移到Schlenk瓶中，氮气保护下室温搅拌3-5h，然后将反应液等分为两份，一份样品中加入乙基乙烯基醚淬灭；为了追踪细胞摄取，用FITC-链转移剂1.1当量标记聚合物，然后用乙基乙烯基醚终止反应；用冰乙醚沉淀产物，得到FITC标记的PTn-R2-C6；
3.2)树枝状聚合物PTn-R2-C2的制备；
按照摩尔比为n:1的比例精确称取步骤2.2)得到的NorGly-R2多肽单体和催化剂Grubbs 3st，并在氮气保护下置于Schlenk瓶中；所需DMF溶剂经冻抽处理后通过注射器转移到Schlenk瓶中，氮气保护下室温搅拌3-5h，然后将反应液等分为两份，一份样品中加入乙基乙烯基醚淬灭；为了追踪细胞摄取，用FITC-链转移剂1.1当量标记聚合物，然后用乙基乙烯基醚终止反应；用冰乙醚沉淀产物，得到FITC标记的PTn-R2-C2；
3.3)树枝状聚合物PTn-R4-C6的制备；
按照摩尔比为n:1的比例精确称取步骤2.3)得到的NorAha-R4多肽单体和催化剂Grubbs 3st，并在氮气保护下置于Schlenk瓶中；所需DMF溶剂经冻抽处理后通过注射器转移到Schlenk瓶中，氮气保护下室温搅拌3-5h，然后将反应液等分为两份，一份样品中加入乙基乙烯基醚淬灭；为了追踪细胞摄取，用FITC-链转移剂1.1当量标记聚合物，然后用乙基乙烯基醚终止反应；用冰乙醚沉淀产物，得到FITC标记的PTn-R4-C6。
4.根据权利要求3所述的通过孔形成介导的直接易位方式进入细胞的透膜刷状聚合物的制备方法，其特征在于，通过1H-NMR中δ＝6.61处的单峰到δ＝5.3～5.9处双峰的位移面积比可得单体转化率；根据δ＝5.3～5.9处双峰的峰面积与δ＝7～7.75处端基苯环1H的积分面积来计算聚合度。
5.权利要求1所述聚合物的应用，其特征在于所述聚合物具有通过孔形成机制进入细胞的特殊属性，利用该属性将聚合物应用于透膜材料，应用该聚合物对基因的负载和压缩，通过孔形成介导的直接易位方式对基因的有效递送。
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